Le virus de l’Hépatite C (VHC), de la famille Flaviviridae, est à l’origine d’une pandémiemondiale. L’infection par le VHC provoque le dévelopment d’hépatites chroniques, decirrhoses et de carcinomes hépatocellulaires (CHC). Les fonctions de la majorité des protéinesvirales sont connues, mis à part pour NS5A dont la seule fonction directe attribuée à ce jour,équivaut à celle d’un facteur d'activation transcriptionnelle. Notre laboratoire a montréprécédemment que les variants de quasiespèce de NS5A isolés à partir du sérum d’un mêmepatient présentaient des différences significatives dans leurs propriétés intrinsèques detransactivation. Fort de ces résultats, nous avons analysé des variants de NS5A isolés à partirde tissu hépatique d’un patient chroniquement infecté par le VHC de génotype 1b. Cesanalyses ont révélé une compartimentation génétique et fonctionnelle des variants de NS5Aentre le tissu tumoral et le tissu non-tumoral adjacent. Nous avons donc émis l’hypothèse queles propriétés transactivatrices de NS5A pourraient jouer un rôle dans la pathogenèse ainsique dans la réplication virale, et que la variabilité naturelle de NS5A pourrait influencer sespropriétés transactivatrices. L’objectif de ce travail de thèse était d’analyser le rôle despropriétés transactivatrices de NS5A dans la pathogenèse hépatique viro-induite ainsi quedans la réplication virale. Pour étudier le rôle des propriétés de transactivation de NS5A dans la pathogenèse hépatique,nous avons développé des vecteurs lentiviraux pour exprimer dans les hépatocytes primaireshumains les variants choisis de NS5A portants différents potentiels de transactivation. Enutilisant la technologie RNA-Seq d’Illumina, l’analyse des transcriptomes d’hépatocytestransduits exprimant les variants transactivateurs fort et faible de NS5A, sera utiliser pouridentifier les voies cellulaires ciblées par les propriétés transactivatrices de NS5A. Pour lesétudes in vivo, nous avons lancé le développement des souris transgénique permettantl’activation conditionnelle de l’expression des variants de NS5A avec fort et faible potentielde transactivation, spécifiquement dans le foie. Ces souris transgéniques seront utilisées pourétudier le rôle potentiel des propriétés transactivatrices dans la pathogenèse VHC induite etplus particulièrement dans le développement des cancers. Pour étudier le rôle des propriétés de transactivation de NS5A dans la réplication virale, nousavons utilisé le système de réplicon subgénomique de VHC exprimant les variants de NS5Aprécédemment caractérisés. Pour exercer ses propriétés transactivatrices, NS5A doit êtrelocalisée au moins partiellement dans le noyau. Nous avons démontré qu’une partie de NS5Ase retrouve dans noyau et est recruté sur des promoteurs cellulaires, modulant ainsidirectement l’expression de gènes cellulaires essentiels pour la réplication de l’ARN viral.Nous avons observé que les variants de NS5A avec différents potentiels de transactivation,confèrent différentes capacités de réplication au réplicon subgénomique, et corrèlent avec lepotentiel de transactivation de variant correspondant. En accord avec ces observations,l’inhibition de translocation nucléaire de NS5A entraine une inhibition de la réplication virale,suggerant un rôle potentiel des propriétés transactivatrices de NS5A dans la réplication l’ARNvirale. En conclusion, nous avons démontré que l’activation transcriptionnelle des gènes cellulairespar la NS5A est essentielle pour la réplication de l’ARN du VHC. Cette modulation des gènescellulaires pourrait également être impliquée dans les mécanismes de la pathogenèse viroinduite.Nous confirmerons cette hypothèse grâce aux souris NS5A. Par ailleurs, ces résultatspourraient contribuer au développement de nouvelles thérapies anti-VHC, basées surl’inhibition de translocation nucléaire de NS5A / Hepatitis C virus (HCV) causes a chronic infection in the majority of infected patients,ultimately leading to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). Although the rolesof the HCV proteins in the viral life cycle are increasingly understood, the precise function ofthe HCV NS5A protein has yet to be elucidated. To date, the only putative direct functionattributed to NS5A is its transcriptional transactivation properties. Our group has previouslyshown that quasispecies variants of NS5A isolated from the serum samples of the samepatient bear different transactivating properties according to their amino acid sequence. Basedon these observations, we performed preliminary phylogenetic and functional analysis ofNS5A variants isolated from liver tissue of individuals infected with HCV of genotype 1b.This analysis revealed genetic and functional compartmentation of NS5A variants in tumoraland adjacent non-tumoral tissue. We hypothesized that the natural variability of NS5A mayimpact its proposed transactivation properties. We also hypothesized that NS5A’s putativetransactivation properties could play a role in HCV replication and in liver pathogenesis. Theaim of the study presented in this thesis was to investigate the role of NS5A transactivationproperties in the development of HCV-induced liver pathogenesis as well as in viralreplication. To study the role of NS5A transcriptional activation properties in liver pathogenesis, wedeveloped lentiviral vectors for the expression of selected NS5A variants bearing differenttransactivation potentials in cultured primary human hepatocytes. We now intend to extendthese preparations using RNAseq technology to analyse the, transcriptome of primaryhepatocytes transduced with lentiviral vectors encoding strongly and weakly transactivatingNS5A variants to identify the cellular pathways targeted by NS5A, allowing us to decipherthe role of NS5A mediated host gene regulation in development of HCV inducedpathogenesis. For in vivo studies, we have begun the development of transgenic mice allowingliver-specific conditional expression of NS5A variants with high and low transactivationpotentials. These transgenic mice will be used to study the possible role of NS5Atransactivation properties in development of HCC. To study the role of NS5A transcriptional activation properties in HCV RNA replication, weused the sub-genomic replicon system expressing previously characterized NS5A sequences..Using this system, we have demonstrated that a subset of NS5A protein can translocate to thenucleus and is recruited to cellular promoters of host cell genes known to be required forefficient replication of HCV replicon RNA as well as those implicated in pathogenesis.Moreover, we have shown that NS5A directly regulate the expression of these genes.Consequently, it was observed that replicons encoding NS5A variants with differenttransactivation potentials exhibited different replication capacities, and that this correlatedwith the transactivation potential of the corresponding NS5A variant. In agreement with theseobservations, inhibition of nuclear translocation of NS5A resulted in the inhibition ofreplication of the HCV subgenomic replicon, further confirming the role of NS5Atransactivation properties in viral RNA replication. In conclusion, we have demonstrated that NS5A-mediated transcriptional regulation ofcellular genes is required for HCV replication. Such NS5A-mediated modulation of cellulargenes may also constitute one of the mechanisms involved in HCV-related liver pathogenesisand development of HCC, an aspect which is currently under investigation using the toolsdeveloped during this project. This study will contribute towards deciphering the role ofNS5A in viral replication as well as providing insight into its role in HCV-induced liverpathogenesis...

L’infection par le Virus de l’Hépatite C (VHC) est un problème majeur de santépublique touchant environ 170 millions de personnes dans le monde. A l’heure actuelle, il n’existe aucun vaccin pour lutter contre le VHC et les traitements curatifs disponibles sont chers, donnent lieu à des effets secondaires très sévères et ne sont efficaces que pour une partie des patients. Le développement de nouvelles stratégies antivirales représente donc un enjeu crucial dans la lutte contre le VHC. Dans le but de développer de nouvelles molécules bloquant différentes étapes du cycle viral, une meilleure compréhension de chacune des ces étapes est nécessaire. Au cours de mon travail de thèse, nous avons étudier le mécanisme d’entrée du VHC dans ses cellules cibles, les hépatocytes. Dans un premier temps nous avons caractérisé un inhibiteur naturel de l’entrée du VHC, appelé EWI-2wint. Ce travail a notamment permis de mettre en évidence l’importance de la dynamique membranaire de l’un des récepteurs du virus, la protéine CD81, dans ce processus. Dans un second axe, nous avons étudié l’effet de la monensine sur l’infection par le VHC. Nous avons ainsi montré que cet inhibiteur pharmacologique bloque une étape tardive du processus d’entrée du VHC.L’ensemble des données accumulées au cours de ma thèse permettent de mieux comprendre le mécanisme d’entrée du VHC et ouvrent la voie au développement de nouveaux outils thérapeutiques. / Hepatitis C, whose causal agent is called Hepatitis C Virus (HCV), is a global health burden with about 170 million people infected. Currently, no vaccine exists again HCV and treatments are effective for only a part of infected people. Therefore, new treatments are urgently needed, as well as a better understanding of the viral life cycle.To do so, we studied the entry process of HCV in its targets cells through the characterisation of HCV entry inhibitors. Firstly, we have shown that EWI-2wint, a natural inhibitor of HCV entry, blocks this process by changing the partitionning of CD81, one of the HCV receptors. In addition, we have studied the effect of monensin on HCV infection and found that this pharmacological inhibitor impairs a late step of HCV entry.Altogether, our results allow a better understading of the HCV entry process and open the way to the development of new therapeutic agents.

La surinfection par HDV/ HBV est la forme la plus grave d'hépatite virale chronique et affecte entre 15-20 millions de patients au niveau mondial. HDV n'est pas susceptible aux traitements anti-HBV et le taux de réponse à l'IFNα est <25%. Malgré une progression plus rapide de la maladie hépatique, la majorité des patients présente une suppression de la réplication du HBV. Les détails des interactions entre HDV, HBV et le système immunitaire inné des cellules infectées restent inconnus. Les objectifs de ces travaux de thèse ont été: i) l'étude de l'infection par HDV et son interaction avec la réponse innée cellulaire; ii) l'identification de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-HDV; iii) l'exploration de l'interaction entre HDV et HBV. L'approche expérimentale a été basée sur l'infection de cellules dHepaRG, capables d´entretenir des cycles réplicatifs complets de HBV et HDV et ayant une réponse immunitaire innée physiologique. Nous avons observé que: i) l'infection par HDV est associée à un réplication forte dans un nombre limité de cellules, et à une induction de l'expression des ISGs; ii) le traitement des cellules infectées par HDV avec de l'IFNα ne conduit pas à une induction accrue des ISGs et a une faible activité antivirale. Quelques agonistes de PRR, notamment activant la voie NF-kB, induisent une forte diminution de la réplication de HDV; iii) malgré le faible nombre de cellules infectées, HDV et ses protéines induisent une diminution de la réplication de HBV. Ces travaux ouvrent des perspectives importantes concernant la caractérisation de la pathogénèse de l'hépatite delta et l'identification de nouvelles stratégies thérapeutiques immuno modulatrices / HDV/HBV superinfection is the most aggressive form of chronic viral hepatitis and is estimated to affect 15-20 million patients worldwide. HDV is not susceptible to available direct anti-HBV drugs and sustained response to IFNα therapy occurs in less than 1/4 of patients. Despite the faster progression of liver disease, most HDV/ HBV infected patients present a suppression of HBV replication. The details of the interactions between HDV, HBV and the host cell innate immune response remain largely unexplored and research efforts have been limited by the lack of infection models. The aims of this thesis work were: i) to study HDV infection and the interplay with the host innate immune response; ii) to identify novel therapeutic strategies for the inhibition of HDV; iii) to further explore HDV/ HBV interference. The experimental strategy was based on infection of dHepaRG cells, which are known to be permissive to both HBV and HDV full replicative cycles and to present physiological innate immune responses. We observed that: i) HDV infection is associated with a strong, yet transient replication, a potent induction of the expression of ISGs; ii) IFN-α treatment of HDVinfected cells does not induce a further increase of ISG expression and has a modest antiviral activity. Conversely, some PRR agonists, in particular those inducing the NFkB pathway, induce a strong decline in HDV replication; iii) despite the low number of coinfected cells, HDV as well as its encoded proteins exert a repressive effect on HBV replication. Our work opens an array of perspectives on the pathogenesis of hepatitis delta and the identification of novel immune modulatory therapeutic strategies

Le virus de l'hépatite B (VHB) reste un problème de santé majeur dans le monde malgré la disponibilité du vaccin. Le VHB n’est pas éradiqué par les thérapies actuelles et 240 millions de personnes infectées chroniquement restent à risque de développer une cirrhose du foie et un carcinome hépatocellulaire (CHC).Le VHB est un petit virus hépatotrope doté d'un génome à ADN double brin partiel (ADNrc). Après infection l'ADNrc est converti en ADN épisomal (ADNccc) qui est ensuite organisé en minichromosome viral, qui est le modèle pour la transcription et qui initie la réplication. La protéine de l'hépatite B x (HBx) est recrutée sur l'ADNccc pour initier et maintenir la transcription de l'ADN ccc. HBx cible aussi directement des gènes cellulaires impliqué dans le développement du CHC.Nous avons utilisé une approche ChIP-Seq pour identifier toutes les cibles génomiques de HBx dans les cellules qui répliquent le VHB. Les cibles HBx sont à la fois des gènes codant les protéines et des ARNnc (75 miARN et 34 lncRNA). Nous avons montré que HBx réprimait un sous-ensemble de miARNs qui réguleraient négativement la réplication virale (ex : miR-24) et des miARNs impliqués dans le développement du CHC (ex : miR-21). Parmi les lncARNs ciblés pour HBx, nous avons étudié DLEU2, qui est fortement surexprimé dans l’infection par le VHB et le CHC. Nous avons en outre montré que DLEU2 lie à la fois HBx et l’histone méthyltransférase Ezh2, la sous-unité catalytique du complexe répressif PRC2. L'interaction avec DLEU2 et HBx relie les fonctions Ezh2/PRC2 conduisant à l'activation constitutive d'un sous-ensemble de gènes cibles d'Ezh2 qui sont normalement conservés dans un état réprimé. Nous avons également montré que l’interaction de HBx avec DLEU2 se produisait sur le minichromosome de l’ADNccc où elle stimulait la transcription/réplication du virus. Enfin, nous avons caractérisé par ATAC-Seq les changements d'accessibilité de la chromatine imposés par HBV dans les hépatocytes humains primaires / Hepatitis B virus (HBV) remains a major health problem worldwide despite the availability of the vaccine. No cure is available for the 240 million peoples chronically infected with HBV that are at risk to develop liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). Viral suppression, achieved by long term treatment with nucleotides analogues (NUCs), impacts on liver fibrosis and prevents liver decompensation but HCC risk is not reduced in the first 5 years of treatment. HBV is a small hepatotropic virus with a partially double strand DNA (rcDNA) genome. After hepatocyte infection the rcDNA is converted into the cccDNA episome that is then organized into a viral minichromosome that is the template for all viral transcripts and initiates replication. The hepatitis B x protein (HBx) is recruited on the cccDNA and is required to launch and maintain cccDNA transcription. HBx has also been shown to directly target cellular genes and this has been related to HCC development.We used a ChIP-Seq approach to determine the full repertoire of HBx genomic targets in HBV replicating cells. HBx targets include both protein coding genes and ncRNA (75 miRNAs and 34 lncRNAs). We showed that HBx represses a subset of miRNAs that would negatively regulate viral replication (i.e. miR-24) and miRNAs involved in HCC development (i.e. miR-21). Among the HBx targeted lncRNAs we focused DLEU2, which is strongly upregulated in HBV infection and HCC. We further showed that DLEU2 binds both HBx the Ezh2 histone methyltransferase, the catalytic subunit of the repressive PRC2 complex. The interaction with DLEU2 and HBx re-wires Ezh2/PRC2 functions leading to the constitutive activation of a subset of Ezh2 target genes that are normally kept in a repressed state. We also showed that HBx interaction with DLEU2 occurs on the cccDNA minichromosome where it boosts HBV transcription/replication. Finally, we characterized by ATAC-Seq HBV imposed changes of chromatin accessibility in primary human hepatocytes

Plusieurs données expérimentales suggèrent que la protéine Core du virus de l’Hépatite B (HBV), en plus de ses fonctions structurales pour la formation des nucléocapsides dans le cytoplasme, pourrait avoir des fonctions régulatrices importantes dans le noyau des hépatocytes infectés. En effet, Core s’associe à l’ADNccc et aux promoteurs de certains gènes cellulaires dans le noyau des hépatocytes infectés et pourrait ainsi contrôler leur régulation transcriptionnelle. De plus, de par sa capacité à lier les ARN, elle pourrait également participer au métabolisme post-transcriptionnel de gènes viraux et/ou cellulaires. Pour caractériser ces fonctions, nous avons réalisé une analyse protéomique des facteurs cellulaires qui interagissent avec la protéine Core dans le noyau d’hépatocytes humains. Cet interactome a mis en évidence un grand nombre de protéines de liaison aux ARN (RBP), qui participent au métabolisme des ARN et en particulier aux mécanismes d’épissage. Deux interactants majeurs de Core ont été plus particulièrement étudiés, SRSF10 et RBMX, impliqués notamment dans l’épissage et la réparation de l’ADN. Une analyse fonctionnelle effectuée par une approche siRNA a montré que SRSF10 et RBMX affectent différemment le niveau des ARN viraux, vraisemblablement en agissant à des étapes différentes du cycle viral. De même, un composé ciblant l’activité de certaines RBP diminue fortement la réplication d’HBV en affectant l’accumulation des ARN viraux. Ainsi, ces résultats suggèrent que Core pourrait interagir avec certaines RBP pour contrôler le destin des ARN viraux et/ou cellulaires, une piste intéressante pour le développement de nouvelles stratégies antivirales ciblant l’hôte / Converging evidences suggest that the Hepatitis B virus (HBV) core protein, beside its well-known structural role to form nucleocapsids in the cytoplasm, could have important regulatory functions in the nucleus of infected hepatocytes. Indeed, nuclear Core was shown to associate with the cccDNA and to the promoters of some cellular genes, suggesting that Core may control viral and/or cellular gene expression. In addition, Core has the capacity to bind RNA, and may thus regulate HBV RNA metabolism. To elucidate these functions, we performed a proteomic analysis of the cellular factors interacting with nuclear Core in human hepatocytes. This interactome revealed a majority of highly interconnected RNA-binding proteins (RBPs), which participate in several steps of mRNA metabolism, including transcription, splicing and nuclear egress. We focused on two major Core-interacting factors, SRSF10 and RBMX that were previously involved in splicing and DNA repair. Functional analyses performed by a siRNA approach indicated that RBMX and SRSF10 were able to differentially regulate the levels of all viral RNAs most likely by acting at different steps of the viral life-cycle. Similarly, a small compound, affecting the activity of selected RBPs, severely impaired HBV replication by strongly reducing viral RNA accumulation. Altogether, these results strongly suggest that Core interacts with some selected RBPs to control the fate of viral and/or cellular RNAs and provide new critical information for the development of novel host-targeting antiviral agents (HTA)

Les avancées en biologie moléculaire et cellulaire des dernières décennies ont permis de redéfinir le rôle de l’ARN au sein des cellules de tous les domaines du vivant. Initialement cantonné dans un rôle de support transitoire de l’information génétique du génome (ADN) en direction des effecteurs ou molécules actives (protéines et métabolites), l’ARN est maintenant associé à toutes les sphères de la biologie. Les molécules d’ARN peuvent agir autant comme génome (virus), comme molécules adaptatrices (ARNt), comme messager de l’information génétique (ARNm), comme enzyme (ribozyme) ou encore comme molécules régulatrices en cis (riboswitch) ou en trans (miARN). Nous savons aussi que la grande majorité du génome des cellules eucaryotes est transcrite à un moment ou un autre. Ces implications de l’ARN en font une cible de choix pour la recherche en génomique fonctionnelle, ainsi que pour des applications thérapeutiques. C’est pourquoi, depuis la découverte des ARN catalytiques et de l’interférence à l’ARN, beaucoup d’efforts ont été consacrés pour développer un éventail d’outils moléculaires permettant d’inhiber l’expression de gènes d’intérêt. Le défi qui se dessine aujourd’hui est le développement d’outils plus spécifiques et plus efficaces, entre autres parce que la variété d’ARN qu’un inhibiteur peut rencontrer est beaucoup plus grande qu’initialement estimée. De plus, les données recueillies lors d’essais cliniques montrent la nécessité de combiner un très grand potentiel avec une spécificité accrue. Les travaux de cette thèse se concentrent sur un outil moléculaire qui a le potentiel de répondre positivement à ce défi : le ribozyme SOFA-HDV. Mon projet de recherche visait à démontrer le potentiel de cet ARN catalytique pour le ciblage de gènes in cellulo et de développer son application. Tout d’abord, j’ai démontré que le ribozyme SOFA-HDV pouvait être utilisé pour inhiber la fonction d’un ARN in cellulo. Cette étude a également mis en évidence l’usage de ce ribozyme comme agent antiviral, avec le virus de l’hépatite C comme modèle. Le développement de nouvelles thérapies plus performantes avec peu d’effets secondaires demeure un enjeu important. Au moment de publier ces travaux, en plus d’être le premier exemple exhaustif de l’utilisation du ribozyme SOFA-HDV in cellulo, notre étude contenait le plus grand nombre de ribozymes jamais testés contre le VHC en une seule publication. Bien que modeste, l’effet observé démontre que ce ribozyme peut inhiber la réplication d’un virus dans un modèle in cellulo. Nos résultats exposent aussi la différence d’accessibilité entre les ARN de polarités positive et négative du VHC in cellulo. Par la suite, j’ai participé au développement de ribozymes SOFA-HDV ciblant le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) dans le cadre d’une collaboration. Parmi les ribozymes testés, nous en avons identifié un dont l’activité catalytique réduit la réplication du VIH de plus de 50 % dans un modèle cellulaire. Dans le cadre de cette étude, nous avons identifié un site hautement favorable pour le ciblage par un ribozyme SOFA-HDV ou par un shARN. Des données suggèrent aussi une spécificité élevée du ribozyme SOFA-HDV. Des tests d’inhibition avec différentes souches du VIH montrent que l’activité du ribozyme est affectée avec un seul mésappariement entre le biosenseur (élément du module SOFA resposable de reconnaissance du substrat) et son site de liaison. Finalement, dans un esprit d’intégration des connaissances recueillies au fil des différents projets impliquant le ribozyme SOFA-HDV, je me suis intéressé à leur processus de sélection pour le ciblage génique. J’ai démontré l’impact de la séquence du biosenseur sur l’activité du ribozyme. J’ai également illustré l’autocoupure possible lorsque la séquence du biosenseur crée un prolongement du bloqueur (élément du module SOFA agissant comme verrou) ainsi que l’impact de la structure du substrat autant au niveau des sites de liaison du domaine de reconnaissance que du biosenseur. Ces nouveaux éléments combinés aux données antérieures sur le ribozyme HDV original m’ont permis d’élaborer une marche à suivre pour la présélection des ribozymes SOFA-HDV selon leur potentiel comme ciseaux moléculaires. En conclusion, ces travaux ont contribué à mettre de l’avant le potentiel du ribozyme SOFA-HDV pour des applications de ciblage de gènes, plus particulièrement pour des cibles virales. De ce fait, il existe maintenant des exemples concrets de l’utilisation de ce ribozyme en cellules humaines. Tout indique que la spécificité du module SOFA est préservée in cellulo et serait avantageusement comparable à d’autres technologies. Globalement, cette thèse devrait rendre l’utilisation du ribozyme SOFA-HDV plus accessible et favoriser son développement comme outil moléculaire.

Le virus de l'hépatite C (VHC) est détecté dans les sérums de patients infectés sous forme de particules infectieuses lipidées de très faibles densités. Le VHC est un virus enveloppé dont l'assemblage de particules virales se produit à la membrane du réticulum endoplasmique consécutivement au clivage séquentiel de sa polyprotéine et à sa maturation en protéines structurales et non structurales. Dans ce travail, nous avons cherché à mieux comprendre les mécanismes d'assemblage, d'enveloppement et de sécrétion des particules infectieuses. Dans une première étude, nous avons montré la connexion fonctionnelle entre les complexes de réplication et les sites d'assemblage. Dans une seconde étude, nous avons montré que p7 ralentissait de manière dose-dépendante le trafic ER-Golgi, conduisant à une rétention intracellulaire de la glycoprotéine virale E2. En outre, nous avons montré que le clivage du précurseur protéique E2p7 contrôle l'expression intracellulaire E2 et les niveaux de sécrétion des particules subvirales et des virions infectieux. Enfin, nous avons également mis en évidence que l'extrémité N-terminale de p7 gouverne l'infectivité spécifique des particules en coordonnant la rencontre des composants de la nucléocapside avec les glycoprotéines, mais aussi l'enveloppement de la nucléocapside. Dans une troisième étude, nous avons découvert des fonctions et des facteurs spécifiques du sérum, des cellules productrices et des séquences du VHC qui modulent la lipidation des particules virales au cours de leur assemblage et de leur sécrétion. Au total, ces différents travaux ont contribué à mieux comprendre les étapes de l'assemblage du VHC et les mécanismes modulant i) le transfert des ARN viraux des complexes de réplication vers les sites d’assemblage, ii) la rencontre des nucléocapsides et des glycoprotéines, et enfin, iii) l'acquisition de lipides par des particules virales / Hepatitis C virus (HCV) is detected in the sera of infected patients as lipidated infectious particles of very-low density. HCV is an enveloped virus whose assembly of viral particles occurs at the endoplasmic reticulum membrane following sequential cleavage of its polyprotein and its maturation as structural and non-structural viral proteins. In this work, we aimed at better understanding the mechanisms of assembly, envelopment and secretion of infectious particles. In a first study, we highlighted the functional connection between replication complexes and assembly sites. In a second study, we showed that p7 dose-dependently slows down the ER-to-Golgi traffic, leading to intracellular retention of E2 viral glycoprotein. In addition, we showed that cleavage of an E2p7 precursor protein controls E2 intracellular expression and secretion levels of subviral particles and infectious virions. Finally, we also highlighted that p7 N-terminal extremity governs the specific infectivity of the infectious particles by coordinating the encountering of the nucleocapsid components with the glycoproteins and the envelopment of the nucleocapsids. In a third study, we discovered specific functions and factors from serum, producer cells, and HCV sequences that modulate lipidation of viral particles during their assembly and secretion. Altogether, these different works contributed at better understanding the steps of HCV assembly and the mechanisms modulating i) the transfer of viral RNAs from replication complexes to assembly sites, ii) the encountering of the nucleocapsids and glycoproteins followed by virion envelopment, and finally, iii) the acquisition of lipids by viral particles

Avec près de 350 millions de personnes chroniquement infectées, et malgré l’existence de vaccins efficaces, le virus de l’Hépatite B (VHB) reste un problème majeur de santé publique. Parmi les protéines virales, la protéine régulatrice HBx possèdent des activités qui pourraient être particulièrement impliquées dans le développement de CHC. Au cours de ce travail, nous nous sommes intéressés aux différences biologiques entre la protéine HBx issue d’une région non tumorale (HBx-NT) et la protéine HBx issue d’une région tumorale (HBx-T) d’un même patient. En particulier, nous nous sommes intéressés à la régénération hépatique après hépatectomie partielle et à la carcinogenèse hépatique dans un modèle murin transgénique. Nous avons démontré l’absence d’impact de la forme tronquée de la protéine HBx sur la régénération hépatique. Nous avons démontré que la protéine HBx entière avait la capacité d’activer la sécrétion d’IL-6 dans la phase d’initiation de la régénération hépatique, conduisant à l’hyperactivation de STAT3, l’accumulation de SOCS3 et la diminution de phosphorylation de ERK. Au final, la protéine HBx entière induit un retard de régénération hépatique. Nous avons démontré une cinétique d’apparition de tumeurs plus rapide chez les souris HBx-T que chez les souris HBx-NT après injection d’un carcinogène chimique. Nous avons aussi pu observer que les deux formes HBx-T et HBx-NT sensibilisaient les hépatocytes à l’apoptose, au cours d’un dommage hépatique aigue, et que cette sensibilisation à l’apoptose pouvait en partie rendre compte de l’effet co-carcinogène observé chez les souris HBx-T et HBx-NT. L’ensemble de mes résultats a permis de mieux comprendre les mécanismes par lesquels la protéine HBx participe au développement de CHC. / Hepatitis B virus (HBV) is a worldwide health issue, as it is estimated that 350 millions people are chronically infected. Among the viral proteins, HBx is thought to be involved in hepatocellular carcinoma (HCC) development. In this work, we were interested in biological differences between HBx sequence from non tumoral region (HBx-NT) compared to HBx from tumoral region (HBx-T) from a single patient. In particular, we studied liver regeneration after partial hepatectomy et hepatocarcinogenesis in a transgenic mice model. We demonstrated that HBx-T did not modulate liver regenereation. We also showed that HBx-NT induced IL-6 overexpression during priming phase of liver regeneration, and that IL-6 overexpression was involved in STAT3 hyperactivation, SOCS3 accumulation and inhibition of ERK. Overall, HBx-NT induced IL-6 overexpression was responsible for a delay in liver regeneration. Moreover, we showed that HBx-T induced a faster development of hepatic tumor after DEN initiation, compared to HBx-NT. Both HBx forms were involved in an apoptosis sensibilization during acute liver injury, that could be involved in co-carcinogenic effect of HBx-T and HBx-NT. Overall, my results participate to the comprehension of HBx impact on liver carcinogenesis

Le virus de l'hépatite C (HCV) est responsable de maladies chroniques du foie et l'une des principales causes de développement du carcinome hépatocellulaire (HCC). Cependant, les mécanismes moléculaires qui permettent le développement d’un HCC suite à une infection chronique par le HCV restent incompris. Les microARN (miR), de petits ARNs non codants qui régulent l'expression des gènes au niveau post-transcriptionnel, sont connus pour jouer un rôle important dans l'homéostasie cellulaire du foie. De plus en plus d’études suggèrent que l'infection par le HCV induit la modification de réseaux intracellulaires impliquant les miRs hépatiques contribuant au développement des lésions du foie, y compris le HCC. En utilisant des techniques d'analyse systématiques, nous avons identifié des miRs qui modulent le cycle viral du HCV mais également des miRs modulés lors de l'infection par le HCV. Cette analyse globale des interactions entre les miRs de l'hôte et le HCV améliore les connaissances actuelles sur les interactions entre le HCV et l’hôte qui contribuent vraisemblablement à la tumorigenèse dans le foie, et ouvre des perspectives pour de potentielles nouvelles approches pour prévenir et/ou traiter le HCC chez les patients infectés par le HCV. / Hepatitis C virus (HCV)-induced chronic liver disease is one of the leading causes of hepatocellular carcinoma (HCC). However, the molecular mechanisms that enable HCC development following chronic HCV infection remain poorly understood. MicroRNAs (miRs), small non coding RNAs that regulate gene expression at a post-transcriptional level have been reported to play an important role in cellular homeostasis within the liver. Increasing evidence suggests that HCV infection induces alteration of intrahepatic miR networks and that deregulation of miRs contributes to liver disease including HCC. Using high-throughput screening and RNA sequencing, we identified miRs that modulate the HCV life cycle and miRs that are modulated upon HCV infection. This comprehensive analysis of the HCV-host miR network improves the current knowledge of the HCV-host interactions that likely contribute to tumorigenesis in the liver and opens perspectives for novel potential approaches to prevent and/or treat HCC in HCV-infected patients.

La particularité de ce virus de l'hépatite B est la synthèse d'un ADN circulaire clos covalent (ADNccc) qui est la forme de persistance du virus dans la cellule. Cet ADN est maintenu à une copie par cellule en moyenne chez l'homme grâce à un recyclage des nucléocapsides dans le noyau. En effet, durant le cycle viral, les nucléocapsides sont soit redirigées dans le noyau pour former de l'ADNccc, soit enveloppées puis sécrétées pour former de nouveaux virions. Du fait de son maintien au sein de l'hépatocyte, la formation et la régulation de l'ADNccc restent des éléments clés du traitement antiviral. Il a été montré in vitro que l'accumulation de cet ADN était régulée par les protéines d'enveloppe. Lors de l'étude du taux d'ADNccc dans des biopsies de foie de patients coinfectés HIV-HBV chronique, il a été découvert un patient présentant 300 fois plus d'ADNccc intrahépatique que la moyenne de la cohorte. L'objectif de ma thèse a été de comprendre quel était le mécanisme conduisant à cette accumulation d'ADNccc in vivo. Cela nous a permis de mettre en évidence le rôle du gène core dans l'accumulation de l'ADNccc / The feature of hepatitis B virus is the synthesis of a covalently closed circular DNA (cccDNA) which is the persistence form of the virus in cell. cccDNA is maintained to 1 copy per human cell thanks to the recycling of capsids into the nucleus. Indeed, during the viral cycle, capsids are either transported into the nucleus to form cccDNA or enveloped and secreted to form new infectious virions. Because of its maintenance in the hepatocyte, cccDNA formation and regulation are still key elements of antiviral treatment. It has been shown that, in vitro, cccDNA accumulation was regulated by envelope proteins. Upon the study of cccDNA levels in liver biopsies of HIV-HBV co-infected patients, an individual with a cccDNA level 300 fold higher than the average of the cohort was identified. My thesis objective was to understand which is the mechanism leading to the cccDNA accumulation observed in vivo. This allowed us to highlight the role of core gene in cccDNA accumulation