Les préparations de Viscum album (VA), connu sous le nom vernaculaire de gui européen, sont fréquemment utilisées en support des traitements anticancéreux, principalement pour améliorer la qualité de vie des malades et réduire la croissance des tumeurs. Elles sont connues pour exercer des effets anti-tumoraux. Il existe de plus en plus de données scientifiques faisant état de liens étroits entre cancer et inflammation. Étant donné que la prostaglandine E2 (PGE2) induite par la cyclo-oxygénase 2 (COX-2) joue un rôle clef dans l’inflammation, j’ai exploré la régulation du système COX-2-PGE2 par VA et ses mécanismes sous-jacents. J’ai montré que VA exerce ses effets anti-inflammatoires en inhibant sélectivement l’expression de COX-2 et en diminuant la production de PGE2 qui en découle, par le biais d’une déstabilisation de l’ARNm de COX-2. En plus de leurs propriétés cytotoxiques, il a été montré que les préparations de VA ont également des effets immunostimulants. Les différentes préparations de VA sont hautement hétérogènes du fait de leurs compositions biochimiques qui varient selon la récolte, l’espèce de l’arbre hôte et les méthodes de préparation qui peuvent influer sur leur efficacité clinique. De ce fait, j’ai réalisé une étude comparative sur cinq préparations de VA dans le but d’analyser leurs capacités de maturation et d’activation des cellules dendritiques (DC) qui peuvent à leur tour présenter une réponse immunitaire anti-tumorale. Les résultats ont montré que parmi les cinq préparations,VA Qu Spez induit de manière significative l’activation des DC et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires telle que l’IL-6, l’IL-8 et le TNF-α qui induisent la production d’IFN-γ,orientant de ce fait la réponse immunitaire vers une réponse Th1. L’orchestration de la11fonction des cellules myélomonocytiques est un élément central à l’interface entre inflammation et cancer. Il constitue un paradigme expliquant la plasticité et la fonction des macrophages. Mon étude met en évidence l’influence de VA Qu Spez sur la polarisation des macrophages qui passent d’un état alternatif (M2) à un état dit classique (ou M1). Les macrophages M2 sont connus pour polariser les réponses immunitaires Th2, pour participer à l’élimination des parasites, pour diminuer l’inflammation, pour promouvoir le remodelage tissulaire et la progression des tumeurs et pour avoir des fonctions immunorégulatrices. Les macrophages M1 sont impliqués dans la réponse Th1, favorisent la résistance aux pathogènes intracellulaires et aux tumeurs et promeuvent des réactions de désagrégation tissulaires. L’ensemble de ces résultats permet de comprendre les propriétés anti-inflammatoires et immunostimulantes des préparations de VA. Des recherches complémentaires permettront d’améliorer les stratégies d’utilisation thérapeutique de VA et son utilisation dans les soins de support aux traitements anticancéreux. / Viscum album (VA) preparations, commonly known as European mistletoe, are frequentlyused as complementary therapy in cancer, mainly to improve quality of life of the patients andto reduce the tumor growth. They are known to exert anti-tumoral effects. There is increasing evidence of the convoluted connection of cancer and inflammation. As cyclooxygenase-2(COX-2)-induced prostaglandin E2 (PGE2) plays a key role in the inflammation, I explored the regulation of COX-2-PGE2 axis by VA and underlying mechanisms. I found that VA exerts anti-inflammatory effects by selectively inhibiting COX-2 expression and ensuing PGE2 production. Inhibition of COX-2 expression implicates COX-2 mRNA destabilisation. In addition to their cytotoxic properties, they have also been shown to have immunostimulatory properties. Each VA preparations are highly heterogeneous because oftheir chemical composition which varies depending on the time of harvest, species of host treeand manufacturing methods, together which might influence clinical efficacy of VA.Therefore I performed a comparative study involving five different preparations of VA concerning maturation and activation of dendritic cells (DCs) which in turn may manifestanti-tumoral immune response. Results showed that among all five preparations, VA Qu Spez significantly induces DC activation, secretion of pro-inflammatory cytokines such as IL-6, Il-8 and TNF-α, enhancing IFN-γ production hence promoting Th1 immune response. The orchestration of myelomonocytic cell function is a key element that links inflammation and cancer and provides a paradigm for macrophage plasticity and function. My study reveals the effect of VA Qu Spez in switching the M2 macrophages which are known to participate inpolarizing Th2 responses, help with parasite clearance, dampen inflammation, promote tissue remodelling and tumor progression and have immunoregulatory functions, towards classicallyactivated M1 macrophages which are part of a polarized Th1 response and mediate resistance13to intracellular pathogens and tumors and elicit tissue-disruptive reactions. These results together should assist in understanding the anti-inflammatory and immunostimulatory properties of VA preparations and further research is warranted to improve the therapeutic strategies of use of VA and their role as complimentary therapy in cancer.

La bactérie Pseudomonas aeruginosa (PA) est un pathogène responsable de 20%-30% des infections nosocomiales en milieu hospitalier. Pour les individus sains, elle ne présente pas de réel danger, mais pour les personnes atteintes par la mucoviscidose et les patients immunodéprimés, elle est la cause principale de mortalité et des infections pulmonaires. PA a développé des souches multi-résistantes aux antibiotiques et des nouvelles approches thérapeutiques plus efficaces sont donc nécessaires. Elle se fixe à la surface des cellules-hôtes par une interaction entre des protéines (lectines) présentes sur sa membrane et des sucres présents sur la membrane cellulaire. L’interaction lectine-sucre joue un rôle important dans l’adhésion de la bactérie puis dans la fabrication d’un biofilm pathogène.Une nouvelle approche thérapeutique consiste à créer des molécules synthétiques (glycomimes) de plus grande affinité que les sucres présents sur les cellules. Pour cela, plus de 150 glycomimes ont été synthétisés et examinés afin de trouver le meilleur candidat pour empêche le processus d'infection de bactéries. Certains d'entre eux ont été choisis et étudiés par la Microscopie à Force Atomique (AFM). Cette thèse est consacrée à l’étude des interactions lectine-glycomime et aussi cellule-bactérie par AFM. L’imagerie combinée avec la modélisation permet de comprendre le rôle du glycomime sur la géométrie des complexes créés et la spectroscopie permet de mesurer les forces d’interaction présentes lors de l’adhésion, au niveau moléculaire et cellulaire. Une réduction de l’adhésion bactérienne a été observée après l’introduction du glycomime, confirmant son rôle d’inhibiteur et la validité de toute la démarche. L’objectif ultime est l’identification des meilleurs glycomimes à introduire afin de développer de nouveaux médicaments. / Pseudomonas aeruginosa (PA) is a human opportunistic pathogen responsible for 20% -30% of nosocomial infections in French hospitals. For healthy people, it presents no real danger, but for people with cystic fibrosis disease and immune-compromised patients, it is the leading cause of mortality and lung infections. PA has developed antibiotic multi-resistant strains and new and more effective therapeutic approaches are needed. It binds to the surface of the host cells by an interaction between proteins (lectins) present on the membrane and sugars of the host-cell membrane. The lectin-sugar interaction plays an important role in adherence of the bacteria and in the manufacture of a pathogenic biofilm.A new therapeutic approach is to create synthetic molecules (glycoclusters) of greater affinity than the natural sugars present on the cells. To this aim, more than 150 glycoclusters have been synthetized and screened to find the best candidate to inhibit the bacteria infection process. Some of them have been selected and studied by Atomic Force Microscopy (AFM). In particular, this thesis is devoted to study the lectin-glycocluster and cell-bacteria interactions by AFM. The combination of AFM imaging with molecular dynamic simulations let understanding the role of the geometry of the glycoclusters on the complex formation, while AFM spectroscopy accesses the lectin-glycocluster interaction forces at the molecular and cellular levels. The reduction of bacterial adhesion has been observed upon the addition of the glycocluster. This confirms the anti-adhesive properties of the glycocluster and validates the procedure. The ultimate goal is the identification of the best glycoclusters in order to develop new drugs.

Dendritische Zellen (DCs) sind befähigt, als potenteste Antigen-präsentierende Zelle anti¬genspezifische Immunantworten zu initiieren und zu regulieren. Mittels in vivo Antigen¬beladung von spezifischen DC-Subpopulationen mit rekombinanten Antigen-gekoppelten Antikörpern gegen C-Typ-Lektinrezeptoren konnte im Mausmodell erfolgreich adaptive zelluläre und humorale Immunantworten hervorgerufen werden. Im Menschen kann dieser Ansatz therapeutisch noch nicht zum Einsatz kommen, da DC-Subpopulationen im humanen Gewebe momentan nicht ausreichend charakterisiert sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden humane Gewebe auf das Vorhandensein der im peripheren Blut beschriebenen DC-Subpopulationen (mDC-1 DCs: CD11c+BDCA1+, mDC-2 DCs: CD11clowBDCA3+ und pDCs: CD11c-CD123+BDCA2+) und die Expression von C-Typ-Lektinrezeptoren (DC-SIGN, MMR, Langerin, DCIR und DEC205) mittels Immun¬fluoreszenz untersucht. Anhand der vorge¬gebenen Marker im peripheren Blut konnten alle drei DC-Subpopulationen in der Milz, Thymus und Tonsillen detektiert werden. Zusätzlich konnte hier erstmalig eine vierte CD11c-CD123-BDCA2+ pDC-2 DC-Subpopulation in der Milz beschrieben werden, deren Funktion derzeit noch näher untersucht wird. Im Thymus konnte CD26 nach FACS-Analysen von Gordon Heidkamp als spezifischer Marker für mDC-2 DCs identifiziert und dies in der vorliegenden Arbeit auch durch Immun¬fluores¬zenzaufnahmen von Gewebeschnitten verifi¬ziert werden. CD26 stellt damit erstmalig einen Marker dar, der erfolgreich als alternativer Marker für BDCA3, welcher unspezifisch an Thrombomodulin bindet, zur Identifikation von mDC-2 DCs in der Immunfluoreszenz von Thymusproben eingesetzt werden könnte. Die getesteten Anti¬körper XCR-1 (monoklonal) und Clec9a (polyklonal) hingegen erschienen in der Immun¬fluoreszenz sowie in FACS-Analysen (Gordon Heidkamp) nicht geeignet. Weiterhin wurde die Expression ausgewählter C-Typ-Lektinrezeptoren (MMR, Langerin, DCIR, DC-SIGN und DEC205) im vorhandenen Gewebe näher betrachtet. Nach Auswertung der Immun¬fluoreszenzen konnte eine weit verbreitete Expression der untersuchten C-Typ-Lektin¬rezeptoren in humaner Milz und Thymus gefunden werden. Einzig hDCIR war auf vereinzelten Zellen exprimiert, und Langerin im Thymus nicht detektierbar. Um nicht verfügbare monoklonale Antikörper gegen C-Typ-Lektinrezeptoren zu produzieren und später Antigene an diese koppeln zu können, sollten lösliche Proteine einiger C-Typ-Lektinrezeptoren (humanes und murines Clec9a, Dectin-1 und -2, Langerin) produziert werden. Dabei gelang es bereits, lösliche Proteine der C-Typ-Lektinrezeptoren von humanem und murinem Dectin-1 zu generieren und diese zur weiteren Antikör¬per¬produktion einzusetzen.

Aus hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) können sich neben allen anderen Zellen des Immunsystems auch dendritische Zellen (DCs) entwickeln. DCs spielen eine zentrale Rolle sowohl bei der Induktion von Immunantworten als auch bei der Aufrechterhaltung peripherer Toleranz. Eine Beeinflussung von DCs zur therapeutischen Nutzung wäre wünschenswert, erfordert aber ein noch tieferes Verständnis über deren Entwicklung im humanen Organismus. Das erste Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung potentieller DC-Vorläuferzellen in humanen lymphatischen Geweben. In Immunfluoreszenzaufnahmen von Thymus, Milz und Tonsillen mit Stammzell-charakterisierenden Markern konnten sowohl die in der Literatur als „Hämatopoetisches Stammzellkompartiment“ beschriebene Zellpopulation als auch weitere Zwischenstufen der Entwicklungsreihe der HSCs detektiert werden. Als Nächstes wurde untersucht, ob die im Gewebe identifizierten CD34+ Zellen in der in vitro Kultur zu DCs differenziert werden konnten. Hierzu wurden zunächst Protokolle etabliert und weiterentwickelt, in denen CD34+ Stammzellen des Nabelschnurbluts zu DCs gereift wurden. In einem anschließenden Schritt wurde das Protokoll mit den besten Ausbeuten an DCs auf Thymuszellen angewendet. Somit gelang es, aus Thymusstammzellen eine DCSubpopulation zu generieren, die aufgrund ihrer Markerexpression den Langerhanszellen ähnelt. Auf ihnen konnten außer Langerin auch andere C-Typ Lektinrezeptoren (Clec9a, DCIR und CD205) detektiert werden. Diese Zellen sind daher interessante Ziele für Untersuchungen zur Antigenbeladung von DCs und deren Präsentation an das adaptive Immunsystem. Zur effektiven Antigenbeladung von DCs werden Antikörper gegen endozytotisch wirksame Oberflächenmoleküle benötigt. Für deren Produktion wurden im weiteren Verlauf der Arbeit His-tragende und Ig-Fusionsproteine von Clec9a, Langerin, Dectin-1 und Dectin-2 produziert, um diese zur Immunisierung und Antikörperproduktion einzusetzen. In Zukunft können diese Antikörper zur Charakterisierung verschiedenster DC-Subpopulationen und außerdem zur Antigenbeladung von DCs herangezogen werden.

<p>Extracellular matrix (ECM) creates high-resolution chemical patterns, by assembling simple molecules with nm-scale features (e.g., carbohydrates, nucleotides, amino acids) into complex structures up to micrometers and extending to even larger scales across tissues (e.g., glycans, DNA, proteins), capable of carrying out the diverse and complex cellular functions. Mimicking the complexity of such biological systems requires precise control over the chemical patterning on substrates that exhibit physiochemical properties similar to biological systems (such as hydrogels). Although hydrogels provide tunable physiochemical properties suitable for biological applications; it is a porous material where pore sizes can range from 30 nm to greater than 1000 nm. Due to this structural heterogeneity, chemical patterning below the length scale of this heterogeneity is very challenging.</p> <p>Here, we demonstrate a new assembly system for generating a nanostructured presentation of carbohydrates on the hydrogel surface. This approach is based on the striped phases assembly of functional alkanes where 1-nm resolution functional patterns are readily assembled on substrates such as highly ordered pyrolytic graphite (HOPG). In this assembly, molecules are stabilized by noncovalent interactions, including alkyl-pi interactions underlying the HOPG, van der Waals interaction between the adjacent alkyl chains, and hydrogen bonding between polar head groups. Topochemical polymerization converts internal diynes into conjugated polydiacetylenes (PDAs). PDAs can also be utilized to covalently attach the striped pattern to polyacrylamide hydrogels through free radical chemistry.</p> <p>Here, we synthesize new amphiphiles with carbohydrate headgroups (N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc), and D-glucuronic acid (GlcA)), assembled into striped phases on HOPG and covalently transfer to polyacrylamide hydrogels. GlcNAc binds to wheat germ agglutinin (WGA), a lectin that binds specifically in a multivalent fashion (dissociation constant KD in nm range) to GlcNAc. We show that GlcNAc striped phases generate highly selective interactions with wheat germ agglutinin (WGA) but do not induce specific binding with concanavalin A (another lectin molecule that does not target GlcNAc). We further demonstrate that WGA binding affinity can be modulated by shifting the position of diacetylenes that bring the polymer backbone closer to the GlcNAc, increasing the effecting local concentration of carbohydrates.</p> <p>We investigated the possibility of using sPDA for secondary functionalization with complex biological molecules (such as biotin and cRGD) to mimic the ECM composition closely. The unusual reactivity of the sPDA backbones during the covalent transfer of the striped phase monolayer to hydrogels illustrates the potential of sPDA reactivity azides. In this work, we show that the addition of substituted azide molecules to sPDA-functionalized hydrogels produces a decrease in the fluorescence of the sPDA monolayer. Since these reactions are occurring on porous hydrogel surfaces characterization using techniques such as IR or NMR is difficult. We carried out further solution-phase reactions using a soluble PDA where PDA UV-vis absorption spectra red-shift after the reaction between the PDA backbone and azide. These experiments support the hypothesis of sPDA and azide click reaction.</p>

Introduktion och syfte: Kariesutveckling influeras av faktorer hos både värd och bakterier. Men när olika individer exponeras för samma nivåer av externa riskfaktorer, är en del individer mer mottagliga för karies jämfört med andra. En förklaring skulle kunna vara olika glykosylering av glykoprotein i saliven. I denna pilotstudie undersökte vi skillnaden i nivåer av monosackariderna sialinsyra, fukos och galaktos hos personer som aldrig haft karies och personer som har/har haft karies. Syftet var även att undersöka om plackenzym kan vara en modifierare av nämnda glykoprotein.Material och metod: Två grupper, med 10 individer i varje, inkluderades i studien. Ena gruppen hade DMFT = 0 och den andra DMFT ≥ 1. Saliv och plack samlades och innehållet av bundna monosackarider (sialinsyra, fukos och galaktos) samt glykosidaser (sialidas, β-fukosidas, β-galaktosidas, α-glukosidas och N-acetylglukosaminidas) analyserades med en fluorometer. Även salivflödet kalkylerades.Resultat: Innehållet av både sialinsyra och galaktos var signifikant högre i gruppen med DMFT = 0, medan innehållet av fukos inte skilde sig åt signifikant mellan grupperna. Ingen signifikant skillnad kunde ses mellan de två grupperna avseende enzymaktivitet och salivflöde.Konklusion: Högre nivåer av bunden sialinsyra och galaktos fanns hos gruppen med DMFT = 0. Resultaten indikerar att dessa monosackarider kan vara en möjlig markör för oral hälsa. Större longitudinella studier behövs för att verifiera sambandet. / Introduction and aim: Caries development is affected by factors within bacteria and host. But when different individuals are exposed to same levels of external risk factors, some individuals are still more susceptible to caries. One explanation could be different glycosylation of salivary glycoproteins. In this pilot study, we investigated the difference in levels of the monosaccharides sialic acid, fucose and galactose between individuals with or without previous caries experience. We also aimed to investigate if plaque glycosidases could be a modifier of these glycoproteins.Material and method: Two groups, with 10 subject in each, were included in this study. One group had DMFT = 0 and the other DMFT ≥ 1. Saliva and plaque were collected and content of bound monosaccharides (sialic acid, fucose and galactose) and glycosidases (sialidase, α-fucosidase, β-galactosidase, α-glucosidase and N-acetylglucosaminidase) were detected using absorbance and fluoroscens respectively. Salivary flow rate was also measured.Results: Content of both sialic acid and galactose were significantly higher in the group with DMFT = 0, while the content of fucose did not differ significantly between the groups. No significant differences could be seen between the two groups (DMFT = 0 and DMFT ≥ 1) regarding any of the investigated glycosidases and salivary flow rate. Conclusion: Higher levels of bound sialic acid and galactose were found in the group with DMFT = 0 and the results indicate that these monosaccharides could be a possible marker for oral health. Larger longitudinal studies are needed to verify this correlation.

Les immunoglobulines intraveineuses (IVIg) constituent une préparation polyclonale d’IgG isolée et regroupée à partir du plasma sanguin de multiples donneurs. Initialement utilisé comme traitement de remplacement chez les patients souffrant d’immunodéficience primaire ou secondaire, les IVIg sont maintenant largement utilisées dans le traitement de plusieurs conditions auto-immunes, allergiques ou inflammatoires à une dose élevée, dite immunomodulatrice. Différents mécanismes d’action ont été postulés au fil des années pour expliquer l’effet thérapeutique des IVIg dans les maladies auto-immunes et inflammatoires. Entre autre, un nombre grandissant de données issues de modèles expérimentaux chez l’animal et l’humain suggère que les IVIg induisent l’expansion et augmentent l’action suppressive des cellules T régulatrices (Tregs), par un mécanisme qui demeure encore inconnu. Également, les patients atteints de maladies auto-immunes ou inflammatoires présentent souvent un nombre abaissé de Tregs par rapport aux individus sains. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels les IVIg modulent les cellules T régulatrices est requise afin de permettre un usage plus rationnel de ce produit sanguin en tant qu’alternative thérapeutique dans le traitement des maladies auto-immunes et inflammatoires. Par le biais d’un modèle expérimental d’allergie respiratoire induite par un allergène, nous avons démontré que les IVIg diminuaient significativement l’inflammation au niveau des voies aériennes ce, en association avec une différenciation des Tregs à partir des cellules T non régulatrices du tissu pulmonaire. Nous avons également démontré qu’au sein de notre modèle expérimental, l’effet anti-inflammatoire des IVIg était dépendant des cellules dendritiques CD11c+ (CDs) pulmonaires, puisque cet effet pouvait être complètement reproduit par le transfert adoptif de CDs provenant de souris préalablement traitées par les IVIg. À cet effet, il est déjà établi que les IVIg peuvent moduler l’activation et les propriétés des CDs pour favoriser la tolérance immunitaire et que ces cellules seraient cruciales pour l’induction périphérique des Tregs. C’est pourquoi, nous avons cherché à mieux comprendre comment les IVIg exercent leur effet sur ces cellules. Pour la première fois, nous avons démontré que la fraction d’IgG riche en acide sialique (SA-IVIg) (constituant 2-5% de l’ensemble des IgG des donneurs) interagit avec un récepteur dendritique inhibiteur de type lectine C (DCIR) et active une cascade de signalement intracellulaire initiée par la phosphorylation du motif ITIM qui est responsable des changements observés en faveur de la tolérance immunitaire auprès des cellules dendritiques et des Tregs. L’activité anti-inflammatoire de la composante SA-IVIg a déjà été décrite dans des études antérieures, mais encore une fois le mécanisme par lequel ce traitement modifie la fonction des CDs n’a pas été établi. Nous avons finalement démontré que le récepteur DCIR facilite l’internalisation des molécules d’IgG liées au récepteur et que cette étape est cruciale pour permettre l’induction périphérique des Tregs. En tant que produit sanguin, les IVIg constitue un traitement précieux qui existe en quantité limitée. La caractérisation des mécanismes d’action des IVIg permettra une meilleure utilisation de ce traitement dans un vaste éventail de pathologies auto-immunes et inflammatoires. / Intravenous immunoglobulin (IVIg) is a therapeutic preparation of normal human polyclonal IgG derived from pooled plasma from a large number of healthy donors. Initially used as replacement therapy for patients with primary and secondary immune deficiencies, IVIg is now also widely used for the treatment of a variety of autoimmune, allergic and systemic inflammatory disorders, at high immunomodulatory doses. The beneficial effect of IVIg in autoimmune and inflammatory diseases has been attributed to different mechanisms. Increasing evidence shows that IVIg induces expansion and enhances the suppressive function of regulatory T cells (Tregs) in different experimental animal models and human subjects, through an unknown mechanism. Human inflammatory and autoimmune diseases are known to be associated with Treg deficiency. Therefore, a more precise understanding of the mechanisms by which IVIg modulate Treg populations seems to be needed for more rational use of this compound as an alternative therapy in context of various inflammatory and autoimmune disorders. Using a robust antigen-driven model of allergic airway disease, we have demonstrated that IVIg markedly attenuates airway inflammation and this effect is associated with the induction of Tregs from non-regulatory T cells in pulmonary tissues. We have also demonstrated that the antiinflammatory actions of IVIg, in our model are dependent on a population of pulmonary CD11c+ dendritic cells (DCs), as the action of IVIg could be completely replicated by adoptive transfer of CD11c+ DCs from IVIg-treated mice. we have shown that tolerogenic DCs involve in the peripheral induction of Tregs. Given the requirement of DCs in the induction of Tregs, we explored the mechanism by which IVIg interacts and modulate these cells and for the first time demonstrated that the purified sialylated fraction of human IgG (SA-IVIg) (that consists 2-5% of whole IgG) interacts with an inhibitory C-type lectin receptor on dendritic (DCIR) and this interaction triggers an ITIM intracellular signaling cascade. This subsequently results in rendering tolerogenic activities to DCs and peripheral induction of Tregs. The anti-inflammatory activity of SA-IVIg has been shown in previous studies, but the mechanism by which it modulates DCs functions is not well understood. We also demonstrated that DCIR facilitates the internalization of IgG molecules into DC and this internalization appears to be a crucial step for induction of Tregs. IVIg is a costly therapeutic compound. Characterization of the mechanism of action of IVIg can lead to a better application of this plasma based therapy in a wide range of autoimmune and inflammatory diseases.

by Wai Ching Man. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2005. / Includes bibliographical references (leaves 154-159). / Abstracts in English and Chinese. / Statement --- p.ii / Acknowledgements --- p.iii / Abstract --- p.v / 摘要 --- p.vii / List of Abbreviations --- p.viii / Table of contents --- p.x / List of Tables --- p.xiv / List of Figures --- p.xv / Chapter Chapter 1 --- Introduction --- p.1 / Chapter Chapter 2 --- Literature review --- p.4 / Chapter 2.1 --- Plant lectins --- p.4 / Chapter 2.1.1 --- Introduction --- p.4 / Chapter 2.1.2 --- Definition and subdivision of plant lectins --- p.4 / Chapter 2.2 --- Monocot mannose-binding lectins --- p.6 / Chapter 2.2.1 --- Occurrence and carbohydrate binding specificity --- p.6 / Chapter 2.2.2 --- Molecular structure and amino acid sequence --- p.7 / Chapter 2.2.3 --- "Molecular cloning, biosynthesis and post-translational modification" --- p.10 / Chapter 2.2.4 --- Mannose-binding lectins of Family Liliaceae --- p.11 / Chapter 2.2.4.1 --- Tulipa gesneriana lectins (TGL) --- p.12 / Chapter 2.2.4.2 --- Aloe arborescens lectins (AAL) --- p.13 / Chapter 2.2.4.3 --- Polygonatum multiflorum agglutinin (PMA) and lectin-related protein --- p.14 / Chapter 2.3 --- Polygonatum odoratum lectins (POL) --- p.15 / Chapter 2.3.1 --- Isolation and purification of POL from Yu Chu --- p.15 / Chapter 2.3.2 --- Agglutinating activity and anti-viral activities of POL --- p.17 / Chapter 2.3.3 --- Bacterial expression of POL in Escherichia coli --- p.18 / Chapter 2.4 --- Plant-based production of recombinant proteins --- p.20 / Chapter 2.4.1 --- Advantages of using plants as expression system --- p.20 / Chapter 2.4.2 --- Plant-derived recombinant proteins --- p.22 / Chapter 2.5 --- Expression of heterologous proteins in rice --- p.24 / Chapter 2.5.1 --- The facts of rice --- p.24 / Chapter 2.5.2 --- Rice storage proteins --- p.25 / Chapter 2.5.2 --- Expression of lysine-rich protein (LRP)/glutelin fusion proteinin rice seeds --- p.28 / Chapter 2.5.3 --- Expression of Galanthus nivalis agglutinin in rice --- p.29 / Chapter 2.6 --- Protein trafficking in plants --- p.30 / Chapter 2.6.1 --- Golgi-dependent pathways --- p.30 / Chapter 2.6.2 --- Golgi-independent pathway --- p.32 / Chapter 2.6.3 --- Expression of protein targeting determinants in tobacco plants and suspension cells --- p.33 / Chapter Chapter 3 --- Materials and Methods --- p.35 / Chapter 3.1 --- Introduction --- p.35 / Chapter 3.2 --- Chemcials --- p.35 / Chapter 3.3 --- Bacterial strains --- p.35 / Chapter 3.4 --- Cloning of POL cDNA --- p.36 / Chapter 3.4.1 --- Plant materials --- p.36 / Chapter 3.4.2 --- RNA extraction --- p.36 / Chapter 3.4.3 --- RT-PCR amplification of POL cDNA --- p.36 / Chapter 3.4.4 --- 5'RACE and 3'RACE --- p.38 / Chapter 3.4.5 --- Sequencing of POL cDNA --- p.39 / Chapter 3.5 --- Analysis of POL protein --- p.40 / Chapter 3.5.1 --- Protein extraction and Tricine-SDS PAGE --- p.40 / Chapter 3.5.2 --- Western blot analysis --- p.41 / Chapter 3.6 --- Chimeric gene construction --- p.42 / Chapter 3.6.1 --- Construction of the Cauliflower mosaic virus (CaMV)35S promoter/POL constructs --- p.44 / Chapter 3.6.2 --- Construction of the glutelin-1 promoter/POL constructs --- p.48 / Chapter 3.6.3 --- Sequence fidelity of chimeric genes --- p.55 / Chapter 3.7 --- Expression of transgenes in rice --- p.55 / Chapter 3.7.1 --- Plant materials --- p.55 / Chapter 3.7.2 --- Agrobacterium transformation --- p.55 / Chapter 3.7.3 --- Callus induction --- p.56 / Chapter 3.7.4 --- Agrobacterium culture and rice transformation --- p.56 / Chapter 3.7.5 --- Selection and regeneration of rice callus --- p.56 / Chapter 3.7.6 --- Isolation of genomic DNA --- p.58 / Chapter 3.7.7 --- Southern blot analysis --- p.58 / Chapter 3.7.8 --- Extraction of leaf total RNA --- p.59 / Chapter 3.7.9 --- Extraction of seed total RNA --- p.59 / Chapter 3.7.10 --- Northern blot analysis --- p.60 / Chapter 3.7.11 --- Protein extraction and Tricine SDS-PAGE --- p.60 / Chapter 3.7.12 --- Western blot analysis --- p.61 / Chapter 3.8 --- Cytopathic effect (CPE) reduction assay --- p.61 / Chapter 3.8.1 --- Protein extraction --- p.61 / Chapter 3.8.2 --- CPE reduction assay --- p.62 / Chapter 3.9 --- Confocal immunofluorescence --- p.63 / Chapter 3.9.1 --- Preparation of sections --- p.63 / Chapter 3.9.2 --- Labelling of fluorescence probes --- p.63 / Chapter 3.9.3 --- Image collection --- p.64 / Chapter Chapter 4 --- Results --- p.65 / Chapter 4.1 --- Cloning of POL cDNA from Yu Chu --- p.65 / Chapter 4.1.1 --- RNA extraction and partial POL cDNA amplification --- p.65 / Chapter 4.1.2 --- 5'RACE and 3'RACE --- p.67 / Chapter 4.1.3 --- Sequencing of POL cDNA --- p.68 / Chapter 4.1.4 --- Sequences comparison of POL and Liliaceae lectins --- p.75 / Chapter 4.2 --- Occurence of POL protein in Yu Chu plant --- p.77 / Chapter 4.3 --- Constitutional expression of POL in rice --- p.79 / Chapter 4.3.1 --- Construction of Cauliflower mosaic virus 35S promoter constructs --- p.80 / Chapter 4.3.2 --- Southern blot analysis --- p.82 / Chapter 4.3.3 --- Northern blot analysis --- p.84 / Chapter 4.3.4 --- Western blot analysis --- p.85 / Chapter 4.3.5 --- Western blot analysis of 35S/POL T1 plant --- p.87 / Chapter 4.4 --- Seed-specific expression of POL in rice --- p.88 / Chapter 4.4.1 --- Construction of the glutelin-1 promoter constructs --- p.89 / Chapter 4.4.2 --- Southern blot analysis --- p.92 / Chapter 4.4.3 --- Northern blot analysis --- p.96 / Chapter 4.4.4 --- Western blot analysis --- p.101 / Chapter 4.4.5 --- Western blot analysis of POL-BP-8O and POL-α-TIP T1 transgenic plants --- p.117 / Chapter 4.5 --- Cytopathic effect (CPE) reduction assay --- p.122 / Chapter 4.6 --- Confocal immunofluorescence studies --- p.125 / Chapter Chapter 5 --- Discussion --- p.134 / Chapter 5.1 --- Cloning of POL cDNA --- p.134 / Chapter 5.2 --- Analysis of constitutional expression of POL in rice --- p.136 / Chapter 5.3 --- Analysis of seed-specific expression of POL in rice --- p.138 / Chapter 5.4 --- Localization of POL in POL-BP-8O and POL-α-TIP transgenic rice seeds --- p.146 / Chapter 5.5 --- Cytopathic effect (CPE) reduction assay --- p.148 / Chapter 5.6 --- Future prospects --- p.151 / Chapter Chapter 6 --- Conclusion --- p.153

Grundlage der vorgelegten Arbeit sind die bei der Alzheimerschen Erkrankung beobachtbaren pathologischen Merkmale, wie die progressive Akkumulation von β-Amyloid-Plaques, cholinerger Dysfunktion und zerebrovaskuläre Abnormalitäten. Die in englischer Sprache verfasste Dissertation ist eine tierexperimentelle Studie, die versucht, den Zusammenhang von β-Amyloid, cholinerger Neurotransmission und zerebralem Gefäßsystem bei der Alzheimerschen Erkrankung näher zu charakterisieren. An Hirnmaterial aus der transgenen Maus Tg2576, die die schwedische Mutation des humanen Amyloidpräkursorproteins als Transgen trägt und ab dem 10. Lebensmonat durch humane β-Amyloid-Plaqueablagerungen in der Hirnrinde imponiert, wurden im Altersverlauf (4 bis 18 Monate) immunhistochemische Untersuchungen zur morphologischen Integrität der zerebralen Mikrogefäße, der kortikalen cholinergen Nervterminalen und der intrazerebralen cholinergen neurovaskulären Innervation durchgeführt. Am somatosensorischen Kortex werden beispielhaft die Expression des Glukosetransporters 1 oder Solanum tuberosum Lektin als Kapillarmarker und des vesikulären Acetylcholintransporters als Marker für cholinerge Fasern mittels Immunfluoreszenz und Laser-Scanning Mikroskopie erfasst, einer semiquantitativen Computer-gestützten Bildanalytischen Auswertung unterzogen und mit dem Ausmaß der kortikalen Plaquebeladung korreliert. So konnte gezeigt werden, dass die Dichte der Blutgefäße und cholinergen Fasern im somatosensorischen Kortex von transgenen Tieren mit dem Alter im Vergleich zu nichttransgenen Kontrolltieren abnimmt, was mit einer Reduktion der perivaskulären cholinergen Innervation einhergeht. Die erhobenen Befunde stützen die von J.C. de la Torre und T. Mussivand schon im Jahre 1993 formulierte „vaskuläre Hypothese“, wonach bei der sporadischen Form der Alzheimerschen Erkrankung alters- und Lebensstil-bedingte Schädigungen des zerebralen Gefäßsystems eine zentrale Rolle bei der Manifestierung der Erkrankung spielen.

科学研究費補助金 研究種目:総合研究(A) 課題番号:03304050 研究代表者:村松 喬 研究期間:1991-1993年度