Orientador: Selma Giorgio / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-29T02:26:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barao_SandraCristina_M.pdf: 8260414 bytes, checksum: 7031af0c856aceaf69b2b015a15b8ea6 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: A capacidade imunoestimulatória dos ribonucleosídeos sintéticos com substituições nas posições 7 e/ou 8 foi comprovada em experimentos in vitro e tratamentos experimentais. Diante da evidência de que os parasitas do gênero Leishmania infectam macrófagos, possuindo um complexo mecanismo de escape e, não raro, os tratamentos convencionais são ineficientes, o objetivo deste trabalho foi testar a possibilidade da utilização do ribonucleosídeo 8-Bromo-Guanosina (8BrGuo) no tratamento da leishmaniose utilizando o modelo murino. Testes in vitro comprovaram que este composto ativa macrófagos murinos infectados com formas amastigotas de Leishmania (L.) amazonensis, diminuindo a infecção em cerca de 70%. Também foram realizados experimentos in vitro com o objetivo de avaliar o mecanismo de ação deste composto na ativação de macrófagos e destruição dos parasitas. Foi analisada a produção de nitrito, um subproduto do óxido nítrico, composto com capacidade oxidativa e tóxica a microrganismos. Para os testes in vivo, com camundongos de linhagem isogênica CBA/J, utilizamos diferentes vias de inoculação e apresentação de 8BrGuo, sendo que o processo mais eficiente e menos agressivo foi o intraperitoneal e a melhor resposta foi em solução utilizando Tween 80® como adjuvante. Paralelamente, investigamos as dosagens de 8BrGuo, sendo que algumas mostraram resultados estatisticamente significativos relacionados à diminuição da infecção. Observamos que o composto mostrou toxicidade nas doses mais elevadas. Mas análises histológicas mostraram que o composto 8BrGuo não provocou alterações teciduais hepáticas e renais 24 horas após o tratamento, nem após 60 dias. Testes bioquímicos de enzimas sangüíneas (transaminase glutâmico pirúvica e transaminase glutâmico oxaloacética), creatinina e hemograma completo mostraram-se normais quando comparados a animais controles. Podemos afirmar, inicialmente, que existe a possibilidade de tratamento da leishmaniose com a 8BrGuo. Contudo ainda há necessidade de maiores avaliações deste composto quanto aos comportamentos farmacocinéticos e farmacodinâmico / Abstract: Immunostimulatory ability of nucleosides substituted in either C8 or C8 and N7 positions has been tested in experimental in vitro treatments. Species belonging to the Leishmania genus parasitize macrophages displaying complex immune mechanism of escape, and treatments of leishmaniasis is often inefficients. The aim of this project was to test the 8BromoGuanosine (8BrGuo) in the treatment of cutaneous leishmaniasis in a murine model. The first tests confirmed that 8BrGuo ativated murine macrophages infected with Leishmania (L.) amazonensis amastigotes in vitro leading to 70% of infection reduction. In order to study the action mechanism of 8BrGuo in the parasite destruction inside the macrophages, another in vitro experiments were carried out, such as the production of nitrite, a subproduct of niric oxide, a powerful oxidative and toxic compound for microrganisms. These results encourage us to continue the investigations with 8BrGuo and isogenic mice CBA/J were for in vivo tests. Different administration routes of 8BrGuo were evaluated and the intraperitoneal route showed to be the most efficient and less agressive to the animals tested. Treatment with 8BrGuo and Tween® as na adjuvant led to statistically significant decrease of L. (L.) amazonensis lesions. Although the drug presented animal toxicity at high doses, at concentrations of 8BrGuo used in the present work it was not observed tissue damages in liverand kidney from treated CBNJ mice. Our results suggest that 8BrGuo induced a therapeutic effect during the leishmaniasis infection in murine model. Future studies concerning time assimilition, half time, elimination, and degradation of 8BrGuo will provide additional clues for the function and potential use of this compound as a therapeutic agent against leishmaniasis / Mestrado / Mestre em Parasitologia

Orientador: Selma Giorgio / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T22:39:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_WagnerWelberArraisda_M.pdf: 3615109 bytes, checksum: 4ad56b306a1d94d293f6c223070386d6 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: As infecções, em geral, provocam mudanças na pressão parcial de oxigênio tornando o microambiente tecidual hipóxico (oxigenação diminuída). O fluxo sangüíneo alterado, a isquemia e a proliferação de células e microrganismos infectantes são alguns dos fatores responsáveis pela hipóxia associada às infecções. Os macrófagos se adaptam a ambientes hipóxicos, alterando o metabolismo, a produção de linfocinas pró-inflamatórias e as atividades exo, endo e fagocíticas. A lesão causada pelo parasita Leishmania amazonensis tem as características que levam a hipóxia tecidual, como a presença de um grande número de amastigotas em divisão, a migração de células inflamatórias, as infecções secundárias com bactérias aeróbicas e anaeróbicas e as mudanças no fluxo sangüíneo tecidual. Assim, analisamos neste trabalho o papel da hipóxia no modelo in vitro da infecção com L. amazonensis e investigamos os possíveis mecanismos de reversão deste ambiente na evolução da lesão na leishmaniose murina, utilizando a terapia com oxigênio hiperbárico. A cultura de macrófagos J774 incubada com amastigotas em ambiente hipóxico (5% de O2) apresentou diminuição da porcentagem de células infectadas quando comparada ao controle normóxico, mas manteve o mesmo percentual de infecção ao ser ativada com gIFN e LPS e não apresentou na produção de nitrito. O tratamento com oxigênio hiperbárico em formas promastigotas e amastigotas inibiu o crescimento e a diferenciação celular. Camundongos BALB/c tratados com oxigênio hiperbárico (1h/dia, 2,5 ATA e 100% de 02) mostraram uma significativa diminuição do tamanho da lesão. Houve diminuição do processo edematoso e conseqüente melhora do fluxo sangüíneo local, mas ocasionou um precoce comprometimento sistêmico com diminuição da sobrevida dos camundongos tratados. Concluímos que a hipóxia é um importante estimulador/ativador de macrófagos e que a restrição de O2 resulta em uma produção deficiente de nitrito, mas não impede que as células restrinjam a infecção com L. amazonensis. Os mecanismos pelos quais os macrófagos matam os amastigotas não são ainda conhecidos, mas podemos sugerir uma ação independente de NO, como, por exemplo, o aumento da atividade lisossomal. Sugerimos também que a HBO favoreceu a metástase, apesar da significativa melhora no fluxo sangüíneo da área lesionada, propiciando futuros estudos sobre o efeito adjuvante do oxigênio hiperbárico com drogas anti-parasitárias no modelo murino da leishmaniose e de outros parasitas / Abstract: Infections can cause the formation of hypoxic areas (low PO2). The altered blood flow, isquemia, cell proliferation and the presence of microorganisms causes hypoxia in injured tissues. Macrophages adapt to the presence of hypoxia and alter their metabolism, pro-inflammatory lymphokines production and phagocytosis activity. Lesions induced by Leishmania amazonensis are characterized by a large number of amastigotes, inflammatory cells migration, secondary infection with anaerobic and aerobic bacteria and altered tissue blood flow which can cause chronic areas of hypoxia. We have analyzed the effect of hypoxia on L. amazonensis in vitro and in vivo models and also studied the effect of hyperbaric therapy on murine leishmaniasis. The murine 1774 macrophages cultures infected with L. amazonensis amastigotes under hypoxic conditions (5% Oz) showed a decrease in the number of infected cells compared with cell cultures infected in normoxia (21% O2). However macrophage cultures activated with gamma-interferon and bacterial lipopolisaccharides showed the same percentage of infected cells compared with non stimulated macrophages in hypoxia and, no significant nitrite production. Hyperbaric treatment inhibited the growth and differentiation of L. amazonensis promastigotes and amastigotes. In addition BALB/c mice infected with L. amazonensis and treated with hyperbaric therapy (1 hour/day, 2.5 ATA, 100% O2) showed a significant decrease of lesions size. We also observed a decreased of the edematous process, an improvement of local blood flow, and early metastasis. Taken together our results provided evidences that hypoxia is an important stimulator/activator factor for L. amazonensis killing macrophages and also that hyperbaric therapy can be tested as an adjuvant therapy with anti-leishmanial drugs / Mestrado / Mestre em Parasitologia

Orientador: Sergio de Albuquerque / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T06:13:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pontin_Karina_M.pdf: 6476173 bytes, checksum: 9da9eec541d3c0baf96a68556e8352c7 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Os antimoniais são atualmente as drogas de escolha para o tratamento da Leishmaniose, porém apresentam problemas como uma grave toxicidade e situações de resistência parasitária. Muitos autores vêm averiguando a possibilidade dos produtos de origem vegetal e animal desempenharem importante papel na terapêutica desta enfermidade, promovendo uma menor toxicidade e custo inferior. No presente trabalho foi avaliada a atividade leishmanicida de um extrato da própolis, produto apiterápico, e de um bioterápico, medicamento homeopático, sobre as formas promastigotas e amastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis, por meio de ensaios in vitro, e in vivo por meio do tratamento em animais Mus musculus experimentalmente infectados pelo parasita. Pelas observações decorrentes dos ensaios in vitro, a própolis apresentou sobre as formas promastigotas porcentagem de lise e valor de coeficiente de inibição (IC50) melhores, quando comparados com o controle positivo (anfotericina B). Tanto o bioterápico quanto a própolis não apresentaram resultados satisfatório sobre as formas amastigotas. Nos ensaios in vivo, durante os 90 dias de tratamento com os compostos em análise, foi verificada a variação do diâmetro médio das lesões dos camundongos Afus musculus infectados com L. (V.) braziliensis, observando uma diminuição no tamanho das lesões. Ambos os compostos apresentaram resultados favoráveis em relação ao controle negativo (solução de cloreto de sódio à 0,9%). Sabendo-se da importância da produção do óxido nítrico (NO) para o controle da infecção sobre diversos parasitas intracelulares, foi avaliada a capacidade de indução de NO pela própolis e pelo bioterápico, observando uma indução significativa apenas no caso da própolis. Tais achados são animadores para uma pesquisa mais aprofundada em relação a estes diferentes tipos de medicamentos, corno por exemplo, a caracterização química e o isolamento do princípio ativo da própolis, responsável pela atividade biológica, e a comprovação e padronização da metodologia homeopática no processo de inativação do bioterápico, a fim da melhoria da ação terapêutica / Abstract: Nowadays antimonials have been the drugs chosen for the Leishmaniosis treatment. Nevertheless, they have shown problems such as high toxicity and some parasite resistance occurrences. Many researchers have investigated the possibility that products from animal and vegetal origin may play an important role in the therapeutics of this disease, with less toxicity and lower prices. This work evaluates the leishmanicyd activity of propolis extract, an apitherapic product, and also of a biotherapic homeopathic drug over the Leishmania (Viannia) braziliensis promastigote and amastigote forms, through in vitro and in vivo assays by means of Mus Musculus animals treatment, which were experimentally infected. Resulting trom the in vitro assays, propolis revealed a better lysis percentage and inhibition coefficient (IC 50) over the promastigote forms when compared to positive control (anphotericin B). Both the biotherapic drug and propolis extract did not show reasonable results over amastigote fonns. Regarding to the in vivo assays, during a 90-day-treatement, a variation of the lesion mean diameter of the Mus Muscu/us mice infected by L.(V.) braziliensis was observed, there was a reduction in the lesion size. Both drugs showed good results in respect to negative control (0.9% saline solution). Being aware of the importance of NO production to control the infection on several intracellular parasites, the capacity of inducting NO production was evaluated using both propolis and biotherapics. An expressive induction was observed only concerning propolis. Such find encourages a further research on those drugs, for instance, the chemical characterization and the isolation of propolis active principles, responsible for its biological activity, as well as the standardization of homeopatic methodologies in the biotherapic inactivation with the pourposes of a better therapeutic drug action / Mestrado / Mestre em Parasitologia

Orientadores: Susanne Rath, Jarbas Jose Rodrigues Rohwedder / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-03T21:55:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Trivelin_LucianoAugusto_M.pdf: 3680129 bytes, checksum: 552275ff64fd086a07c86571842e7dc9 (MD5) Previous issue date: 2003 / Mestrado

Orientador: Selma Giorgio / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:13:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Colhone_MarcelleCarolina_M.pdf: 3874270 bytes, checksum: b5d79e5cde6aed06f67783a5f55086f1 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: o fluxo sangüíneo alterado, isquemia, proliferação celular e a presença de microrganismos resultam em queda acentuada de pressão parcial de oxigênio (hipóxia) no tecido lesado. Macrófagos se adaptam a hipóxia, alterando seu metabolismo, produção de linfocinas pro-inflamatórias e atividade fagocítica. No presente trabalho comparamos os efeitos da hipóxia (5% de O2) e da normóxia (21 % de 02) na infecção de macrófagos com o protozoário parasita Leishmania amazonensis. Macrófagos de duas diferentes origens (linhagem celular murina 774 e macrófagos peritoneais murinos) expostos a hipóxia mostraram redução na porcentagem de células infectadas e no número de parasitas intracelulares por célula. A cinética da infecção indicou que a hipóxia não deprime a fagocitose de L. amazonensis, mas induz macrófagos a reduzirem o parasitismo intracelular. Além disso, a. hipóxia não age sinergicamente com interferon gama (lFN-y) elipopolissacarídeo (LPS) em macrófagos para induzir morte do parasita. Experimentos também demonstram ausência de correlação entre a produção de óxido nítrico e o controle da infecção em macrófagos sob condições hipóxicas. Proteínas do choque térmico de 70kDa (HSP70) é induzida por hipóxia em muitos tipos de células e contribui para sua sobrevivência durante exposição a condições hipóxicas. Análises da expressão de HSP70 em linhagem celular murina J774, expostas à hipóxia, mostram uma notável redução na expressão de HSP70. Macrófagos infectados com L. amazonensis também reduziram a expressão de HSP70. Macrófagos infectados com amastigotas de L. amazonensis sob condições hiperbáricas (HBO) (2 horas, 2,5 ATA, 100% 02) apresentaram significativa redução na porcentagem de células infectadas e no número de parasitas intracelulares por células. Todos os resultados fornecem evidências de que a hipóxia, que ocorre em várias condições patológicas, e a HBO, podem alterar a susceptibilidade de macrófagos a infecção com Leishmania / Abstract: The altered blood flow, isquemia, cell proliferation and the presence of microorganisms cause hypoxia (low pO2) in injured tissues. Macrophages adapt to hypoxia and alter their metabolism, pro-inflammatory Iymphokines production and phagocytosis activity. In the present study we compared the effect of 5% oxygen tension (hypoxia) and a normal tension of 21 % oxygen (normoxia) on macrophage infection by the protozoan parasite Leishmania amazonensis. Macrophages from two different sources (murine cell line J774 and murine peritoneal macrophages) exposed to hypoxia showed a reduction of the percentage of infected cells and of the number of intracellular parasites per cell. The kinetic of infection indicated that hypoxia did not depress L. amazonensis phagocytosis but induced macrophages to reduce intracellular parasitism. Furthermore, hypoxia did not act synergistically with gamma interferon (IFN-y) and bacterial lipopolisaccharides (LPS) in macrophages to induce parasite killing. Experiments also indicated no correlation between nitric oxide production and control of infection in macrophages under hypoxic condition. Heat shock protein 70 (HSP70) is induced by hypoxia in the most of mammalian cell types and contributes to their ability to survive during hypoxic episodes. Analyses of the Hsp70 in murine cell line J774 exposed to hypoxia indicated a notable reduction in HSP70 expression. Macrophages infected with L. amazonensis also showed a reduction in HSP70expression. Macrophages infected with L. amazonensis amastigotes under hyperbaric condition (HBO) (2 hours, 2,5 ATA, 100% 02) showed a significant decrease of the percentage of infected cells and number of intracellular parasites per cell. Taken together our results provided the first evidence that hypoxia, which occurs in various pathological conditions, and HBO treatment, can alter macrophage susceptibility to a parasite infection / Mestrado / Mestre em Parasitologia

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:30:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8091_1.pdf: 1744575 bytes, checksum: 7a2b6fdff1816c5aee4d1fc22f03208f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / A leishmaniose visceral americana (LVA) é uma protozoose sistêmica que acomete pessoas de ambos os sexos e predomina em menores de 15 anos de idade. O diagnóstico fundamentase nos dados clínicos, na epidemiologia, na visualização microscópica do parasito em aspirados teciduais (com sensibilidade variável), nos testes sorológicos (que apresentam limitações) e, mais recentemente, na reação em cadeia da polimerase (PCR). Com o objetivo de testar a validade da PCR no diagnóstico da LVA, 162 indivíduos admitidos no hospital Hospital Escola Dr. Hélvio Auto (HEHA) em Maceió-Alagoas, com hipótese de diagnóstico de LVA foram incluídos no estudo 56,2% do sexo masculino e 43,8% do sexo feminino, com idades entre quatro meses a 66 anos, (média de 13 e mediana de 8,5 anos); 65,4% de procedência rural e 34,6% urbana. A doença foi confirmada em 104 casos (64,4%), dos quais 55,8% eram do sexo masculino e 44,2% feminino, com idades variando entre 7 meses e 66 anos, (média de 12,9 e mediana de 9,5 anos). O aspirado medular, obtido em 99 dos 104 casos, foi submetido à microscopia óptica. Amastigotas de Leishmania foram identificadas em 86 (87%) dos pacientes. Em 13 (13%) pacientes, nos quais não foram encontrados parasitos no aspirado medular, pela microscopia óptica, e em cinco que não fizeram esse exame, o diagnóstico fundamentou-se no quadro clínico e na resposta favorável ao tratamento. A maioria, 89,4% foi tratada com N-metilglucamina; 2,8% receberam apenas anfotericina B e 7,7% iniciaram o tratamento com antimonial, sendo substituído, posteriormente, por anfotericina B. Durante o estudo, quatro pacientes faleceram: dois em decorrência da própria doença e os demais por falta de resposta ao tratamento com glucantime e a anfotericina B. A PCR foi processada em amostras de sangue medular e periférico em pacientes com e sem LVA, avaliando, assim, a sensibilidade e especificidade do teste e sua concordância com a microscopia óptica. A PCR foi positiva em sangue medular de 100% dos pacientes com parasitos à microscopia óptica e em 61,5% dos que não foram observados parasitos. A concordância entre a visualização ou não do parasito no aspirado medular e a PCR ser positiva foi considerada sofrível (Kappa=0,41). Comparando-se os resultados da PCR obtidos nos aspirados da medula com os do sangue periférico, a concordância foi considerada ótima (Kappa=0,88). Indivíduos doentes e não-doentes de LVA tiveram o sangue aspirado da medula e o sangue periférico processado pela PCR. O teste foi positivo em todos os aspirados medulares dos doentes e em 58,5% dos que não tinham a doença, ficando a especificidade em 41,5%. No sangue periférico, o teste foi positivo em 96,7% dos doentes e em 59,2% dos não doentes. Para avaliar a utilidade da PCR como critério de cura, 30 pacientes tiveram o sangue periférico processado pela PCR, antes e ao término da medicação; somente 10% tornaram-se negativos ao fim do tratamento. Esses pacientes foram tratados com N-metilglucamina, exceto um, que teve o antimonial substituído por anfotericina B. O fígado e o baço foram medidos na admissão e ao término do tratamento; ocorrendo redução com significância estatística (pfígado e pbaço = 0,000) quando submetido ao teste T pareado. Por sua elevada sensibilidade, tanto no sangue medular como periférico, sugere-se que a PCR poderá ser usada como teste diagnóstico auxiliar, nos casos suspeitos de LVA, nos quais a microscopia seja negativa. Nesse estudo a PCR não se mostrou útil como critério de cura na avaliação dos pacientes

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2016 / Made available in DSpace on 2016-09-20T04:12:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 340464.pdf: 31475017 bytes, checksum: 76e8a2f3169647c7c80919f63f656d3f (MD5) Previous issue date: 2016 / Em poucas áreas da economia o Brasil pode desempenhar papel tão destacado quanto no uso sustentável e inteligente do potencial de sua biodiversidade. As plantas medicinais sempre foram objeto de estudo, buscando-se novas fontes para obtenção de princípios ativos, responsáveis por sua ação farmacológica ou terapêutica. Jungia sellowii é uma planta endêmica brasileira que tem suas raízes utilizadas para distúrbios digestivos, porém permanece pouco explorada e conhecida cientificamente. Com o intuito de promover a investigação fitoquímica da espécie para avaliação da atividade biológica in vitro dos componentes majoritários, o extrato bruto das raizes foi submetido a sucessivos procedimentos cromatográficos. Dos quais foi possível purificar e caracterizar 10 substâncias, sendo dois esteroides; o ß-sitosterol e o estigmasterol; um derivado do ácido cafeico, o cafeato de etila; sete terpenóides dos quais cinco são derivados da mesma via metabólica sendo eles a perezona, o a e ß- piptizóis, a diperezona, a curcuhidroquinona-O-ß-Glicopiranosideo; dois derivados do linalol e ácido jungico. Todas as substancias estão sendo descritas pela primeira vez para a espécie e a curcuhidroquinona-O-ß-Glicopiranosideo uma substancia nova, além do derivado trixano ter sido isolado pela primeira vez de fonte natural. A avaliação da atividade leihmanicida in vitro em promastigotas de L. infantum, L. donovani e L. amazonenses da fração Butanol mostrou na dose de 500µg/mL uma porcentagem de inibição de 73%, 60% e 72% respectivamente. Contudo a substancia majoritária curcuhidroquinona-O-ß-Glicopiranosideo apresentou atividade somente contra L. amazonenses sugerindo um efeito sinérgico de outras substancias presentes na fração responsáveis pela atividade. Já a perezona apresentou potente atividade leishmanicida contra amastigotas de L. amazonenses Com uma IC50 de 6,28 ±0,14 µM. Os resultados obtidos ressaltam a importância do estudo fitoquímico e o potencial biológico de Jungia sellowii. <br> / Abstract : In a few areas of the economy Brazil can play a role as prominent and sustainable as the use of the potential of its biodiversity. Medicinal plants have always been the focus of many studies, as sources for active principles responsible for their pharmacological or therapeutic action. Jungia sellowii is a Brazilian endemic plant and has its roots are used for digestive disorders, but remains poorly explored and unknown scientifically. In order to promote the phytochemical research of the specie and to evaluate the biological activity in vitro of it s major components, the crude extract of the roots was subjected to successive chromatographic procedures. Of which was possible to purify and characterize 10 substances, two steroids ß-sitosterol and stigmasterol; a derivative of caffeic acid, ethyl caffeate; seven terpenoids five derived from the same metabolic pathway: perezone, a and ß- piptizols, diperezone and curcuhydroquinone-O-ß-glucopyranoside; two derivatives of linalol, and jungic acid. All substances were described for the first times in the species, curcuhydroquinone-O-ß-glucopyranoside a new substance, and the trixane derivative was isolated for the first time from natural source. The evaluation of the in vitro activity leishimanicid against promastigotes of L. infantum, L. donovani and L. amazonenses of the butanol fraction showed inhibition percentage of 73%, 60% and 72%, respectively. Curcuhydroquinone-O-ß-glucopyranoside the majority substance was active only against L. Amazonensis, suggesting a synergistic effect of other substances present in the fraction responsible for the activity. And perezone has show potent leishmanicid activity against amastigotes of L. amazonenses with an IC50 of 6,28 ±0,14 µM. The results highlight the importance of phytochemical study and the biological potential of J. sellowii.

Orientador: Maria Isabel Nogueira Cano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T02:11:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Conte_FabioFrangiotti_M.pdf: 8161172 bytes, checksum: ff9bc4f07d1c0552b0c3a7af62e238c2 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Os telômeros são complexos de DNA e proteínas que protegem os cromossomos eucarióticos da degradação e fusão terminais, garantindo a estabilidade genômica. As seqüências teloméricas são ricas em guaninas e na maioria dos eucariotos terminam em uma protrusão 3' simples fita denominada de "3'G-overhang". As seqüências adjacentes aos telômeros constituem a região subtelomérica, a qual em Leishmania spp., diferentemente de Trypanosoma cruzi, T. brucei e Plasmodium falciparum, não contém genes que codificam antígenos de superfície. Fu & Barker (1998) caracterizaram essa região em diferentes espécies do gênero Leishmania e verificaram que a mesma possui blocos de uma sequência de 100 pb conhecida como "Leishmania Conserved Telomere Associated Sequences" (LCT AS), a qual aparece flanqueada por repetições teloméricas. Há dois blocos de seqüências conservadas (CSBl e CSB2) que fazem parte das LCTAS e que têm diferente organização e número de cópias na região subtelomérica (Fu & Barker, 1998). Devido ao alto grau de conservação das seqüências desses elementos, sugere-se que estes desempenhem função importante no processo de segregação dos cromossomos e que possam conter sítios para ligação de proteínas do complexo telomérico. O intuito principal deste projeto de Mestrado foi estudar a organização genômica de seqüências da região teloméricalsubtelomérica de Leishmania amazonensis. A partir dos resultados dos "Southem blottings" e dos ensaios de cinética de digestão com a exonuclease Bal31 foi possível estimar que os Fragmentos de Restrição Terminais (TRF "Terminal Restriction Fragments") de L. amazonensis possuem aproximadamente 3,3 kb e que o tamanho médio dos telômeros varia de 0,2 a 1,0 kb. Além disso, as hibridizações com as seqüências CSBl e CSB2 das LCTAS revelaram que esses domínios aparecem como blocos de 0,2 a 1,6 kb, flanqueados por sítios HaeIII, e que CSB 1 e CSB2 encontram-se em menor número de cópias em relação à seqüência telomérica. Demonstrou-se também que há sítios HinjI presentes nas regiões subteloméricas da maioria dos cromossomos, assim como sítios AfaI em posição distal e próximos ao término dos cromossomos. Utilizando-se "Southem blotting" não denaturante, estimou-se o tamanho e a seqüência da protrusão "3'G-overhang" dos cromossomos de L. amazonensis. Essa estrutura possui 2: 12 nucleotídeos e difere das outras espécies do gênero Leishmania por apenas três nucleotídeos na extremidade 3' . Para confirmar os resultados acima, realizou-se a hibridização com as seqüências telomérica e subteloméricas dos cromossomos de L. amazonensis separados por PFGE. Os cromossomos foram separados em 25 bandas coradas com brometo de etídeo com pesos moleculares variando de 0,35 2: 3,0 Mb. Todas as bandas hibridizaram com as seqüências telomérica e subtelomérica, indicando que as mesmas são moléculas lineares. Os experimentos de PFGE em segunda dimensão foram usados com o objetivo de se analisar a organização dessas seqüências nos cromossomos e demonstraram que a maioria dos telômeros de L. amazonensis são polimórficos em tamanho. Um modelo hipotético para essa organização foi proposto. Os ensaios de "Electrophoretic Mobility Shift Assay" (EMSA) e "UV cross-linking" foram utilizados para identificar proteínas formadoras de complexos com os elementos subteloméricos conservados e com a repetição telomérica na forma de dupla-fita. Resultados preliminares demonstraram a existência de três complexos DNA-proteína denominados LaCIF para "Leishmania CSB2 Interacting Factor" e LaTAFI-2 para "Leishmania Telomere Associated Factor 1 and 2". Todos os complexos foram formados com proteínas presentes em extratos S1OO e nuclear e com sondas na forma de dupla-fita. Nenhum complexo foi formado quando se utilizou a seqüência CSB 1 como sonda. Os resultados obtidos neste projeto, apesar de preliminares, poderão contribuir para uma maior compreensão sobre a organização estrutural e sobre a composição da cromatina na região teloméricalsubtelomérica de L. amazonensis, o principal agente etiológico da leishmaniose cutânea e cutâneo-difusa no Brasil / Abstract: Telomeres are protein-DNA complexes that protect eukaryotic chromosomes from degradation and end fusions, ensuring genomic stability. The telomeric sequences are guanine-rich and in most eukaryotes telomeres end as "3'G-overhangs". The subtelomeric region is adjacent to telomeres and in Leishmania spp., unlike Trypanosoma cruzi, T. brucei and Plasmodium falciparum, does not contain sequences encoding for surface antigens. Fu & Barker (1998) have characterized this region in different species ofthe genus Leishmania and verified that it is formed by blocks of 100 bp sequences named "Leishmania Conserved Telomere Associated Sequences" (LCTAS). LCTAS are flanqued by telomeric repeats and contain two conserved sequence elements, CSB 1 and CSB2, which differ in organization and distribution (Fu & Barker, 1998). Due to the high degree of sequence conservation between CSBl and CSB2 the authors sugested that these subtelomeric domains may play important role in the process of chromosome segregation and that they could harbor binding sites for telomeric proteins. The main goal of this project was to study the genomic organization of telomeric/subtelomeric sequences of Leishmania amazonensis. From the results obtained with Southem blottings and exonuclease Bal31 treatment it was possible to estimate that the length of Terminal Restriction Fragments (TRF) of L. amazonensis is about 3.3 kb and that telomeres range in size from 0.2 to 1.0 kb. Using the same approaches it was also possible to observe that CSB 1 and CSB2 subtelomeric elements are organized as segments of 0.2 to 1.6 kb, flanqued by HaeIlI sites, and that they are present in lower copy number than the telomeric sequence. It was also possible to demonstrated most of Leishmania amazonensis chromosomes contain HinjI and AfaI sites at subtelomeric positions and that AfaI sites are located at a more distal position in relation to the center of the chromosome. Using non-denaturing Southem blotting it was possible to estimate the sequence and size of the 3' G-overhang in L. amazonensis chromosomes. These structures are about _ 12 nucleotides long and differ from other species of Leishmania by only three nucleotides at the 3' end. To confirm the above results, L. amazonensis chromosomes were separated by Pulsed Field Gel Electrophoresis and hibridized with telomeric and subtelomeric sequences. The results showed that, under our standard conditions, all L. amazonensis chromosomes can be separated in a unique gel as 25 ethidium-bromide bands whose molecular weights vary from 0.35 - _ 3.0 Mb. All ofthese bands hybridized with the telomeric and subtelomeric sequences, indicating that they are linear molecules. PFGE in second dimension was used to analyse the organization of these sequences at the chromosome leveI and demonstrated that most of L. amazonensis telomeres are polimorfic in size. A hypothetical model for this organization was proposed. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) and UV cross-linking were used to identify protein forming-complexes with the conserved subtelomeric elements and with the telomeric repeat in double-stranded formo Pre1iminary results demonstrated the existence of three protein-DNA complexes named LaCIF for "Leishmania CSB2 Interacting Factor" and LaTAFI-2 for "Leishmania Telomere Associated Factor 1 and 2". AlI complexes were formed with proteins present in S100 and nuclear extracts and with the oligoprobes in double-stranded form. No complex was formed when the assays were done with CSB 1 as the oligoprobe. The results obtained in the present work, although in part preliminary, will contribute to a better understand of the estructural organization of the chromosome terminus and the composition of the chromatin in the telomeric/subtelomeric region of L. amazonensis, the main ethiologic agent of cutaneous leishmaniasis in Brazil / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador : Yuji Takahata / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-18T06:36:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_MariaCristinaAndreazza_M.pdf: 6558233 bytes, checksum: f57d332d0bfa82368a70bdadcf3b5fa5 (MD5) Previous issue date: 1993 / Mestrado

A leishmaniose tegumentar americana (LTA), uma das formas clínicas das leishmanioses, está em expansão no Brasil e representa importante causa de morbidade para populações residentes em áreas endêmicas. Avaliações do perfil epidemiológico, dos serviços de diagnóstico e tratamento são necessárias para o estabelecimento de estratégias de controle da doença, assim como o emprego de novas ferramentas laboratoriais, como a PCR. Neste trabalho foram avaliados os aspectos epidemiológicos, de diagnóstico e tratamento de pacientes com LTA de diferentes regiões de Minas Gerais, além do uso de diferentes técnicas de extração de DNA e de iniciadores na PCR para a identificação e diferenciação do agente etiológico. Adicionalmente, foi comparada a positividade dos iniciadores dirigidos para a região conservada (150/152) e variável (13Y/13Z) do minicírculo do kDNA de Leishmania em amostras biológicas de pacientes sugestivos para LTA. Foi realizado levantamento epidemiológico, de diagnóstico e tratamento de 824 pacientes portadores de LTA, sendo 261 da região sul e sudoeste do estado de Minas Gerais (SSMG) e 563 do Vale do Rio Doce (VRD). Os dados foram obtidos através das fichas de notificação das Gerências Regionais de Saúde (GRS) do SSMG e do ambulatório de Leishmanioses “Dr. Paulo Araújo Magalhães” de Caratinga (VRD) entre 2002 e 2006. Trinta e nove pacientes com lesões sugestivas para LTA, provenientes destas regiões foram submetidos a exames laboratoriais, além da PCR. As amostras de DNA foram extraídas por aquecimento, pela técnica do fenol/clorofórmio, proteinase K e kit Wizard, e posteriormente usadas na PCR e PCR-RFLP. No período analisado, foi observada diminuição de 59,7% dos casos de LTA no SSMG e de até 25,7% no VRD. A forma clínica cutânea foi a predominante, com 91,9 e 93,6% no SSMG e VRD respectivamente. No SSMG, a maioria dos pacientes (51,7%) tem residência urbana, enquanto que no VRD a rural foi predominante (95,7%). No SSMG houve positividade em 55,6, 10,7 e 19,5% dos casos de LTA no Teste de Montenegro (TM), nos exames parasitológico e histopatológico, respectivamente. No VRD a positividade dos casos de LTA foi de 84,0 no TM e 73,0% no exame parasitológico. A alta por cura com a medicação empregada variou de 71,8 a 92,0% no SSMG e chegou a 78,0% no VRD. Dos 39 pacientes sugestivos, 32 foram confirmados para LTA. As extrações permitiram observar que mesmo a partir de DNA total degradado foi possível detectar kDNA de Leishmania. Nas amostras sugestivas, a positividade com 13Y/13Z e 150/152 foi de 56,4 e 76,9% respectivamente. Nos pacientes confirmados para LTA, a positividade com 13Y/13Z foi de 68,7% e com 150/152 foi de 93,7%. O emprego dos iniciadores 150/152 foi mais viável, o que não descarta o uso de 13Y/13Z, dada a expressiva positividade alcançada em amostras que requerem extração simplificada de DNA e com baixo custo. A PCR-RFLP possibilitou a identificação de L. (V.) braziliensis nas amostras biológicas dos pacientes com LTA. Os dados do presente trabalho também reforçam a necessidade de ações que estabeleçam um centro de referência no diagnóstico e tratamento da LTA no SSMG. / The american tegumentary leishmaniasis, (ATL), one of clinic forms of leishmaniasis, is in expansion in Brazil and represent important cause of morbidity for populations who live in endemic areas. Profile epidemiological studies, health services and treatment are needs to establish strategies of disease control, as well as to employ new tools laboratorials, like PCR ones. This research evaluated the epidemiological aspects, diagnoses and treatment from patients with ATL from different regions Minas Gerais, beyond to use varied extraction techniques DNA and different primers in PCR to make possible the identification and differentiation of the etiological agents. Additionally, it compared the positivity of the primers addressed to the conserved (150/152) and variable (13Y/13Z) region of the Leishmania kDNA minicircle in biological samples of patients suggestive to ATL. It was to carried out epidemiological studies, diagnoses and treatment of 824 patients with ATL, being 261 from Southern and Southwestern regions of Minas Gerais state (SSMG) and 563 from river Doce valley (VRD). The data were obtained from notification files Regional Health Authorities – RHA of SSMG and from Leishmaniasis ambulatory “Dr. Paulo Araújo Magalhães” at Caratinga city (VRD) between 2002 and 2006. Thirty nine patients from these regions and with suggestive ATL lesions were submitted to laboratorial exams, beyond of the PCR. The DNA samples extracted by heating, phenol/ chloroform technique, proteinase K and by Wizard kit, and later used in the PCR and PCR-RFLP. In the period analyzed, it was observed decrease of 59.7% of ATL cases in SSMG and of up to 25.7% in VRD. The cutaneous clinic form was predominant with 91.9 and 93.6% in SSMG and VRD respectively. The greatest part of the patients from SSMG has urban residence (51.7%) while in VRD the rural was predominant (95.7%). In the SSMG there was positivity in 55.6, 10.7 and 19.5% of ATL cases in the Montenegro test (MT), parasitological and histopatological exams, respectively. In the VRD the positivity was 84.0 in the MT and 73.0% in the parasitological exam. Discharge from the treatment due to cure varied of 71.8 to 92.0% in the SSMG and reached 78.0% in VRD. From the 39 suggestive patients, 32 were confirmed to ATL. The DNA extractions allowed observing that even starting from total degraded DNA was possible to detect kDNA of Leishmania. In the suggestive samples, the positivity of DNA with 13Y/13Z and 150/152 was about 56.4 and 76.9% respectively. In the confirmed patients to ATL, the positivity to 13Y/13Z was about 68.7% and to 150/152 was of 93.7%. The employment of the primers 150/152 was viable, what doesn't discard the use of 13Y/13Z, given the expressive positivity reached in samples that request simplified extraction of DNA and with low cost. PCR-RFLP made possible the identification of L. (V.) braziliensis in the patients' biological samples with LTA. The data of the present work they also reinforce the need of actions that establish a reference center in the diagnosis and treatment of LTA in SSMG. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES