Orientador: Simone Baldini Lucheis / Coorientador: Wilma Aparecida Starke Buzetti / Banca: Rosângela Zacarias Machado / Banca: José Eduardo Tolezano / Resumo: Não disponível / Abstract: Not available / Mestre

Resumo: Apesar de alguns relatos da ocorrência de leishmaniose visceral em felinos, a literatura é escassa no que diz respeito à sua pesquisa em populações de gatos de áreas endêmicas para a doença. Desta forma, o presente estudo teve por objetivo pesquisar em uma área endêmica para leishmaniose visceral canina, a possibilidade de infecção em gatos, por meio de exame parasitológico direto e da pesquisa de anticorpos anti-Leishmania chagasi pelas técnicas de ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) e reação de imunofluorescência indireta (RIFI). Para tanto, foram colhidas amostras de soro de 200 gatos, encaminhados ao Centro de Controle de Zoonoses do município de Araçatuba - São Paulo - Brasil, bem como realizadas punções biópsias aspirativas de linfonodo, medula óssea, baço e fígado, utilizados para a confecção de preparados citológicos para a pesquisa direta de formas amastigotas de Leishmania sp. A prevalência da doença nessa população de gatos foi de 6,5%. Dos 200 animais avaliados, oito (4,0%) apresentaram resultado parasitológico positivo, seis (3,0%) apresentaram títulos sorológicos acima do ponto de corte (0,332) pela técnica de ELlSA e um (0,5%) evidenciou título superior ao ponto de corte (1:40) pela RIFI, totalizando 13 gatos considerados positivos. / Abstract: In spite of some reports of the occurrence of feline visceral leishmaniasis, the literature is scarce about its research on populations of cats in endemic areas for the disease. The present work aimed to study, in an endemic area for canine visceral leishmaniasis, the infection possibility in cats using the direct parasitological test, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and indirect immunofluorescent antibody test (IFAT). For this purpose, a total of 200 cats directed to the Zoonosis Control Center of the municipal district of Araçatuba - São Paulo - Brazil were employed. Lymph node, bone marrow, spleen and liver aspiration biopsies were carried out and observed under optical microscope to search for amastigote forms of the parasite and serum samples were submitted to serological methods in order to detect anti-Leishmania chagasi circulating antibodies. The prevalence of the disease in this population of cats was 6.5%. Amastigote forms of the parasite were observed in eight (4.0%) cats; by ELISA method, six (3.0%) cats presented titer above the specie's cut off point (0,332) and one cat (0,5%) showed a titer above 1:40, a positive serological reaction, by IFAT, totalizing 13 positive cats. / Orientador: Mary Marcondes / Coorientador: Aparecido Antonio Camacho / Banca: Mary Marcondes / Banca: Mirela Tinucci Costa / Banca: Márcia Dalastra Laurenti / Mestre

Resumo: A Leishmaniose Visceral é uma zoonose relevante que mais recentemente tem afetado pacientes imunossuprimidos, e tornou-se um sério problema para a saúde pública. O objetivo deste trabalho foi de avaliar a imunopatologia da infecção com Leishmania chagasi em camundongos BALB/c imunossuprimidos com dexametasona até o momento da infecção. Foram realizadas culturas de células esplênicas sem estímulo e com estímulo (Ag de L. chagasi e ConA) para dosagem das citocinas IFN-g, IL-2, IL-4 e IL-10, e determinação das cargas parasitárias do baço e do fígado. Os grupos imunossuprimidos apresentaram os pesos dos baços e porcentagem de CD4 estatisticamente inferiores aos grupos normais no momento da infecção e nos outros momentos de estudo revelaram a produção tanto de citocinas do tipo TH1(IFN-g e IL-2) quanto do tipo TH2 (IL-10). Os grupos infectados se comportaram de maneira semelhante, produzindo citocinas tipo TH1 e TH2, independentemente da imunossupressão. As cargas parasitárias do baço e do fígado destes grupos não apresentaram diferença estatisticamente significante em nenhum dos momentos. Sugere-se que a imunossupressão realizada com a dexametasona não interferiu na infecção com L. chagasi, provavelmente pelo seu efeito reversível. / Abstract: Visceral Leishmaniasis is a relevant zoonosis infecting immunosuppressed patients, becoming a serious problem to public health in the last years. The objective of this study was to evaluate the immunopathology of Leishmania chagasi infection in BALB/c mice immunosuppressed with dexamethasone until the day of infection. Spleen cells with and without specific stimulus (Ag of L. chagasi and ConA) were cultured for cytokine quantification (IFN-g, IL-2, IL-4 and IL-10) and spleen and liver parasite loads were determined. Immunosuppressed groups showed statistically lower spleen weight and CD4 percentage than normal groups on the day of infection and on the other days of the study, showing the production of TH1(IFN-g and IL-2) and TH2 (IL-10). cytokines. The other infected groups presented the same results, producing TH1 and TH2 cytokines, no matter if they were immunosuppressed and infected. Spleen and liver parasite loads in these groups did not show statistical differences. It was concluded that immunosuppression using dexamethasone did not interfere in L. chagasi infection, probably due its reversible effect. / Orientador: Helio Langoni / Coorientador: Simone Baldini Lucheis / Banca: Lisiane de Almeida Martins / Banca: Cáris Caroni Nunes / Banca: Jussara Marcondes Machado / Banca: Luciane Alarcão Dias Melicio / Doutor

Made available in DSpace on 2011-12-27T14:14:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 000401399-0.pdf: 32443 bytes, checksum: 60362b79ab18cc90bf8d7d5686822ecf (MD5) license.txt: 581 bytes, checksum: 44ea52f0b7567232681c6e3d72285adc (MD5) / American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) is a disease caused by protozoans of the genus Leishmania. It is transmitted through the bite of insects of the genus Lutzomyia. In most parts of Brazil, as the Rio de Janeiro State, the infection is caused by L. braziliensis. Two main clinical forms are described: cutaneous and mucosal leishmaniasis. Most of the human cases are in cutaneous lesions. However, despite the low frequency mucosal lesion, the magnitude of the tissue destruction and the resistance to the treatment result in a difficult following up of the patients. The nature of cells comprising the lesion environment may play a determinant role in this infection, as it has been described for other models of compartmentalization of the immune response. Studies have indicated the need for detailed investigation of the lesion microenvironment in order to establish the immunopathological picture of the infection. Thus, the study of ATL mucosal lesions might contribute to the understanding of the dynamics of the infection. In order to verify the composition of the inflammatory reaction present in mucosal lesions of ATL patients, we examined biopsies obtained from 20 patients suffering of mucosal leishmaniasis (12 with nose lesion and 8 with oral lesion), as well as 20 health donors (10 oral mucosa and 10 nasal mucosa). The mucosal tissues were analyzed by immunohistochemistry, using antibodies which recognize different subpopulations of cells (CD3, CD4, CD8, CD22, CD68, neutrophil elastase, CD1a) and inflammatory markers (CLA, Ki67, Bcl-2, NOS2, CD62E, Fas, FasL).The lesions presented an inflammatory reaction mainly consisting of T cells and macrophages. It was also observed an association between high NOS2 expression and reduced numbers of parasites, highlighting the importance of NOS2 in the elimination of parasites. The results demonstrated that the inflammatory reaction present in mucosal leishmaniasis is similar in nasal and oral mucosa, despite the tendency to be more intense in oral lesions. Moreover, the comparison of lesions and health tissue showed a significant increase of inflammatory cells in the first group. However, it was detected some inflammatory reaction in the named health tissues. These data could be the result of a continuous aggression by infectious agents and micro lesions, since mucosa is considered an immunological barrier to infections and trauma. In addition, parasites were more in oral tissues. Sice the patients having oral leishmaniasis have the tendency to frequently be diagnosed earlier than those ones having nasal lesion, the presence of parasites could be the result of lesion evolution. / A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é causada por protozoários do gênero Leishmania. É transmitida pela picada de insetos do gênero Lutzomyia. Em regiões do Brasil, como no Rio de Janeiro, é causada pela L. braziliensis. Duas formas clínicas principais são descritas: leishmaniose cutânea e mucosa. A maior parte dos casos humanos é constituído de lesões cutâneas. Contudo, apesar da baixa freqüência de lesões mucosas, a extensão da destruição tecidual e a freqüência de resistência ao tratamento tornam difícil acompanhamento dos pacientes. Os tipos celulares que compõem o ambiente das lesões podem apresentar envolvimento determinante na infecção, como já descrito em outros modelos de compartimentalização da resposta imune. Estudos indicam a necessidade de detalhamento do microambiente para estabelecer o quadro imunopatológico das lesões. Assim, o estudo das lesões mucosas da LTA pode contribuir para a compreensão da dinâmica da infecção. Com o intuito de verificar a composição do infiltrado inflamatório presente nas lesões mucosas de LTA, nós examinamos biópsias de 20 pacientes de leishmaniose mucosa (12 com lesões nasais e 8 com lesões orais), assim como 20 doadores clinicamente sadios (10 biopsias de mucosa oral e 10 de mucosa nasal). Os fragmentos de mucosa foram analisados por imunohistoquímica, usando anticorpos monoclonais capazes de reconhecer: diferentes subpopulações celulares (CD3, CD4, CD8, CD22, CD68, elastase neutrofílica, CD1a) e marcadores de inflamação (CLA, Ki67, Bcl-2, NOS2, CD62E, Fas, FasL). As lesões apresentavam reação inflamatória constituída principalmente de células T e macrófagos. Também se observava uma associação entre expressão elevada de NOS2 e reduzido número de parasitas, indicando a importância da NOS2 na eliminação de parasitas. Os resultados demonstram que a reação inflamatória presente na leishmaniose mucosa é semelhante seja no sítio de lesão oral ou nasal, apesar da tendência de ser mais intensa nas lesões orais. A comparação das lesões com tecidos considerados sadios demonstrou o aumento significante da concentração de células inflamatórias nas lesões. Células inflamatórias residuais estavam presentes nos tecidos considerados sadios. Este achado poderia ser o resultado da agressão contínua por agentes infecciosos e por microtraumatismos, já que a mucosa é considerada uma das barreiras do nosso organismo. Parasitas foram mais detectados nas lesões orais. Já que pacientes com lesão oral têm tendência ao diagnóstico precoce se comparado aos casos de lesão nasal, a maior presença de parasitas poderia ser conseqüência do tempo de evolução.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Núcleo de Medicina Tropical, 2014. / Submitted by Larissa Stefane Vieira Rodrigues (larissarodrigues@bce.unb.br) on 2014-11-12T17:32:39Z No. of bitstreams: 1 2014_DanielaSant’AnaDeAquino.pdf: 6175557 bytes, checksum: 26a02e952ac55ed41bf830fd604fe0c9 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2014-11-14T13:15:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_DanielaSant’AnaDeAquino.pdf: 6175557 bytes, checksum: 26a02e952ac55ed41bf830fd604fe0c9 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-14T13:15:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_DanielaSant’AnaDeAquino.pdf: 6175557 bytes, checksum: 26a02e952ac55ed41bf830fd604fe0c9 (MD5) / Doenças infecciosas são as principais causas de morte no mundo. Dentre essas doenças, a leishmaniose destaca-se no Brasil e no mundo pelo seu caráter endêmico e grande incidência, além disso, as manifestações clínicas, que variam das formas cutâneas à forma visceral, dependem da espécie do parasito bem como do sistema imunitário do indivíduo. O tratamento da doença baseia-se nos compostos antimoniais pentavalentes, que apesar de eficazes apresentam grande toxicidade para o hospedeiro e induzem mecanismos de resistência dos parasitos. Esses aspectos estimulam os estudos para identificar novos compostos voltados ao tratamento da leishmaniose. Os peptídeos antimicrobianos são promissores agentes leishmanicida, pois suas características estruturais e eletrostáticas lhes permitem interagir com as membranas celulares dos parasitos causando seu rompimento. Considerando o efeito microbicida da filosseptina-1 (PSN-1) nas formas promastigotas de Leishmania amazonensis e considerando que os macrófagos são as principais células envolvidas na patogênese da leishmaniose, o objetivo do trabalho foi avaliar o efeito microbicida da PSN-1 nas formas amastigotas de L. amazonensis e determinar se esse efeito relaciona-se com a produção das espécies reativas de oxigênio ou com a formação dos corpúsculos lipídicos. Formas amastigotas axênicas foram obtidas pela incubação de cultivos promastigotas de L. amazonensis por 96 horas a 37°C, seguindo-se a infecção dos macrófagos por 8 horas. Cultivos infectados foram tratados com diferentes concentrações da PSN-1 (0, 2, 16 e 64 μg/mL) por 2 h para avaliar o efeito microbicida pela determinação do índice de infecção, para determinar no sobrenadante das culturas, a produção de óxido nítrico após 24 h de incubação pelo método de Griess e de peróxido de hidrogênio após 1 h de incubação pelo método de Pick e Keisari; para a quantificação dos corpúsculos lipídicos utilizou-se o método da coloração com óleo vermelho. Os resultados mostraram que, quando comparado ao controle basal, o efeito microbicida da filosseptina-1 ocorreu nas três concentrações reduzindo o índice de infecção de macrófagos em 52%, 81% ou 96% com 2, 16 ou 64 μg/mL, respectivamente (p<0,05); a produção de óxido nítrico aumentou com as três concentrações de PSN-1 (p<0,05); a produção de peróxido de hidrogênio não foi afetada pelo tratamento com as menores concentrações do peptídeo, no entanto a maior delas (64 μg/mL) causou redução desse radical, na presença ou não da infecção. O índice corpuscular aumentou com a menor concentração do peptídeo (2 μg/mL) devido ao aumento no percentual de macrófagos que expressavam corpúsculos lipídicos; o tratamento com 16 μg/mL também aumentou o percentual de macrófagos que exibiam corpúsculos lipídicos. Os resultados mostraram que o efeito microbicida ocorreu em um padrão dose-dependente, em que, a concentração máxima (64 μg/mL) foi capaz de reduzir em 96% o índice de infecção dos macrófagos, após 2 horas de incubação com o peptídeo. Em conjunto, o efeito das diferentes concentrações da PSN-1 nas formas amastigotas de L. amazonensis indicou o potencial desse peptídeo no tratamento da leishmaniose. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Infectious diseases are the leading causes of death worldwide. Among these diseases, leishmaniasis stands out in Brazil and in the world for its endemic nature and its widespread prevalence; furthermore its clinical manifestations, range from cutaneous forms to visceral forms, depending upon the species of the parasite and on the immune system of the individual. Disease control is based on treatment with pentavalent antimonial compounds, which, while effective, have high toxicity to the host, and induce the generation of parasitic resistance mechanisms. These aspects encourage studies to identify novel compounds aimed at treating leishmaniasis. Antimicrobial peptides are promising leishmanicidal agents because their structural and electrostatic characteristics allow them to interact with the cell membranes of parasites causing their breakup. Considering the microbicidal effect of phyloseptin-1 (PSN-1) on promastigotes of Leishmania amazonensis and considering that macrophages are the main cells involved in the pathogenesis of leishmaniasis, the objective of this study was to evaluate the microbicidal effect of PSN-1 in amastigotes of L. amazonensis and to determine whether this effect is related to the production of oxygen reactive species or the formation of lipid bodies. Axenic amastigotes were obtained by incubation of promastigote cultures of L. amazonensis for 96 hours at 37 ° C, followed by infection of macrophages for 8 hours. Infected cultures were treated with different concentrations of phyloseptin-1 (0, 2, 16 and 64 μg /mL) for 2 h to evaluate the microbicidal effect by determining the infection rate and also to determine the supernatant of cultures producing nitric oxide after a 24 hour incubation by the Griess method of hydrogen peroxide after a 1 hour incubation by the Pick and Keisari method. For the quantification of lipid bodies we used the method of staining with Red Oil. The results showed that compared to the basal control, the microbicidal effect of PSN-1 was present in all three doses reducing the infection rate of macrophages, after treatment with the peptide or not, by 52%, 81% or 96% with 2, 16 or 64 μg/mL, respectively (p<0.05); The production of nitric oxide increased with the three concentrations of PSN-1 (p<0.05); production of hydrogen peroxide was not affected by treatment with lower concentrations of the peptide, however, most of them (64 μg/mL) caused a reduction of this radical in the presence or absence of infection. The corpuscular index increased with the lowest concentration of the peptide (2 mg/mL) due to the increase in the percentage of macrophages expressing lipid bodies; treatment with 16 μg/mL also increased the percentage of macrophages that exhibited lipid droplets. The results show that the microbicidal effect occurred in a dose-dependent pattern, wherein the maximum concentration (64 μg/mL) was able to reduce in 96% the rate of infection of macrophages after 2 hours incubation with the peptide. Altogether, the effect of different concentrations of PSN-1 in amastigotes of L. amazonensis indicate the potential of this peptide in the treatment of leishmaniasis.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-11-19T16:36:59Z No. of bitstreams: 1 2014_ Aurilene Gomes Monteiro.pdf: 1120017 bytes, checksum: 1181ffcd849a4f54466fcf6b6659445b (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-11-20T14:19:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_ Aurilene Gomes Monteiro.pdf: 1120017 bytes, checksum: 1181ffcd849a4f54466fcf6b6659445b (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-20T14:19:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_ Aurilene Gomes Monteiro.pdf: 1120017 bytes, checksum: 1181ffcd849a4f54466fcf6b6659445b (MD5) / A leishmaniose é uma das doenças parasitárias mais relevantes, estando em expansão em áreas urbanas e periurbanas no Centro-Oeste do Brasil. Na verdade, o diagnóstico sorológico é empregado no Brasil para determinar a eutanásia de cães positivos. No presente estudo examinamos a relevância do diagnóstico molecular no controle da leishmaniose visceral canina. Por outro lado, a sorologia positiva não está diretamente relacionada a uma doença ativa. Desta forma, avaliamos cinquenta e oito (58) cães de diferentes regiões do Distrito Federal a partir de abril de 2012 a dezembro 2013 relativa à infecção por Leishmania. Para tanto, os animais foram fornecidos pelo Centro de Controle de Zoonoses, após investigação epidemiológica. Analisamos biópsias de fígado, baço, nódulos linfáticos e medula óssea através de exames parasitológicos (HE imprints e cultura dos parasitas isolados) e moleculares (PCR da região ITS1 do rDNA e da região 3’ UTR do gene da HSP70). A amostra teve mais de 62% dos cães machos e a maioria destes animais tinha pelos curtos e as orelhas caídas. Análise por PCR das biópsias apresentou resultados positivos em 47 (81%) dos animais. As amostras positivas foram de 35 cães sintomáticos (83%) e 12 (75%) de cães assintomáticos. A reação de PCR-RFLP revelou a espécie L. infantum em 47 (100%) das amostras positivas para a PCR. Deste modo, concluiu-se que o diagnóstico molecular é mais sensível e específico para identificar a leishmaniose visceral em cães. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Leishmaniasis is one of the most relevant parasitic diseases, being in expansion on urban and periurban areas in Brazil´s Center East. Actually, serological diagnostic is employed in Brazil determining euthanasia of positive dogs. In this study we examined the relevance of the molecular diagnostic in the control of canine visceral leishmaniasis. On the other hand, a positive serology is not directly correlated to an active disease. In this way, we evaluated fifty-eight (58) dogs from different regions of the Federal District from April 2012 to December 2013 concerning Leishmania infection. For this purpose, animals were provided by the Center for Control of Zoonoses, after epidemiological investigation. We analyzed biopsies from liver, spleen, lymph nodes and bone marrow through parasitological (HE imprints and culture parasite isolation) and molecular tests (PCR of ITS1 region of the rDNA and 3’ UTR region of the HSP70 gene). Our sample had more than 62% of male dogs and most of these animals had short hair and dropping ears. PCR analysis of the biopsies showed positive results in 47 (81%) animals. Positive samples were from 35 (83%) symptomatic and 12 (75%) asymptomatic dogs. PCR-RFLP revealed L. infantum in 47 animals (100% of the PCR positive samples). In this way, we concluded that the molecular diagnosis is more sensible and specific to identify visceral leishmaniasis in dogs.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Núcleo de Medicina Tropical, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-11-24T18:36:17Z No. of bitstreams: 1 2014_MauroMacieldeArruda.pdf: 5466854 bytes, checksum: d70b31aa614ceb8e0f6566c97c4cb41c (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-11-25T13:03:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_MauroMacieldeArruda.pdf: 5466854 bytes, checksum: d70b31aa614ceb8e0f6566c97c4cb41c (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-25T13:03:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_MauroMacieldeArruda.pdf: 5466854 bytes, checksum: d70b31aa614ceb8e0f6566c97c4cb41c (MD5) / Introdução: A leishmaniose visceral é uma enfermidade parasitária, provocada pelo protozoário Leishmania (Leishmania) infantum (sin. Leishmania (Leishmania) chagasi). A limitada acurácia dos testes empregados para o diagnóstico dos cães pode contribuir com o baixo impacto de uma das medidas de controle preconizadas pelo Ministério da Saúde brasileiro, a eutanásia de cães sororreagentes para leishmaniose. Os objetivos deste trabalho buscam estimar a acurácia e a confiabilidade de dois testes imunoenzimáticos que utilizam antígenos de L.(L.) major ou de L.(L.) infantum em laboratórios de diferentes níveis de complexidade e estimar a acurácia dos testes de ELISA e IFI aplicados em combinação sequencial ou de forma paralela, analisando os valores preditivos positivos e negativos destas abordagens em prevalências variáveis de infecção canina. Método e principais resultados: Foi utilizado um painel de 1.425 amostras de soros caninos, coletados em estudo multicêntrico. As amostras foram analisadas por meio de técnicas de visualização direta de parasitos, por estudo histopatológico corado com hematoxilina-eosina, pela técnica de imunohistoquímica e pelo isolamento do parasito em cultura. Estas técnicas constituíram o padrão de referência, sendo um caso positivo para a infecção por L. infantum o animal que apresentasse positividade em pelo menos um dos testes. Os resultados da acurácia do teste de ELISA com antígenos de L. major e L. infantum realizados em condições ideais no Laboratório de Referencia Nacional foi de 91,84% (IC95% 86,3 - 97,3) e 89,80% (IC95% 83,8 - 95,7) para sensibilidade e de 83,57% (IC95% 81,7 - 85,7) e 82,69% (IC95% 80,6 - 84,7) para especificidade, respectivamente. A AUC (área abaixo da curva ROC) foi de 0,920 para antígeno de L. major e de 0,898 para L. infantum. Os coeficientes de correlação intraclasse médios dos testes com antígenos de L. major, variaram entre 0,890 (0,876-0,902 IC95%) e 0,948 (0,942-0,953 IC95%) e com os antígenos de L. infantum entre 0,818 (0,792-0,841IC95%) e 0,879 (0,865-0,8910 IC95%). A sensibilidade e a especificidade do teste de imunofluorescência indireta (IFI) foi 90,8% (IC95% 84,2 - 97,5) e 53,4% (IC95% 51,6 - 55,1), respectivamente. Utilizados de forma combinada o teste de ELISA com antígeno de L. major e o teste de IFI mostraram que em paralelo o desempenho da sensibilidade global subiu para 99,2%, porém a especificidade diminuiu para 44,8%. Na utilização dos testes em série (ELISA seguido de IFI) observou-se uma diminuição na sensibilidade (83,3%) e melhora na especificidade (92,5%). Conclusões: A acurácia dos dois testes avaliados é semelhante, com um desempenho discretamente melhor do antígeno de L. major. A reprodutibilidade dos testes foi quase que perfeita (>0,81) com desempenho pouco melhor para o antígeno de L. major. Conclui-se, portanto, que não se justifica a mudança do antígeno no teste de ELISA atualmente constituído por L. major para diagnóstico de leishmaniose visceral canina no Brasil. Finalmente, a combinação dos testes de ELISA com antígeno de L. major seguido do teste de IFI melhorou a especificidade da abordagem diagnóstica, sem perda substancial da sensibilidade. A combinação em série destes testes pode satisfazer os anseios, tanto da saúde pública como dos proprietários de cães residentes em áreas endêmicas, por uma abordagem diagnóstica mais acurada da leishmaniose visceral canina. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Background Visceral leishmaniasis is a parasitic disease caused by the protozoan Leishmania (Leishmania) infantum (syn. Leishmania (Leishmania) chagasi). The limited accuracy of diagnostic tests for canine leishmaniasis may contribute to the lack of impact of the control measures recommended by the Brazilian Ministry of Health, i.e., euthanasia of seroreactive dogs. The objective of this study was to estimate the accuracy and reliability of two ELISA tests employing L. (L.) major or L.(L.) infantum antigen used by laboratories of different levels of complexity and estimate the accuracy of the ELISA tests and IFI applied in sequential or parallel combination , analyzing the positive and negative predictive values of these variables approaches prevalence of canine infection. Methods and principal findings A series of 1,425 serum samples collected from dogs in a multicenter study was used. The samples were analyzed by direct visualization of the parasite in hematoxylin/eosin-stained sections, immune histochemistry, and isolation of the parasite in culture. These techniques represented the reference standard and an animal that was positive in at least one of the tests was defined as infected with L. infantum. The results of the accuracy of the ELISA test with antigens of L. major and L. infantum played in ideal conditions at the National Reference Laboratory was 91.84% (CI 95% CI 86.3 - 97.3 ) and 89.80% ( CI95% 83.8 - 95.7 ) for sensitivity and 83.57% (CI95% 81.7 - 85.7 ) and 82.59 ( CI95% 80.6 - 84.7 ) specificity%, respectively. The AUC (area under the ROC curve) was 0.920 for the L. major and L. infantum 0.898 to. The mean intraclass correlation coefficients of the tests ranged from 0.890 (CI95% 0.876-0.902) to 0.948 (CI95% 0.942-0.953) when L. major was used as antigen, and from 0.818 (CI95% 0.792-0.841) to 0.879 (CI95% 0.865-0.8910) when L. infantum was used. The sensitivity and specificity of indirect immunofluorescence assay (IFA ) was 90.8 % ( 95% CI 84.2 to 97.5 ) and 53.4 % ( 95% CI 51.6 to 55.1 ) , respectively. Used in combination with the ELISA antigen of L. major and the IFA test showed that parallel the performance of the overall sensitivity increased to 99.2 % , but the specificity decreased to 44.8 % . The use of serial testing ( ELISA followed by IFI ) observed a 15 decrease in sensitivity ( 83.3 % ) and improved specificity ( 92.5 % ). Conclusions The accuracy of the two assays was similar with a slightly better performance of the L. major. Reliability of the test was almost perfect (> 0.81) with slightly better performance for the L. major. These results do not support a change in the antigen composition of ELISA tests (L. major) currently used for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis in Brazil. Finally, the combination of ELISA tests with L. major antigen followed by the IFA test improved the specificity of the diagnostic approach without substantial loss of sensitivity. Serial combination of these tests can satisfy the desires of both the public health and dog owners living in endemic areas for a more accurate diagnostic approach of canine visceral leishmaniasis.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-12-05T15:38:29Z No. of bitstreams: 1 2014_NubiaMariaPereiradeSousa.pdf: 3986507 bytes, checksum: d1332dbd839a8cf7865da5a7049cc1ae (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-12-08T11:51:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_NubiaMariaPereiradeSousa.pdf: 3986507 bytes, checksum: d1332dbd839a8cf7865da5a7049cc1ae (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-08T11:51:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_NubiaMariaPereiradeSousa.pdf: 3986507 bytes, checksum: d1332dbd839a8cf7865da5a7049cc1ae (MD5) / As leishmanioses são doenças infecto-parasitárias que acometem o ser humano e são causadas por várias espécies de protozoários pertencentes ao gênero Leishmania. A quimioterapia é o único tratamento efetivo para a doença. No entanto, efeitos adversos, administração parenteral, tratamentos não responsivos, regimes de tratamento com altas doses por longos períodos e custos elevados dos esquemas de tratamento são fatores limitantes do uso destas drogas. Neste contexto, a prospecção de novos fármacos contra as leishmanioses possui uma grande importância para a saúde pública em muitos países em desenvolvimento, incluindo o Brasil. No presente estudo foi avaliado a atividade leishmanicida da 5-Etoxicarbonil-4-(2-hidroxifenil)-6-metil-3,4-diidropirimidin-2(1H)-tiona (codificado como 4p) sobre formas promastigotas e amastigotas de L.(L.) amazonensis. Este composto pertence a classe de heterocíclicos conhecidos como DHPMs (3,4dihidropirimidin-2(1H)-ona ou -tiona). O composto 4p apresentou efeito citotóxico contra as formas promastigotas, sendo a concentração inibitória (50%) dos parasitos é de 50 μM. O efeito antiproliferativo de 4p foi observado pela modificação dos índices celulares presentes nas diferentes fases da curva de crescimento das formas promastigotas tratadas. O tratamento com 4p induziu alterações morfológicas importantes em formas promastigotas e amastigotas avaliadas por microscopia eletrônica de varredura e microscopia eletrônica de transmissão. Os resultados sugerem que o composto 4p na concentração de 50 μM interfere com os microtúbulos destes protozoários, produzindo várias alterações na membrana celular. E ainda promoveu alterações estruturais nas mitocôndrias. Ensaios de infecção experimental in vitro demonstraram que este composto é eficiente na eliminação dos parasitos intracelulares quando aplicados em regime de pré-tratamento, sendo também eficiente quando aplicados com a infecção já em curso. Assim, a classe das DHPMs pode representar uma arquitetura molecular promissora para o desenvolvimento de novos agentes leishmanicidas alvo dirigido. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The leishmaniasis is an infectious and parasitic diseases that affects humans and is caused by several species of protozoa belonging to the Leishmania genus. Chemotherapy is the only effective treatment for this disease. Adverse effects, parenteral administration route, unresponsive treatments, treatment regimens with high doses for long periods and high costs of treatment are however limiting factors for a wide use of these drugs. In this context, the search for new drugs against leishmaniasis has a huge importance for the public health policy on many developing countries, including Brazil. In this present study it was evaluated the antileishmanial activity of 5-ethoxycarbonyl-4-(2-hydroxyphenyl)-6-methyl-3,4-diidropirimidin-2(1H)-thione (codified as 4p) against promastigotes and amastigotes forms of L. (L.) amazonensis. This compound belongs to a class of heterocyclic known as DHPMs (3,4dihidropirimidin-2 (1H)-one and thione). Compound 4p showed cytotoxic effects against the promastigote forms of L. (L.) amazonensis, with a half minimal (50%) inhibitory concentration (IC50) of 50 μM. Compound 4p caused an antiproliferative effect against this parasite significantly reducing the parasite cells number throughout all stages of the growth curve. Treatment with 4p also produced several ultrastructural changes on the promastigotes and amastigotes forms as depicted from scanning electron microscopy and transmission electron microscopy analyses. Our results suggest that compound 4p concentration of 50 μM appears to interfere with the protozoan microtubules affording several cellular membrane alterations. It was also showed ultrastructural disruption of the mitochondria. Experimental in vitro infection showed that this compound is effective to eliminate intracellular parasites when applied under pre-treatment schedule, as well, when applied during the ongoing infection. In this context, the class of DHPMs may represent a promising molecular architecture for the development of new antileishmanial target-directed agents.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2006. / Submitted by Natália Cristina Ramos dos Santos (nataliaguilera3@hotmail.com) on 2009-10-31T16:11:40Z No. of bitstreams: 1 2006_Daniella Barreto Santana.pdf: 1808092 bytes, checksum: 6050e51aee3d99b95f04cb15e837f7f5 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-07-08T13:00:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Daniella Barreto Santana.pdf: 1808092 bytes, checksum: 6050e51aee3d99b95f04cb15e837f7f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-07-08T13:00:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Daniella Barreto Santana.pdf: 1808092 bytes, checksum: 6050e51aee3d99b95f04cb15e837f7f5 (MD5) Previous issue date: 2006 / Triatomíneos do gênero Rhodnius: R. neglectus e R. robustus, vetores naturais do Trypanosoma rangeli, foram identificados utilizando-se as chaves taxonômicas de Lent & Wygodzinsky, 1979 e a morfometria geométrica das asas. Este último confirmou sua utilidade como parâmetro de identificação taxonômica em triatomíneos do gênero Rhodnius. No estudo comparativo das estatísticas vitais e dos aspectos de comportamento alimentar, os triatomíneos das duas espécies foram observados diariamente para se estabelecer: (i) o período de desenvolvimento dos estádios ninfais; (ii) percentual de mortalidade; (iii) detecção do hospedeiro (tempo de aproximação dos triatomíneos ao hospedeiro vertebrado experimental); (iv) número de tentativas de picadas dos insetos no hospedeiro; (v) tempo total do repasto sanguíneo; (vi) índice de picadas; (vii) lapso entre o final do repasto e a primeira defecação; e (viii) quantidade de sangue ingerido. Comparando-se as duas espécies, R. neglectus apresentou um período ninfal significativamente menor que R. robustus, havendo diferença significativa (p<0,001) para todos os estádios, exceto para Ninfa V. Com relação ao comportamento alimentar, as duas espécies apresentaram os parâmetros bem similares, exceto para o número de picadas onde R. neglectus se apresentou significativamente maior para as Ninfas IV e V, e para a quantidade de sangue ingerido onde R. robustus apresentou uma média de ingestão significativamente maior que R. neglectus. Em R. robustus, registrou-se a presença dos dois pares de glândulas (D1 e D2), característica da espécie estudada. Para verificar o potencial vetorial de T. rangeli nas espécies de triatomíneos, utilizou-se três procedimentos laboratoriais com a cepa SC-58: infecção via alimentação em camundongo infectado, via inoculação intracelômica e via xenodiagnóstico artificial, mas não houve infecção das glândulas salivares. Após diversas tentativas, T. rangeli infectou a hemolinfa em apenas dois triatomíneos, sem progresso de infecção. Com a cepa LP-01, isolada recentemente de R. neglectus naturalmente infectado, realizou-se uma tentativa de infecção via alimentação em camundongo infectado, sem demonstrar invasão hemolinfática. Na infecção in vitro das glândulas salivares, foi utilizada uma glândula controle (sem infecção) e mais quatros glândulas, infectadas por quatro tempos distintos (30 minutos, 1, 3 e 24 horas), que foram processadas e levadas ao Microscópio Eletrônico de Varredura para verificar e documentar o processo inicial de adesão e penetração na membrana basal. Após o processamento, observou se que apenas com 30 minutos e 1 hora de infecção, flagelados encontravam-se aderidos na membrana basal, formando “grumos” com aparência de estar penetrando por orifícios grandes e visíveis. Isto poderia sugerir então que de alguma maneira, os flagelados lesam a membrana basal, com a finalidade de atravessá-la e ganhar passo às células do epitélio glandular. / Rhodnius neglectus and Rhodnius robustus (Hemíptera, Triatominae), two species from the genus Rhodnius, were initially identified using the well known taxonomical keys described by Lent and Wygodzinsky ( 1979) and, in addition, techniques of wings geometric morphometry. Both approaches resulted in good agreement confirming the value of the last one in accurate identification of species of Rhodnius spp .Comparative studies on experimental life tables and feeding behavior of R. neglectus and R. robustus important natural vectors of Trypanosoma rangeli in Brazil, were carried out in order to establish: (i) time instars development (ii) mortality (iii) source host detection (iv) average number of bugs’ bite on host (v) bloodmeal spending time (vi) biting rate (vii) elapsed time between bloodmeal intake and first defecation (viii) total bloodmeal ingested . Main results of such comparison were: R. neglectus have shown a faster development of nymphs than R. robustus during all different stages except nymph V ( p<0,001). Regarding feeding behavior, if on one hand R neglectus demonstrated a higher number of bites in instar IV and V, on the other hand R. robustus have shown higher average of blood uptake . Two pairs of salivary glands (D1 and D2) were recorded in R. robustus and histologically described .The vector potential of the two species under study were pursued with challenges using two strains of T. rangeli (strains SC58 and LP01). Attempts of experimental infection using mouse infected with the flagellate, artificial xenodiagnosis and intracoelomic injections of cultures of the flagellate, were carried out with partial intestinal and haemolymphatic infections. No invasion of salivary glands were obtained in spite of our repeated efforts. Alternatively, salivary glands “in vitro infections” procedures, in different time-point( 30’, 1 hour, 24 hours) were performed. Studies on infected glands by light microscopy and scanning electron microscopy (SME) were done. Striking results were the recording of parasites recognition, adhesion and , probably, initial penetration through holes /orifices apparently produce by the flagellum of T. rangeli trypomastigotes/epimastigotes on the basal membrane surface. Our interpretation is that the parasite somehow open holes through the basal membrane of the salivary glands when they form clusters of flagellum first, to gain entry into the adjacent glandular epithelium.

Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2011. / Submitted by claudia teixeira (claudiadtx@gmail.com) on 2011-06-22T01:12:53Z No. of bitstreams: 1 2011_BrunaCândidoGuido.pdf: 2583425 bytes, checksum: 6da0d341ca671f7a9832a6e4581fc86b (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-06-22T15:03:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_BrunaCândidoGuido.pdf: 2583425 bytes, checksum: 6da0d341ca671f7a9832a6e4581fc86b (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-22T15:03:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_BrunaCândidoGuido.pdf: 2583425 bytes, checksum: 6da0d341ca671f7a9832a6e4581fc86b (MD5) / As leishmanioses, doenças infecciosas causadas por protozoários intracelulares do gênero Leishmania, apresentam manifestações clínicas diversas e tratamento de difícil administração com efeitos colaterais severos. Estas doenças ainda representam um relevante problema de saúde pública que somado a questão do tratamento, refletem a necessidade de se avançar na pesquisa e na busca por novos fármacos. As proteases, enzimas que catalisam a hidrólise de ligações peptídicas de proteínas e cadeias polipeptídicas, desempenham alguns papéis chaves nos parasitos protozoários como na transição do ciclo de vida, invasão do hospedeiro, evasão imune do parasito e na patogênese de doenças parasitárias. Neste contexto, este trabalho se focaliza no estudo da otubaína de Leishmania chagasi, uma cisteíno protease pertencente às enzimas deubiquitinantes (DUBs). Algumas DUBs são essenciais na imunomodulação e regulação da resposta inflamatória. A otubaína 1 de humanos, por exemplo, possui como substrato a proteína E3 GRAIL associada à anergia dos linfócitos. Este trabalho teve como objetivo a clonagem e expressão da otubaína recombinante de L. chagasi (rOtuLc) bem como sua citolocalização, caracterização de sua atividade e proposição da sua estrutura por modelagem e dinâmica molecular. O gene da OtucLc foi amplificado e seu produto clonado no vetor de expressão, pET-19b, expresso em E. coli BL21 (DE3). A rOtuLc foi induzida com 0,1 mM IPTG, a 16 ºC por 16 h. A proteína recombinante solúvel foi purificada em coluna de agarose-níquel. Anticorpos anti-OtuLc foram produzidos em camundongos e sua especificidade foi confirmada por immunoblot. A imunocitolocalização da OtuLc em promastigotas de L. chagasi revelou sua localização em vesículas e uma marcação pontual de forte intensidade na região anterior, próximo ao cinetoplasto. Testes de atividade da rOtuLc contra os substratos Ub-AMC e Z-LRGG-AMC foram realizados e a rOtuLc mostrou-se inativa. Finalmente, a modelagem molecular por homologia e os ensaios de dinâmica molecular de equilíbrio indicaram que a OtuLc é composta por 10 hélices ? e 1 folha ?, de 4 fitas, e mantém conservado o posicionamento dos resíduos da tríade catalítica, estando o resíduo Cys81 no início de uma hélice ? direita próxima à fita ? onde se encontram os resíduos His261 e Asn263. Estes resultados iniciais poderão servir como ferramentas de grande valia para uma avaliação futura do potencial quimioterápico da OtuLc. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Leishmaniasis are infectious diseases caused by intracellular protozoa of the genus Leishmania which have different clinical manifestations and treatment difficult to administer with serious secondary effects. These diseases still represent a significant public health problem and together with the difficulties encountered in the current treatment reflect the need to advance the search for new drugs. Proteases, enzymes that catalyze the hydrolysis of peptide bonds of proteins and polypeptide chains, play key roles in some protozoan parasites such as life cycle transition, host invasion, parasite immune evasion and parasitic diseases pathogenesis. In this context, this work focuses on studing Leishmania chagasi otubain, a cysteine protease belonging to deubiquitinating enzyme (DUBS). Some DUBs are essential in immunomodulation and regulation of the inflammatory response. The human otubain 1, for example, has the GRAIL E3 protein as substrate, associated with anergy in lymphocytes. The aim of this work was the cloning and expression of recombinant L. chagasi otubain (rOtuLc), the verification of its cytolocalization, the activity characterization and the structure proposition by molecular modeling and dynamics. The OtuLc gene was amplified and the product cloned into the expression vector pET-19b expressed in E. coli BL21 (DE3). Expression of recombinant protein condition was 0,1 mM IPTG, 16 °C for 16 h. The soluble recombinant protein was purified by nickel-agarose column. Anti-OtuLc antibodies were produced in mice and its specificity was confirmed by immunoblot. Cytolocalization of OtuLc in L. chagasi promastigotes revealed vesicular pattern localization and a high-intensity point labeled in the anterior region near the kinetoplast. rOtuLc activity tests against Ub-AMC and Z-LRGG-AMC substracts were performed and the recombinant protein was found to be inactive. Finally, homology molecular modeling and molecular dynamics assay indicated that OtuLc is composed of 10 α helices and 1 β sheet and retains the conserved residues of catalytic triad positioning with Cys81 residue at the beginning of a right handed α helix near to His261 and Asn263 at the β sheet. These initial results may serve as valuable tools for future assessement of the chemotherapeutic potential of OtuLc.