Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T16:19:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 202333.pdf: 3239923 bytes, checksum: 183f5c1614e5718a56e46b2b07869aa4 (MD5) / O presente estudo teve como objetivo verificar a eficácia da PCR no diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) em pacientes do Estado de Santa Catarina comparando com a microscopia e intradermorreação. Duas formas de preservação das amostras e de extração de DNA foram testadas: imprinted em papel de nitrocelulose (NP) e imersão em etanol 70% (EB). A extração do imprinted em papel de nitrocelulose (NP) foi realizada por eluição e a imersão em etanol 70% (EB) pelo método do fenol-clorofórmio. As amostras foram analisadas por PCR, utilizando oligonucleotídeos direcionados a região conservada do minicírculo do DNA cinetoplástico (kDNA). A microscopia detectou a presença de Leishmania sp. 80% das 55 amostras analisadas enquanto a PCR detectou a presença de Leishmania sp. em 74,5% das 55 amostras e em 75,5% de 45 amostras de pacientes submetidos ao Teste de Montenegro. A extração de DNA pelo fenol-clorofórmio das amostras EB mostrou-se mais eficiente quando comparada com a extração por eluição das amostras NP. Além disso, a PCR-RFLP foi empregada para a identificação das espécies de Leishmania das amostras de pacientes. A maioria das amostras foi identificada como L. (Viannia) braziliensis. Este trabalho sugere o uso da PCR para a confirmação dos casos de ACL onde a microscopia ou intradermorreação sejam negativas e mostra a predominância de L. (V.) braziliensis como espécie causadora da LTA em SC.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-05Bitstream added on 2014-06-13T19:53:39Z : No. of bitstreams: 1 candido_tc_me_araca.pdf: 695625 bytes, checksum: 2f5b5c66c41e1d07fc364672891e34d8 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A Leishmaniose visceral canina (LVC), conhecida como calazar, é uma antropozoonose endêmica no Brasil, causada pela Leishmania L. chagasi. O teste sorológico de ELISA tem sido empregado na rotina de inquéritos epidemiológicos e no auxílio diagnóstico clínico de cães suspeitos. O método de ensaio imunoenzimático em fase sólida (ELISA) usando o antígeno total de Leishmania L. chagasi (ELISA-AgT), assim como, o ELISA - Ligante de Fucose e Manose (ELISA-FML), tem demonstrado boa sensibilidade e especificidade para detectar a doença em cães assintomáticos e oligossintomáticos. O presente trabalho teve como objetivo comparar dois antígenos pelo método de ELISA no sorodiagnóstico de cães naturalmente infectados pela LVC, positivos no exame parasitológico, e agrupados em: grupo sintomático e, grupo oligossintomáticos, tendo como grupo controle cães de área não endêmica. Nos animais oligossintomáticos, a sensibilidade observada para ELISA-AgT foi de 86,7%, já para o método ELISA-FML apresentou valor de 90%. A especificidade foi de 100% no método de ELISA-AgT e 96,7 % para o ELISA-FML. Nos animais sintomáticos, a sensibilidade e especificidade para o ELISA-AgT foram de 90% e 93,3%, respectivamente; já o método de ELISA-FML apresentou sensibilidade e especificidade de 86,7% e 96,7%. No teste ELISA-AgT o valor preditivo positivo foi de 93,1% nos sintomáticos e 100% nos oligossintomáticos, enquanto que nos animais submetidos ao teste ELISA-FML, foi observado 96,3% para os sintomáticos e 96,4% para os oligossintomáticos. O índice Kappa foi utilizado para medir o grau de concordância real entre os dois métodos imunoenzimáticos empregados e o exame parasitológico direto, mostrando boa concordância entre os métodos realizados. / Visceral canine leishmaniasis or calazar is Brazilian an endemic antropozoonosis caused by Leishmania L. chagasi. ELISA sorologycal test has been used in routine of epidemiological studies and in diagnosis of clinical suspect dogs. The immunoenzymatic assay in solid phase (ELISA) using Leishmania L. chagasi total antigens AgT-ELISA and Fucose Manose ligant-ELISA (FML-ELISA) has been showed good sensibility and specificity for detection disease in asymptomatic and oligosymptomatic dogs. The present paper has the goal of compare the efficiency of two antigens by ELISA methods in dogs naturally affect by leishmaniasis with positive parasitological exam and grouped by symptoms. Group composed by symptomatic dogs, and Group by oligosymptomatic dogs. Control group was constituted of dogs from Leishmania free areas. Dogs of Group oligosymptomatics presented 86,7% of sensibility in AgT-ELISA and 90% at FML-ELISA. The specificity was 100% at AgT-ELISA and 96.7% for FML-ELISA. At Group symptomatics the sensibility and specificity for AgTELISA and FML-ELISA were respectively 90% and 93.3% and, the FMLELISA showed 86.7% and 96.7% corresponding to sensibility and specificity. On ELISA-AgT the positive predictive valor was 93.1% at symptomatic and 100% at oligosymptomatic, moreover in the dogs tested by FML-ELISA the valor was 96.3% for the symptomatic and 96.4% for oligosymptomatics. The Kappa was used and showed a good concordance between both methods tested. Our results had shown that in oligosymptomatics animals the FML-ELISA presented greater sensitivity, while that, in the symptomatic animals, the AgT-ELISA showed more sensible in the detention of positive.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-04-07Bitstream added on 2014-06-13T19:01:38Z : No. of bitstreams: 1 nogueira_fs_dr_botfmvz.pdf: 613808 bytes, checksum: 53835c4f383e76a5d3d5fb8ba35f88b5 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Constituiu objetivo desta pesquisa avaliar experimentalmente os efeitos decorrentes do tratamento de cães naturalmente infectados por Leishmania spp., com anfotericina b em associação ao alopurinol e prednisona, avaliando as lesões hepática e renal, e principalmente a eficácia deste protocolo para o controle da doença por meio da sorologia, pesquisa de parasitos, e manifestações clínicas. Para tanto, foram utilizados 20 cães adultos, machos e fêmeas, soropositivos pelo teste ELISA. Todos os cães foram tratados com anfotericina b na dose de 0,5 mg/kg a cada 3 dias durante 16 aplicações, associado ao alopurinol na dose de 10 mg/kg/12horas durante 18 meses e prednisona 0,5 mg/kg/24 horas durante 8 semanas. O experimento foi realizado durante 18 meses, sendo que as variáveis foram analisadas em momentos diferentes. Os animais foram monitorados quanto à lesão renal e hepática por meio da concentração sérica de uréia, creatinina, aspartato aminotransferase (AST), e alanina aminotransferase (ALT) em 7 momentos: M0 - antes do tratamento, M1 - 14 dias, M2 - 28 dias, M3 - 42 dias, M4 - 56 dias, M5 - 12 meses e M6 - 18 meses. Os cães foram submetidos a exame físico rotineiro a cada 3 meses, e classificados em assintomáticos, oligossintomáticos e sintomáticos. Da mesma forma, nos momentos supramencionados, procedeu-se à análise do proteinograma, ou seja, da concentração sérica de proteína total, albumina, globulina e relação albumina/globulina. A pesquisa de anticorpos anti-leishmania e a análise imunoistoquímica, foram realizadas - antes do início da terapia e decorridos 18 meses. A pesquisa de formas parasitárias através da avaliação citopatológica do aspirado de linfonodo, foi efetuada a cada 6 meses. O protocolo terapêutico promoveu remissão total dos sinais clínicos em quinze animais, entretanto dois cães... / The goal of this research was to experimentally assess the effects of the treatment of dogs infected by Leishmania spp., with amphotericin B associated to allopurinol and prednisone , evaluating renal and liver lesion and, mainly, the effectiveness of such protocol in controlling the disease by means of sorology, parasite detection and clinical manifestation. Twenty adult, male and female, ELISA-seropositive dogs were therefore used. All dogs were treated with 16 administrations of amphotericin B, each dosed at 0.5 mg/kg and given in 3-day intervals, associated to allopurinol dosed at 10 mg/kg/12 hours for 18 months and prednisone dosed at 0,5 mg/kg/24 hours for 8 weeks. The experiment was carried out for 18 months and the variables analysed at distinct times. All animals were monitored in respect of renal and liver lesion through their serum concentrations of urea, creatinine, aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase in 7 moments: M0 - before treatment, M1 - 14 days, M2 - 28 days, M3 - 42 days, M4 - 56 days, M5 - 12 months and M6 - 18 months. All dogs were submitted to routine physical examination every 3 months and classified as asymptomatic, oligosymptomatic and symptomatic. Likewise, at the same moments proteinogram analysis was also carried out using serum concentration of total protein, albumin, globulin and albumin/globulin ratio. Antileishmania antibody detection and immunohistochemical analysis were carried out at 2 times - before the therapy and 18 months after its start. Every 6 months a cytopathological evaluation of the lymphoid aspirate was carried out in search of parasitic bodies. The therapeutic protocol promoted complete remission of clinical signals in fifteen animals, however two dogs showed relapse and three came to die. Amphotericin B immunomodulatory effect was demonstrated through seroconversion and proteinogram... (Complete abstract, click electronic access below)

Orientador : Profª. Drª. Vanete Thomaz Soccol / Co-orientador : Prof. Dr. ItaLmar Teodorico Navarro / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Processos Biotecnológicos. Defesa: Curitiba, 07/07/2010 / Inclui referências : f. 18-21-52-58-81-88-115-119 / Área de concentração: Saúde Humana e Animal / Resumo

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-05-16Bitstream added on 2014-06-13T20:26:19Z : No. of bitstreams: 1 machado_jg_dr_botfmvz.pdf: 2164394 bytes, checksum: 900650ee155d0c853824e1af4b5332b0 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A Leishmaniose Visceral é uma zoonose relevante que mais recentemente tem afetado pacientes imunossuprimidos, e tornou-se um sério problema para a saúde pública. O objetivo deste trabalho foi de avaliar a imunopatologia da infecção com Leishmania chagasi em camundongos BALB/c imunossuprimidos com dexametasona até o momento da infecção. Foram realizadas culturas de células esplênicas sem estímulo e com estímulo (Ag de L. chagasi e ConA) para dosagem das citocinas IFN-g, IL-2, IL-4 e IL-10, e determinação das cargas parasitárias do baço e do fígado. Os grupos imunossuprimidos apresentaram os pesos dos baços e porcentagem de CD4 estatisticamente inferiores aos grupos normais no momento da infecção e nos outros momentos de estudo revelaram a produção tanto de citocinas do tipo TH1(IFN-g e IL-2) quanto do tipo TH2 (IL-10). Os grupos infectados se comportaram de maneira semelhante, produzindo citocinas tipo TH1 e TH2, independentemente da imunossupressão. As cargas parasitárias do baço e do fígado destes grupos não apresentaram diferença estatisticamente significante em nenhum dos momentos. Sugere-se que a imunossupressão realizada com a dexametasona não interferiu na infecção com L. chagasi, provavelmente pelo seu efeito reversível. / Visceral Leishmaniasis is a relevant zoonosis infecting immunosuppressed patients, becoming a serious problem to public health in the last years. The objective of this study was to evaluate the immunopathology of Leishmania chagasi infection in BALB/c mice immunosuppressed with dexamethasone until the day of infection. Spleen cells with and without specific stimulus (Ag of L. chagasi and ConA) were cultured for cytokine quantification (IFN-g, IL-2, IL-4 and IL-10) and spleen and liver parasite loads were determined. Immunosuppressed groups showed statistically lower spleen weight and CD4 percentage than normal groups on the day of infection and on the other days of the study, showing the production of TH1(IFN-g and IL-2) and TH2 (IL-10). cytokines. The other infected groups presented the same results, producing TH1 and TH2 cytokines, no matter if they were immunosuppressed and infected. Spleen and liver parasite loads in these groups did not show statistical differences. It was concluded that immunosuppression using dexamethasone did not interfere in L. chagasi infection, probably due its reversible effect.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-06-22T16:37:38Z No. of bitstreams: 1 2016_IgorMeloZimovski.pdf: 2384759 bytes, checksum: 7028c9dbda127c85f0eb4f8cb61eadfb (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-07-30T12:25:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_IgorMeloZimovski.pdf: 2384759 bytes, checksum: 7028c9dbda127c85f0eb4f8cb61eadfb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-30T12:25:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_IgorMeloZimovski.pdf: 2384759 bytes, checksum: 7028c9dbda127c85f0eb4f8cb61eadfb (MD5) / A leishmaniose visceral é uma doença negligenciada que apresenta cerca de 0,2 a 0,4 milhões de novos casos por ano em todo o mundo, sendo o Brasil um dos seis países com maior número de casos. O cão domestico é considerado o principal reservatório urbano do agente Leishmania infantum que é transmitido principalmente pelo vetor flebotomíneo Lutzomya longipalpis. A leishmaniose visceral canina tem caráter crônico e cães infectados em área endêmica podem não apresentar sinais clínicos aparentes, dificultando detecção e o controle da doença. Os casos caninos podem estar associados aos casos humanos, pela proximidade entre homem e o cão doméstico. O Ministério da Saúde preconiza o uso de testes sorológicos para a detecção de cães positivos para a doença e eutanásia dos mesmos, porém estes apresentam limitações quanto à sensibilidade e a especificidade. Testes moleculares como a PCR-RFLP têm mostrado grandes vantagens em relação aos testes convencionais no diagnóstico e identificação da espécie do parasito. Assim, o presente estudo avaliou a detecção do DNA da região ITS1 do rDNA e da região 3’-UTR do gene HSP70 de Leishmania em amostras de medula óssea de cães de um hospital veterinário particular no DF, seguidas de PCR-RFLP para identificar a espécie do parasito. Além disso, estudamos a associação do diagnóstico molecular com exames parasitológicos e sorológicos, bem como com perfil clínico, hematológico e de alguns parâmetros bioquímicos dos animais estudados. As reações de PCR do ITS1 e 3’-UTR do gene HSP70 apresentaram 78,69% e 52,46% de positividade respectivamente. Os testes parasitológicos detectaram apenas 40,98% das amostras positivas, sendo a L. infantum a única espécie identificada pelo RFLP. Os sintomas incluíram perda de peso, alterações gastrointestinais, fraqueza, epistáxe e uveíte. Cães de orelhas caídas, pelagem curta e de grande porte estavam em maior proporção entre os positivos. Observou-se também anemia, trombocitopenia e alterações dos valores normais do número de leucócitos nesses animais. No perfil bioquímico, apenas a ALT (alanina amino transferase) foi significativamente mais alta nos cães com detecção molecular positiva. Assim conclui-se que as ferramentas moleculares são potentes para a detecção e identificação de Leishmania em amostras de cães nas áreas endêmicas, permitindo também o diagnóstico em cães assintomáticos. Assim, tornam-se essenciais para a conclusão do diagnóstico na clínica veterinária, permitindo a decisão correta das medidas para o controle da doença. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Visceral leishmaniasis is a neglected disease with about 0.2 to 0.4 million of new cases per year worldwide, and Brazil is one of the six countries with the highest number of cases. The domestic dog is considered the main urban reservoir of the agent Leishmania infantum which is mainly transmitted by the sand fly vector Lutzomya longipalpis. Canine visceral leishmaniasis has chronic character and infected dogs in endemic areas can not show overt clinical signs, hindering detection and control of the disease. The canine cases may be associated with human cases, because of the proximity between man and the domestic dog. The Ministry of Health recommends the use of serological tests for the detection of positive dogs for the disease and their euthanasia, but these tests have limitations in terms of sensitivity and specificity. Molecular tests such as PCR-RFLP have shown great advantages over conventional assays in diagnosis and species identification of the parasite. In this way, the present report evaluate Leishmania DNA detection of ITS1 ribosomal DNA or 3’-UTR of the HSP70 gene in bone marrow samples from dogs attended in a veterinary hospital in the Federal District (DF-Brazil). Parasite detection was followed by species identification through PCR-RFLP. Furthermore we compared the molecular testing with some parasitological, serological, clinical and biochemical characteristics of these animals. The ITS1 PCR reactions and 3'-UTR of HSP70 gene showed 78.69% and 52.46% of positivity respectively. Parasitological tests detected only 40.98% of the positive samples, and L. infantum was the only species identified by RFLP. Symptoms include weight loss, gastrointestinal disorders, weakness, epistaxis and uveitis. Dog-eared, short hair and large were in greater proportion of the positive dogs. It was also observed anemia, thrombocytopenia and alterations of the normal values of the number of leukocytes in these animals. In biochemical profile, only ALT (alanine transaminase) was significantly higher in dogs with positive molecular detection. It was concluded that the molecular tools are potent for the Leishmania detection and identification of positive dogs in endemic areas, and allow diagnosis in asymptomatic dogs. Thus the molecular test becomes essential for the completion of diagnosis in veterinary clinic, allowing the correct actions to control this disease.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-27Bitstream added on 2014-06-13T19:51:41Z : No. of bitstreams: 1 tenorio_ms_me_botfm_prot.pdf: 32328989 bytes, checksum: 58bf70d9322c8ac4bb4bd82408775473 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Not available

Orientadora : Profª Drª Vanete Thomaz-Soccol / Co-orientadora : Profª Drª Silvana Maria Alban / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba,26/07/2014 / Inclui referências / Área de concentração: Parasitologia / Resumo:As leishmanioses são causadas por protozoários do gênero Leishmania Ross, 1903. Esta doença é uma das principais parasitoses negligenciadas, re-emergentes e afeta cerca de 350 milhões de indivíduos no mundo. O objetivo deste trabalho foi identificar peptídeos miméticos, para uso como antígenos em imunodiagnóstico e imunoprofilaxia da leishmaniose tegumentar americana (LTA). Bacteriófagos, expressando peptídeos em sua superfície, foram selecionados por imunoglobulinas específicas para Leishmania (Vianna) braziliensis (L. braziliensis). Posteriormente os mesmos foram submetidos à extração e sequenciamento do seu DNA. Três peptídeos (P-1, P-2 e P-3) foram identificados, sintetizados e inoculados individualmente ou combinados (MIX) em hamsters golden. Os animais imunizados com peptídeos produziram anticorpos que reconheceram diferentes proteínas do antígeno solúvel (AS) de L. braziliensis. A comparação das sequências dos três peptídeos, em banco de dados, demonstrou que elas apresentam homologia com glicoproteína de 63 kDa de Leishmania, lipofosfoglicano e com outras proteínas hipotéticas de Leishmania. Os peptídeos foram avaliados como antígenos no teste ELISA indireto. Dois grupos de pacientes foram investigados, sendo o primeiro constituído por 25 indivíduos que tiveram diagnóstico parasitológico confirmado e o segundo por 57 pacientes que apresentavam suspeita clínica de LTA, eram moradores de área endêmica e que tinham teste sorológico positivo para a doença. Os três peptídeos e o MIX foram imunorreativos contra soro de pacientes dos dois grupos. O peptídeo 1, 2, 3, MIX e AS reagiram com 64, 56, 44/56, 40/72 e 80% das amostras de soro, respectivamente. No Grupo 2, os três peptídeos só ou em combinação foram capazes de diagnosticar 82 a 84% dos indivíduos. Para obtenção do ponto de corte (Cut-off) entre soros positivos e negativos dois cálculos foram aplicados. O primeiro foi realizado calculando a média das absorbâncias obtidas para um grupo de indivíduos considerados negativos e acrescidos de dois desvios padrão (2SD) e o segundo foi empregando a Curva ROC (Receiver Operating Characteristics). As sensibilidades do teste ELISA utilizando os peptídeos foram de 64 a 74% para o peptídeo 1, 56 a 65% para o peptídeo 2, 44 a 68% para o peptídeo 3, 40 a 79% para o MIX e de 80 e 91% para o AS. O MIX de peptídeos apresentou o melhor desempenho (79% de sensibilidade) entre os peptídeos seguido do P-1 (74%). A aplicação do teste t sugeriu que o P-1 seria melhor alternativa entre os peptídeos para o diagnóstico da LTA. As especificidades dos antígenos variaram de 92 a 100% demonstrando a habilidade destes em diagnosticar corretamente os indivíduos sadios. Reações cruzadas com soros de pacientes com doença de chagas, hanseníase e tuberculose foram avaliadas contra todos os antígenos. A reação cruzada com soro de pacientes com doença de chagas foi 0% para o P-1 enquanto que para o AS foi 60%. Os peptídeos sintéticos também foram testados em ensaios de imunoproteção contra leishmaniose experimental (LE) em hamsters. Foi possível observar que os animais do grupo controle positivo (que receberam o desafio com L. braziliensis e não receberam peptídeos) apresentaram lesões específicas de LE, enquanto que os animais imunizados com os peptídeos individualmente ou em combinação não apresentaram lesões ou as apresentaram em menor número. Os animais que receberam o peptídeo 2 não desenvolveram lesões. Promastigotas de L. braziliensis foram isoladas, em meio de cultura, da pata, baço e fígado de animais de todos os grupos, com exceção do grupo dois e do grupo controle negativo. Essas análises demonstram que a metodologia selecionada para a realização dessa pesquisa foi adequada, visto que sequências peptídicas com homologia aos principais fatores de virulência de Leishmania sp. foram obtidas, resultados promissores em testes sorológicos de diagnóstico foram alcançados e imunoproteção de animais contra a leishmaniose experimental foi observada. Palavras-chave: Phage display. leishmaniose. ELISA. Vacinas. / Abstract: Leishmaniosis are caused by protozoan parasites of the genus Leishmania Ross, 1903. This is one of the main neglected, re-emerging parasitic diseases and affects about 350 million people worldwide. The objective of this study was to identify mimetic peptides to use as antigens in immunodiagnosis and immunoprophylaxis of American Cutaneous Leishmaniosis (ACL). Bacteriophages expressing peptides on their surface were selected by specific immunoglobulins for Leishmania (Vianna) braziliensis (L. braziliensis). Subsequently, they were subjected to DNA extraction and sequencing. Three peptides (P-1, P-2 e P-3) were identified, synthesized and individually or combined (MIX) inoculated in Golden hamsters. Animals immunized with peptides produced antibodies that recognized different proteins from the Soluble Antigen (SA) from L. braziliensis. Comparison of the sequences of the three peptides in database showed that they have similarity with a 63 kDa glycoprotein of Leishmania, a lipophosphoglycan and other hypothetical proteins of Leishmania. The peptides were evaluated as antigens in indirect ELISA. Two groups of patients were studied: the first consists of 25 individuals who had confirmed parasitological diagnosis and the second group of 57 patients who had clinical suspicion of ACL and were residents of endemic area and also had a positive serologic test for the disease. The three peptides and the MIX were immunoreactive against sera of patients in both groups. Peptide 1, 2, 3, MIX and AS were reactive with 64, 56, 44/56, 40/72 and 80% sera samples, respectively. In Group 2, the three peptides alone or in combination were able to diagnose 82 a 84% of individuals. In order to obtain the cut-off between positive and negative sera, two calculations were applied. The first one was conducted by calculating the mean absorbance obtained for a group of individuals considered negative plus two standard deviations (2SD). The second calculation was using the ROC curve (Receiver Operating Characteristics). The sensibility of the ELISA assay using the peptides were 64 to 74% for peptide 1, 56 to 65% for peptide 2, 44 to 68% for peptide 3, 40 to 79% for the MIX and 80 to 91% for the SA. The MIX of peptides showed the best performance (79%) among the peptides followed by P-1 (74%). The application of the t-test suggested that P-1 was the best alternative among the peptides for the diagnosis of ACL.The specificities of antigens ranged from 92% to 100% demonstrating the ability to correctly diagnose the healthy individuals. Cross-reactions with sera from patients with Chagas disease, leprosy and tuberculosis were evaluated against all antigens. Cross-reactivity with Chagas disease was zero for the P-1 and 60% for SA. The synthetic peptides were also tested in assays of immune protection against experimental Leishmaniosis (EL) in hamsters. It was possible to observe that the animals in the positive control group (that received a challenge with L. braziliensis and did not receive peptides) presented specific lesions of EL, whereas animals immunized with the peptides alone or in combination presented a few or no lesions. The animals receiving the peptide 2 did not develop lesions. Promastigotes of L. braziliensis were isolated in culture medium from the paw, spleen and liver from animals of all groups except group 2 and negative control group. These analysis show that the methodology selected for this study was appropriate. Since peptide sequences with homology to the main virulence factors of Leishmania sp. were obtained, promising results in serological diagnostic tests were achieved and immune protection of animals against EL was observed. Keywords: Phage display. Leishmaniosis. ELISA. Vaccines.

Submitted by PAULO HENRIQUE LEAL BERTOLO null (henrique_medvet@yahoo.com.br) on 2017-04-13T18:33:10Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Paulo_Henrique_leal_Bertolo.pdf: 1792617 bytes, checksum: 2f57fae9d383e993afd0d14baabfbac8 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-04-17T13:09:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 bertolo_phl_me_jabo.pdf: 1792617 bytes, checksum: 2f57fae9d383e993afd0d14baabfbac8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-17T13:09:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 bertolo_phl_me_jabo.pdf: 1792617 bytes, checksum: 2f57fae9d383e993afd0d14baabfbac8 (MD5) Previous issue date: 2017-02-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A onicogrifose é um dos principais achados clínicos em cães com Leishmaniose Visceral (LV), porém são escassas as pesquisas com enfoque na região ungueal de cães infectados. O objetivo do presente estudo foi avaliar a região ungueal de cães com LV que apresentaram ou não onicogrifose, por meio das análises histopatológica e imuno-histoquímica. O terceiro dígito dos membros torácico e pélvico foi colhido de 16 cães naturalmente infectados com Leishmania infantum, sem predileção por sexo, raça ou idade. Os animais foram divididos em dois grupos, cães com onicogrifose (GO; n=7) e sem onicogrifose (GSO; n=9). Os dígitos foram avaliados em quatro regiões (epiderme/derme dorsal, epiderme/derme ventral, matriz ungueal dorsal e matriz ungueal ventral). Todas as lesões observadas (infiltrado inflamatório mononuclear, degeneração vacuolar dos queratinócitos basais, separação dermo-epidérmica e incontinência pigmentar) estavam presentes em ambos os grupos, porém em maior intensidade nos dígitos de cães com onicrogrifose. A imunomarcação das formas amastigotas de Leishmania infantum foi observada nas diferentes áreas do dígito. Observou-se diferença estatística entre as áreas de epiderme/derme dorsal com a matriz dorsal e com a matriz ventral nos dígitos do membro pélvico e, entre a epiderme/derme dorsal com a matriz dorsal no membro torácico do grupo GO. Conclui-se que a principal alteração histopatológica da região ungueal de cães com LV é o infiltrado inflamatório mononuclear independente da presença de onicogrifose. Estes animais apresentaram a presença do parasita na região responsável pelo crescimento da unha. Esta onicopatia parece estar associada à presença do parasita e ao microambiente inflamatório local. / Onychogryphosis is among the main clinical findings in dogs with Visceral Leishmaniasis (VL). However, there are few researches focusing on the claw region of infected dogs. This aim of this study was to evaluate claw region of dogs with symptomatic CanL with and without onychogryphosis, through histopathological and immunohistochemical analyzes. The third digit of the right thoracic and pelvic limbs was collected from 16 dogs with CanL, without for sex, breed or age predilection. The dogs were divided into two groups, dogs with (GO; n = 7) and without onychogryphosis (GSO; n = 9). The digits were evaluated in four regions (dorsal epidermis / dermis, dorsal matrix / dermis, ventral matrix / dermis, ventral epidermis / dermis). All the lesions observed (mononuclear inflammatory infiltrate, basal keratinocyte vacuolation, dermoepidermal clefting and pigmentary incontinence) were presente in both groups, but more strongly in the digits of dogs with onychogryphosis. Immunohistochemistry revealed numerous amastigotes in the different areas of the digit. Statistical difference was observed between dorsal epidermis / dermis areas with dorsal matrix / dermis and ventral matrix / dermis in the digits of the pelvic limb, and between dorsal epidermis / dermis áreas with dorsal matrix / dermis of the thoracic limb in dogs with onychogryphosis. In conclusion, main histopathological alteration of the claw region of dogs with CanL was mononuclear inflammatory infiltrate in the dorsal epidermis / dermis area independently of onychogryphosis. The dogs presented high parasitic load in the region responsible for the growth of the nail. This onycopathy does not appear to be associated only with presence of the parasite, but also with local inflammatory microenvironment, which possibly contributes to onychogryphosis by release of inflammatory mediators at the site.

Orientador: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Coorientador: Valéria Marçal Felix de Lima / Banca: Ana Lúcia Abreu Silva / Banca: Hélio José Montassier / Resumo: A Leishmaniose Visceral (LV) é uma zoonose de distribuição mundial. No Brasil foi descrita em várias regiões, mas na região sudeste vem ocorrendo de forma significativa desde 1998, na região de Araçatuba, SP. O cão é o principal reservatório doméstico do protozoário Leishmania chagasi e a principal fonte de contaminação para o homem. A resposta imune do hospedeiro canino frente ao parasito é variável e por este fato, os cães apresentam sinais clínicos acentuados ou ausência destes. Os animais que apresentam maior carga parasitária e sinais clínicos mais severos são considerados susceptíveis à infecção pelo parasito. Este padrão está associado ao perfil de citocinas produzidas, ou seja, na predominância de citocinas Th1 são resistentes ou Th2 susceptíveis. No entanto existem muitas variações neste padrão de resposta, ou seja, muitos animais apresentam a produção de citocinas Th1 e Th2, sugerindo um desequilíbrio na proporção de citocinas pró e antiinflamatórias, que favorecem a multiplicação e sobrevivência dos parasitos. Este desequilíbrio tem influência direta sobre a ativação de macrófagos e sobre sua capacidade microbicida e de apresentação antigênica, levando a uma anergia de linfócitos T e a manutenção e cronicidade da infecção. As quimiocinas são citocinas com potente atividade quimiotática sobre leucócitos. Na LV existem estudos no homem e em modelos experimentais, mas no cão apenas um estudo avalia o seu papel no baço. Existe muita controvérsia sobre o seu verdadeiro papel na LV, pois descreve-se tanto a sua ação próinflamatória quanto a sua ação deletéria, que favorece o parasito. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar o papel das quimiocinas MIP-1a e MCP-1 no baço e fígado de 30 cães... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Visceral Leishmaniasis (VL) is a zoonosis of worldwide distribution. In Brazil has been described in several regions, but has been occurring in the Southeast significantly since 1998 in Araçatuba, SP. The dog is the main domestic reservoir of Leishmania chagasi and the main source of contamination for humans. The canine host immune response against the parasite is variable. Dogs have severe intensity or absence of clinical symptoms. Animals that have a higher parasite load and clinical signs are considered more susceptible to infection by the parasite. This pattern is associated with the profile of cytokines produced, in the predominance of Th1 they are resistant or in the predominance of Th2 they are susceptible. However there are many variations on this response pattern, many animals have the production of Th1 and Th2 cytokines, suggesting an imbalance in the proportion of pro and anti-inflammatory cytokines, which favor the multiplication and survival of parasites. This imbalance has a direct influence on the activation of macrophages and their microbicidal activity and antigen presentation, leading to anergy of T lymphocytes and the maintenance and chronicity of infection. Chemokines are cytokines with potent chemotactic activity on leukocytes. In the VL are studies in humans and experimental models, but the dog only one study assessing its role in the spleen. There is much controversy over its true role in VL, because it describes both its pro-inflammatory action and its deleterious effects, which favors the parasite. Therefore, the aim of this study was to evaluate the role of chemokines MIP-1α and MCP-1 in the spleen and liver of 30 dogs naturally infected with Leishmania spp. and compare the findings with the parasite load of each organ. For this purpose, samples of liver and spleen were analyzed... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre