Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_daiane_drawanz_hartwig.pdf: 4007239 bytes, checksum: 7d50e5824c8c66e23049bd005ad56ea6 (MD5) Previous issue date: 2010-12-20 / Leptospirosis is a serious infectious disease caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira, it is classified as a zoonosis of worldwide distribution. This disease results morbidity and mortality in humans and animals, justifying the application of prophylactic strategies. Current vaccines against leptospirosis are composed of inactivated bacteria and do not stimulate cross-protection. Thus, there is need to develop a safe and effective vaccine. In this study, we used the outer membrane proteins LigANI e LipL32, because they have been identified as vaccinogens. These, in their recombinant form, are usually expressed in Escherichia coli and as subunit vaccines have shown variable efficacy. We describe in this work the use of Pichia pastoris as an alternative expression system. The genes ligANI and lipL32 were cloned into vector pPICZαB, which allowed the secretory expression of proteins in P. pastoris. The protein yield in this system was 276 mg/L for LigANI and 285 mg/L for LipL32. The recombinant proteins were glycosylated and remained antigenic. The immunoprotective potential was evaluated in the hamster model, challenged with virulent L. interrogans serovar Copenhageni. Both proteins induced high levels of antibodies (P < 0.001). The animals immunized with LigANI and LipL32 using aluminium hydroxide as adjuvant, showed no protection against challenge, but showed a significant increase in survival (P < 0.001). In conclusion, the yeast P. pastoris has proved an efficient heterologous expression system of LigANI and LipL32 L. interrogans proteins. The secreted and glycosylated LigANI protein may be used in the control of leptospirosis, although additional studies are needed. / Leptospirose é uma doença infecciosa grave causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira, sendo classificada como uma zoonose de ampla distribuição mundial. Esta doença resulta morbidade e mortalidade em humanos e animais, justificando a aplicação de estratégias profiláticas. As vacinas atuais contra a leptospirose são compostas por bactérias inativadas e não estimulam proteção cruzada. Assim, existe a necessidade de desenvolver uma vacina efetiva. No presente estudo, as proteínas de membrana externa LigANI e LipL32 foram utilizadas, pois são apontadas como potenciais vacinógenos. Estas, em sua forma recombinante, costumam ser expressas em Escherichia coli e, como vacina de subunidade tem apresentado eficiência variável. Nós descrevemos neste trabalho a utilização da levedura Pichia pastoris como sistema de expressão alternativo. Os genes ligANI e lipL32 foram clonados no vetor pPICZαB, que permitiu a expressão secretória das proteínas em P. pastoris. O rendimento das proteínas neste sistema foi de 276 mg/L para LigANI e 285 mg/L para LipL32. As proteínas recombinantes foram glicosiladas e mantiveram-se antigênicas. O potencial imunoprotetor das proteínas foi avaliado em modelo hamster desafiado com cepa virulenta de L. interrogans sorovar Copenhageni. Ambas as proteínas induziram altas taxas de anticorpos (P < 0,001). Os animais imunizados com LigANI e LipL32, utilizando hidróxido de alumínio como adjuvante, não apresentaram proteção contra o desafio, mas demonstraram um aumento significativo na sobrevida (P < 0,001). Em conclusão, a levedura P. pastoris demonstrou ser um eficiente sistema de expressão heterólogo das proteínas LigANI e LipL32 de L. interrogans. A proteína LigANI secretada e glicosilada pode ser utilizada no controle da leptospirose, embora estudos adicionais sejam necessários.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_andre_grassmann.pdf: 1497268 bytes, checksum: 73f55a329ef2c9be70227b63b45785a2 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Leptospirosis is an infectious disease that affects humans, wild and domestic animals worldwide. Pathogenic spirochetes from the Leptospira genus are the causative agents of this zoonosis. The several Leptospira species have noted antigenic diversity, even within the same species. This is the main reason current bacterin vaccines have limitations, such as adverse effects and short term immunity, restricting their use in human populations. The need for effective leptospirosis vaccines promoted studies on characterization of new vaccine candidates. The 32 kDa outer membrane lipoprotein, LipL32, is the most abundant protein in the whole leptospira proteome, it is conserved in all pathogenic serovars and absent in saprophytes. This protein is immunogenic and able to bind to mammalian extracellular matrix. However, LipL32 subunit vaccines did not protect animals against challenge. In an attempt to solve this, we use LipL32 fused and coadministered with B subunit of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LTB) to enhance the immune response. LTB is a non-toxic molecule with immunoestimulatory and immunomodulatory properties. The recombinant proteins rLTB, rLipL32 and rLTB::LipL32 were expressed in E. coli, purified and characterized. Female hamsters were distributed in groups as follows: rLTB; rLTB+rLipL32; rLTB::LipL32, homologous bacterin; PBS. The serum from each animal was collected for humoral immune response determination by ELISA. The animals were challenged with 5×LD50 dose of Leptospira interrogans strain Fiocruz L1-130. Both treatments induced high titers of anti-rLipL32 antibodies. The rLTB+rLipL32 and rLTB::LipL32 treatments afforded significant protective response upon challenge, when compared to control groups (p<0.05). No prior study with leptospirosis had used LTB as the adjuvant, or fused antigens in an attempt to control this disease. Furthermore, this is the first report of a protective subunit vaccine using rLipL32 as the antigen, and an important contribution towards the development of improved leptospirosis vaccines. / A leptospirose é uma doença infecciosa que afeta humanos e animais silvestres e domésticos em todo mundo. As espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira são os agentes causadores desta zoonose. As diversas espécies de leptospiras possuem notada diversidade antigênica, inclusive em uma mesma espécie. Esta característica resulta em limitação das atuais vacinas bacterinas que não induzem proteção cruzada entre os diferentes sorovares. Além disso, estas vacinas geram efeitos adversos e imunidade de curta duração, restringindo seu uso em populações humanas. A necessidade de novas vacinas eficazes contra a leptospirose estimulou estudos para caracterizar novos antígenos vacinais. A lipoproteína de membrana externa de 32 kDa, LipL32 é a proteína mais abundante no proteoma total da leptospira, conservada entre todos os sorovares patogênicos e ausente nas leptospiras saprófitas. Esta proteína é imunogênica e possui habilidade de ligar-se à matriz extracelular de mamíferos. Porém, animais inoculados com vacinas de subunidade utilizando LipL32 não sobrevivem ao desafio. Em função disso, utilizamos LipL32 fusionada e co-administrada com a subunidade B da enterotoxina termolábil de Escherichia coli (LTB) para melhorar a resposta imune. LTB é uma molécula atóxica com reconhecida atividade imunoestimuladora e imunomoduladora. As proteínas recombinantes rLTB, rLipL32 e rLTB::LipL32 foram produzidas em E. coli, purificadas e caracterizadas. Hamsters fêmeas foram distribuídas em grupos e inoculadas com duas doses, da seguinte forma: rLTB; rLTB+rLipL32; rLTB::LipL32, bacterina homóloga e PBS. Soro foi coletado individualmente para determinação da resposta imune humoral por ELISA. Os animais foram desafiados com uma dose de 5×DL50 de Leptospira interrogans cepa Fiocruz L1-130. Os tratamentos induziram altos títulos de anticorpos anti-rLipL32. Os tratamentos rLTB+rLipL32 e rLTB::LipL32 induziram resposta protetora significativa frente ao desafio quando comparados com os grupos controle (p<0,05). Nenhum estudo anterior usou LTB como adjuvante para uma vacina contra leptospirose, tampouco antígenos fusionados com o intuito de controlar esta doença. Além disso, este é o primeiro relato de indução de imunidade protetora utilizando rLipL32 como vacina de subunidade, uma importante contribuição para o desenvolvimento de vacinas mais eficazes contra leptospirose.

Leptospirose é uma doença infecciosa emergente cujos agentes etiológicos são espécies patogênicas do gênero Leptospira. Leptospiras patogênicas possuem inúmeros genes específicos codificando proteínas com funções desconhecidas, sugerindo que as leptospiras apresentam fatores de virulência únicos. Adesinas bacterianas são importantes fatores de virulência e, assim, a identificação de adesinas conservadas em espécies patogênicas de Leptospira pela construção de bibliotecas genômicas expostas na superfície de bacteriófagos (shotgun phage display), seguida por seleção em células e/ou componentes da matriz extracelular (biopanning), pode revelar novos antígenos e alvos para o tratamento e prevenção da leptospirose. Bibliotecas foram construídas com o DNA genômico de L. interrogans fragmentado e o fagomídeo pG8SAET, sendo testadas algumas abordagens para clonagem como a ligação entre extremidades cegas (blunt-end) e técnicas baseadas em ligação entre extremidades coesivas, incluindo a obtenção de ORESTES e a utilização de adaptadores em grampo. Apesar de serem encontradas algumas limitações, a clonagem por ligação blunt-end se mostrou a mais eficiente para a construção de bibliotecas, sendo adotada para a construção de três bibliotecas em maior escala. A seleção de novas possíveis adesinas a partir das bibliotecas construídas foi realizada em células eucarióticas através da metodologia BRASIL. A primeira biblioteca (BBT1) exibiu 106 clones totais, a partir da qual foram selecionados quatro proteínas em fase apenas com a proteína VIII do fago (pVIII). No entanto, nenhuma delas seria exposta por programas de predição na bactéria. Outras duas bibliotecas foram construídas (BBT2 e BBT3), as quais obtiveram um número ideal de clones para uma ampla cobertura do genoma (>2x107 clones). Por apresentar maior proporção de clones válidos, a BBT2 foi utilizada para a seleção de adesinas, resultando em onze clones em fase com pVIII e/ou sequência sinal do fago. Análises por programas de predição revelaram três proteínas hipotéticas, denominadas LepA962, LepA069 e LepA388, as quais poderiam estar expostas ou ser secretadas pela bactéria, sugerindo uma possível função de adesina. O estudo da proteína LepA388 levou ao reconhecimento de outras doze proteínas semelhantes e pertencentes a uma família paráloga contendo um domínio denominado DUF_61, motivo de função desconhecida presente em proteínas compartilhadas somente entre as espécies patogênicas mais virulentas de Leptospira. Por esta razão, a proteína LepA388 foi a mais estudada. A clonagem de três porções da proteína (LepA388P, LepA388NR e LepA388F) para expressão heteróloga resultou em proteínas recombinantes insolúveis e, considerando a riqueza em resíduos de cisteína presente em sua estrutura, não foi possível renaturá-las adequadamente. Diante dos obstáculos encontrados, apenas a porção contendo a sequência apresentada pelo fago (LepA388P) foi utilizada para obtenção de antissoros em camundongos, os quais apresentaram altos títulos, demonstrando a alta imunogenicidade da proteína LepA388P. O reconhecimento de proteínas nativas da família paráloga DUF_61 em extratos de diferentes sorovares de Leptospira não foi observado, assim como sua expressão in vitro a partir de bactérias em diferentes condições de cultivo. Estudos adicionais sobre a expressão in vivo e funções dos membros desta família são necessários para uma compreensão mais ampla de seu papel na biologia de leptospiras e, possivelmente, na patogênese da leptospirose. / Leptospirosis is an emerging infectious disease whose etiologic agents are pathogenic species of the genus Leptospira. Pathogenic leptospires have countless specific genes encoding proteins with unknown functions, suggesting that leptospires have unique virulence factors. Bacterial adhesins are important virulence factors and so the identification of conserved adhesins in pathogenic Leptospira species from shotgun phage display libraries, followed by selection (biopanning) in cells and/or extracellular matrix components, can reveal new antigens and strategies for leptospirosis treatment and prevention. Libraries were constructed using fragmented genomic DNA from L. interrogans and pG8SAET phagemid vector. Cloning approaches included blunt-end ligation and techniques based in cohesive-end ligation, such as ORESTES strategy and hairpin linkers. Despite some limitations, cloning by blunt-end ligation was the most efficient for library construction, being adopted for the construction of three libraries on a larger scale. Selection of new possible adhesins was performed by biopanning of the libraries in eukaryotic cells through BRASIL methodology. The first library called BBT1 exhibited approximately 106 total clones, and its biopanning resulted in four proteins fused to phage protein VIII, but none of them were expected to be exposed by the bacteria. Other libraries were built (BBT2 and BBT3) which reached the expected number of clones to obtain a larger genome representation (> 2x107 clones). Since it showed the highest proportion of positive clones, BBT2 was selected to perform a second biopanning, resulting in eleven proteins fused to phage protein VIII and/or signal peptide. In silico analysis revealed three hypothetical proteins, named LepA962, LepA069 and LepA388, that would be exposed or secreted by the bacteria, suggesting a possible adhesin function. The study of LepA388 protein led to the recognition of twelve other similar proteins belonging to a paralogous family that contains a domain called DUF_61, domain of unknown function that is present in proteins shared only among the most virulent pathogenic species of Leptospira. For this reason, the LepA388 protein was the most studied. The cloning of three portions of the protein (LepA388P, LepA388NR and LepA388F) for heterologous expression resulted in insoluble recombinant proteins, and given the presence of many cysteine residues in its structure, it was not possible to renature them appropriately. In face of the imposed obstacles, only the portion containing the sequence presented by the bacteriophage (LepA388P) was used to obtain antisera in mice, which showed high titers, demonstrating the high immunogenicity of the protein LepA388P. Recognition of native DUF_61 paralogous family proteins in extracts from distinct Leptospira serovars was not observed, as well as its in vitro expression from bacteria cultured in different conditions. Additional studies on the in vivo expression and functions of members of this family are needed for a broader understanding of their role in leptospiral biology and possibly in the pathogenesis of leptospirosis.

A leptospirose é uma doença endêmica causada por Leptospiras. O genoma da Leptospira interrogans sorovar Copenhageni foi analisado para seleção de potenciais antígenos vacinais. Oito genes foram selecionados e clonados para expressão e purificação dos antígenos. A salmonela SL3261 foi usada como carregadora dos genes de leptospira em vetor pAEsox para expressão das proteínas in vivo. As salmonelas recombinantes induziram resposta imune quando administradas em camundongos por via intraperitoneal. Hamsters foram imunizados com as salmonelas, observando-se que a SLLIC10191 induziu proteção parcial no desafio com L. interrogans sorovar Pomona. Vetores híbridos foram construídos para expressão simultânea de dois antígenos em salmonelas in vivo. Observamos indução de anticorpos específicos, porém, os ensaios de desafio não foram conclusivos. Vários parâmetros do desafio com sorovar Copenhageni foram estudados, como contagem das bactérias e ajuste de dose, variação de virulência por passagens em cultivo e interferência da idade dos animais. / Leptospirosis is an endemic disease caused by Leptospira. The genome of Leptospira interrogans serovar Copenhageni was analyzed for screening potential vaccine antigens. Eight genes were selected and cloned for expression and purification. Salmonella SL3261 was used as carrier of the genes of leptospira in pAEsox vector for in vivo proteins expression of proteins in vivo. Recombinant Salmonella induced immune response when administered intraperitoneally in mice intraperitoneally. Hamsters were immunized with salmonella, resulting we observed that the SLLIC10191 induced partial protection against on challenge with L. interrogans serovar Pomona. Hybrid vectors were constructed for expression of two antigens simultaneously by salmonella in vivo. We observed induction of specific antibodies, however, the challenge tests were not conclusive. Several parameters of the challenge assay with serovar Copenhageni were studied, such as the counting of bacteria count and dose adjustment, changes in virulence by passages in culture and interference backgroundof from the age of animals.

A leptospirose é uma zoonose causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. No mundo, aproximadamente 500.000 casos são reportados a cada ano, com 10% de taxa de mortalidade. Atualmente, vacinas contra leptospirose são compostas por células inativadas e são ineficazes em diferentes aspectos. Após analise do genoma, os genes LIC11121, LIC11087, LIC11228 e LIC11084 foram escolhidos para caracterização da imunogenicidade de suas respectivas proteínas. Esses genes foram clonados no vetor de expressão pAE e as proteínas recombinantes foram purificadas. Os resultados sugerem que essas proteínas podem estar localizadas na membrana externa, são imunogênicas, possivelmente expressas durante a infecção e que podem ter envolvimento em mecanismos de evasão do sistema imune e de patogenicidade da bactéria. Além disso, em um de dois experimentos, a proteína rLIC11084 induziu imunidade protetora parcial em hamsters imunizados frente desafio letal. / Leptospirosis is a zoonotic disease caused by pathogenic bacteria of genus Leptospira. In the world, nearly 500,000 cases are reported each year, with 10% of mortality rate. Currently, vaccines against leptospirosis are composed by inactivated cells that are ineffective in many aspects. After genome analysis, the genes LIC11121, LIC11087, LIC11228 e LIC11084 were chosen for immunogenicity characterization of their respective proteins. These genes were cloned in the pAE expression vector and the proteins encoded by LIC11087, LIC11228 and LIC11084 were purified. The results suggest the localization of these proteins in the bacterial outer membrane, are immunogenic, are possibly expressed during infection and may have involvement in mechanisms of immune system evasion and pathogenicity. Moreover, in one of two experiments, the rLIC11084 protein induced partial protective immunity of immunized hamsters against lethal challenge.

A leptospirose é uma zoonose causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. O sequenciamento do genoma completo de L. interrogans sorovar Copenhageni tem permitido a obtenção e caracterização de proteínas potencialmente envolvidas na patogênese desta bactéria, como lipoproteínas e proteínas de membrana externa. Neste trabalho, foram estudados três genes, OmpL1, LIC10731 e LIC10645, dos quais o gene OmpL1 foi o mais frequente em diferentes espécies de Leptospira. As proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade ao metal. As três proteínas recombinantes promoveram resposta humoral e celular após imunização em camundongos. Ensaios de adesão mostraram que as proteínas se ligam à laminina e plasminogênio, e adicionalmente a proteína OmpL1 se liga ao fibrinogênio e fibronectina plasmática. A proteína OmpL1 foi bastante reativa com soro de pacientes de leptospirose. Os resultados sugerem que as proteínas referentes aos genes estudados podem desempenhar um papel na patogênese da bactéria. / Leptospirosis is a zoonosis caused by pathogenic bacteria of genus Leptospira. Annotation of the genome sequences of L. interrogans serovar Copenhageni allows the identification and characterization of proteins potentially involved in the pathogenesis of this bacterium, such as lipoproteins and outer-membrane proteins. The present study characterized three genes, OmpL1, LIC10731 and LIC10645, and one of them, OmpL1, was the most frequent among different species of Leptospira. The recombinant proteins were purified by metal-chelating chromatography. All three recombinant proteins promoted humoral and cellular response after immunization in mice. Binding assays showed that all proteins interact to laminin and plasminogen, and additionally protein OmpL1 binds to fibrinogen and plasma fibronectin. OmpL1 was highly reactive with positive-leptospirosis human sera. The results suggest that the proteins encoded by these genes may play a role in the bacterium pathogenesis.

Leptospirose é uma zoonose mundial que causa grandes prejuízos econômicos e sociais. Os mecanismos de patogenicidade da leptospira ainda não estão totalmente elucidados. Nesse trabalho foi avaliado o papel de três proteínas hipotéticas de superfície na patogenia da leptospirose: LIC11009, LIC11360 e LIC11975. Os genes foram clonados a partir do DNA da L. interrogans sorovar Copenhageni e as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade. RT-qPCR mostrou a transcrição dos genes em leptospiras. As proteínas recombinantes reagiram com soro de humanos diagnosticados com leptospirose. rLIC11009 induziu somente resposta imune Th1 em camundongos, enquanto que rLIC11360 e rLIC11975 induziram resposta Th1 e Th2. As três proteínas recombinantes se ligaram à laminina e plasminogênio, enquanto rLIC11360 e rLIC11975 também se ligaram à fibronectina plasmática e fibrinogênio. Em adição, rLIC11360 se ligou ainda aos reguladores do sistema complemento fator H e C4BP. Os resultados sugerem que as proteínas estudadas podem auxiliar a leptospira a evadir e invadir o hospedeiro. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis that causes great economic and social losses. The pathogenic mechanisms of leptospira are not yet fully elucidated. In this study we evaluated the role of three hypothetical surface proteins in the leptospiral pathogenesis: LIC11009, LIC11360 and LIC11975. Genes were cloned from DNA of L. interrogans serovar Copenhageni and the recombinant proteins were purified by affinity chromatography. RT - qPCR data have shown that the genes are fully transcribed in leptospires. Recombinant proteins reacted with sera from humans diagnosed with leptospirosis. rLIC11009 induced Th1 immune response in mice, whereas rLIC11360 and rLIC11975 promoted both Th1 and Th2. The three recombinant proteins interacted with laminin and plasminogen while, rLIC11360 and rLIC11975, also interacted with plasma fibronectin and fibrinogen. In addition, rLIC11360 interacted with the complement regulators factor H and C4BP. These results suggest that the proteins tested can help leptospires to evade and invade the host.

A leptospirose é uma zoonose de distribuição mundial causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira. Resultados experimentais demonstraram que a patogênese pode estar relacionada com a capacidade destas bactérias em aderir a proteínas da matriz extracelular, escapar da resposta imune do hospedeiro e de produzir toxinas. Este trabalho teve como objetivo identificar proteínas secretadas por Leptospira interrogans sorovar Pomona estirpe Fromm kennewicki (patogênica) e Leptospira biflexa sorovar Patoc estirpe Patoc I (saprófita), através de análise proteômica. As leptospiras foram cultivadas em meio EMJH suplementado com soro de coelho ou albumina bovina. Os sobrenadantes foram filtrados, dialisados e liofilizados para aplicação das tecnologias de análise proteômica utilizando gel bidimensional e análise em solução. A análise dos peptídeos obtidos, nos dois procedimentos, foi realizada utilizando-se LC/MS/MS. Foi possível a identificação de 159 proteínas diferentes nas amostras de L.interrogans, entre as quais 64 foram positivas em pelo menos uma das ferramentas usadas para a predição. Em L. biflexa, 104 proteínas diferentes foram identificadas, entre elas 43 proteínas foram positivas pela análise in silico. Entre as proteínas identificadas, estão aquelas que possuem peptídeo sinal sec ou tat dependentes. Em outras, a predição da localização celular é desconhecida ou podem ter múltiplos sítios de localização, e ainda, proteínas que não possuem peptídeo sinal e que podem ser secretadas por mecanismos não convencionais. Muitos destas são proteínas hipotéticas sem domínios conservados detectados. No que diz respeito à atividade proteolítica, foi identificada a presença de metaloproteases no secretoma de L.interrogans. Não houve detecção da presença significativa de proteases bacterianas em amostras de L. biflexa. A identificação e a caracterização funcional de proteínas secretadas poderão contribuir para a elucidação dos mecanismos patogênicos e no desenvolvimento de novas estratégias para o tratamento e prevenção de leptospirose. / Leptospirosis is a zoonosis of worldwide distribution caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira. The mechanisms by which leptospires invade the host and cause the disease are not yet fully understood. Experimental results have shown that the pathogenesis may be related to the ability of these bacteria to bind to extracellular matrix proteins, to escape hosts immune responses and to produce toxins. This work aimed to identify secreted proteins by Leptospira interrogans serovar Pomona strain Fromm kennewicki (pathogenic) and Leptospira biflexa serovar strain Patoc Patoc I (saprophyte) through proteomic analysis. The leptospires were grown in EMJH supplemented with rabbit serum or BSA. Supernatants were filtered, dialyzed and lyophilized to proteomic technology, two-dimensional gel and non-gel. The analysis of the obtained peptides in two procedures was performed using LC/MS/LC. It was possible to identify 159 different proteins in the samples of L.interrogans; among them, 64 were positive proteins in at least one of the tools used for prediction. In L. biflexa, 104 different proteins were identified; among them, 43 positive proteins were positive by in silico analysis. Among the identified proteins are those that possess sec or tat dependent signal peptide. In others, the prediction of the cellular location is unknown or may have multiple sites of localization, and even proteins which have no signal peptide can be secreted by unconventional mechanisms. Many of these are hypothetical proteins with no detected putative conserved domains. The presence of metalloproteases has been identified in the L.interrogans´ secretome, using proteolytic assay. There was no significant detection of the presence of bacterial proteases in samples of L. biflexa. The identification and functional characterization of secreted proteins may contribute to the elucidation of pathogenic mechanisms and in the developing of new strategies for the treatment and prevention of leptospirosis.

A leptospirose é uma zoonose causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. Apesar de sua importância, a patogênese e virulência permanecem não elucidadas. As leptospiras não apresentam proteases conhecidas de degradação de matriz extracelular, atividade crucial para a penetração e disseminação nos hospedeiros. Assim, foi proposta a investigação da interação de leptospiras com plasminogênio/plasmina e as implicações para a infecção. As leptospiras capturam plasminogênio na superfície, e este é convertido à plasmina por ativadores do hospedeiro. A plasmina associada propicia degradação de componentes de matriz extracelular, habilidade de penetração e evasão imune. Adicionalmente, as leptospiras estimulam a expressão de ativadores de plasminogênio e metaloproteases de matriz. Os resultados contribuem para o conhecimento do processo infeccioso das leptospiras, descrevendo um novo mecanismo de patogenicidade. / Leptospirosis is a zoonosis caused by pathogenic bacteria from genus Leptospira. Despite its importance, the pathogenicity and virulence remain to be elucidated. The leptospires do not present known proteases able to degrade extracellular matrix, an activity essential for the penetration and dissemination within the hosts. Therefore, we proposed the investigation of the leptospiral interaction with plasminogen/plasmin and its implications for infection. Leptospires capture plasminogen on the surface, which is converted to plasmin by hosts activators. Surface-bound plasmin confers extracellular matrix components degradation, penetration ability and immune evasion. Additionally, leptospires stimulate plasminogen activators and matrix metaloproteases expressions. The results constitute one possible mechanism that contributes to the invasion process and the rapid dissemination of Leptospira.

As bactérias patogênicas do gênero Leptospira são o agente causador da leptospirose, uma doença de importância global. As leptospiras patogênicas causam infecção em um amplo espectro de animais e no homem. As leptospiras podem invadir o corpo humano através de abrasões na pele e mucosa. A invasividade bacteriana depende de várias etapas, tais como: aderência, invasão e disseminação através dos tecidos do hospedeiro. Recentemente, nosso grupo identificou proteínas de membrana externa que atuam como adesinas de leptospira e/ou receptores de componentes do plasma hospedeiro, o que poderia contribuir para a patogenicidade bacteriana. Assim, o presente projeto tem como objetivo avaliar as propriedades funcionais do gene LIC10920, identificado na sequência genômica de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni, como uma proteína hipotética, predita de membrana externa. A sequência LIC10920 foi amplificada por PCR e clonada no vetor de expressão pAE. O plasmídeo pAE contendo o inserto foi introduzido em estirpes de E. coli para a expressão da proteína. A proteína recombinante rLIC10920 foi purificada por cromatografia de afinidade a níquel e sua integridade estrutural foi avaliada pela técnica de dicroísmo circular. Camundongos foram imunizados com a LIC10920 para a avaliação da sua imunogenicidade. A presença de IgG humano contra LIC10920, foi avaliada por ELISA, em amostras de soro de pacientes com leptospirose. Assim, como a sua ligação com componentes da matriz extracelular e plasma do hospedeiro. Animais imunizados apresentaram alto título de anticorpos contra LIC10920. Além disso, a proteína foi reconhecida por anticorpos presente em amostras de soro humano infectado. A proteína foi capaz de interagir com plasminogênio e laminina de maneira dose-dependente e saturável. Em ambas as interações, a participação das regiões imunogênicas se mostrou importante. rLIC10920 foi capaz de capturar o plasminogênio direto do soro humano também de maneira dose-dependente. Por fim, foi observado que o plasminogênio ligado a rLIC10920 pode ser convertido em plasmina. A proteína em estudo é expressa durante a infecção e podemos atribuir a função de adesina, com papel na patogênese da bactéria. / Pathogenic bacteria of genus Leptospira are the causative agent of leptospirosis, a disease of global importance. Pathogenic leptospires cause infection in a broad spectrum of animals and humans. Pathogenic leptospires can efficiently invade the human body through skin and mucosa and promptly spread into blood vessels, reaching target organs. Bacterial invasiveness depends on several steps, such as adherence, invasion and throughout host tissues. Recently, our group has identified outer membrane proteins that act as leptospiral adhesins and/or receptors of host plasma components, which could contribute for bacterial pathogenesis. This project aims to evaluate the functional properties of the gene LIC10920, identified in the genome sequence of Leptospira interrogans serovar Copenhageni, as a predicted outer membrane protein of unknown function. The LIC10920 sequence was amplified by PCR, cloned into the expression vector pAE. Plasmids containing cloned DNA were introduced in E. coli strains for protein expression. The recombinant protein was purified by the metal affinity chromatography and its structural integrity was assessed by circular dichroism spectroscopy. Mice were subcutaneously immunized with LIC10920 for immunogenicity evaluation. The presence of IgG against LIC10920 in confirmed leptospirosis human serum samples was evaluated by ELISA. Binding of protein with extracellular matrix or plasma components was also assessed. Sera from immunized animals show that the rLIC10920 protein is capable to stimulate antibody immune response in mice. In addition, the protein is recognized by antibodies in leptospirosis human serum samples. The recombinant protein was capable of binding plasminogen and laminin. Dose-dependent and saturable binding was observed when increasing concentrations of the rLIC10920 were allowed adhere to a fixed concentration of plasminogen or of laminin, fulfilling the receptor-ligand interactions. In both cases, the participation of the immunogenic regions occurs, but in the case of laminin, the dependence is greater with structured epitopes. It has been shown that plasminogen linked to rLIC10920 can be converted to plasmin in the presence of activator. The recombinant protein was able to capture the plasminogen directly from normal human serum in a dose-dependent manner, suggesting the involvement of native protein in host-pathogen interactions. The protein under study is expressed during the infection and due to its capacity of interaction with host components, we may anticipate its role in leptospiral pathogenesis.