A L-asparaginase (EC 3.5.1.1) é uma enzima importante para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA), neoplasia mais frequente em crianças e adolescentes. A L-asparaginase hidrolisa a L-asparagina resultando em ácido aspártico e amônio, impedindo que as células tumorais utilizem esse aminoácido para síntese proteica, ocasionando a morte celular apoptótica. Atualmente a enzima é obtida a partir de Escherichia coli e Erwinia chrysanthemi; no entanto, ambas as formulações estão associadas a um alto índice de efeitos adversos que comprometem a evolução e eficácia do tratamento. A levedura Saccharomyces cerevisiae tem o gene ASP1 responsável pela produção de L-asparaginase 1 (Sc_ASPase1) que tem sido pouco estudada. Para elucidar as características de Sc_ASPase1 nós expressamos a proteína em E. coli BL21(DE3) e a purificamos por cromatografia de afinidade. Sc_ASPase1 tem uma atividade especifica de 195,4 U/mg para L-asparagina e de 0,36 U/mg para L-glutamina, e um comportamento alostérico com um K0.5 de 75 µM para L-asparagina. Por meio de mutação sitio dirigida demonstramos a importância dos resíduos Thr64-Thy78-Th141-Lys215 para a catálise. As isoformas mutantes da proteína A331D, K335E, Y243S, S301N e ΔG77 não apresentaram melhoria nos parâmetros cinéticos ou atividade específica. Construímos e clonamos Sc_ASPase1 com a deleção dos primeiros 52 aminoácidos, porém nas condições testadas a proteína foi expressa na forma insolúvel. Demonstramos que Sc_ASPase1 possui potencial antineoplásico, pois com 10 U/mL de enzima foi capaz causar a 85% de mortalidade da linhagem leucêmica MOLT-4. Na mesma concentração, a enzima de E. coli é capaz de matar 95% de células dessa mesma linhagem. / L-Asparaginase (EC 3.5.1.1) is an important enzyme for the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL), the most common malignancy in children and adolescents. L-asparaginase hydrolyzes L-asparagine resulting in ammonium and aspartic acid, preventing tumor cells of using such amino acid for protein synthesis, leading to apoptotic cell death. Currently, the enzyme is obtained from Escherichia coli and Erwinia chrysanthemi; however, both formulations are associated with a high incidence of side effects that compromise the progress and effectiveness of treatment. The yeast Saccharomyces cerevisiae has ASP1 gene responsible for the production of L-asparaginase 1 (Sc_ASPase1) that has been poor studied. To elucidate the characteristics of Sc_ASPase1, we expressed the protein in E. coli BL21 (DE3) cells and purified it by affinity chromatography. Sc_ASPase1 has a specific activity of 195.4 U/mg for L-asparagine and 0.36 U/mg for L-glutamine, and an allosteric behavior with a K0.5 of 75 µM for L-asparagine. Through site directed mutation, we demonstrated the importance of Thr64-Thy78-Th141-Lys215 residues for catalysis. The mutant protein isoforms A331D, K335E, Y243S, S301N and ΔG77 showed no improvement in kinetic parameters or specific activity. We build and cloned Sc_ASPase1 with the deletion of the first 52 amino acids, but under the conditions tested the protein was expressed in insoluble form. Sc_ASPase1 have demonstrated potential antineoplastic activityc, since 10 U/mL of enzyme lead to 85% of mortality in leukemia cell line MOLT-4. At the same concentration, the E. coli enzyme kills 95% of the cells of the same line.

A doença enxerto contra hospedeiro é uma complicação comum nos pacientes submetidos ao transplante de medula óssea alogênico. Com o objetivo de contribuir para o esclarecimento da participação das células de Langerhans na doença enxerto contra hospedeiro crônica (GVHDc) quando de sua ocorrência na mucosa bucal, foram analisados 40 pacientes oncohematológicos e hematológicos submetidos ao transplante de medula óssea alogênico no Hospital Amaral Carvalho, Jaú - SP. Cortes microscópicos de 3µm de espessura da mucosa jugal com padrão de normalidade (controle - 20 pacientes) e de pacientes transplantados com e sem GVHDc, foram avaliados em hematoxilina e eosina e pela técnica imuno-histoquímica padrão da estreptavidina-biotina-peroxidase utilizando-se o anticorpo monoclonal anti- CD1a. As células de Langerhans imunomarcadas foram quantificadas no epitélio da mucosa jugal, sendo o número médio destas células estatisticamente comparado entre os pacientes controle e os pacientes transplantados com e sem GVHDc. Os resultados demonstraram um maior número de células de Langerhans na mucosa jugal dos pacientes com GVHDc quando comparado aqueles sem GVHDc e ao grupo controle (p=0,001). Foi observado também, a presença de intenso infiltrado inflamatório crônico, justaepitelial, com desorganização das células da camada basal do epitélio, com vacuolização celular, satelitose, corpúsculos acidofílicos e ocorrência de clivagem entre e o epitélio e o tecido conjuntivo nos pacientes que desenvolveram GVHDc. Estes resultados sugerem que a células de Langerhans participa da doença enxerto contra hospedeiro crônica na mucosa jugal dos pacientes submetidos ao transplante de medula óssea alogênico, sendo provavelmente recrutadas pelo processo inflamatório e imunopatológico que caracteriza esta doença. / The graft versus host disease (GVHD) is a common complication in patients submited to alogeneic bone marrow transplantation. To understand the role of Langerhans cells in chronic GVHD (cGVHD) in oral mucosa, we analyzed 40 oncohematological or hematological patients who received alogeneic bone marrow transplantation at Hospital Amaral Carvalho, Jaú - SP. Slices of 3µm from normal oral mucosa (control - 20 patients) and transplanted patients with and without cGVHD were analyzed by hematoxylin-eosin technique and conventional immunohistochemistry of streptavidin-biotin peroxidase technique for monoclonal antibody anti-CD1a. The immunomarked Langerhans cells were quantified in the epithelium of oral mucosa; the average number of these cells was statistically significant when compared to the control group and patients with and without cGVHD. The results showed higher number of Langerhans cells in oral mucosa of cGVHD when we compared the control group and the group of patients with and without cGVHD (p=0,001). We also observed the presence of chronic juxtaepithelial inflammatory infiltrate, with basal layer epithelium desorganization, vacuolization, satellitosis, acidophilic bodies and presence of gap between epithelium and connective tissue of patients with cGVHD. These results suggest that Langerhans cells may have a role in cGVHD of oral mucosa in patients submited to alogeneic bone marrow transplantation, and they may be recruited by inflammatory and immunopathologic process that are characteristic in this disease.

A descoberta de novos alvos terapêuticos capazes de reverter o efeito tumoral imunossupressor sobre as células dendríticas (DCs) é de grande relevância clínica. Identificamos que monócitos de pacientes com leucemia linfóide crônica (LLC) têm alterações na sinalização de STAT6 induzida por IL-4 que previne a maturação fenotípico-funcional das DCs. Embora os monócitos dos pacientes apresentem alta expressão de IL-4R, a atividade de STAT6 está inibida devido aos elevados níveis de SOCS5. IL-10 reproduz esta desregulação de STAT6/SOCS5 nos monócitos de doadores saudáveis, causando diferenciação defeituosa das DCs. Isso indica que SOCS5 está envolvida nas alterações das DCs de pacientes. Ainda, encontramos que a inibição de STAT3 com pirimetamina, um composto em ensaio clínico para LLC, não afeta a maturação das DCs, diferentemente da inibição de STAT5 por JQ1. Isso mostra que STAT5 é importante para a maturação das DCs, e sugere que a JQ1, mas não a pirimetamina, pode causar imunossupressão. Já SOCS5 pode ser um novo potencial alvo para terapia do câncer. / Discovery of new targets to reverse tumor immunosuppression on dendritic cells (DCs) hold great therapeutic promise. Here, we identify that monocytes from chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients have alteration in IL-4-induced STAT6 signaling that prevents DCs phenotypic and functional maturation. Although patients monocytes display high IL-4R expression, STAT6 activity is inhibited because of elevated SOCS5 levels. IL-10-treatment of healthy donors monocytes reproduces this altered mechanism (STAT6/SOCS5) and leads to a defective DC differentiation. These findings indicate that a high SOCS5 level is involved on CLL-DCs impaired function. Moreover, we find that pharmacologic inhibition of STAT3 by pyrimethamine, a clinical trial compound for CLL, does not affect LPS-induced DCs maturation while STAT5 inhibition by JQ1 prevents it. Our findings show that STAT5 is important for DCs maturation, and suggest that JQ1, but not pyrimetamine, can cause immunosuppression. Additionally, SOCS5 emerges as a new potential target for cancer treatment.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:39:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LYSA BERNARDES MINASI.pdf: 541313 bytes, checksum: 5a4220856b565e6951c969b984acd390 (MD5) Previous issue date: 2009-03-16 / The acute lymphoblastic leukemia (ALL) is considered the result of abnormalities occurring in a progenitor cell of the lympho hematopoietic system. The abnormalities modify the program of cell differentiation, determining a proliferative advantage of leukemic clone on the other cells of hematopoietic tissue. The leukemia-free survival for more than five years, which is considered as criterion of cure for the disease in recent years has been approximately 80%. In the infant population the ALL is five times more incidents than the LMA, and is the cause of approximately 3/4 of all children diagnosed with leukemia. In ALL, 60% to 75% of patients present numerical abnormalities on the chromosomal batch, such as hiperdiploidia or hipodiploidia, or structural, such as translocations and deletions. Karyotypic changes are associated with recurrent clinical characteristics and prognostic measures. In this study, the cytogenetic evaluation was performed for all 22 patients included in the study. These patients were diagnosed at Hospital Araújo Jorge / ACCG and the Santa Casa de Misericórdia de Goiânia, in the period of March to December of 2008. Samples of bone marrow or peripheral blood were sent to the Laboratory of Human Cytogenetics and Molecular Genetics (Lagen) of SuLeide / SES / GO for cytogenetic analysis. Cytogenetic evaluation in 58% of karyotypes that was carried out had changed. We observed the presence of numerical changes, as hyperdiploid, near-haploid and trisomy of chromosome 21 and structural which are represented as follows: 46,XX,4q+/46,XX,t(q1;q4), 46,XX,t(10;14)(q22;q32), 46,XY,del(16q22)/46,XY,del(6q26)/Hyperdiploid, 46,XX/46,XX,del(8)(q21.2-22)/ Hyperdiploid, 46,XY,t(7;12)(q34;q22);del(10qter)/46,XY,t(7;12)(q34;q22)/46,XY,t(4;8)(q31.2;q23)/4 6,XY,t(12;16)(q24.1;q23)/Near-haploid, 46,XX,del(17q25), 46,XY,t(7;12)(q35;p11),+21. The morphologic remission of patients studied in twenty eighth day of induction treatment (D+28) was obtained in all cases. A Minimal Residual Disease (MRD) was positive in 14% of the cases. The patients were stratified into two groups at risk of relapse according to the protocol GBTL1 ALL-99: low risk of relapse (55%) and high risk of relapse (45%). Most of the chromosomal changes have not been described so far, therefore there is a certain limitation on the definition of the prognosis. The correlation between the cytogenetic findings and clinical and laboratory characteristics was established, demonstrating the importance of doing it to infer about the prognosis. / A leucemia linfóide aguda é considerada o resultado de anormalidades ocorrendo em uma célula progenitora do sistema linfo-hematopoético. As anormalidades modificam o programa de diferenciação celular, determinando uma vantagem proliferativa do clone leucêmico sobre as demais células do tecido hematopoético. A sobrevida livre de leucemia por mais de cinco anos, que é considerada como critério de cura para a doença, nos últimos anos, tem sido de aproximadamente 80%. Na população infantil a LLA é cinco vezes mais incidente do que a LMA, sendo a causa de aproximadamente 3/4 de todo o diagnóstico de leucemia infantil. Na LLA, entre 60% a 75% dos pacientes apresentam anormalidades numéricas do lote cromossômico, como a hiperdiploidia ou hipodiploidia, ou estruturais, como translocações e deleções. As alterações cariotípicas recorrentes estão associadas a características clínicas e prognósticas específicas. Neste estudo, a avaliação citogenética foi realizada para todos os 22 pacientes incluídos no estudo. Tais pacientes foram diagnosticados no Hospital Araújo Jorge/ACCG e na Santa Casa de Misericórdia de Goiânia, no período de março a dezembro de 2008. As amostras de medula óssea ou sangue periférico foram enviadas ao Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular (LaGene) da SuLeide/SES/GO para análise citogenética. Na avaliação citogenética 58% dos cariótipos realizados apresentavam-se alterados. Foram observadas a presença de alterações numéricas, como hiperdiploidias, near-haploidia e trissomia do cromossomo 21 e estruturais representadas a seguir: 46,XX,4q+/46,XX,t(q1;q4), 46,XX,t(10;14)(q22;q32), 46,XY,del(16q22)/46,XY,del(6q26)/Hiperdiploidia, 46,XX/46,XX,del(8)(q21.2-22)/ Hiperdiploidia 46,XY,t(7;12)(q34;q22);del(10qter)/46,XY,t(7;12)(q34;q22)/46,XY,t(4;8)(q31.2;q23)/4 6,XY,t(12;16)(q24.1;q23)/Near-haploidia, 46,XX,del(17q25), 46,XY,t(7;12)(q35;p11),+21. A remissão morfológica dos pacientes estudados no vigésimo oitavo dia da indução do tratamento (D+28) foi obtida em todos os casos. A Doença Residual Mínima (DRM) foi positiva em 14% dos casos. Os pacientes foram estratificados em dois grupos de risco de recaída de acordo com o protocolo GBTL1 LLA-99: baixo risco de recaída (55%) e alto risco de recaída (45%). A maioria das alterações cromossômicas ainda não foram descritas até o momento, havendo portanto uma certa limitação quanto a definição do prognóstico. A correlação entre os achados citogenéticos e características clínico-laboratórias foi estabelecida, demonstrando a importância de fazê-la para inferir a respeito do prognóstico.

A Leucemia Mieloide Crônica é uma doença hematopoiética associada a células estaminais que se manifesta principalmente com a expansão mielopoese. O cromossomo Philadelphia positivo PH+ é gerado por uma translocação recíproca (9, 22) (Q34, Q11) e pela fusão entre o gene Abel- son, essa fusáo codifica e desregula á protéına Tirosina Quinase, o suficiente para a iniciação e manutenção da doença. Inibidores como o Mesilato de Imatinibe revolucionou o tratamento de pacientes com leucemia mieloide crônica. As mutaç ões no domínio de quinase do Bcr-Abl, constituindo o mecanismo mais frequente de resistência adquirida para a terapia com inibidores da tirosina quinase. A mutação T315I atualmente e maior desafio para manutenção da Leucemia mieloide crônica na fase crônica, uma vez que os inibidores de Tirosina Quinase atualmente en- contrados no mercado são incapazes de mantê-la na forma controlada. Métodos computacionais baseados em fragmentos moleculares surgiram como uma nova estratégia para a descoberta de fármacos. Foi usado o programa LigBuilder para fazer geração das novas moléculas candidatas a ffármacos, usando dois métodos o Grow e Linker, as moléculas foram selecionadas por meio de docking com programa Glide da suite Maestro em cada mutação selecionadas da tirosina quinase, usando os melhores Gscores, para cada mutac¸a˜o, posteriormente foram submetidas ao programa QikProp, que tem a função comparar as moléculas com banco de dados de fármacos conhecidos. No último passo, é feito o estudo do docking das moléculas selecionas no sítio usando os protocolos de Induced Fit docking, que realiza o docking flexível-flexível, ou seja, ligante flexível e sítio de ligação da proteína flexível. / Chronic myeloid leukemia is associated with hematopoietic stem cell disorder that manifests itself primarily with myelopoiesis the expansion. The Philadelphia chromosome positive PH is generated by a reciprocal translocation (9, 22) (q34, q11), and by the merger of the Abelson gene fusion that encodes and deregulates quinase Tyrosine protein enough for the initiation and maintenance of disease. Tyrosine quinase provides a therapeutic target, which used to inhi- bition of this protein Known as tyrosine Quinase. Inhibitors such as Imatinibe mesylate has revolutionized the treatment of patients with chronic myeloid leukemia. Mutations in domain quinase Bcr-Abl, constituting the most frequent mechanism acquired resistance to therapy with tyrosine quinase. The T315I mutation and currently biggest challenge for maintenance of chro- nic myeloid leukemia in chronic phase, since inhibitors of tyrosine Quinase currently found on the market are unable to it maintaining it in a controlled manner, leading the patient achieved. Methods based on fragment docking emerged as a new strategy for drug discovery. evaluating all possible input locations and connecting the inhibitor and protein, and thus may provide a new molecule will be able to make effective inhibition. The docking studies are divided into three parts. At first, the fragments are placed to interact within the possible interaction sites. In the second step, the molecules are created from the best fragments which interacted with a particular website. In the last step, the study of molecules created in the docking site using the protocols of Induced Fit Docking which performs flexible, flexible docking ie flexible linker protein is made flexible.

A leucemia linfoide aguda (LLA) é uma neoplasia hematológica agressiva, caracterizada pela expansão clonal de progenitores linfoides e ativação exacerbada de vias de sinalização. A via de sinalização de IGF1R/IRS1 inicia-se pela ligação do ligante IGF1 ao seu receptor transmembrana IGF1R, e subsequente ativação de seu substrato IRS1, que transmite sinais mitogênicos e antiapoptóticos, principalmente através da modulação das vias de sinalização PI3K/AKT/mTOR e MAPK . Estas vias de sinalização desempenham uma importante função na proliferação, sobrevivência e migração de células de leucêmicas. Dessa forma, o objetivo do nosso trabalho foi investigar a participação da via de sinalização IGF1R/IRS1 na LLA. Linhagens celulares Jurkat, MOLT-4, Namalwa e Raji foram tratadas ou não com inibidor de IGF1R/IRS1-2, NT157, ou com inibidor de IGF1R/IR, OSI-906, e submetidas à avaliação da viabilidade celular, apoptose, proliferação, ciclo celular, migração e expressão/ativação gênica e proteica. Células mononucleares de pacientes com LLA e de doadores saudáveis foram submetidas aos ensaios de viabilidade e apoptose, após tratamento com NT157 e OSI-906. O efeito do NT157 in vivo foi avaliado utilizando modelo de xenotransplante de células CEM em camundongos NSG. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa e Comitê de Ética no Uso dos Animais da Instituição. A análise estatística foi realizada pelo teste ANOVA e teste t de Student. O tratamento com NT157 reduziu a viabilidade e a proliferação, induziu apoptose e modulou o ciclo celular em todas as linhagens testadas (p<0,05). Similarmente, OSI- 906 reduziu a viabilidade e a proliferação, modulou o ciclo celular, porém não foi capaz de induzir apoptose nas linhagens de LLA (p<0,05). Os tratamentos com NT157 e com OSI-906 diminuíram significativamente a migração de Jurkat em fibronectina, porém não modularam a migração de Namalwa. Em um contexto molecular, a exposição ao NT157 resultou em inibição da fosforilação de proteínas da via de sinalização PI3K/AKT/mTOR e modulou a expressão de 25 genes relacionados com a via de sinalização MAPK, dentre eles CDKN1A (p21), FOS e JUN (p<0,05). OSI-906modulou a ativação das proteínas da via de sinalização PI3K/AKT/mTOR e a expressão gênica de p21, FOS e JUN, porém de uma forma diferente da modulação encontrada pelo tratamento com NT157 (p<0,05). Em células mononucleares de pacientes com LLA, NT157 induziu uma resposta heterogênea na viabilidade e induziu apoptose, e OSI-906 reduziu a viabilidade, porém não foi capaz de induzir apoptose nestes pacientes (p<0,05). Os tratamentos com NT157 e OSI-906 não apresentaram citotoxicidade em células de doadores saudáveis. Adicionalmente, o tratamento in vivo com veículo ou NT157 na dose de 50mg/kg/dia, via intraperitoneal, em modelos de xenotransplante com células CEM em camundongos NSG (n=5 para cada grupo) não apresentou efeitos antineoplásicos. Em conclusão, a inibição farmacológica de IGF1R/IRS1-2, por NT157, e de IGF1R/IR, por OSI-906, apresentaram efeitos antineoplásicos significativos em modelos de linhagens celulares e amostras primárias de pacientes com LLA. Os resultados dos estudos in vivo em modelos de xenotransplante indicam a necessidade de estudos de farmacocinética e farmacodinâmica para o NT157. Nossos resultados revelaram que NT157 exerce um efeito citotóxico nas células de LLA, enquanto que OSI-906 tem um efeito predominantemente citostático. Estes dados indicam que o inibidor de IGF1R/IRS1-2, NT157, obteve resultados antineoplásicos mais atrativos e a inibição direta de IRS1 pode ser um potencial alvo terapêutico em LLA. / Acute lymphoid leukemia (ALL) is an aggressive hematological neoplasm, characterized by clonal expansion of lymphoid progenitors and exacerbated activation of signaling pathways. The IGF1R/IRS1 signaling pathway initiated through binding of the ligand IGF1 to its transmembrane receptor IGF1R, and the subsequent activation of its substrate IRS1, which transmit mitogenic and antiapoptotic signals, mainly through the modulation of the PI3K/AKT/mTOR and MAPK signaling pathways. These signaling pathways play an important function in cell proliferation, survival and migration of leukemia cells. Therefore, the objective of our study was to investigate the participation of the IGF1R/IRS1 signaling pathway in ALL. Jurkat, MOLT-4, Namalwa and Raji cell lines were treated or not with IGF1R/IRS1-2 inhibitor, NT157, or with IGF1R/IR inhibitor, OSI-906, and evaluated for cell viability, apoptosis, proliferation, cell cycle, migration, gene and protein expression/activation. Mononuclear cells from patients with ALL and from healthy donors were submitted to the viability and apoptosis assays, after treatment with NT157 and OSI-906. The NT157 effect in vivo was evaluated using CEM cell line xenograft model in NSG mice. The study was approved by the Research Ethics Committee and the Ethics Committee on the Use of Animals of the Institution. Statistical analysis was performed by ANOVA and Student t test. Treatment with NT157 reduced viability and proliferation, induced apoptosis, and modulated the cell cycle in all cell lines tested (p<0.05). Similarly, OSI-906 reduced viability and proliferation, modulated the cell cycle, but was not able to induce apoptosis in ALL cell lines (p<0.05). Treatments with NT157 and OSI-906 significantly decreased the migration of Jurkat in fibronectin, but did not modulate the Namalwa migration. In a molecular context, the NT157 exposure resulted in inhibition of the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway protein phosphorylation and modulated the expression of 25 genes related to the MAPK signaling pathway, including CDKN1A (p21), FOS and JUN (p<0,05). OSI-906 modulated the activation of the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway proteins and the p21, FOS and JUN geneexpression, but in a different way from the modulation found by treatment with NT157 (p<0.05). In mononuclear cells of patients with ALL, NT157 induced a heterogeneous response in viability and induced apoptosis, and OSI-906 reduced viability, but was not able to induce apoptosis in these patients (p<0.05). Treatments with NT157 and OSI- 906 did not show cytotoxicity in healthy donor cells. Additionally, in vivo treatment with vehicle or NT157 at the dose of 50 mg/kg/day, intraperitoneally, in xenotransplantation models with CEM cells in NSG mice (n=5 for each group) showed no antineoplastic effects. In conclusion, the pharmacological inhibition of IGF1R/IRS1- 2, by NT157, and IGF1R/IR, by OSI-906, showed significant antineoplastic effects in cell line models and in primary samples of patients with ALL. The results of in vivo studies in xenotransplantation models indicate the need for pharmacokinetic and pharmacodynamic studies for NT157. In conclusions, our results revealed that NT157 exerts a cytotoxic effect on ALL cell lines and primary ALL cells, whereas OSI-906 has a predominantly cytostatic effect. These data indicate that the IGF1R/IRS1-2 inhibitor, NT157, obtained more attractive antineoplastic results and the direct inhibition of IRS1 may be a potential therapeutic to target in ALL.

A enzima L-asparaginase (ASNase) usada como biofármaco no tratamento de Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) é de origem bacteriana, o que provoca reações imunológicas nos paciente e a ASNase usada no Brasil é importada o que dificulta seu uso por razões de abastecimento e de preço. Por outra parte, dentro dos sistemas de expressão de proteínas recombinantes usados pela biotecnologia, destaca-se a Pichia pastoris, levedura metilotrófica de fácil manipulação, crescimento rápido, alta capacidade de expressão e capaz de realizar modificações pós-traducionais. Neste projeto, o gene de ASNase II de Saccharomyces cerevisiae foi expressa em P. pastoris (Muts), tendo sido analisada a localização da enzima nos meios extracelular, intracelular e espaço periplasmático. Além disso, foram avaliadas diversas condições de crescimento e indução da ASNase em agitador orbital e finalmente foi feito o cultivo em biorreator de 3L operado em batelada. Segundo o analise da expressão, a enzima foi localizada no espaço periplasmático. O crescimento de P. pastoris em diferentes concentrações de glicerol (10,0 - 50,0 g.L-1) mostraram parâmetros cinéticos similares (&#181;máx = 0,35 h-1; tg= 2,0 h) e o maior fator de conversão de substrato em células (Y x/s = 0,9 g g-1) foi obtido com 10,0 g.L-1 de glicerol. A expressão de ASNase somente ocorreu a 20 &#176;C e melhora com concentrações de metanol acima de 1,0% (v/v), obtendo-se a maior produção da enzima a 3% de metanol durante 48 horas, o que foi corroborado pelo planejamento fatorial fraccionado (3n-k + 2), n = 3 e k =1. Também se observou que o pH de indução, a suplementação com aminoácidos ou casaminoácidos e concentração de glicerol durante a fase de crescimento apresentaram pouca ou nenhuma influência na expressão. Entretanto, as células induzidas imediatamente após o glicerol ter sido consumido melhoraram a produção de ASNase. No cultivo em biorreator, a fase de crescimento foi feita com 10,0 e 40,0 g.L-1-1 de glicerol, e a fase de indução com pulsos de 3,0% (v/v) de metanol durante 120 horas. A maior atividade volumétrica (710,2 U.L-1) de ASNase foi obtida na batelada com 40,0 g.L-1 de glicerol e a atividade periplasmática foi constante durante o tempo de cultivo o que significa que o controle do pH afeta positivamente na expressão de ASNase. / The bacterial L-asparaginase (ASNase) is used as biopharmaceutical in the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) and non-Hodgkin lymphoma and because his origin causes immune reactions in patients. The ASNase used in Brazil is imported which hinders its use due to supply availability and price. The methylotrophic yeast Pichia pastoris, is a microrganism easy to handle and with fast growth and high capacity of expression of recombinant proteins and that is able to carry out post-translational modifications. In this work, Saccharomyces cerevisiae ASNase II gene was expressed in Pichia pastoris (Muts) and was analyzed its localization in extra and intracellular medium and periplasmic space. Also, different conditions of growth and induction were evaluated in shaker, that culminated in a cultivation carried out in 3L bioreactor operated in batch. According the expression analysis, the enzyme was localized in periplasmic space; Pichia pastoris growth in different concentrations of glycerol (10 - 50 g.L-1) show similar kinetic parameters (&#181;máx = 0.35 h-1; tg = 2.0 h), with the higher substrate to biomass yield (Y x/s= 0.9 g.g-1) obtained with 10 g.L-1 of glycerol. The ASNase expression only occurred at 20°C and improves with methanol concentrations above 1.0% (v/v) to yield the highest production ASNase 3.0% methanol for 48 hours, which was corroborated by factorial fractionated design (3n-k + 2), n = 3 and k = 1. Also was observed that the pH of induction, supplementation with amino acids or casaminoacids and glycerol concentration during the growth phase had little or null influence on the expression. However the induction immediately after glycerol depletion improved the ASNase production. In bioreactor, were used 10 and 40 g.L-1 of glycerol in the growth phase and in the induction phase were used methanol pulses of 3.0% (v/v) during 120 hours. The major volumetric activity (710,2 U.L-1) of ASNase occurred in batch cultivation with 40 g.L-1 of glycerol and periplasmic activity was almost constant during the process which means that the control of pH affects positively the ASNase expression.

A introdução do Mesilato de Imatinibe (MI) como primeiro inibidor específico de BCR-ABL1 na prática clínica revolucionou o tratamento da Leucemia Mieloide Crônica (LMC), tornando-se a terapia padrão para o tratamento desta doença. Porém, cerca de 30% dos pacientes com LMC não respondem à terapia com MI e um número substancial destes casos de resistência não tem causa conhecida. O MI interage com transportadores de membrana ABCG2 e SLCO1A2. Este estudo teve como objetivo investigar a relação da expressão gênica de ABCG2 e de SLCO1A2 com marcadores de resposta ao tratamento com MI, em indivíduos com LMC e avaliar a influência dos polimorfismos ABCG2 c.421C>A e ABCG2 c.-19-99G>A na resposta ao MI. Foram incluídos 118 pacientes com LMC os quais foram classificados em dois grupos: Grupo Respondedor, constituído por 70 pacientes com resposta citogenética completa com a dose padrão de MI (400 mg/dia) por até 18 meses e, Grupo não Respondedor constituído por 48 pacientes sem resposta citogenética completa à dose inicial de 400 mg/dia de MI ou que perderam esta resposta ao longo do tratamento e foram reescalonados para doses de 600 ou 800 mg/dia. A resposta ao tratamento foi avaliada segundo os critérios da European LeukemiaNet. Foram excluídos pacientes com alterações citogenéticas diferentes do cromossomo Ph e mutações no gene BCR-ABL1. Amostras de sangue periférico foram utilizadas para: extração do RNA total para quantificação dos transcritos BCR-ABL1 e expressão gênica de ABCG2 e SLCO1A2; extração de DNA e análise citogenética de banda G. A expressão do gene ABCG2 e SLCO1A2 e as análises dos polimorfismos foram feitas por PCR em tempo real. A expressão de ABCG2 foi maior no grupo de não respondedores ao MI (P=0,028). Este resultado foi influenciado pelos pacientes com resistência primária (N= 34 P=0,029), mas não pelos que apresentaram resistência secundária (N=14 P=0,249) quando comparado com respondedores (N=70). A elevada expressão do gene ABCG2 foi também associada àqueles pacientes que não tiveram resposta molecular maior (número de transcritos BCR-ABL1 &#8804; 0,1%) (P=0,027) quando todos os pacientes foram analisados. O gene estudado não foi associado com a resposta molecular completa (número de transcritos BCR-ABL1 &#8804; 0,032%). Com relação ao gene SLCO1A2 não foi possível determinar sua expressão devido à baixa concentração do RNA obtido. Os polimorfismos c.421C>A e c.-19-99G>A não foram associados com a expressão do gene ABCG2 e a resposta ao MI. A RMC (no grupo de respondedores) foi associada com o genótipo 421CC e houve tendência a maior frequencia de portadores do genótipo -19-99GG neste mesmo grupo. Portadores do genótipo -19-99AA apresentaram tendência ao risco de ter LMC. Os resultados deste estudo nos permitem concluir que a maior expressão de ABCG2 está associada com a resistência primária ao MI podendo então ser um mediador da resistência ao MI. Os polimorfismos do gene ABCG2 não influenciaram na expressão gênica de ABCG2, mas impactaram na RMC no grupo respondedor ao MI. / The introduction of imatinib mesylate (IM) as the first specific inhibitor of BCR-ABL1 in clinical practice has revolutionized the treatment of chronic myeloid leukemia (CML), becoming the standard therapy for this disease. However, about 20% of CML patients do not respond to therapy with IM and a substantial number of these cases of resistance have no known cause. The MI interacts with membrane transporters ABCG2 and SLCO1A2. The aim of this study was to investigate the relationship of ABCG2 and SLCO1A2 gene expression with markers of response to MI in individuals with CML and evaluate the influence of polymorphisms ABCG2 c.421C> A and c. ABCG2-19-99G> A in response to the MI. One hundred and eighteen patients in chronic phase of CML were studied and classified in two groups: Responder Group comprised 70 patients who had a complete cytogenetic response within 18 months of treatment. The non-responder group comprised 48 patients who did not have a complete cytogenetic response with the initial dose (400 mg/day) of IM or who relapsed during treatment and were submitted to higher doses of 600 or 800 mg/day. Criteria of failed response to treatment were established by European LeukemiaNet. Patients with cytogenetic patterns other than the Philadelphia chromosome and patients with mutations in the BCR-ABL1 gene were excluded from this study. Blood samples were obtained for: total RNA extraction for quantification of BCR-ABL1 and gene expression of ABCG2 and SLCO1A2; genomic DNA extraction and band G cytogenetic analysis. The gene expression and the analysis of the polymorphisms were performed by real time PCR. Expression of ABCG2 in non-responder group was higher than in responder group (P=0.028). This result was influenced by patients with primary resistance (n= 34 P=0.029) but not secondary resistance (n=14 P=0.249) when compared with responders (n=70). The higher expression of ABCG2 gene was also associated with those patients who had major molecular response (number of BCR-ABL1 . 0.1%) (P=0.027) when all patients were analyzed. The studied gene was not associated with the complete molecular response (number of BCR-ABL1 .0.0032). Regarding to the gene SLCO1A2 was not possible to determine its expression due to low concentration of RNA obtained. The c.421C>A e c.-19-99G>A were not associated neither with the ABCG2 gene expression and MI response. CMR in responders group was associated with the 421CC genotype ant there was a trend for higher frequency of carriers of genotype -19-99GG in the same group. Carriers of 19-99AA genotype tended to the risk of having CML. The results of this study allow us to conclude that the higher expression of ABCG2 is associated with primary resistance to IM and may be a mediator of resistance to IM. The ABCG2 polymorphisms did not influence the gene expression of ABCG2 but impacted in CMR of the responders to IM.

A Leucemia Linfóide Aguda (LLA) é uma doença heterogênea em relação à biologia e ao prognóstico. Além de alterações genéticas, anormalidades epigenéticas, estão estreitamente relacionadas ao processo de carcinogênese e entre os mecanismos epigenéticos, a acetilação das histonas é um componente essencial para a regulação da estrutura da cromatina e atividade transcricional. Esse processo é mediado pelas histonas acetiltransferases (HATs). Por outro lado, a desacetilação, por meio das histonas desacetilases (HDACs), está relacionada à condensação da cromatina e repressão transcricional. A expressão anormal das HDACs tem sido associada ao processo de leucemogênese, revelando ser uma área promissora na caracterização de grupos de risco e tratamento do câncer. Os objetivos deste trabalho foram avaliar a expressão dos genes da classe I de HDACs (HDAC 1, 2, 3 e 8), correlacionar os resultados com as características clínicas e de prognóstico (idade, gênero, grupo de risco, contagem inicial de blastos, imunofenótipo, resposta ao tratamento, doença residual mínima nos dias 14 e 18 e a sobrevida livre de eventos) em 46 amostras consecutivas de medula óssea de crianças e adolescentes portadores de LLA; comparar e correlacionar a expressão dos genes estudados entre as amostras de pacientes portadores LLA e 10 amostras de medula óssea sem doença hematológica. A análise da expressão gênica foi realizada através da técnica de PCR em Tempo Real pelo método TaqMan®. Foi observado um aumento da expressão do gene HDAC1 nas amostras dos pacientes bons respondedores ao ix tratamento. O gene HDAC2 foi mais expresso no grupo de pacientes do gênero masculino (p=0,038). Esse gene também mostrou uma expressão aumentada nos pacientes de alto risco (p=0,060) e com sobrevida menor (p=0,065), entretanto os valores encontrados não foram estatisticamente significativos. Além disso, foi observada uma expressão aumentada dos genes HDAC2 (p=0,007), HDAC3 (p=0,014) e HDAC8 (p=0,002) em amostras de pacientes com LLA quando comparadas às amostras de medula óssea sem doença hematológica. Houve correlação entre a expressão de todos os genes de classe I das HDACs, exceto entre HDAC1 e HDAC8. Os resultados obtidos nesse trabalho sugerem que as HDACs de classe I, podem representar importantes alvos para futuros estudos em LLA, no entanto são necessários de testes funcionais para confirmar estes resultados. / Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) is a heterogeneous disease with distinct biologic and prognostic groups. In addition to genetic alterations, epigenetic processes play an important role in carcinogenesis, among which histone acetylation/deacetylation is crucial for chromatin modulation structure and transcriptional activity. Histone acetylation is regulated by the enzyme histone acetyl transferases (HATs). On the other hand, the deacetylation process is regulated by histone deacetylases (HDACs) enzymes, which is associated with the chromatin condensation and transcriptional repression. Abnormal expression of HDACs is a common feature of cancer and has revealed a promising field to stratify cancer treatment and risk classification. The investigation of these expression profiles may represent an important clinical factor for diagnosis and management of hematological malignances. The objectives of the present study were to analyze the expression profile of the class 1 HDACs (HDAC1, 2, 3 and 8) genes in bone marrow samples obtained from 46 childhood ALL samples, to correlate the results with prognostic and clinical features (age, gender, risk group, immunophenotype, treatment response, minimal residual disease and event free survival) of the patients; to evaluated differences in gene expression between ALL samples and 10 bone marrow samples without hematological disease and to verify the correlation of these genes. The gene expression analysis were made using xi TaqMan real-time polymerase chain reaction. A higher expression of HDAC1 in patients with better treatment response was observed. The HDAC2 showed a higher expression in male gender (p=0,038). HDAC2 also showed a higher expression for higher risk (p=0,060) and lower survival patients (p=0,065), however the statistical analysis did not show significant results. Furthermore, there was a higher expression of HDAC2 (p=0,007), HDAC3 (p=0,014) and HDAC8 (p=0,002) in ALL samples when compared to healthy donors. Class I HDACs showed correlation in gene expression, except for HDAC1 and HDAC8. These results suggest that class I HDACs can represent important targets for ALL research; however, it is necessary to perform functional investigation to confirm these results.

A L-Asparaginase (L-ASNase) é uma enzima tetramérica bacteriana, utilizada em sessões de quimioterapia. Essa enzima depleta os aminoácidos asparagina (Asn) e glutamina (Gln), transformando-os em aspartato (Asp) ou glutamato (Glu), respectivamente, e em amônia. Contudo, a L-ASNase pode induzir resposta imune, levando à produção de anticorpos antiasparaginase, uma causa importante de resistência ao medicamento. Uma L-ASNase ideal seria aquela com alta atividade e estabilidade e baixo potencial imunogênico, porém, as L-ASNases utilizadas na terapêutica não reúnem essas características simultaneamente. Por essa razão, o presente trabalho utilizou técnicas de mutagênese randômica, a fim de criar uma nova proteoforma de L-ASNase de E. chrysanthemi com uma melhor atividade e estabilidade. Além disso, foram estudadas condições de cultivo em agitador metabólico, visando à otimização de condições de produção. Foi criada uma biblioteca com 1.056 clones, e desses, 19 foram selecionados por apresentarem atividade superior ou igual à enzima selvagem quando dosada em extrato bruto. Dentre eles, dois mutantes se destacaram por apresentarem a atividade específica glutaminásica diferente da enzima selvagem. Análises in silico indicam que o mutante 9-6D apresentou diminuição de desordem estrutural e epítopos imunogênicos. O mutante 9-5F demonstrou uma diminuição da porcentagem da atividade glutaminásica quando comparada a enzima selvagem. O estudo de produção do mutante 9-5F indicou que a temperatura de indução, seguida da concentração do indutor, são os parâmetros mais relevantes para a otimização da produção de L-ASNase de E. chrysanthemi mutante. / L-Asparaginase (L-ASNase) is a bacterial tetrameric enzyme used in chemotherapy sessions that deplete asparagine (Asn) and glutamine (Gln), transforming them into Aspartate (Asp) or glutamate (Glu), respectively, and ammonia. However, L-ASNase can induce immune response leading to the production of anti-asparaginase antibody, an important cause of drug resistance. Ideally, L-ASNase would be one with high activity, high stability and low immunogenic potential, but the L-ASNases commercially available today do not present these characteristics simultaneously. For this reason, this study used techniques of random and site-directed mutagenesis in order to create a new proteoform of E. chrysanthemi L-ASNase with improved activity and stability. In addition, culture conditions were studied in a metabolic shaker, aiming at the optimization of production conditions. A library with 1,056 clones was created, and of these clones, 19 were selected because they had activity superior or equal to the wild-type enzyme in crude protein extract. Among them, 2 mutants stood out for having different glutaminase specific activity in relation to wild-type enzyme. The 9-6D mutant also showed decreased structural disorder and immunogenic epitopes. The 9-5F mutant demonstrated a decrease in percentage of glutaminase activity when compared to the wild-type enzyme. The production study of 9-5F mutant indicated that the induction temperature followed by the inductor concentration are the most relevant parameters for the production optimization of E. chrysanthemi mutant L-ASNase.