A leucemia mielóide aguda (LMA) acomete pacientes de todas as faixas etárias com freqüência aumentada em idosos. Nosso estado não apresenta registros sistemáticos da patologia, justificando-se desta forma o levantamento através dos centros de diagnóstico e tratamento, os quais concentram a maioria dos casos. Foram incluídos todos os pacientes com diagnóstico de LMA “de novo” levantados a partir dos registros dos centros de diagnóstico e tratamento da patologia no estado no período entre 1996 e 2000. Foram computados no período 532 pacientes (taxa estimada de 1,04 casos / 100.000 habitantes / ano). A idade média ao diagnóstico foi 41,0 anos e 46,6 % dos casos eram do sexo masculino. Houve distribuição semelhante nas 7 mesorregiões geográficas do estado. Em relação ao número de casos por faixa etária, observou-se uma taxa estimada em 0,5 – 1 caso / 100.000 habitantes até a faixa etária dos 45 anos, atingindo 3,5 casos / 100.000 habitantes na faixa etária igual ou superior a 70 anos. A sobrevida média considerando todos os casos foi de 17%, aumentando para 25% considerando a população abaixo de 60 anos e alcançando 40% na população entre 10 e 20 anos. Tais dados evidenciam uma distribuição semelhante por região, estimativa de incidência na faixa infantil semelhante a países desenvolvidos e bastante menor na população idosa. A mortalidade geral foi semelhante àquela relatada na literatura. / Acute myeloid leukemia (AML) affects patients in all age groups, but it is more frequent among elderly people. The state of Rio Grande do Sul does not have systematic data on AML; thus these data have to be collected from hospitals or centers where the disease is diagnosed and treated. Patients with de novo acute myeloid leukemia were included based on the information retrieved from hospital registries between 1996 and 2000. At the time, 532 patients had been registered (estimated rate of 1.04 cases per 100,000 inhabitants / year). Mean age at diagnosis was 41.0 years, and 46.6% of the patients were male. Cases were similarly distributed across the seven meso-regions of Rio Grande do Sul. There was an estimated incidence of 0.5 to 1 case per 100,000 inhabitants up to the age of 45 years, and of 3.5 cases per 100,000 inhabitants for individuals aged 70 years and older. The mean five-year survival rate was 17% for all cases, 25% for patients under the age of 60 years, and 40% for those aged between 10 and 20 years. There was a similar distribution of AML cases per region, an incidence rate in the pediatric population similar to that of developed countries, and a much lower incidence among elderly patients. Overall mortality was comparable to that reported in the literature.

Introdução: A Leucemia Mielóide Aguda (LMA) é uma neoplasia complexa e heterogênea do tecido hematopoético, causada por mutações, desregulação da expressão gênica e modificações epigenéticas. Vários marcadores moleculares têm sido descritos para LMA, auxiliando a estratificação dos pacientes em grupos de risco. Recentemente, mutações em DNMT3A foram identificadas em 22.1% dos pacientes com LMA, estando independentemente associadas com pior prognóstico. Objetivos: Determinar a freqüência de mutações somáticas no gene DNMT3A e principais translocações cromossômicas em uma amostra de pacientes com LMA, correlacionando com dados clínicos Métodos: Foram pesquisadas, em 82 amostras de medula óssea de portadores de LMA atendidos no Hospital de Clínicas de Porto Alegre, RS, Brasil, para mutações somáticas no gene DNMT3A por seqüenciamento e principais transcritos de fusão por RT-PCR. Resultados: A freqüência de mutações no gene DNMT3A foi de 8%(6) sendo 3 do tipo R882H. A freqüência relativa dos transcritos de fusão oriundos das translocações t(8;21), t(15;17), t(9;11) e inv16, respectivamente foram: 6,1%(5), 14,6% (12), 0%(0) e 2,4%(2). Conclusão: A descoberta de mutações recorrentes no gene DNMT3A e sua possível implicação prognóstica pode ser um instrumento valioso para a tomada de decisões terapêuticas. Que nos conste, este é o primeiro estudo sobre a presença de mutações somáticas do gene DNMT3A em portadores de LMA no Brasil. Embora em uma amostra relativamente pequena, a freqüência encontrada destas mutações foi inferior à relatada para pacientes caucasianos, sugerindo uma possível variação etnico-geográfica. / Introduction: Acute Myeloid Leukemia (AML) is a complex and heterogeneous neoplasm hematopoietic tissue, caused by mutations, dysregulation of gene expression and epigenetic modifications. Several molecular markers have been described for AML, helping to classify patients into risk groups. Recently, mutations in DNMT3A were identified in 22.1% of patients with AML and these independently associated with poor prognosis. Aims: Determine the frequency of somatic mutations in the gene DNMT3A and major chromosomal translocations in a sample of patients with AML, correlating with clinical data. Methods: We investigated in 82 samples of bone marrow or peripheral blood of patients with AML treated at the Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Brazil, for somatic mutations in DNMT3A gene by sequencing and major fusion transcripts by RT-PCR. Results: The frequency of mutations in the DNMT3A gene was 8%(6) 3 being type R882H. The relative frequency of fusion transcripts arising from translocation t(8;21), t(15;17), t(9;11) and inv16, respectively were: 6,1%(5), 14,6% (12), 0%(0) and 2,4%(2). Conclusion: The discovery of recurrent mutations in the DNMT3A gene and its possible prognostic implications can be a valuable tool for making treatment decisions. From what we have recorded, this is the first study on the presence of somatic mutations of the DNMT3A gene in patients with AML in Brazil. Although in a relatively small sample, the frequency of these mutations was found lower than that reported for Caucasian patients and similar to that observed in Asian patients, suggesting a possible ethno-geographic variation.

Orientadores: Fabiola Traina, Sara Teresinha Olalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T21:51:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MachadoNeto_JoaoAgostinho_M.pdf: 23849071 bytes, checksum: df78354ffdd25c98c274422937e03f93 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A ocorrência da leucemia aguda resulta de uma combinação de mutações e alterações em funções protéicas que conferem a capacidade de proliferação, defeito na diferenciação e apoptose celular. Síndromes mielodisplásicas (SMD) são desordens hematopoéticas resultantes de alterações na célula pluripotente, caracterizadas por hematopoese ineficaz e alta taxa de evolução para leucemia mieloide aguda (LMA). Células leucêmicas expressam uma variedade de receptores de fatores de crescimento e citocinas, como o receptor do Insulin-like growth factor 1 (IGF-1R). A via de sinalização do IGF-1 inicia-se através da ativação de seu receptor e subsequente ativação de seus substratos, como os substratos do receptor de insulina (IRS). Algumas evidências indicam a participação das proteínas IRS em doenças hematológicas: (1) IRS1 foi descrito como constitutivamente fosforilado e associado ao BCR-ABL em células K562; (2) a expressão de IRS1 foi relacionada com pior prognóstico em leucemia linfóide aguda (LLA) BCR-ABL positiva; (3) IRS2 associa-se ao receptor de eritropoetina; (4) a expressão de IRS2 foi modulada durante estímulos com eritropoetina e IGF-1 e em processos de diferenciação em células hematopoéticas normais e leucêmicas. Neste estudo, foi observada a presença da expressão gênica e protéica de IRS1 e IRS2 em células hematopoéticas normais, mielodisplásicas e leucêmicas, entretanto, o padrão de expressão das duas proteínas foi diferente. Em linhagens celulares de leucemia aguda, IRS1 foi expresso em linhagens de leucemia aguda mieloide (P39, K562, NB4, KG-1, e HL60) e linfoide (MOLT4, Jurkat, Raji e Daudi), enquanto que IRS2 foi expresso preferencialmente em linhagens mieloides. Em células hematopoéticas primárias, não houve diferença na expressão de IRS1 entre células hematopoéticas de pacientes com SMD e LMA e controles normais, e a expressão gênica de IRS1 apresentou-se aumentada em amostras de medula óssea de pacientes com LLA em relação aos controles normais. A expressão de IRS2 foi menor nas amostras de medula óssea de pacientes com SMD, LMA e LLA em relação aos controles normais, e a expressão de IRS2 foi menor em pacientes com SMD de alto risco se comparados com SMD baixo risco, de acordo com a classificação FAB, WHO e com número de citopenias. A participação de IRS2 na diferenciação eritróide de células hematopoéticas normais e mielodisplásicas foi evidenciada através da avaliação da expressão de IRS2 durante a diferenciação eritroide de células progenitoras de medula óssea de doadores normais e de pacientes com SMD. O estudo evidenciou o aumento da expressão de IRS2 durante a diferenciação eritroide, sendo que nas células mielodisplásicas, IRS2 apresentou um menor aumento se comparado às células hematopoéticas normais. Em células BCR-ABL positivas, a inibição da expressão de IRS1 (realizada através do uso de shRNA mediado por lentivírus específico para IRS1) resultou em inibição da proliferação celular e crescimento clonal, acúmulo de células na fase G0/G1 e redução de células na fase S do ciclo celular. A inibição de IRS1 resultou na inibição da fosforilação das proteínas Akt, P70S6K e ERK. Entretanto, a inibição de IRS1 não modulou a apoptose e as proteínas BCL2, BAX e BAD, assim como não modulou a fosforilação de BCR-ABL e CRKL e não apresentou sinergismo quando associado ao inibidor de tirosina quinase do BCR-ABL (imatinib). Estes dados indicam que IRS1 participa dos processos celulares de proliferação celular e clonogenicidade em células BCR-ABL positivas, através da modulação de Akt, P70S6K e ERK. Os achados aqui descritos sugerem que IRS1 é expresso em células hematopoéticas normais, mielodisplásicas e leucêmicas, destacando-se sua elevada expressão em células de LLA e sua participação na via de sinalização BCR-ABL. Estes dados indicam que IRS1 pode ser um alvo terapêutico em LLA e leucemia mieloide crônica (LMC), especialmente nas leucemias BCR-ABL positivas e resistentes a inibidores da atividade tirosina quinase do BCR-ABL. Adicionalmente, IRS2 é expresso em células hematopoéticas, destacando-se a sua expressão reduzida em células mielodisplásicas e leucêmicas quando comparadas às células hematopoéticas normais. A reduzida expressão de IRS2 em células hematopoéticas de pacientes com SMD de alto risco quando comparados aos de baixo risco e o reduzido aumento da expressão de IRS2 na diferenciação eritroide de progenitores de pacientes com SMD sugerem que a expressão de IRS2 participa da fisiopatologia das SMD e pode ser um marcador prognóstico nesta doença / Abstract: Acute leukemia results from a combination of mutations and changes in protein functions that confer the ability of proliferation, and defect in differentiation and apoptosis. Myelodysplastic syndromes (MDS) are hematopoietic disorders caused by alterations in pluripotent cells, characterized by ineffective hematopoiesis and a high rate of progression towards acute myeloid leukemia (AML). Leukemia cells express a variety of receptors for growth factors and cytokines, such as Insulin-like growth factor 1 (IGF-1R). The signaling pathway is initiated by activating its receptor and subsequent activation of its substrates such as insulin receptor substrate (IRS). There is evidence that suggests an involvement of IRS proteins in hematopoeitic disease: (1) IRS1 was described as constitutively phosphorylated and associated with BCR-ABL in K562 cells, (2) the IRS1 expression was associated with a poorer prognosis in BCR-ABL positive acute lymphoblastic leukemia (ALL), (3) IRS2 bind to erythropoietin receptors, (4) IRS2 expression was modulated during stimulation with erythropoietin and IGF-1 during cell differentiation in normal and leukemia hematopoietic cells. In this study, we observed the presence of the gene and protein of IRS1 and IRS2 in normal hematopoietic, leukemia, and myelodysplastic cells, however, the expression pattern of these proteins was different. In acute leukemia cell lines, IRS1 was expressed in myeloid leukemia cells (P39, K562, NB4, KG-1 e HL60) and lymphoid leukemia cells (MOLT4, Junkat, Raji e Daudi), whereas IRS2 expression was more evident in myeloid cell lines. In primary hematopoietic cells, no difference was observed in IRS1 expression between normal, MDS and AML cells, and the IRS1 expression was increased in bone marrow samples from ALL patients compared to normal controls. IRS2 expression was lower in bone marrow samples from patients with MDS, AML and ALL compared to normal controls, and the IRS2 expression was lower in high risk compared with low risk MDS patients, according to FAB and WHO classification, and number of cytopenias. The participation of IRS2 in erythroid differentiation of normal and myelodysplastic hematopoietic cells was evidenced by evaluating IRS2 expression during erythroid differentiation of progenitor cells from the bone marrow of normal donors and patients with MDS. The study demonstrated an increase in IRS2 expression during erythroid differentiation, whereas in myelodysplastic cells, IRS2 showed a smaller increase compared to normal hematopoietic cells. In BCR-ABL positive cells, IRS1 inhibition (by lentivirus-mediated shrunk specific for IRS1) resulted in inhibition of cell proliferation and clonal growth, accumulation of the cells in G0/G1 phase and reduction of cells in S phase of cell cycle. The IRS1 silencing resulted in inhibition of Akt, P70S6K and ERK phosphorylation. However, IRS1 inhibition did not modulate apoptosis; and the proteins BCL2, BAX and BAD, did not modulate the phosphorylation of BCR-ABL and CRKL, nor did they show synergism when combined with tyrosine kinase inhibitor of BCR-ABL (Imatinib). These data indicate that IRS1 participates in the proliferation and clonogenic of BCRABL positive cells by modulation of Akt, P70S6K and ERK. The findings reported herein suggest that IRS1 is expressed in normal hematopoietic, leukemia and myelodysplastic cells, highlighting its high expression in ALL cells and involvement in the BCR-ABL pathway. These data indicate that IRS1 may be a therapeutic target in ALL and chronic myeloid leukemia (CML), especially in BCR-ABL positive leukemias resistant to inhibitors of tyrosine kinase activity of BCRABL. In addition, IRS2 is expressed in hematopoietic cells, highlighting its reduced expression in myelodysplastic and leukemia cells compared to normal hematopoietic cells. The reduced IRS2 expression in high risk when compared to low risk MDS and the lower increase in IRS2 expression during the erythroid differentiation of progenitor cells from MDS patients suggest that the expression of IRS2 participates in the pathophysiology of MDS and may be a prognostic marker in this disease / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Orientador: Fabíola Traina / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T22:39:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Scopim-Ribeiro_Renata_M.pdf: 3643524 bytes, checksum: fec865c6ccea452efda050e40c6f1aa1 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As neoplasias mieloides compreendem um grupo heterogêneo de doenças hematológicas que se originam de um precursor mieloide comum, em diferentes fases de diferenciação. As alterações celulares que levam ao desenvolvimento de neoplasias podem ocorrer através de mecanismos epigenéticos ou de alterações genéticas. DNMT3A codifica metiltransferases que adicionam grupamentos metil a resíduos de citosina do DNA e TET2 promove a hidroxilação da citosina metilada, o que os caracteriza como elementos importantes no controle epigenético. DNMT3A e TET2 encontram-se frequentemente mutados em neoplasias mieloides, mas o impacto prognóstico destas mutações ainda é controverso. A consequência funcional da mutação de DNMT3A em neoplasias mieloides ainda não foi definida, mas o silenciamento da proteína em células progenitoras murinas favorece a autorrenovação e compromete a diferenciação celular. A mutação de TET2 tem como consequência a perda de função do gene e participa da transformação neoplásica das células mieloides, favorecendo a proliferação da série mielomonocítica. Entretanto, a expressão de TET2 e DNMT3A nestas doenças ainda é pouco elucidada. Assim, os objetivos deste estudo foram (1) investigar a expressão de TET2 e DNMT3A em células hematopoéticas de indivíduos normais e pacientes com síndrome mielodisplásica (SMD) e leucemia mieloide aguda (LMA), (2) correlacionar a expressão de TET2 e DNMT3A com o fenótipo clínico e sobrevida de pacientes com SMD; (3) investigar a expressão de TET2 e DNMT3A durante a diferenciação celular hematopoética e (4) avaliar o efeito do silenciamento de DNMT3A no fenótipo de linhagens celulares leucêmicas. No presente estudo, verificamos redução na expressão de TET2 em células provenientes de pacientes com SMD e LMA quando comparada à expressão em controles normais (p<.001), e redução em SMD alto risco quando comparada à SMD baixo risco (p=.02). Os resultados em amostras sequenciais de cinco pacientes com SMD indicaram redução da expressão de TET2 no momento da progressão da doença. A análise univariada evidenciou que fatores clínicos tiveram impacto tanto na sobrevida livre de evento como sobrevida global, incluindo a classificação de risco pela OMS 2008 (alto vs. baixo, p<.0001), IPSS (int-2/alto vs. baixo/int-1, p<.0001), hemoglobina (<10 vs. ? 10, p<.05), contagem de leucócitos (< 3 vs. ? 3 x109/L, p<.05), contagem absoluta de neutrófilos (< 1.5 vs. ? 1.5, p<.05) e porcentagem de blastos na medula óssea (? 5 vs. <5 ou ? 10 vs. <10, p<.0004). Além disso, a baixa expressão de TET2 teve impacto negativo na sobrevida livre de evento (HR: 6.51 [2.42-17.49], p=.0002) e na sobrevida global (HR: 7.25 [2.77-18.99], p<.0001). A análise multivariada indicou que a baixa expressão de TET2 (p <.0001), IPSS alto/intermediate-2 (p <.0001), e hemoglobina <10 g/dL (P<.03) são fatores prognósticos para menor sobrevida livre de evento e sobrevida global. Durante a diferenciação eritroide de células CD34+ de indivíduos normais e pacientes com SMD, observamos um aumento significativo da expressão de TET2 (p=. 03). Na avaliação da diferenciação celular de linhagens leucêmicas, observamos aumento significativo na expressão de TET2 durante as diferenciações granulocítica (p=.04) e megacariocítica (p=.03); e um aumento não significativo durante a diferenciação eritrocítica. A expressão de DNMT3A foi semelhante entre pacientes com LMA, SMD e controles normais, e não teve impacto significativo na sobrevida dos pacientes com SMD. A expressão de DNMT3A não foi modulada durante a diferenciação eritroide de células CD34+ de indivíduos normais e pacientes com SMD. Nos modelos de diferenciação celular de linhagens leucêmicas, observamos aumento significativo da expressão de DNMT3A durante a diferenciação granulocítica, mas não durante a diferenciação eritrocítica e megacariocítica. A redução na expressão de DNMT3A não resultou em alteração significativa na apoptose, na proliferação e no ciclo celular em linhagens leucêmicas HL60 e U937. A expressão gênica e proteica de PTEN não foi modulada em células leucêmicas submetidas à inibição de DNMT3A. Os achados aqui descritos sugerem que, similarmente à presença de mutação no TET2, a baixa expressão de TET2 pode participar do processo de transformação celular em SMD de alto risco e LMA; estudos clínicos deveriam considerar a investigação da expressão gênica de TET2 em conjunto com a pesquisa de mutação TET2 na definição de prognóstico. Os resultados de expressão e função de DNMT3A sugerem que a mutação, e não a expressão, deva ser o principal mecanismo pelo qual o DNMT3A participa da transformação neoplásica e que a função de DNMT3A pode depender da linhagem celular estudada / Abstract: Myeloid neoplasms comprise a heterogeneous group of hematologic malignancies that originate from a common myeloid precursor at different stages of differentiation. Cellular changes that lead to development of malignancies may occur through epigenetic mechanisms or genetic alterations. DNMT3A encodes methyltransferases that add methyl groups to cytosine residues in DNA, TET2 promotes hydroxylation of methylated cytosine, and both proteins are important elements in epigenetic control. TET2 and DNMT3A are recurrently mutated in myeloid malignancies, but the prognostic consequence of TET2 and DNMT3A mutation is still controversial. The functional consequences of DNMT3A mutation has not been defined, but the protein silencing in murine progenitor cells promotes self-renewal and reduces cell differentiation. TET2 mutation results in loss of function and participates in the neoplastic transformation of myeloid cells, favoring the proliferation of granulomonocytic cells. However, the expression of TET2 and DNMT3A in these diseases has been rarely addressed. Then, the aims of this study were (1) to evaluate TET2 and DNMT3A gene expression in hematopoietic cells from healthy individuals and from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) and acute myeloid leukemia (AML); (2) to correlate TET2 and DNMT3A expression with clinical phenotype and outcomes of MDS patients; (3) to investigate TET2 and DNMT3A expression during hematopoietic cell differentiation; and (4) to evaluate the effect of DNMT3A silencing in the phenotype of leukemia cell lines. In this study, the expression of TET2 was decreased in cells from patients with MDS and AML compared to healthy donors (p<.001) and reduced high-risk MDS compared to low risk MDS (p=.02). The results in sequential samples from five patients with MDS indicate reduced expression of TET2 at the time of disease progression. By univariate analysis, clinical factors that significantly affected both event free survival (EFS) and overall survival (OS) included risk stratification by WHO 2008 (high vs. low, p<.0001), IPSS (int-2/high vs. low/int-1, p <.0001), hemoglobin (<10 vs. ? 10, p<.05), white blood cell counts (< 3 vs. ? 3 x109/L, p<.05), absolute neutrophil counts (< 1.5 vs. ? 1.5, p<.05) and bone marrow blast percentage (? 5 vs. <5 or ? 10 vs. <10, p<.0004). Furthermore, low TET2 expression negatively impacted both EFS (HR: 6.51 [2.42-17.49], p=.0002) and OS (HR: 7.25 [2.77-18.99], p<.0001). Multivariate analyses indicated that low TET2 expression (p <.0001), along with IPSS high/intermediate-2 risk group (p <.0001), and hemoglobin <10 g/dL (p<.03) were independently prognostic for worse EFS and OS. During erythroid differentiation of CD34+ cells from normal individuals and patients with low-risk MDS, we observed an increased expression of TET2 (p=.03). During cell differentiation of leukemic cell lines, we observed a significantly increase in the expression of TET2 during granulocytic and megakaryocytic differentiation (p=.04 and p=.03, respectively); there was also an increased expression during erythrocytic differentiation, but this was not statistically significant. The expression of DNMT3A was similar between patients with AML, MDS and healthy donors, and it did not impact survival outcomes in MDS patients. DNMT3A expression was not modulated during erythroid differentiation of CD34+ cells from normal individuals and patients with MDS. In leukemic cell lines models of differentiation, we observed a significantly increase in the DNMT3A expression during granulocytic differentiation, but not in erythrocytic and megakaryocytic differentiation. The DNMT3A silencing did not result in significant changes in apoptosis, proliferation and cell cycle in leukemic cell lines HL60 and U937. PTEN gene and protein expression was not modulated in leukemic cell lines submitted to inhibition of DNMT3A. The findings reported here suggest that, similarly to the presence of TET2 mutations, the low expression of TET2 can participate in the process of cell transformation in high risk MDS and AML. Clinical studies should consider the investigation of TET2 expression together with the studies of TET2 mutation to defining prognosis. Our results of expression and function suggest that DNMT3A mutation, instead of the expression, should be the main mechanism by which DNMT3A participates in neoplastic transformation and that DNMT3A function may vary according to the cell line studied / Mestrado / Clinica Medica / Mestra em Ciências

Orientador: Irene Gyongyver Heidemarie Lorand Metze / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T02:52:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rego_MonicaFortesNapoleaodo_D.pdf: 1896028 bytes, checksum: d0c30f6192c810b425474ce94b9f276b (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A Leucemia Mieloide Crônica (LMC) é uma neoplasia mieloproliferativa, caracterizada pela presença do cromossomo Philadelphia, que é o resultado da translocação balanceada entre os braços longos dos cromossomos 9 e 22 que corresponde à formação do gene híbrido BCR-ABL, que codifica uma proteína quimérica com atividade tirosina-quinase, diretamente implicada na patogênese da doença. O mesilato de imatinibe (IM) é um inibidor seletivo dessa enzima e tem sido usado como terapia alvo-específica na LMC com excelentes resultados em estudos clínicos. É controverso na literatura se estes resultados sao reproduzíveis na população em geral e que processos podem ser implementados para otimizá-los. No nosso estudo realizamos uma análise de pacientes com LMC que tomaram IM entre 2002 e 2013, atendidos no Hospital São Marcos, em Teresina-PI. Teve, como objetivo, caracterizar a LMC no Piauí do ponto de visto clínico e laboratorial, avaliar a eficácia do tratamento com IM em portadores de LMC fase crônica e acelerada, através da resposta citogenética aos 12 meses. Investigou-se a influência dos seguintes fatores na resposta citogenética completa aos 12 meses: idade, sexo, fase da doença, tempo entre o diagnóstico e o início do IM, anos de escolaridade, renda per capita (em reais), distância da moradia ao hospital em Km e escores prognósticos. Cento e quarenta e quatro pacientes foram elegíveis, sendo que 130 deles em fase crônica e 14 em fase acelerada. A mediana de idade foi de 41 anos (8-81). Setenta e seis (52,2%) foram do sexo masculino. Oitenta e cinco (59%) pacientes estavam em fase crônica precoce (menos de um ano entre diagnóstico e início do tratamento). A mediana de escolaridade foi de 4 anos (0-17). Em relação aos índices prognósticos, 89% dos casos foram de risco intermediário ou alto no escore de Sokal, 40% o foram no escore de Hasford, enquanto que a maioria foi de baixo risco no de Eutos. Aos doze meses, 68 casos entraram em resposta citogenética completa. Foram significantes para resposta citogenética aos 12 meses, a escolaridade (p=0, 001), o escore de Hasford (p = 0, 007) e o período entre o diagnóstico e o início do imatinibe (p=0, 001). A mediana de seguimento foi de 65 meses (7-149). Ao término da avaliação 60 (52,8%) pacientes ainda faziam uso do mesilato de imatinibe e 41 (29,4%) tinham descontinuado a medicação (35 por perda de resposta e 6 por progressão). O fato de oito pacientes terem critérios de fase acelerada ao diagnóstico não influiu no resultado do tratamento. Desde que o Ministério da Saúde forneceu o medicamento, o tratamento alvo-específico na LMC produziu excelentes resultados em Teresina. Foi mais importante para o resultado a introdução precoce do tratamento, bem como o grau de instrução dos pacientes / Abstract: Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative neoplasm characterized by the presence of the Philadelphia chromosome, which is the result of a balanced translocation between the long arms of chromosomes 9 and 22 corresponding to the hybrid gene BCR-ABL, which encodes a chimeric protein with tyrosine kinase activity and directly implicated in the pathogenesis of the disease. Imatinib mesylate (IM) is a selective inhibitor of this enzyme and has been used as targeted therapy for CML with excellent results in clinical studies. It is controversial if these results are reproducible in the community based treatment and which strategies could be used to optimize the results. In our study we performed an analysis of CML patients treated IM between 2002 and 2013 at the St. Mark¿s Hospital, Teresina-Pi. We studied the clinical and laboratory features of the patients at diagnosis and evaluated the effectiveness of the IM treatment by complete cytogenetic response (CCR) at 12 months. We also studied the influence of age, sex, stage of disease, time between diagnosis and the start of IM, years of schooling, per capita income, distance from house to hospital in KM and the Sokal, Hasford and Eutos scores on this response. One hundred forty-four patients were eligible: 130 patients in chronic and 14 in accelerated phase. The median age was 41 years (8-81). Seventy-six (52.2%) were male. Eighty-five (59%) patients were classified as early chronic phase (less than one year between diagnosis and start of IM treatment). The median educational level was 4 years (0-17). According to the Sokal score 89% of cases were intermediate or high-risk but this was the case only for 40% in the Hasford score. The majority was low risk in the Eutos score. After twelve months 68 patients achieved CCR. Years of formal education (p=0,001), Hasford risk category (p=0,007) and the period between diagnosis and the start of IM (p=0,001) influenced achievement of CCR. The median follow-up period was 65 months (7-149). At the of this period 60 (52,8%) patients were still using IM. In 41 the medication had been discontinued: in 35 for loss of response and in 6 after disease progression. The fact that 14 patients had criteria of accelerated phase at diagnosis did not affect the outcome of treatment. Since the Ministry of Health provided the drug, the target-specific treatment in CML has produced excellent results in Teresina. The early introduction of treatment as well as the educational level of the patients were the most important factors influencing treatment outcome / Doutorado / Medicina Interna / Doutora em Ciências Médicas

A leucemia mieloide crônica (LMC) é uma expansão clonal da célula tronco hematopoética, traduzindo-se por hiperplasia mieloide, leucocitose, neutrofilia, basofilia e esplenomegalia. O cromossomo Filadélfia é característico da doença, sendo produto da translocação t(9:22)(q34;q11), resultando na fusão dos genes ABL e BCR. Esta fusão gera um gene híbrido que codifica uma proteína com elevada atividade tirosinoquinase e tem um papel central na patogenia da LMC. O mesilato de imatinibe (MI) é um derivado da fenilaminopirimidina que inibe a proteína tirosinoquinase BCR-ABL1 in vitro e in vivo. O MI interage com transportadores de membrana de influxo, como o organic carion solute carrier 22 ,member 1 (SLC22A1,hOCT1); e de efluxo, como ATP binding cassette B1 (ABCB1, MDR1, P-gp). Os polimorfismos ABCB1 c.1236C>T, C.3435C>T e c.2677G>T/A têm sido associados com a alteração da função da P-gp. Este estudo teve por objetivo investigar a relação da expressão do RNAm de ABCB1 e SLC22A1 com marcadores de resposta ao tratamento com MI e avaliar a atividade funcional da P-gp em células mononucleares de pacientes com diferentes haplótipos para os polimorfismos ABCB1 c.1236C>T, c.3435C>T e c.2677G>T/A. Foram incluídos 118 pacientes com LMC para o estudo da expressão do RNAm de SLC22A1 e ABCB1 e para o estudo da atividade da P-gp foram selecionados 28 pacientes de acordo com os haplótipos dos polimorfismos ABCB1 c.1236C>T, c.3435C>T e c.2677G>T/A. Para o estudo da expressão do RNAm de SLC22A1 e ABCB1 foram constituídos dois grupos: Grupo 1 com 70 pacientes com resposta citogenética completa com a dose padrão de MI (400 mg/dia de MI) em até 18 meses e, Grupo 2 com 48 pacientes sem resposta citogenética completa com a dose inicial de 400 mg/dia de MI ou que perderam esta resposta ao longo do tratamento. Para o estudo da atividade funcional da P-gp, dos 118 pacientes incluídos, foram selecionados 10 pacientes que apresentaram o haplótipo 1236CC/3435CC/2677GG, 10 pacientes que apresentaram o haplótipo 1236CT/3435CT/2677GT e 8 pacientes que apresentaram o haplótipo 1236TT/3435TT/2677TT. A resposta ao tratamento foi avaliada segundo os critérios da European LeukemiaNet. Amostras de sangue foram obtidas para: quantificação de BCR-ABL1, extração do RNAm total, análise citogenética de banda G, dosagem da concentração plasmática de MI e análise da atividade e expressão da P-gp. A análise da expressão dos genes ABCB1 e SLC22A1 foi feita por PCR em tempo real, a análise da atividade e expressão da P-gp foram feitas por citometria de fluxo e a dosagem da concentração plasmática de MI foi realizada por eletroforese capilar. Resultados: A expressão de ABCB1 e SLC22A1 foi analisada nos 118 pacientes incluídos e foi similar entre os grupos de resposta. A elevada expressão do gene SLC22A1 foi associada àqueles pacientes que alcançaram a resposta molecular maior (RMM) no grupo respondedor (P=0,009). Não houve associação entre a expressão de ABCB1 e a resposta ao MI. Nenhum dos genes foi associado à resposta molecular completa (RMC). No estudo da atividade da P-gp foi observada uma maior atividade nos pacientes que apresentavam o haplótipo 1236CC/3435CC/2677GG quando comparado àqueles que possuíam o haplótipo com alelo mutado. Não houve diferença na expressão do RNAm dos genes SLC22A1 e ABCB1, expressão da P-gp e concentração plasmástica de MI entre os grupos de haplótipos. Os pacientes que não alcançaram a RMM apresentaram uma maior taxa de efluxo mediado pela P-gp quando comparado aos indivíduos que alcançaram esta resposta (64,7% vs. 45,7%; P=0,001). Os indivíduos que alcançaram a RMM e RMC apresentaram maior mediana de expressão do gene SLC22A1. Os pacientes sem RMM apresentaram menor concentração plasmática de MI quando comparados aos que alcançaram esta resposta (0,51 &#181;g/mL vs. 1,42 &#181;g/mL; P=0,001). Não foi observada associação entre a concentração plasmática de MI e a RMC. Em conclusão os pacientes respondedores a dose padrão de 400mg/dia de MI e que alcançaram a RMM apresentam maior expressão de RNAm de SLC22A1 e os portadores dos haplótipos 1236CT/3435CT/2677GT e 1236TT/3435TT/2677TT exibem menor efluxo mediado pela P-gp apresentando maior frequência de RMM. / Chronic myeloid leukemia (CML) is a clonal expansion of hematopoietic stem cell, translating into myeloid hyperplasia, leukocytosis, neutrophilia, basophilia and splenomegaly. The Philadelphia chromosome is characteristic of the disease, being the product of the translocation t(9:22)( q34,q11), resulting in the fusion of the BCR and ABL genes. This fusion generates a hybrid gene that encodes a protein with elevated tyrosine kinase activity and plays a central role in the pathogenesis of CML. Imatinib mesylate (IM) is a derivative of fenilaminopirimidine that inhibits BCR-ABL1 fusion protein tyrosine kinase in vitro and in vivo. IM interacts with uptake membrane transporters, such as cation organic solute carrier 22, member 1 (SLC22A1, hOCT1) and efflux as ATP binding cassette B1 (ABCB1, MDR1,P-gp). ABCB1 polymorphisms c.1236C>T,c.3435C>T and c.2677G>T/A have been associated with altered function of P-gp. This study aimed to investigate the relationship between mRNA expression of ABCB1 and SLC22A1 with markers of response to treatment with IM and evaluate the functional activity of P-gp in mononuclear cells of patients with different haplotypes for ABCB1 c.1236C>T, c.3435C>T and c.2677G>T/A polymorphisms. This study included 118 patients with CML to study the mRNA expression of SLC22A1 and ABCB1 and to study the P-gp activity, 28 patients were selected according to the haplotypes of ABCB1 c.1236C>T, c.3435C>T and c.2677G>T/A polymorphisms. To study the mRNA expression of SLC22A1 and ABCB1, two groups were constituted: Group 1 with 70 patients with a complete cytogenetic response with standard-dose IM (400 mg/day) in 18 months, and group 2 with 48 patients without complete cytogenetic response with the initial dose of IM (400 mg/day) or have lost this response during treatment. To study the P-gp functional activity, 10 patients with haplotype 1236CC/3435CC/2677GG, 10 patients with haplotype 1236CT/3435CT/2677GT and 8 patients with haplotype 1236TT/3435TT/2677TT were enrolled. Treatment response was assessed according to European LeukemiaNet criteria. Blood samples were obtained for: quantification of BCR-ABL1, mRNA extraction, G band cytogenetic analysis, measurement of IM plasma levels and P-gp activity and expression. The ABCB1 and SLC22A1 gene expression analysis was made by real-time PCR, analysis of P-gp activity and protein expression were performed by flow cytometry and determination of plasma Levels of IM was performed by capillary electrophoresis. Results: Expression of ABCB1 and SLC22A1 were analyzed in 118 patients included and was similar between the response groups. Higher expression of the SLC22A1 gene was associated with those patients who achieved a major molecular response (MMR) in the responder group (P=0.009). There was no association between ABCB1 expression and IM response. None of the studied genes was associated with complete molecular response (CMR). In the study of P-gp activity we observed greater activity mediated by P-gp in patients with 1236CC/3435CC/2677GG haplotype when compared to those with the mutated allele. There was no difference in mRNA expression of SLC22A1 and ABCB1 genes, P-gp expression and IM plasma levels between haplotypes groups. Patients who did not achieve MMR showed a higher rate of efflux mediated by P-gp compared to individuals who did achieve this response (64.7% vs. 45.7%, P=0.001). Individuals who achieved MMR and CMR had higher median of SLC22A1 expression. Patients without MMR had lower IM plasma levels compared with those who achieved this response (0.51 &#181;g/mL vs. 1.42 &#181;g/mL, P=0.001). No association was observed between IM plasma levels and CMR. In conclusion patients responders to standard dose of IM (400 mg/day) and who achieved MMR have higher SLC22A1 mRNA expression and the carriers of 1236CT/3435CT/2677GT 1236TT/3435TT/2677TT haplotypes exhibit lower efflux mediated by P-gp with higher frequency of MMR.

Orientador: Cármino Antonio de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T09:59:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Almeida_MariaHelenade_D.pdf: 2031022 bytes, checksum: 4ca81cfeb49f5ad6382582a5201e8b80 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A leucemia mieloide crônica e uma doença clonal, caracterizada por uma translocação recíproca entre os cromossomos 9 e 22. A introdução do tratamento com inibidores de tirosino quinase, administrado por via oral, revolucionou e melhorou drasticamente o tratamento destes pacientes, porem a eficácia deste tratamento esta diretamente relacionada ao uso desta medicação a longo prazo. Pacientes e métodos: 137 pacientes com leucemia mieloide crônica, em uso de inibidores de tirosino quinase, tiveram a sua aderência avaliada em três diferentes momentos: seis meses retrospectivo, seis e doze meses prospectivos. Três diferentes métodos indiretos foram utilizados para a avaliação da aderência: o teste de Morisky, o diário de medicação e o índice de posse da medicação. Resultados: não houve diferença significante quando consideramos os três diferentes momentos em que avaliação foi realizada e o método considerado mais efetivo para a avaliação da aderência foi considerado o índice de posse da medicação (p=0.0001). Considerando as informações acima, o método utilizado para a avaliação da aderência foi o índice de posse da medicação avaliado apos, aproximadamente, 12 meses de analise. A mediana de aderência observada neste estudo foi de 96,5%. Os fatores que influenciaram a aderência foram: nível socioeconômico, qualidade de vida, tempo de uso dos inibidores de tirosino quinase e participação em protocolos de pesquisa clinica. Sendo que pacientes com níveis socioeconômicos mais elevados, com melhor qualidade de vida e que estavam inseridos em protocolos clínicos estavam relacionados com melhores índices de aderência (p=0.01, p=0.007 e p=0.02 respectivamente). Enquanto que pacientes com tempo mais prolongado de uso dos inibidores de tirosino quinase estavam relacionados a piores índices de aderência (p=0.03). Para os pacientes em uso de imatinibe por um período de 24 a 48 meses, em primeira linha de tratamento a aderência foi significativamente melhor em pacientes que apresentavam resposta molecular maior quando comparado ao grupo que não havia atingido este beneficio terapêutico (p=0.04). Apenas 24% da população avaliada mantenve-se completamente aderente no período de avaliação. Conclusões: a manutenção de uma aderência adequado em pacientes com leucemia mieloide crônica em uso de inibidores de tirosino quinase esta relacionado com a obtenção de melhores índices de resposta molecular e consequentemente, melhores resultados terapêuticos. A monitorização continua da aderência nestes pacientes e fundamental para que se atinjam os objetivos x xi terapêuticos. Informações sobre os fatores que podem influenciar a aderência, uma equipe multidisciplinar especializada e treinada para assistir este paciente pode fazer a diferença na obtenção de melhores resultados terapêuticos / Abstract: Chronic myeloid leukemia is a clonal disorder caused by the reciprocal translocation between cromossomes 9 and 22.The introduction of oral tyrosine kinase inhibitors has dramatically revolucioned and improved outcomes in these patients. However, treatment success is directly related to good long-term adherence and questions relating to adherence to prescribed therapy have become an important issue. Patient and Methods: adherence to tyrosine kinase inhibitors therapy was evaluated in 137 chronic myeloid leukemia patients in three different times: six months retrospective, six and twelve month prospectively. Three different methods were used to evaluate adherence: the Morisky Questionnaire, the medication diary and the medication possession ratio. Results: there was no difference between the three different time of evaluation and the medication possession ratio was the most effective method of assessing adherence (p=0.0001); the median adherence was 96.5%. Duration of tyrosine kinase inhibitors treatment was the variable that most impacted adherence (p=0.03); the medication possession ratio was inversely correlated to the duration of therapy. Additionally, participation in clinical trials, better quality of life as reported by patients and higher socioeconomic status were all related to better adherence (p=0.02, p=0.007 and p=0.01, respectively). For patients treated with imatinib for 24 to 48 months (n=22), individuals with major molecular response had a significantly better medication possession ratio than those who failed to achieve MMR (p=0.04). In this group the mean MPR was 87% for the population without apparent molecular response and 96% for those achieving major molecular response, however only 24% of the patients were completely adherent to tirosine kinase inhibitors treatment. Conclusions: higher adherence in chronic myeloid leukemia patients using imatinib is related with best molecular response and therapeutic outcomes. Monitoring the adherence treatment is critical to improving de therapeutics results. A specialized, trained multidisciplinary team that is capable of gaining the trust of patients may persuade them to comply with treatment and detect those who require better monitoring to optimize treatment / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Clínica Médica

A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa resultante da expansão clonal da célula hematopoética precursora. Sua fisiopatologia está associada ao cromossomo (cr) Philadelphia (Ph) originado da t(9;22) e ao oncogene bcr-abl1 que codifica a proteína Bcr-Abl1 com constitutiva atividade de tirosinoquinase (TK). A expressão de Bcr-Abl determina a leucemogênese por meio da alteração da adesão das células progenitoras leucêmicas ao estroma medular e resistência à apoptose. Os inibidores de TK, o mesilato de imatinibe, dasatinibe e nilotinibe são utilizados no tratamento da LMC, entretanto, casos de resistência têm sido relacionados à presença de mutações em Bcr-Abl1, duplicação do cr Ph e superexpressão do gene bcr-abl1. A resistência ou refratariedade de alguns pacientes ao tratamento com inibidores de TK impulsiona a realização de estudos para melhor conhecimento da fisiopatologia da LMC e descrição de novos alvos terapêuticos. Nesse contexto, o presente estudo investigou a participação de microRNAs na modulação da expressão de genes que regulam a apoptose. O objetivo geral deste trabalho foi investigar o efeito de bcr-abl1 e da atividade tirosinoquinase de Bcr-abl na expressão desses miRNAs em linhagens celulares e pacientes com LMC. O RNA das linhagens celulares, de pacientes e controles foram obtidos por meio da extração com Trizol® e o cDNA sintetizado com o kit High Capacity cDNA reverse transcription. A expressão dos microRNAs e dos genes alvoss foi quantificada por PCR em tempo real utilizando o kit SYBR Green PCR Master Mix® e TaqMan Universal PCR Master Mix®. A inibição de Bcr-Abl1 na linhagem HL-60.Bcr-Abl1 tratada com o mesilato de imatinibe aumentou a expressão de miR-let-7d, miR-15a, miR-130a e miR-145 e diminuiu os níveis de miR-21. O tratamento com dasatinibe aumentou a expressão de miR-let-7e, miR-15a, miR-16, miR-21, miR-30e, miR-130a e miR-142-3p. O nilotinibe aumentou a expressão de miR-let-7e, miR-15a, miR-16, miR-130a e miR-145 e, diminuiu os níveis de miRlet- 7d e miR-21. Os resultados obtidos da análise entre os de pacientes com LMC em diferentes fases da doença mostraram elevados níveis de miR-15a, miR-130b e miR-145 em pacientes na fase crônica versus controles e baixos níveis de miR-16, miR-26a e miR-146a. Pacientes em fases avançadas versus controles apresentaram baixa expressão de miR-let-7d, miR-16, miR-142-3p, miR-145 e miR-146a. Baixos níveis de miR-let-7d, miR-15a, miR-16, miR-29c, miR-142-3p, miR-145 e miR-146a foram observados nas fases avançadas da LMC em relação a fase crônica. Os genes anti-apoptóticos a1, bcl-2, c-flip, ciap-1 e ciap-2 estavam mais elevados na fase crônica do que nos controles. A expressão do gene c-flip estava diminuída e dos genes a1, ciap-1 e mcl-1 aumentada nas fases avançadas em relação aos controles e a fase crônica. Pacientes com LMC resistentes ao MI apresentaram menores níveis de miR-26a, miR-29c, miR-130b, miR-146a e dos genes anti-apoptóticos ciap-1 e mcl-1. Os dados obtidos sugerem que a TK Bcr-Abl modula a expressão de microRNAs que possuem como alvos genes que regulam a apoptose celular / Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disease resulting from clonal expasion of hematopoietic precursor cells. Its physiopathology is associated to Philadelphia (Ph) chromosome (cr) originated from the t(9;22) and bcr-abl1 oncogene that encodes the Bcr-Abl protein with constitutive tyrosine kinase activity (TK). The Bcr-Abl1 expression determines leukemogenesis by altering the leukemic progenitor cells´ adhesion by bone marrow stroma and apoptosis resistance. TK inhibitors imatinib mesylate, dasatinib and nilotinib are used to treat CML, however, cases of resistance have been linked to mutation in Bcr-Abl1, duplication of the cr Ph and overexpression of the bcr-abl1. The resistance or refractoriness of some patients to treatment with TK inhibitors drives the studies to better understand the CML physiopathology and description of new therapeutic targets. In this context, this study investigated the participation of microRNAs in modulating expression of the genes that regulate apoptosis. The aim of this study was to investigate the effect of Bcr- Abl1 and its kinase activity in the expression of miRNAs in cell lines and CML patients. The RNA from cell lines, patients and controls were obtained by extraction with Trizol® and cDNA was synthesized with the kit High Capacity cDNA reverse transcription. The expression of miRNAs and target genes was quantified by real time PCR using SYBR Green PCR Master Mix® kit and TaqMan Universal PCR Master Mix®. The Bcr-Abl1 inhibition in the cell line HL-60.Bcr-Abl1 treated with imatinib mesylate increased the expression of miR-let- 7d, miR-15a, miR-130a and miR-145 and decreased miR-21 levels. Treatment with dasatinib increased the expression of miR-let-7e, miR-15a, miR-16, miR-21, miR-30e, miR-130a and miR- 142-3p. Nilotinib increased the expression of miR-let-7e, miR-15a, miR-16, miR-130a and miR- 145 and, decreased miR-let-7d and miR-21 levels. The results of the analysis among patients with CML in different stages of disease showed high levels of miR-15a, miR-130b and miR-145 in chronic phase versus controls and low levels of miR-16, miR-26a and miR-146a. Patients in advanced phases versus controls showed low expression of miR-let-7d, miR-16, miR-142-3p, miR-145 and miR-146a. Low levels of miR-let-7d, miR-15a, miR-16, miR-29c, miR-142-3p, miR-145 and miR-146a were observed in CML advanced phases when compared with chronic phase. The antiapoptotic genes a1, bcl-2, c-flip, ciap-1 and ciap-2 were higher in chronic phase than in controls. The c-flip expression was decreased and a1, ciap-1 and mcl-1 expression was increased in advanced phases when compared to controls and chronic phase. CML patients resistant to imatinib mesylate presented low levels of miR-26a, miR-29c, miR-130b, miR-146a and ciap-1 and mcl-1 antiapoptotic genes. The data obtained suggest that Bcr-Abl1 TK modulates the miRNA expression which has target genes involved in the apoptosis´ regulation.

A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa, resultante da expansão clonal da célula-tronco hematopoética pluripotente. A fisiopatologia da LMC está associada a uma translocação entre os braços longos dos cromossomos 9 e 22, o que promove o aparecimento do neogene bcr-abl, cujo gene codifica uma proteína denominada Bcr-Abl. A oncoproteína Bcr-Abl possui atividade tirosina-quinase constitutiva que é a responsável pelo fenótipo maligno da célula, incluindo resistência à apoptose. O tratamento da LMC pode ser realizado com hidroxiuréia, IFN- associado à citarabina, inibidores de TK (mesilato de imatinibe e dasatinibe) e transplante de medula óssea. O tratamento de escolha para pacientes com LMC na fase crônica é o inibidor de tirosina-quinase mesilato de imatinibe e para os refratários utiliza-se o dasatinibe. Apesar do conhecimento acerca do mecanismo de ação dos inibidores de TK, pouco se sabe sobre seu efeito na maquinaria apoptótica. Sendo assim, no presente trabalho foi detectada a expressão dos genes e proteínas anti- (A1, Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-W, C-Flip, Ciap-1, Ciap-2 e Mcl-1) e pró-apoptóticos (Bad, Bak, Bax, Bcl-Xs, Bid, Bik, Bimel, Bmf, Bok, Fas, Fasl, Noxa e Puma) em células mononucleares de 32 indivíduos saudáveis e 26 pacientes com LMC antes e após 12 meses da terapia com mesilato de imatinibe e dasatinibe. Dentre os 26 pacientes avaliados, 13 eram do sexo feminino e 13 do sexo masculino, três eram negros, um amarelo e 22 brancos, com idade média de 48 anos (faixa etária de 25 a 77 anos). O grupo controle foi composto por 32 indivíduos, 16 do sexo feminino e 16 do sexo masculino, 26 eram brancos, quatro negros e dois amarelos, com idade média de 45 anos (idade de 23 a 77 anos). O isolamento das células mononucleares foi realizado pelo método de Ficoll-Hypaque, a determinação da expressão gênica por PCR em tempo real e a protéica por western-blot. Os resultados foram expressos em unidade relativa de expressão (U.R.E.), comparados entre os diferentes grupos (controle e pacientes pré- e pós-tratamento), associados à resposta aos medicamentos e correlacionados ao índice de prognóstico de SOKAL. Na comparação dos dados de expressão gênica entre pacientes e controles, verificou-se que os pacientes apresentaram maior expressão dos genes bcl-xL, c-flip, mcl-1 e fas e níveis reduzidos de bik. O mesilato de imatinibe modulou significativamente a transcrição dos genes bcl-xL, bok, mcl-1 e noxa, enquanto que o dasatinibe agiu sobre a expressão dos genes a1, bmf, c-flip, ciap-1, ciap-2 e mcl-1. Os pacientes refratários ao mesilato de imatinibe apresentaram níveis elevados de expressão de a1 e c-flip e reduzida expressão de bcl-2, ciap-2, bak, bax, bid e fasl em relação aos pacientes em remissão. A expressão protéica refletiu os dados da quantificação do RNAm dos genes. Os dados da presente investigação indicam que as células mononucleares dos pacientes com LMC apresentam desregulação do processo de apoptose celular. Essa alteração pode ser parcialmente associada ao fenótipo de resistência das células leucêmicas Bcr-Abl+ à apoptose e ausência de resposta aos inibidores de TK. Os dados revelam ainda que os inibidores de tirosina-quinase interferem na transcrição e tradução das moléculas envolvidas na regulação do processo de apoptose. / Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disease resultant of a clonal expansion of pluripotent hematopoietic stem cells. The CML physiopathology is associated with a translocation between chromosomes 9 and 22 long arms, promoting the formation of a bcr-abl neogene, which codifies the Bcr-Abl protein. The Bcr-Abl oncoprotein presents tyrosine-kinase activity that is responsible for the malign phenotype which includes apoptosis resistance. CML treatment may be performed with hydroxyurea, IFN- plus cytarabine, tyrosine-kinase inhibitors (imatinib mesylate and dasatinib) and bone marrow transplantation. The standard treatment for CML patients in chronic phase is the tyrosine-kinase inhibitor imatinib mesylate (IM) and for IM-refractory patients dasatinibe is employed. Despite of the knowledge related to the mechanism of action of tyrosine-kinase inhibitors, little is known about its effects on the apoptosis machinery. In this work we characterized both the mRNA and protein patterns of expression of the anti- (A1, Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-W, C-Flip, Ciap-1, Ciap-2 e Mcl-1) and pro-apoptotic (Bad, Bak, Bax, Bcl-Xs, Bid, Bik, Bimel, Bmf, Bok, Fas, Fasl, Noxa e Puma) regulators in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 32 healthy individual and 26 CML patients before and after 12 months of imatinib mesylate and dasatinibe therapy. Thirteen patients were female and thirteen were male, three were black, one was japanese and 22 were white, the mean age was 48 years (varying from 25 to 77 years). The control group was composed of 32 individuals, 16 were female and 16 were male, 26 were white, four black and two japanese, the mean age was 45 years (varying from 23 to 77 years). PBMC isolation was performed by Ficoll-Hypaque, gene expression was assessed by real time PCR and protein expression was carried out by western-blot methodology. Results were given by the relative expression, after comparison between the different groups (control and patients before and after treatment), associated with drug response and related to Sokal index. The comparison of gene expression profiles between patients and controls showed that CML patients present increased levels of bcl-xL, c-flip, mcl-1 and fas expression and reduced levels of bik gene expression. The imatinib mesylate significantly modulated the transcription of bcl-xL, bok, mcl-1 and noxa, whereas dasatinib affected the expression of a1, bmf, c-flip, ciap-1, ciap-2 and mcl-1. MI-refractory patients present higher levels of a1 and c-flip and lower levels of bcl-2, ciap-2, bak, bax, bid and fasl when compared to patients who achieved complete cytogenetic response. Overall, the patterns of protein expression agree with the profiles of mRNA expression. Taken together, the results described in this investigation indicate that PBMC from CML patients present deregulation in cell death pathways. These alterations could partly account for the apoptosis resistance phenotype observed in Bcr-Abl+ leukemic cells and for lack of response to tyrosine kinase inhibitors. Furthermore, our data also reveal that tyrosine kinase inhibitors interfere in the transcription and translation of molecules that regulate the apoptosis process.

Na leucemia mielóide crônica (LMC) a proteína Bcr-Abl possui atividade tirosina-quinase constitutivamente ativada, induzindo a mieloproliferação e a resistência das células à apoptose. A maioria dos pacientes na fase crônica da LMC tratados com inibidores de tirosina-quinase (TKIs), como o mesilato de imatinibe, apresenta remissão citogenética completa da doença, mas uma parcela desses pacientes tem se mostrado resistente à terapia. A fisiopatologia da LMC e os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na resistência à terapia com TKIs são diversos e precisam ser melhor estudados. Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi quantificar os níveis de expressão do gene DIDO, incluindo suas diferentes isoformas (DIDO 1, 2 e 3) e promotores (DIDO PP e PD) em controles e em pacientes com LMC nas diferentes fases da doença, tratados ou não com TKIs, bem como em linhagens celulares BCR-ABL1+ sensíveis (S) e resistentes (R) ao mesilato de imatinibe (MI). A literatura relata que DIDO 1 participa do processo de apoptose e que alterações na expressão de DIDO 2 e DIDO 3 podem estar associadas com o desenvolvimento de neoplasias mielóides. Dessa forma, foram estudados 60 pacientes com LMC e 57 controles, assim como as linhagens celulares HL-60, HL-60.Bcr-Abl+, LAMA 84 S, LAMA 84 R, KCL 22 S e KCL 22 R. Foram separadas as células mononucleares de sangue periférico dos pacientes e controles, com posterior extração de RNA e síntese de cDNA, que foi então empregado nas reações de PCR em tempo real (qPCR) para quantificação das expressões gênicas de DIDO 1, 2, 3, PP, PD e ORF. As linhagens celulares foram tratadas por 4h com TKIs e então a expressão das diferentes isoformas de DIDO foi também quantificada por qPCR. A avaliação da expressão proteica de Bcr-Abl, c-Abl e proteínas fosforiladas nas linhagens foi realizada por Western-blotting. A expressão de DIDO 1 e 2 foi maior nos pacientes nas fases avançadas da LMC e nos pacientes na fase crônica da doença tratados com TKIs (mesilato de imatinibe ou dasatinibe) do que nos controles. Os pacientes na fase crônica da LMC tratados com MI expressaram mais DIDO 1 e 3 do que os pacientes na fase crônica sem tratamento. Houve uma correlação positiva entre expressão de BCR-ABL1 e de DIDO 2 e entre índice de Sokal dos pacientes e expressão de DIDO 2. Na linhagem HL60.Bcr-Abl+, a expressão de proteínas fosforiladas reduziu após tratamento de 4h com TKIs, mas não houve alteração na expressão gênica de DIDO. Nas linhagens celulares S e R, houve aumento da expressão de DIDO 1 após o tratamento de 4h com MI. Conclui-se, portanto, que as diferentes isoformas de DIDO parecem exercer funções distintas na leucemia mielóide crônica; que o tratamento de pacientes e linhagens BCR-ABL1 positivas com inibidores de tirosina-quinase aumenta expressão de DIDO 1; e que a expressão de DIDO 2 correlaciona-se positivamente à expressão de BCR-ABL1 e ao índice de Sokal dos pacientes. / In chronic myeloid leukemia (CML) the Bcr-Abl protein has constitutively activated tyrosine kinase activity, that induces to myeloproliferation and apoptosis resistance of the cells. Most patients in chronic phase of CML treated with the tyrosine kinase inhibitor (TKI) imatinib mesylate have a complete cytogenetic remission, but a portion of these patients have been shown to be resistant to therapy. The pathophysiology of CML and the cellular and molecular mechanisms involved in resistance to TKIs therapy are diverse and require further study. In this sense, the aim of this study was to quantify the expression levels of the DIDO gene, including its isoforms (DIDO 1, 2 and 3) and promoters (DIDO PP and PD) in controls and in patients with CML in different phases of the disease treated or not treated with TKIs, as well as in cell lines BCR-ABL1+ sensitive (S) and resistant (R) to imatinib mesylate (IM). The literature reports that DIDO 1 is involved in apoptosis process and that alterations of DIDO 2 and DIDO 3 expression may be associated with the development of myeloid neoplasms. Thus, 60 CML patients, 57 control individuals and the cell lines HL-60, HL-60.Bcr-Abl+, LAMA 84 S, LAMA 84 R, KCL 22 S and KCL 22 R were studied. Peripheral blood mononuclear cells of patients and controls were isolated and RNA extraction and cDNA synthesis were performed. The cDNA samples were used in Real-Time PCR reactions (qPCR) to quantify the DIDO 1, 2, 3, PP, PD and ORF gene expression. The cell lines were treated during 4h with TKIs and then the expression of DIDO different isoforms was also quantified by qPCR. The assessment of protein expression of Bcr-Abl, c-Abl and phosphorylated proteins in this cell lines was performed by Western blotting. The DIDO 1 and 2 expression was higher in advanced phases patients and in chronic phase patients CML treated with TKIs (imatinib mesylate and dasatinib) than in controls. Chronic phase CML Patients treated with IM expressed more DIDO 1 and 3 than chronic phase untreated patients. There was a positive correlation between BCR-ABL1 expression and DIDO 2 expression and between Sokal score prognostic and DIDO 2 expression. In HL60.Bcr-Abl+ cells the expression of phosphorylated proteins was lower after treatment during 4h with TKIs, but there was no change in DIDO gene expression. There were an increase of DIDO 1 expression in all S and R cell lines after treatment during 4h with IM. Therefore we conclude that the DIDO different isoforms may have different functions in chronic myeloid leukemia; the treatment of patients and BCR-ABL1+ cell lines with TKIs increases DIDO 1 expression; and that the DIDO 2 expression is positively correlated to the BCR-ABL1 expression and Sokal score prognostic of CML patients.