O câncer é a segunda causa de morte no mundo sendo a quimioterapia parte fundamental no tratamento, constituindo-se muitas vezes na única opção de cura para os pacientes. Entretanto, progressão de doença e morte ainda são problemas resultantes de resistência intrínseca e adquirida às drogas. Com o intuito de melhorar a resposta aos tratamentos e a sobrevida dos indivíduos, sistemas de avaliação de resposta a drogas vêm sendo testados para determinar a potencial atividade das drogas antes da sua administração aos pacientes. O ChemoBiogram é o primeiro kit para avaliação de quimiorresistencia in vitro, buscando solucionar problemas de manipulação de quimioterápicos e degradação e extravio de amostras. Desta forma, o objetivo geral deste trabalho é avaliar a quimiorresistência em leucemias agudas, utilizando como ferramenta o kit. Para isso foi avaliada a integridade e ação biológica das drogas sobre células leucêmicas utilizando linhagens celulares de LLA e LMA, assim como em cultivos primários a partir de amostras de medula óssea. Os padrões dos fármacos de interesse foram padronizados por HPLC e tiveram seu IC50 determinado utilizando as linhagens HL60 e Jurkat. As drogas foram liofilizadas em diferentes doses na placa de 96 poços. A estabilidade do kit foi analisada ao longo dos meses, atingindo até seis meses de integridade para todas as drogas. Para a avaliação da ação biológica as linhagens HL60 e Jurkat foram cultivadas em meio RPMI 1640 e mantidas em condições padrões. A viabilidade celular foi avaliada pelo método de azul de Tripan, citometria de fluxo e agentes colorimétricos, sendo o cortante CellTiter 96 o mais eficiente para aplicação no modelo proposto. Os resultados demonstram confiabilidade quanto à estabilidade e reprodutibilidade dos efeitos citotóxicos das drogas testadas. A aplicação do teste in vitro em culturas primárias apresentaram importante correlação clínica quanto à resposta aos tratamentos administrados. / Cancer is the second death cause in the world. Despite chemotherapy is an essencial part of the treatment as well as in many times the only option of cure for the patients, disease progression and death are still resultants problems from the intrinsinc and acquired drug resistance. In order to improve the response to treatments and individuals survival, several studies have evaluated different response systems to the drugs to determine the potential drug activity before their administration to the patients. In an attempt to solve manipulation problems of chemotherapeutics and degradation of samples, we developed ChemoBiogram that is the first in vitro chemoresistance assay for evaluation in a kit format. Thus, the general aim of this work is to validate the test for chemoresistance evaluation in acute leukemias, by confirming the integrity and biological action of the drugs on cell lines of ALL and AML, as well as in primary cultures from bone marrow samples. The drugs standards of interest were standardized by HPLC and the IC50 was determined using HL60 and Jurkat cell lines. After standardization and determination of the doses the drugs were lyophilized in two different concentrations in the 96-well plate. The stability of the kit was analyzed over the months, reaching even nine month of integrity for all drugs. To assess biological action, the HL60 and Jurkat cell lines were cultured in RPMI 1640 and keep under standard conditions. The cell viability was evaluated by the trypan blue exclusion method, flow cytometry and colorimetric agent with the CellTiter 96 as an efficient standard for kit application. The results demonstrated reliability regarding stability and reproducibility of the cytotoxic effects of tested drugs. The application of the ChemoBiogram kit in primary cultures presented an important clinical correlation regarding the response of administered treatments.

O câncer é a segunda causa de morte no mundo sendo a quimioterapia parte fundamental no tratamento, constituindo-se muitas vezes na única opção de cura para os pacientes. Entretanto, progressão de doença e morte ainda são problemas resultantes de resistência intrínseca e adquirida às drogas. Com o intuito de melhorar a resposta aos tratamentos e a sobrevida dos indivíduos, sistemas de avaliação de resposta a drogas vêm sendo testados para determinar a potencial atividade das drogas antes da sua administração aos pacientes. O ChemoBiogram é o primeiro kit para avaliação de quimiorresistencia in vitro, buscando solucionar problemas de manipulação de quimioterápicos e degradação e extravio de amostras. Desta forma, o objetivo geral deste trabalho é avaliar a quimiorresistência em leucemias agudas, utilizando como ferramenta o kit. Para isso foi avaliada a integridade e ação biológica das drogas sobre células leucêmicas utilizando linhagens celulares de LLA e LMA, assim como em cultivos primários a partir de amostras de medula óssea. Os padrões dos fármacos de interesse foram padronizados por HPLC e tiveram seu IC50 determinado utilizando as linhagens HL60 e Jurkat. As drogas foram liofilizadas em diferentes doses na placa de 96 poços. A estabilidade do kit foi analisada ao longo dos meses, atingindo até seis meses de integridade para todas as drogas. Para a avaliação da ação biológica as linhagens HL60 e Jurkat foram cultivadas em meio RPMI 1640 e mantidas em condições padrões. A viabilidade celular foi avaliada pelo método de azul de Tripan, citometria de fluxo e agentes colorimétricos, sendo o cortante CellTiter 96 o mais eficiente para aplicação no modelo proposto. Os resultados demonstram confiabilidade quanto à estabilidade e reprodutibilidade dos efeitos citotóxicos das drogas testadas. A aplicação do teste in vitro em culturas primárias apresentaram importante correlação clínica quanto à resposta aos tratamentos administrados. / Cancer is the second death cause in the world. Despite chemotherapy is an essencial part of the treatment as well as in many times the only option of cure for the patients, disease progression and death are still resultants problems from the intrinsinc and acquired drug resistance. In order to improve the response to treatments and individuals survival, several studies have evaluated different response systems to the drugs to determine the potential drug activity before their administration to the patients. In an attempt to solve manipulation problems of chemotherapeutics and degradation of samples, we developed ChemoBiogram that is the first in vitro chemoresistance assay for evaluation in a kit format. Thus, the general aim of this work is to validate the test for chemoresistance evaluation in acute leukemias, by confirming the integrity and biological action of the drugs on cell lines of ALL and AML, as well as in primary cultures from bone marrow samples. The drugs standards of interest were standardized by HPLC and the IC50 was determined using HL60 and Jurkat cell lines. After standardization and determination of the doses the drugs were lyophilized in two different concentrations in the 96-well plate. The stability of the kit was analyzed over the months, reaching even nine month of integrity for all drugs. To assess biological action, the HL60 and Jurkat cell lines were cultured in RPMI 1640 and keep under standard conditions. The cell viability was evaluated by the trypan blue exclusion method, flow cytometry and colorimetric agent with the CellTiter 96 as an efficient standard for kit application. The results demonstrated reliability regarding stability and reproducibility of the cytotoxic effects of tested drugs. The application of the ChemoBiogram kit in primary cultures presented an important clinical correlation regarding the response of administered treatments.

O câncer é a segunda causa de morte no mundo sendo a quimioterapia parte fundamental no tratamento, constituindo-se muitas vezes na única opção de cura para os pacientes. Entretanto, progressão de doença e morte ainda são problemas resultantes de resistência intrínseca e adquirida às drogas. Com o intuito de melhorar a resposta aos tratamentos e a sobrevida dos indivíduos, sistemas de avaliação de resposta a drogas vêm sendo testados para determinar a potencial atividade das drogas antes da sua administração aos pacientes. O ChemoBiogram é o primeiro kit para avaliação de quimiorresistencia in vitro, buscando solucionar problemas de manipulação de quimioterápicos e degradação e extravio de amostras. Desta forma, o objetivo geral deste trabalho é avaliar a quimiorresistência em leucemias agudas, utilizando como ferramenta o kit. Para isso foi avaliada a integridade e ação biológica das drogas sobre células leucêmicas utilizando linhagens celulares de LLA e LMA, assim como em cultivos primários a partir de amostras de medula óssea. Os padrões dos fármacos de interesse foram padronizados por HPLC e tiveram seu IC50 determinado utilizando as linhagens HL60 e Jurkat. As drogas foram liofilizadas em diferentes doses na placa de 96 poços. A estabilidade do kit foi analisada ao longo dos meses, atingindo até seis meses de integridade para todas as drogas. Para a avaliação da ação biológica as linhagens HL60 e Jurkat foram cultivadas em meio RPMI 1640 e mantidas em condições padrões. A viabilidade celular foi avaliada pelo método de azul de Tripan, citometria de fluxo e agentes colorimétricos, sendo o cortante CellTiter 96 o mais eficiente para aplicação no modelo proposto. Os resultados demonstram confiabilidade quanto à estabilidade e reprodutibilidade dos efeitos citotóxicos das drogas testadas. A aplicação do teste in vitro em culturas primárias apresentaram importante correlação clínica quanto à resposta aos tratamentos administrados. / Cancer is the second death cause in the world. Despite chemotherapy is an essencial part of the treatment as well as in many times the only option of cure for the patients, disease progression and death are still resultants problems from the intrinsinc and acquired drug resistance. In order to improve the response to treatments and individuals survival, several studies have evaluated different response systems to the drugs to determine the potential drug activity before their administration to the patients. In an attempt to solve manipulation problems of chemotherapeutics and degradation of samples, we developed ChemoBiogram that is the first in vitro chemoresistance assay for evaluation in a kit format. Thus, the general aim of this work is to validate the test for chemoresistance evaluation in acute leukemias, by confirming the integrity and biological action of the drugs on cell lines of ALL and AML, as well as in primary cultures from bone marrow samples. The drugs standards of interest were standardized by HPLC and the IC50 was determined using HL60 and Jurkat cell lines. After standardization and determination of the doses the drugs were lyophilized in two different concentrations in the 96-well plate. The stability of the kit was analyzed over the months, reaching even nine month of integrity for all drugs. To assess biological action, the HL60 and Jurkat cell lines were cultured in RPMI 1640 and keep under standard conditions. The cell viability was evaluated by the trypan blue exclusion method, flow cytometry and colorimetric agent with the CellTiter 96 as an efficient standard for kit application. The results demonstrated reliability regarding stability and reproducibility of the cytotoxic effects of tested drugs. The application of the ChemoBiogram kit in primary cultures presented an important clinical correlation regarding the response of administered treatments.

O gene humano lysine methyltransferase 2E (KMT2E) pertence ao grupo Trithorax (TrxG) e age como proteína modificadora de histonas envolvida no controle transcricional de genes relacionados a hematopoiese. Foi previamente identificado como supressor tumoral, atuando sobre a diferenciação, proliferação e ciclo celular. DAMM et al. (2011) e LUCENA-ARAÚJO et al. (2014) descreveram a associação entre baixos níveis de expressão do gene KMT2E e desfechos desfavoráveis do tratamento de pacientes com leucemia mielóide aguda (LMA) e leucemia promielocítica aguda (LPA), respectivamente. O objetivo desse trabalho foi estudar os efeitos do aumento da expressão do gene KMT2E na leucemia mielóide aguda (LMA). Foi utilizada a linhagem celular U937, reconhecida como modelo de LMA, e o aumento da expressão do gene de interesse foi obtido por meio da transfecção das células com um vetor lentiviral contendo o cDNA codificante para a isoforma longa do gene (pCDH-MSCV-MCS-EF1-GFP+Puro, aqui chamado pMEG). As partículas lentivirais foram geradas por co-transfecção em células da linhagem HEK 293T, e posteriormente, titulados com a linhagem celular HT 1080. A expressão do gene e a presença da proteína foram confirmadas por qPCR e western blotting, respectivamente. Foram realizados ensaios funcionais de ciclo celular, proliferação, viabilidade, apoptose espontânea e induzida por trióxido de arsênico e luz ultravioleta e diferenciação celular induzida por 12-miristato 13-acetato de forbol (TPA), com as amostras U937 wild type (WT), U937 pMEG (U937 transduzidas com o vetor vazio) e U937 pMEG-KMT2E. Também foram realizadas mensurações da massa tumoral das células inoculadas em camundongos NSG. A expressão relativa do gene KMT2E na célula U937 pMEG-KMT2E foi 1000 vezes mais alta que na célula U937 sem a modificação genética. Os ensaios de diferenciação celular demonstraram que as células U937 pMEG-KMT2E apresentaram maior diferenciação em monócitos/macrófagos que as células controles, quando levada em consideração a marcação para o antígeno CD11c. A expressão induzida de KMT2E em células U937 não alterou a proliferação, viabilidade, ciclo celular, apoptose, ix espontânea ou induzida e o aspecto clonogênico in vitro, porém, foi associado a um maior crescimento tumoral em modelo animal. Nossa hipótese para justificar as diferenças entre os achados in vitro e in vivo é que o aumento da expressão de KMT2E, talvez por meio do aumento de CD11c, facilitou a interação entre as células e o microambiente, estimulando assim o crescimento tumoral in vivo. / The human lysine methyltransferase 2E (KMT2E) gene belongs to the Trithorax (TrxG) group and acts as a histone modifying protein participating in the transcriptional regulation of hematopoiesis-related genes. KMT2E has been previously described as a tumor suppressor, involved in cellular differentiation, proliferation and cell cycle progression. DAMM et al. (2011) and LUCENA-ARAÚJO et al. (2014) described the association between low levels of KMT2E gene expression and poor treatment outcomes in patients with acute myeloid leukemia (AML) and acute promyelocytic leukemia (APL), respectively. The aim of this project was to study the effects of high levels of KMT2E expression in acute myeloid leukemia (AML). For this purpose, the U937 AML cell line was used and an high expression of the gene was obtained by transfecting the cells with a lentiviral vector containing the cDNA encoding the long isoform of the gene (pCDH-MSCV-MCS-EF1- GFP + Pure, here called pMEG). The lentiviral particles were transfected into HEK 293T cells and the viral concentration was determined by titration using HT 1080 cells. The gene expression and the protein presence were confirmed by qPCR and western blotting, respectively. All experiments to determine the biological function of overexpressed KMT2E were conducted with U937 wild type, U937 pMEG (U937 transduced with the empty vector) and U937 pMEG-KMT2E cells. In-vitro the impact of overexpressed KMT2E was studied on cell cycle progression, proliferation and cell viability, spontaneous and induced apoptosis by arsenic trioxide and ultraviolet light and cell differentiation induced by 12-myristate 13-phorbol acetate (TPA). In vivo, the effect of overexpressed KMT2E was detected by comparing the tumor mass growth in NSG mice when inoculating U937 pMEG and pMEG-KMT2E cells in each flank of the same mouse. The relative expression level of the KMT2E gene in pMEG-KMT2E U937 cells was 1000 higher than in the wild type U937 strain. The cell differentiation assay revealed that U937 pMEG-KMT2E cells presented an increased monocyte/macrophage differentiation, when analyzing the CD11c antigen. Induced xi overexpression of KMT2E in U937 cells did not alter cell proliferation, cell viability, cell cycle progression, spontaneous or induced apoptosis or clonogenic appearance in vitro. However, the overexpression of KMT2E resulted in an increased tumor mass formation in vivo. Taking our discrepant in vitro and in vivo results into account, we could hypothesize that the increased expression of KMT2E, possibly caused by the enhanced expression of CD11c, favored the interaction between U937 pMEGKMT2E cells and their microenvironment, thereby stimulating tumor growth in vivo.

Metanálises prévias sugerem que os regimes de indução de leucemia mielóide aguda contendo idarrubicina (IDA) ou doses altas de daunorrubicina (DDA) podem induzir taxas de remissão completa (RC) superiores a daunorrubicina em doses convencionais (DDC), embora comparações robustas entre as duas ainda não existam. Conduzimos uma metanálise por mixed treatment comparison (MTC) Bayesiana baseada em ampla evidência envolvendo estes três tratamentos, na indução de remissão completa. A busca na literatura incluiu MEDLINE, Cochrane e LILACS, desde sua concepção até Outubro/2011, e resultou em 15 ensaios clínicos arrolando 6019 pacientes adultos. DDA (RR 1.16; 95%CrI 1.06- 1.29) e IDA (RR 1.14; 95%CrI 1.01-1.28) mostraram taxas de RC superiores a DDC. IDA também mostrou taxas de mortalidade em longo prazo inferiores quando comparada com DDC (RR 0.93, 95%CrI 0.86-0.99), enquanto DDA e DDC não mostraram diferenças neste desfecho. A comparação de DDA e IDA não apresentou diferença significativa em RC (RR 0.99; 95%CrI 0.87-1.11) e mortalidade global (RR 1.01, 95%CrI 0.91-1.11). IDA e DDA se mostram consistentemente superiores a DDC na indução de RC, e IDA foi associada a menor mortalidade global em longo prazo. Baseados nestes achados, recomendamos a incorporação de IDA ou DDA como tratamentos padrão para indução de LMA, em detrimento de DDC. / Previous meta-analyses suggested that acute myeloid leukemia induction regimens containing idarubicin (IDA) or high-dose daunorubicin (HDD) could induce higher rates of complete remission (CR) than conventional dose daunorubicin (CDD), with a possible benefit in overall survival. However, robust comparisons between these regimens are still lacking. We conducted a mixed treatment comparison (MTC) meta-analysis using a broad available network regarding these three regimens. Search strategy included MEDLINE, Cochrane and LILACS, from inception until October/2011, and resulted in 15 trials enrolling 6,019 adult patients. HDD (RR 1.16; 95%CrI 1.06-1.29) and IDA (RR 1.14; 95%CrI 1.01-1.28) showed higher CR rates than CDD. IDA also led to lower long term overall mortality rates when compared to CDD (RR 0.93, 95%CrI 0.86-0.99), while HDD and CDD were no different. HDD and IDA comparison did not reach statistically significant differences in CR (RR 0.99; 95%CrI 0.87-1.11) and in long term mortality (RR 1.01, 95%CrI 0.91-1.11). IDA and HDD are consistently superior to CDD in inducing CR, and IDA was associated with lower long term mortality. Based on these findings, we recommend incorporation of IDA or HDD as standard treatment for AML, to the detriment of CDD.

Base teórica: Fator de crescimento neural (NGF) foi primeiramente descrito nos anos 50 e, até hoje, sua função e mecanismos estão sendo descobertos e compreendidos. Combinados com seus receptores, receptores de tirosina quinase A (TrkA) e o pan receptor p75NTR, está envolvido na proliferação e sobrevivência de células B, também em respostas imunes. Entretanto, o papel do NGF em leucemias agudas (LA) pediátricas permanece pouco conhecido. Objetivo: Desenvolvemos um estudo de coorte observacional para avaliar os níveis de NGF na medula óssea (MO) ou no sangue periférico (SP) de crianças com leucemia aguda. Métodos: 40 amostras de MO ou SP foram coletadas de 17 crianças e adolescentes com leucemia linfoide aguda e de 2 com leucemia mieloide aguda em diferentes momentos do tratamento. Resultados: Os níveis de NGF ao final da fase de indução dos pacientes com LA foi significativamente menor naqueles que evoluíram a óbito. Conclusão: Estes achados fornecem a primeira evidência de um possível papel do NGF como um marcador de pior prognóstico em pacientes com LA. Palavras chave: fator de crescimento neural, neurotrofinas, leucemia aguda pediátrica, leucemia linfoide aguda e leucemia mieloide aguda / BACKGROUND: Neural growth factor (NGF) was first described in the 50ths and, until now, it´s function and mechanisms are being discovered and understood. Combined to the receptors, tropomyosin-related receptor kinase A (TrkA) and pan receptor p75NTR , they are involved in proliferation and survival of B-cells, also in immune responses. However, the role of NGF in pediatric acute leukemia remains poorly understood. OBJECTIVE: We carried out a cohort observational study to evaluate NGF levels in bone marrow (BM) or peripheral blood (PB) samples from children with AL. METHODS: 40 BM or PB samples were collected from 17 children and adolescents with acute lymphoid leukemia (ALL) and 2 with acute myeloid leukemia (AML) in different moments of treatment. RESULTS: NGF levels at the end of induction phase in AL patients were significantly lower in those that evolved to death. CONCLUSIONS: These findings provide the first evidence for a possible role of NGF as a marker of poor prognosis in pediatric AL. Keywords: Neural growth factor, neurotrophin, acute childhood leukemia, acute lymphoid leukemia, acute myeloid leukemia

Base teórica: Fator de crescimento neural (NGF) foi primeiramente descrito nos anos 50 e, até hoje, sua função e mecanismos estão sendo descobertos e compreendidos. Combinados com seus receptores, receptores de tirosina quinase A (TrkA) e o pan receptor p75NTR, está envolvido na proliferação e sobrevivência de células B, também em respostas imunes. Entretanto, o papel do NGF em leucemias agudas (LA) pediátricas permanece pouco conhecido. Objetivo: Desenvolvemos um estudo de coorte observacional para avaliar os níveis de NGF na medula óssea (MO) ou no sangue periférico (SP) de crianças com leucemia aguda. Métodos: 40 amostras de MO ou SP foram coletadas de 17 crianças e adolescentes com leucemia linfoide aguda e de 2 com leucemia mieloide aguda em diferentes momentos do tratamento. Resultados: Os níveis de NGF ao final da fase de indução dos pacientes com LA foi significativamente menor naqueles que evoluíram a óbito. Conclusão: Estes achados fornecem a primeira evidência de um possível papel do NGF como um marcador de pior prognóstico em pacientes com LA. Palavras chave: fator de crescimento neural, neurotrofinas, leucemia aguda pediátrica, leucemia linfoide aguda e leucemia mieloide aguda / BACKGROUND: Neural growth factor (NGF) was first described in the 50ths and, until now, it´s function and mechanisms are being discovered and understood. Combined to the receptors, tropomyosin-related receptor kinase A (TrkA) and pan receptor p75NTR , they are involved in proliferation and survival of B-cells, also in immune responses. However, the role of NGF in pediatric acute leukemia remains poorly understood. OBJECTIVE: We carried out a cohort observational study to evaluate NGF levels in bone marrow (BM) or peripheral blood (PB) samples from children with AL. METHODS: 40 BM or PB samples were collected from 17 children and adolescents with acute lymphoid leukemia (ALL) and 2 with acute myeloid leukemia (AML) in different moments of treatment. RESULTS: NGF levels at the end of induction phase in AL patients were significantly lower in those that evolved to death. CONCLUSIONS: These findings provide the first evidence for a possible role of NGF as a marker of poor prognosis in pediatric AL. Keywords: Neural growth factor, neurotrophin, acute childhood leukemia, acute lymphoid leukemia, acute myeloid leukemia

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T08:35:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 280488.pdf: 1132214 bytes, checksum: 35224f58973c9b99525a5eeeb2f53138 (MD5) / A Daunorrubicina (DNR) é amplamente utilizada na fase de indução do tratamento da Leucemia Mielóide Aguda (LMA). No entanto, o fenômeno de resistência a múltiplos fármacos (MDR), pode comprometer sua eficiência terapêutica como agente antineoplásico. Considerando que fármacos doadores de Óxido Nítrico (NO) têm sido investigados por terem um papel importante na sensibilização de células neoplásicas aos agentes quimioterápicos, o objetivo desse trabalho foi investigar o envolvimento do NO nos mecanismos moleculares de resistência à DNR em células de LMA de origem humana K562. Nossos resultados mostram que a incubação das células K562, com concentrações crescentes de DNR e de SNAP, um doador de NO, não causou morte celular significativa quando utilizados de forma individualizada. No entanto, a adição simultânea desses compostos, causou citotoxicidade de maneira concentração dependente. Para estudar os mecanismos pelos quais esses compostos provocaram morte celular, foi realizada a avaliação do ciclo celular, da expressão das proteínas antiapoptóticas Bcl-2 e survivina, proapotótica Bax e da caspase-3. A DNR (100 µM) e o SNAP (1mM) respectivamente causam bloqueio nas fases S e G0/G1 do ciclo celular na célula K562. Contudo, quando adicionados simultaneamente, o SNAP não altera o bloqueio causado pela DNR na fase S. Além disso, as células K562 apresentam de maneira constitutiva a expressão das proteínas antiapoptóticas Bcl-2 e survivina, e o tratamento com DNR e SNAP, isoladamente, não alteraram de forma significativa a expressão dessas proteínas. No entanto, a adição simultânea desses compostos causou redução de 40% e 70% na expressão de Bcl-2 e na survivina, respectivamente. A DNR e o SNAP também não alteram a expressão da proteína proapoptótica Bax, porém a associação desses compostos causou um aumento de 30% na expressão dessa proteína. A análise da distribuição intracelular de DNR nas células K562, por imunofluorescência mostra que a DNR acumula-se em regiões pontuais do citoplasma. Entretanto, quando as células K562 são tratadas com a associação de DNR e SNAP, há um acúmulo maior de DNR na célula e sua localização ocorre preferencialmente na região nuclear. Os resultados, obtidos na avaliação do acúmulo e retenção de DNR por citometria de fluxo, corroboram com esses resultados. Na análise da expressão dos genes abcc1 e lrp por RT-PCR, foi observado que as células K562 apresentam expressão constitutiva de ambos os genes. Em relação ao gene lrp, observamos que a DNR e o SNAP associados ou não causaram uma significativa diminuição na sua expressão. No entanto, a expressão do gene abcc1 não foi alterada na presença de SNAP e o tratamento com DNR causou uma pequena redução na sua expressão, a qual foi intensificada com a associação DNR e SNAP. A compilação das evidências obtidas nesse estudo nos permite sugerir que o NO inibe a atividade da abcc1, o que leva a um aumento intracelular de DNR, o qual permite que o fármaco atinja seu alvo de ação citotóxica no núcleo. Assim, o dano ao DNA causado pela DNR ativa a apoptose via mitocondrial pelo aumento da expressão da Bax e inibição das proteínas Bcl-2 e survivina, culminando na ativação da caspase 3 e indução da apoptose nas células de leucemia mielóide aguda K562. / Daunorubicin (DNR) is widely used in the induction phase of the treatment for Acute Myeloid Leukemia (AML). However, multiple drug resistance (MDR) may compromise its therapeutic efficacy as an antineoplastic agent. Considering that Nitric Oxide (NO) donating drugs have been investigated for their important role in the sensitization of neoplastic cells to chemotherapy drugs, the goal of this work was to investigate the involvement of NO in the molecular mechanisms of resistance to DNR in human AML K562 cells. Our results have shown that the incubation of K562 cells, with increasing concentrations of DNR and SNAP (NO donors) did not cause significant cell death when used individually, but the simultaneous addition of these compounds produced cytotoxicity in a concentration-dependent manner. In order to study the mechanisms through which these compounds induce cell death, the cell cycle, the expression of anti-apoptotic proteins Bcl-2 and survivin, proapoptotic Bax, and caspase-3 were evaluated. DNR (100 ìM) and SNAP (1 mM) halt phases S and G0/G1 of the cell cycle in K562 cells, respectively. When added simultaneously, however, SNAP does not alter the block caused by DNR on phase S. Furthermore, K562 cells constitutively express anti-apoptotic proteins Bcl-2 and survivin, and treatment with DNR and SNAP separately does not significantly alter the expression of these proteins. Notwithstanding, the simultaneous addition of these compounds resulted in 40% and 70% reductions in the expression of Bcl-2 and survivin, respectively. DNR and SNAP also did not alter the expression of the proapoptotic protein Bax, but the association of both compounds resulted in a 30% increase in the expression of the same protein. The immunofluorescence analysis of the intracellular distribution of DNR in K562 cells shows that DNR accumulates in speckles in the cytoplasm. However, when K562 cells are treated with a mixture of DNR and SNAP, there is a greater accumulation of DNR in the cells, located primarily in the nuclear region. The results obtained in the evaluation of the accumulation and retention of DNR through flow cytometry support the previously mentioned findings. The RT-PCR analysis of the expression of abcc1and Irp genes showed that K562 cells constitutively express both genes. Regarding Irp, DNR and SNAP did not produce a significant decrease in its expression, either combined or separately. However, the expression of the abcc1 gene was not affected by the presence of SNAP but when treated with DNR its expression presented a small reduction, which was intensified by the association of DNR and SNAP. The compilation of evidence obtained in this study allows us to suggest that NO inhibits the activity of abcc1, leading to an intracellular increase in DNR, which allows this drug to reach its target of cytotoxic activity in the nucleus. Thus, the DNA damage caused by DNR triggers the mitochondrial apoptosis pathway with an increase in the expression of Bax and inhibition of Bcl-2 and survivin proteins, culminating in the activation of caspase-3 and the induction of apoptosis in acute myeloid leukemia K562 cells.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-31 / Objetivo: Estabelecer o diagnóstico laboratorial da leucemia mielóide aguda (LMA), leucemia aguda indiferenciada (LAI) e leucemia aguda bifenotípica (LAB), através de um estudo prospectivo, observacional e descritivo de 62 pacientes atendidos consecutivamente na Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas – FHEMOAM, no período de Setembro de 2000 a Setembro de 2003, avaliar a freqüência, características clínicas e laboratoriais com a finalidade de permitir um diagnóstico mais preciso com conseqüente melhor escolha terapêutica. Método: A classificação da LMA foi realizada utilizando os critérios morfológicos do grupo cooperativo franco-americano-britânico (FAB). Estudos imunológicos foram realizados utilizando a técnica imunoenzimática EnVision System Alkaline Phosphatase (DAKO), que permite identificar a reação nas células leucêmicas em esfregaços de medula óssea e/ou sangue periférico e em preparados de citocentrífugas (spins), com a utilização de um amplo painel de anticorpos monoclonais. Os subtipos FAB de LMA foram analisados em relação a características clínicas idade (crianças e adultos), sexo, linfonodomegalias (>2cm), esplenomegalia (≥3cm), dados laboratoriais (níveis de hemoglobina, contagem de glóbulos brancos e plaquetas, características morfológicas, citoquímicas e perfil imunofenotípico dos blastos). Resultados: A LMA ocorreu em 62 pacientes sendo 25 crianças (40,3%, idade mediana de 6 anos e 9 meses) e 37 adultos (59,7%, com idade mediana de 30 anos); houve predomínio do sexo masculino (41 pacientes - 66% dos casos). A distribuição dos casos de acordo com os subtipos FAB foi 1 caso M0, 12 M1(19%), 15 M2(24%), 8 M3(13%), 6 M4 (10%), 15 M5 (24%), 1 M6 e 4M7(6%). Entre as crianças M2 foi o tipo mais comum (32%) e entre os adultos a LMA M5 (27%). Os antígenos mielóides mais freqüentes foram CD13, CD33 e anti– MPO. A LAI ocorreu em 3 pacientes e a LAB em 1 paciente. Conclusão: Neste trabalho, observamos algumas diferenças em relação a estudos nacionais e internacionais como a faixa etária mais baixa e a menor freqüência da LMA M3 entre nossos pacientes. A classificação FAB é ainda de grande importância no diagnóstico da LMA, porém a contribuição dos dados da imunofenotipagem é fundamental na classificação da LMA subtipo M0 e M7, assim como na caracterização da leucemia aguda indiferenciada e bifenotípica. / Objective: The present study investigated the best laboratorial diagnosis methods to acute myeloid leukemia, acute undifferentiated leukemia and biphenotypic acute leukemia. We have prospective, observacional and descriptive study about 62 patients from Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas - FHEMOAM, in the period of September of 2000 at June of 2003. The frequency, clinical and laboratories characteristics was analyzed. .Methods: The classification of the acute myeloid leukemia – LMA was stablished by morphological and cytochemical criteria according by the French-American-British (FAB) classification and immunologic aspects using the imunoenzymatic technique from DAKO - EnVision System Alkaline Phosphatase, that allows to identify to leukemia subgroups in bone marrow smears and/or peripheral blood and in cytospins, with a large monoclonal antibody panel. The LMA subtypes had been analyzed according age (children and adults), sex, morphologic and cytochemistry characteristics, immunophenotipic profile, lymph node and a variety of organs masses occurrence (lymph node ≥ 2 cm, spleen and liver ≥ 3 cm), laboratories findings as leucocytes and platelets counts, hemoglobin, countings. Results: We observed that the LMA occurred in 62 patients, being 25 children (40,3%) and 37 adults (60%); with predominance of the masculine sex happening in 66% of the cases (41 patients). The most common subtypes had been the LMA M2 in children and LMA M5, in adults; the phenotype more common had been CD13, CD33 and anti – MPO myeloid antigens. Auer’rod occurred in 26 cases (42%) and the more frequent laboratories findings had been leucocyte and platelets accounts below of 100.000/mm3 and hemoglobin below of 10g/dl. Limph node with more than 2 cm of diameter, spleen and liver with size bigger than 3 cm was observed in less than half of cases. The LAI was observed in 3 patients and the LAB in only 1 patient. Conclusion: The results indicate that FAB classification was very important at LMA diagnostic, however immunophenotyping has a strong importance in the M0 and M7 subtype of LMA classification, as well as in the characterization of the undifferentiated and biphenotypic acute leukemia. In this work, we observed some differences between data of the northeast region and Southeastern of Brazil as the frequency of the LMA M3 lower between our patients. In order hand, in our region we observed that LMA occurs in more young patients in relation to described in literature about other countries / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Metanálises prévias sugerem que os regimes de indução de leucemia mielóide aguda contendo idarrubicina (IDA) ou doses altas de daunorrubicina (DDA) podem induzir taxas de remissão completa (RC) superiores a daunorrubicina em doses convencionais (DDC), embora comparações robustas entre as duas ainda não existam. Conduzimos uma metanálise por mixed treatment comparison (MTC) Bayesiana baseada em ampla evidência envolvendo estes três tratamentos, na indução de remissão completa. A busca na literatura incluiu MEDLINE, Cochrane e LILACS, desde sua concepção até Outubro/2011, e resultou em 15 ensaios clínicos arrolando 6019 pacientes adultos. DDA (RR 1.16; 95%CrI 1.06- 1.29) e IDA (RR 1.14; 95%CrI 1.01-1.28) mostraram taxas de RC superiores a DDC. IDA também mostrou taxas de mortalidade em longo prazo inferiores quando comparada com DDC (RR 0.93, 95%CrI 0.86-0.99), enquanto DDA e DDC não mostraram diferenças neste desfecho. A comparação de DDA e IDA não apresentou diferença significativa em RC (RR 0.99; 95%CrI 0.87-1.11) e mortalidade global (RR 1.01, 95%CrI 0.91-1.11). IDA e DDA se mostram consistentemente superiores a DDC na indução de RC, e IDA foi associada a menor mortalidade global em longo prazo. Baseados nestes achados, recomendamos a incorporação de IDA ou DDA como tratamentos padrão para indução de LMA, em detrimento de DDC. / Previous meta-analyses suggested that acute myeloid leukemia induction regimens containing idarubicin (IDA) or high-dose daunorubicin (HDD) could induce higher rates of complete remission (CR) than conventional dose daunorubicin (CDD), with a possible benefit in overall survival. However, robust comparisons between these regimens are still lacking. We conducted a mixed treatment comparison (MTC) meta-analysis using a broad available network regarding these three regimens. Search strategy included MEDLINE, Cochrane and LILACS, from inception until October/2011, and resulted in 15 trials enrolling 6,019 adult patients. HDD (RR 1.16; 95%CrI 1.06-1.29) and IDA (RR 1.14; 95%CrI 1.01-1.28) showed higher CR rates than CDD. IDA also led to lower long term overall mortality rates when compared to CDD (RR 0.93, 95%CrI 0.86-0.99), while HDD and CDD were no different. HDD and IDA comparison did not reach statistically significant differences in CR (RR 0.99; 95%CrI 0.87-1.11) and in long term mortality (RR 1.01, 95%CrI 0.91-1.11). IDA and HDD are consistently superior to CDD in inducing CR, and IDA was associated with lower long term mortality. Based on these findings, we recommend incorporation of IDA or HDD as standard treatment for AML, to the detriment of CDD.