Memoria para optar al Título Profesional de Ingeniera Agrónoma / Una práctica muy común en la mayoría de las bodegas es la utilización de levaduras comerciales en los procesos de fermentación alcohólica. Sin embargo, esta práctica produce una sustitución progresiva de la población microbiana nativa y como consecuencia una pérdida en la tipicidad de los vinos de una región determinada. Para evitar esta pérdida de tipicidad, actualmente, se tiende a seleccionar cepas nativas, las cuales no sólo permiten potenciar el carácter de los terroirs, sino que, también controlar el proceso de fermentación, ya que estas levaduras poseen las características para ajustarse a las particularidades de la materia prima de cada valle. El presente estudio busca evaluar la contribución de las cepas no-Saccharomyces nativas en el perfil aromático de vinos Cabernet Sauvignon, mediante inoculaciones secuenciales, aplicando levaduras no-Saccharomyces nativas y luego una Saccharomyces comercial. Para este propósito, se realizaron 3 tratamientos con inoculaciones secuenciales. Dos de ellos con levaduras no-Saccharomyces nativas (Metschinikowia PSMG1 y Hanseniaspora SBIMP3) y uno con una levadura no-Saccharomyces comercial (Torulaspora delbrueckii). Los tratamientos, al paso de 48 horas, se inocularon con la levadura Saccharomyces cerevisiae, la cual termina el proceso fermentativo. Los tratamientos se compararon con un control el cual sólo fue inoculado con la levadura Saccharomyces cerevisiae. El segundo objetivo de esta investigación fue evaluar la implantación de las levaduras nativas aplicando una estrategia molecular durante el proceso fermentativo.

Memoria para optar al Título Profesional de Ingeniero Agrónomo / Los productos enológicos derivados de levaduras corresponden a insumos ampliamente utilizados en la industria enológica. Estos productos comerciales están constituidos principalmente por glucanos y manoproteínas (polisacáridos), los cuales son naturalmente liberados al medio vínico durante la autolisis de las levaduras. Se ha observado que el uso de estos productos aportaría principalmente manoproteínas que podrían intervenir en la estabilidad proteica y tartárica. Asimismo, se ha descrito que las manoproteínas podrían interactuar con compuestos fenólicos, lo que produciría una mejora de las propiedades sensoriales de los vinos.

Memoria para optar al título profesional de Ingeniero Agrónomo Mención Enología / En los últimos años ha aumentado el interés por el uso de preparaciones comerciales de levaduras inactivas, ya que estas podrían otorgar variados beneficios a los procesos tecnológicos y sensoriales de los vinos. A pesar de ello, la información relativa a su composición química, modo de acción y su efecto en la calidad sensorial de los vinos es todavía muy escasa. En la presente investigación se evaluó el efecto de una preparación comercial de levaduras inactivas marca Vin’Style® sobre la composición fenólica y las características sensoriales de vinos cultivar Cabernet Sauvignon estilo varietal y reserva.

Tesis para optar al Grado de Magíster en: Enología y Vitivinicultura / La transformación del mosto de uva en vino, es un complejo proceso microbiológico realizado principalmente por levaduras del género Saccharomyces, responsables de la fermentación alcohólica. Actualmente, las co-inoculaciones con levaduras comerciales no Saccharomyces (Torulaspora delbrueckii) y Saccharomyces cerevisiae, son una alternativa para la incorporación de enzimas β-glucosidasas, pectinasas y proteasas al mosto. El mosto alberga una diversa microbiota inicial; esta heterogeneidad microbiológica dificulta el control del proceso fermentativo. Por ello, se desarrolló un método de monitoreo de levaduras vínicas en fermentaciones de co-inoculación, aplicando métodos de taxonomía molecular. Se analizaron las regiones ribosomales, sobre las cuales se diseñó una estrategia “in silico”, mediante perfiles de restricción (RFLP), empleando endonucleasas específicas; lográndose una fácil y fidedigna diferenciación de los microorganismos involucrados. De manera experimental se trabajó con un mosto del cultivar Syrah; que se separó en dos cubas, una fue inoculada únicamente con Saccharomyces cerevisiae y otra fue co-inoculada con Torulaspora delbrueckii y Saccharomyces cerevisiae. Se examinaron distintas etapas del proceso de fermentación, logrando en todos los casos extraer ADN de forma directa desde las muestras de vino en una aproximación independiente de cultivo. El ADN extraído fue sujeto a un proceso de PCR para amplificar la región ITS 5.8S. Estos amplicones se sometieron a digestión con las enzimas AluI, ApaI, HaeIII, SphI, lo que permitió definir e identificar la presencia de las levaduras involucradas en cada fase de la fermentación alcohólica. Todo esto permitió demostrar que la variación genética de las regiones ribosomales, permite la diferenciación a través de métodos moleculares, de las levaduras vínicas: Saccharomyces cerevisiae y Torulaspora delbrueckii, comúnmente usadas en co-inoculación. / Transformation of grape must into wine is a complex microbiological process done mainly by Saccharomyces yeasts, responsible for the alcoholic fermentation. Currently, co-inoculated with Saccharomyces commercial yeasts (Torulaspora delbrueckii) and Saccharomyces cerevisiae, are an alternative to the incorporation of β-glucosidase enzymes, pectinase and protease to the must. The must has a diverse microbiota initial, this heterogeneity hinders this fermentation process control. Therefore, we developed a method of monitoring fermentations wine yeasts in co-inoculation, using methods of molecular taxonomy. Ribosomal regions were analyzed, over which strategy was designed “in silico” by restriction profiles (RFLP) using specific endonucleases; achieving an easy and accurate differentiation of the microorganisms involved. Experimentally we worked with Syrah grape cultivar, which split into two tanks, one was inoculated with Saccharomyces cerevisiae and other was co-inoculated with Torulaspora delbrueckii and Saccharomyces cerevisiae. We examined various stages of the fermentation process, obtaining in all cases extract DNA directly from the wine samples in a culture-independent approach. The extracted DNA was subjected to a process of PCR to amplify the region ITS 5.8 S. These amplicons were digested with the enzyme AluI, ApaI, HaeIII, SphI, allowing define and identify the presence of yeast involved in each stage of the fermentation. All this helped to show that the genetic variation of ribosomal regions, allows differentiation through molecular methods of wine yeasts: Saccharomyces cerevisiae and Torulaspora delbrueckii, commonly used in co-inoculation.

Memoria para optar al Título Profesional de Ingeniero Agrónomo / Las levaduras del género Brettanomyces son consideradas como agentes deteriorantes en vinos en distintas partes del mundo. Comúnmente su presencia en los vinos es detectada por características olfativas específicas (olor animal a tempera y medicinal). Basado en los resultados de Humeres (2006), se demostró que estas mismas características sensoriales pueden ser encontradas en vinos contaminados con levaduras del género Candida spp. Los objetivos de esta investigación fueron comprobar la existencia de levaduras Brettanomyces spp. o Candida spp. en muestras de vinos con caracteres organolépticos “Brett” y correlacionar el microorganismo encontrado en la muestra, con un carácter sensorial definido (olor animal a tempera y medicinal), atribuido a Brettanomyces spp. Con este fin, se recolectaron 15 muestras de vinos, de diferentes cepas (Cabernet Sauvignon, Merlot, Petit Verdot, Carménère y Syrah) y de diferentes viñas. Cada muestra de vino fue sensorialmente reconocida con carácter “Brett” por el enólogo de su respectiva bodega. Las muestras de vino fueron sembradas en placas con medio selectivo para Brettanomyces spp., generándose desarrollo de colonias en todas las muestras de vino. De estas colonias se extrajo ADN para realizar una caracterización molecular de las levaduras obtenidas, la que consistió en la amplificación por PCR de la región 5.8S-ITS del rRNA y la subsiguiente digestión de los amplificados utilizando las enzimas de restricción HaeIII y HinfI. La identificación de los perfiles se realizó mediante la comparación con cepas conocidas de Brettanomyces spp. y la clasificación de especies de Esteve-Zarzoso et al. (1999). A través de estos métodos fue posible la identificación de la cepa Brettanomyces bruxellensis en un 100% de las muestras de vino analizadas, sin detectarse la presencia de Candida spp. A través del análisis sensorial se pudo determinar que la intensidad de los descriptores aromáticos de “Brett”, varían de acuerdo con las distintas cepas de vinos. Con esta investigación se puede concluir que levaduras del género Brettanomyces spp. son causantes de la característica sensorial “Brett” y que el parámetro sensorial reconocido comúnmente en todas la variedades de vinos estudiadas fue el olor medicinal. / The yeasts from the Brettanomyces genre are considered as deteriorative agents in different parts of the world. Commonly their presence in wines is detected by specific sensorial characteristics (animal smell, paint smell, medicinal smell). Experiences from previous studies proved that those same sensorial characteristics can be found in wines contaminated with yeasts from the Candida spp. genre. The objectives of this investigation were verifying the existence of Brettanomyces spp. or Candida spp. yeasts in wine samples with organoleptic “Brett” characteristics and to correlate the microorganism found in the sample, with a defined character (animal smell, paint smell, medicinal smell) attributed to Brettanomyces spp. For this purpose, 15 wine samples were collected, from different strains (Cabernet Sauvignon, Merlot, Petit Verdot, Carménère and Syrah) and from different vineyards. Every sample was sensory recognized with “Brett” character by the winemaker of its respective cellar. The wine samples were plated with selective medium for Brettanomyces spp., generating a development of colonies in all the wine samples. From these colonies DNA was extracted to carry out a molecular characterization of the obtained yeast, which consisted in the amplification by PCR of the region 5.8S-ITS of the rRNA and the subsequent digestion of the amplifications using the restriction enzymes HaeIII and HinfI. The identification of the profiles was realized through the comparison with known strains of Brettanomyces spp. and the species classification of Esteve-Zarzoso et al. (1999). Through these methods the identification of the Brettanomyces bruxellensis strain was possible in 100% of the wine samples that were analyzed, without detecting the presence of Candida spp. Through the sensorial analysis it was determined that the intensity of the aromatic descriptor of “Brett”, varies according to the different strains of wine. With this investigation it can be concluded that the yeasts of the Brettanomyces spp. genre are the cause of the sensorial characteristic “Brett” and that the sensorial parameter commonly recognized in all the studied varieties of wine was the medicinal smell.

El aroma de los embutidos crudos curados es uno de los atributos más valorados por los consumidores. Por este motivo, es de gran importancia para la industria cárnica conocer los principales compuestos aromáticos responsables de la mayor aceptación de los productos tradicionales, su evolución a lo largo del proceso de fabricación así como los factores que fomentan la generación de dichos compuestos. Una de las posibles causas de la formación de determinados compuestos volátiles en embutidos crudos curados tradicionales es la presencia de una microbiota autóctona cuyo metabolismo y actividad favorece el desarrollo y la mejora del aroma en dichos productos. En la presente tesis se ha realizado un estudio sobre las levaduras presentes en embutidos crudos curados tradicionales y su contribución a la generación de compuestos volátiles con poder aromático. Por un lado, se han aplicado técnicas moleculares para la identificación y caracterización de levaduras aisladas de embutidos crudos curados tradicionales. Por otro lado, se ha estudiado el potencial aromático de cada una de las levaduras caracterizadas mediante el análisis de los compuestos volátiles por microextracción en fase sólida (SPME) y cromatografía de gases acoplada a espectrómetro de masas (GC-MS). Además, esta técnica también se ha utilizado para estudiar el efecto de las cepas de levaduras seleccionadas por su potencial aromático sobre la generación de compuestos volátiles en un sistema modelo cárnico y en embutidos crudos curados tradicionales. En esta Tesis Doctoral se ha demostrado la existencia de una gran variabilidad genética en las cepas de la especie Debaryomyces hansenii aisladas de embutidos crudos curados tradicionales. Por otra parte, se ha verificado la contribución de dos de las cepas de D. hansenii seleccionadas al perfil aromático de los embutidos crudo curados. Por último, se ha propuesto utilizar la técnica de espectrometría de masas directa Selected Ion Flow Tube-Mass Spectrometry (SIFT-MS) para evaluar la inoculación de levaduras en embutidos crudos curados y se ha demostrado la eficacia de esta técnica para relacionar la formación de ciertos compuestos volátiles con la población de las diferentes levaduras inoculadas. / Cano García, L. (2014). Selección de levaduras de debaryomyces hansenii y determinación de su efecto en la calidad aromática de los embutidos crudos curados [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48483 / TESIS

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las enfermedades asociadas a circovirus porcino tipo 2 (PCV2) son consideradas el problema económico más grande de la industria porcina mundial. Además de mejorar la gestión y las prácticas de manejo (mejor higiene, menor hacinamiento y mejor ventilación), la disponibilidad de vacunas anti-PCV2 representa la opción inmunológica más eficaz para paliar el impacto de estas enfermedades. La proteína de la cápside de PCV2 (Cap) es un importante antígeno para el desarrollo de vacunas. Actualmente, la mayoría de las vacunas comerciales anti-PCV2 se producen como formulaciones inyectables de este antígeno. Aunque eficaces, estas vacunas tienen ciertas desventajas, incluyendo estrés animal e inmunosupresión concomitante, además de la implicancia de procedimientos laboriosos asociados y consumidores de tiempo. En este estudio, una cepa recombinante de la levadura Saccharomyces cerevisiae fue utilizada como vector y vehículo para entregar el antígeno de la cápside viral proveniente de un aislado nacional de PCV2. Este procedimiento se realizó con el fin de obtener datos dirigidos a estudiar el desarrollo de una vacuna oral contra el virus. De esta forma, el potencial inmunogénico de este sistema fue probado en ratones BALB/c, después de la administración de la levadura recombinante vía oral, bajo dos formulaciones distintas, como cepa viva y como extracto sonicado. Para esto, el gen cap químicamente sintetizado con la preferencia codogénica optimizada de la levadura (opt-cap) fue replicado en Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae a través del vector, pYES2. La expresión de la proteína Cap en la levadura fue confirmada a través de Western Blot con suero anti PCV2. Posteriormente, resultados de experimentación in vivo confirmaron que la administración oral en ratones de extractos sonicados de la levadura recombinante, estimulan la inducción de anticuerpos séricos y fecales específicos contra el antígeno Cap más eficientemente que la cepa viva. Estos resultados demostraron que es factible utilizar la levadura S. cerevisiae como un sistema seguro y simple de producir antígenos virales de PCV2, y de esta manera, su entrega vía oral podría ser una estratégica alternativa para inducir eficientemente anticuerpos anti-PCV2. Los resultados obtenidos en esta memoria en un modelo murino, están dirigidos a realizar investigación adicional en cerdos, el hospedero natural de PCV2 / Financiamiento: Proyecto Fondecyt de Iniciación en Investigación No. 1111013 y el Proyecto de Iniciación en Investigación de la Vicerrectoría de Investigación y Desarrollo de la Universidad de Chile, VID I 07/15-2

Memoria para optar al Título Profesional de Ingeniero Agrónomo / El uso de las levaduras comerciales en la industria del vino, ha mejorado y facilitado los manejos asociados a su elaboración, aportando mayor calidad sensorial. Hay diferentes tipos de levaduras que participan en las etapas de la vinificación, dentro de las cuales cabe destacar la encargada de la fermentación alcohólica (Saccharomyces cerevisiae), la que transformará en su última etapa los azúcares de la uva en vino.

Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / La levadura Xanthophyllomyces dendrorhous es capaz de sintetizar astaxantina, un carotenoide utilizado en la industria acuícola. La síntesis de este pigmento se produce a partir de metabolitos de la ruta del mevalonato, que también son necesarios para la síntesis de esteroles. El ergosterol (ergosta-5,7,22-trien-3β-ol) es un componente de las membranas celulares de los hongos y el producto final de la ruta de esteroles. Ambas rutas han manifestado estar reguladas por la vía SREBP, la cual en mamíferos regula los niveles de colesterol en la células. En hongos la vía SREBP se encuentra conservada, como en la levadura Schizosaccharomyces pombe donde el factor de transcripción Sre1N regula la síntesis de esteroles y la respuesta a hipoxia. Se ha visto que la regulación de las rutas biosintéticas de carotenoides y esteroles está relacionada, ya que la deleción del gen CYP61 que participa en la síntesis de ergosterol (mutante CBS-6938cyp61-), resultó en un fenotipo que sobreproduce carotenoides. Estas observaciones podrían ser explicadas por un efecto negativo del ergosterol sobre la regulación de la biosíntesis de carotenoides y esteroles, especialmente a nivel de la transcripción de genes de la ruta del mevalonato como el gen HMGR. Es así como en este seminario de título se planteó poner a prueba dicha hipótesis construyendo otros mutantes de la biosíntesis de ergosterol (mutantes de los genes ERG3 y ERG4) para evaluar si estos mantienen el mismo fenotipo que la mutante CBS-6938cyp61- (ausencia de ergosterol y sobreproducción de carotenoides). Mediante análisis bioinformático se identificaron los genes ERG3 y ERG4 de X. dendrorhous y se construyeron los plásmidos para la deleción de ambos genes en la cepa CBS-6938, obteniendo las mutantes CBS-6938Δerg3 y CBS-6938Δerg4. Se evaluó el fenotipo de las mutantes con respecto a la cepa CBS-6938 mediante análisis xiii de carotenoides y esteroles totales, obrservando un aumento en los niveles de esteroles, aunque no se afectó el nivel de carotenoides totales. También se realizó un análisis de expresión mediante RT-qPCR del gen HMGS, el cual posiblemente es regulado por vía SREBP en X. dendrorhous, donde solo observó un aumento en el nivel de transcrito de este gen en la mutante del gen ERG4. Además, las cepas mutantes presentaron una disminución en el crecimiento en presencia de los azoles clotrimazol y ketoconazol y el antifúngico Anfotericina B. Los resultados indican que la via SREBP no se encuentra activa en las mutantes CBS-6938Δerg3 y CBS-6938Δerg4. En conclusión, no es la ausencia de ergosterol lo que estaría activando la via SREBP, sino más bien la acumulación de esteroles específicos como sería el caso la cepa CBS-6938cyp61-. / The yeast Xanthophyllomyces dendrorhous is able to synthesize astaxanthin, a carotenoid used in the aquaculture industry. This pigment is synthesized from metabolites of the mevalonate pathway, which are also necessary for the synthesis of sterols. Ergosterol (ergosta-5,7,22-trien-3β-ol) is a component of fungal cell membranes and the final product of the sterol pathway. Both routes have been reported to be regulated by the SREBP pathway, which in mammals regulates cholesterol levels in cells. In fungi the SREBP pathway is conserved, as in the yeast Schizosaccharomyces pombe where the transcription factor Sre1N regulates the synthesis of sterols and the response to hypoxia. It has been found that the regulation of the biosynthetic pathways of carotenoids and sterols is related, since the deletion of the CYP61 gene involved in the synthesis of ergosterol (mutant CBS-6938cyp61-), resulted in a phenotype that overproduces carotenoids. These observations could be explained by a negative effect of ergosterol on the regulation of the biosynthesis of carotenoids and sterols, especially at the level of the transcription of genes of the mevalonate route such as the HMGR gene. Thus, in this work it was proposed to test this hypothesis by the mutation other mutants of ergosterol biosynthesis (mutants of the ERG3 and ERG4 genes) to evaluate whether they maintain the same phenotype as the mutant CBS-6938cyp61- (absence of ergosterol and overproduction of carotenoids). By bioinformatic analysis, the ERG3 and ERG4 genes of X. dendrorhous were identified and the plasmids were constructed for the deletion of both genes in strain CBS-6938, obtaining the mutants CBS-6938Δerg3 and CBS-6938Δerg4. The phenotype of the mutants was evaluated with respect to the aforementioned strain CBS-6938 by analysis xv of carotenoids production and total sterols, were an increase in sterol levels was observed although no change was observed in total carotenoids. . An expression analysis was also performed by RT-qPCR of the HMGS gene, which is suggested to be regulated via SREBP in X. dendrorhous. In this case, the mutants presented only increase in the transcript level in the mutant of ERG4. In addition, a decrease in the growth of the mutant strains was observed in the presence of the azoles clotrimazole and ketoconazole and the antifungal agent Amphotericin B. The results indicate that the SREBP pathway is not active in the mutants CBS-6938Δerg3 and CBS-6938Δerg4. In conclusion, it is not the absence of ergosterol that would be activating the SREBP pathway, but rather the accumulation of specific sterols as would be the case with the strain CBS-6938cyp61-.

Memoria para optar al Título Profesional de Ingeniero Agrónomo / La composición aromática es una de las principales características en la que se basa el consumidor al comparar diferentes vinos. En los últimos años, se ha descrito la creciente demanda de los consumidores por nuevos estilos de vinos, que presenten un perfil organoléptico complejo y otorgue tipicidad con características sensoriales distintivas. Con el objetivo de complejizar la mezcla de compuestos aromáticos en el vino, se han realizado múltiples estudios, en relación a la selección y utilización de levaduras no-Saccharomyces durante el proceso de vinificación. Estos estudios han demostrado el potencial tecnológico que tendrían estas levaduras, pertenecientes principalmente a los géneros Torulaspora, Hanseniaspora, Candida, Pichia, Debaryomyces, Kluyveromyces y Metschnikowia. Estas levaduras son capaces de liberar diversos compuestos aromáticos, especialmente ésteres, por acción enzimática. Esto se traduce en un aumento de la componente frutal y floral en los vinos, características altamente apreciadas por los consumidores, a nivel nacional e internacional. / Aromatic composition is one of the main features in which the consumer is based on comparing different wines. In recent years, the growing consumer demand for new styles of wine, which present a complex organoleptic profile and confers typicality with distinctive sensory characteristics has been described. Aiming to obtain a more complex mixture of aromatic compounds in wine, many studies have been conducted in relation to the selection and use of non- Saccharomyces yeast during the vinification process. These studies have demonstrated the technological potential that these yeasts, belonging mainly to the genera Torulaspora, Hanseniaspora, Candida, Pichia, Debaryomyces, Kluyveromyces and Metschnikowia would have. These yeasts are capable of releasing various aromatic compounds, especially esters, by enzymatic action. These results will be described like an increase in fruit and floral component in wines, highly appreciated characteristics by consumers, at national and international level.