Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Le virus de l'hépatite B (VHB) est un virus enveloppé composé d'un ADN partiellement double brin (ADNrc) contenu dans une capside icosahédrique. Le VHB est responsable d'infections aiguës et chroniques. VHB est non cytopathique mais l’inflammation chronique entraîne une fibrose hépatique, une cirrhose et un carcinome hépatocellulaire. Le VHB se réplique via un intermédiaire à ARN. La transcription nécessite que l'ADNrc soit convertit en un ADN circulaire clos de manière covalente (ADNccc). Cet ADNccc sert de matrice pour la transcription de l'ARN prégénomique (ARNpg), qui est spécifiquement encapsidé grâce aux interactions entre la polymérase virale, l'ARNpg et la protéine core (Cp) qui forme la capside. La polymérase rétrotranscrit l'ARNpg en ADN monocaténaire puis en ADNrc, conduisant à des matrices de capside matures (MatC). Cp avec 185 aa contient un domaine N-terminal structuré, et un domaine C-terminal (CTD) flexible. Le CTD comprend deux signaux de localisation nucléaire (NLS) et un domaine de liaison avec l’importin β (IBB). Le CTD est orienté vers l'intérieur de la capside de part son interaction avec les acides nucléiques simples brins tandis qu'il est exposé vers l'extérieur dans les capsides vides (EmpC) et les MatC. De plus Cp étant surexprimée, cela conduit à l'assemblage des EmpC. Le VHB doit délivrer son génome dans le noyau des cellules infectées pour sa réplication. Le transport nucléaire est médié par la capside qui interagit avec les récepteurs d'import. L’équipe a démontré préalablement que ce transport a besoin des récepteurs Importin α (Imp.α) et Importin β (Imp.β) en induisant le transport des capsides au panier nucléaire où elle est stoppée par l'interaction avec la nucléoporine 153 (Nup153). Nous avons démontré que l’Imp.α, mais pas l'Imp.β, se lie aux MatC suggérant que seule la partie du CTD qui contient les NLS est exposée à l’extérieur des MatC. En comparaison, nous avons analysé les EmpC en collaboration avec Adam Zlotnick (Université d'Indiana, États-Unis) et démontré que les EmpC sont capables de lier directement l'Imp.β. Cette interaction qui est plus forte que l’interaction avec l'Imp.α s'effectue via la reconnaissance du domaine IBB du CTD, ce qui implique une exposition totale du CTD à l'extérieur de la capside. Nous avons aussi montré que la liaison avec l'Imp.β à des concentrations très élevées fournit des forces de déstabilisation menant au désassemblage des EmpC. La libération du génome dans le panier nucléaire implique que l’interaction entre les MatC et Nup153 participe au désassemblage de la capside. Afin de valider cette hypothèse, nous avons exposé des MatC dont le génome est radiomarqué avec un fragment de Nup153 contenant le domaine clé, montré pour interagir avec la capside, en présence de nucléases. Nous avons mis en évidence qu'en présence de ce fragment, les MatC restent stables. Cela suggère la nécessité de facteurs cellulaires additionnels pour le désassemblage des MatC. Cette conclusion est conforme avec nos résultats sur noyaux isolés, dans lesquels nous avons observé une localisation nucléaire des capsides laissant supposer que les facteurs cellulaires nécessaires au désassemblage des MatC sont nucléaires. Afin d'étudier plus en détail l'étape de désassemblage et la libération du génome viral, nous avons mis au point un système permettant de suivre en temps réel le devenir du génome viral. / The Hepatitis B Virus (HBV) is an enveloped virus containing a partially double stranded DNA genome (rcDNA). HBV causes acute and chronic infections. HBV is not cytotoxic but chronic inflammation leads to liver fibrosis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. HBV replicates via an RNA intermediate, which is transcribed from a covalently closed circular form of the viral DNA (cccDNA). This pregenomic RNA is specifically encapsidated into the capsid by interaction with the viral polymerase, which also interacts with the core protein (Cp), forming the capsid. The polymerase retrotranscribes the pregenomic RNA into single stranded DNA and subsequently partially double stranded DNA resulting in mature capsids (MatC). Cp is an 185 aa long polypeptide comprising a N-terminal assembly domain, and a flexible C-terminal domain (CTD). The CTD includes two overlapping nuclear localization signals (NLS) of eight aa and an Importin ß Binding Domain (IBB) of 34 aa. The CTD is fixed in the interior of the capsid by interacting with single stranded nucleic acids but translocates to the exterior in MatC and empty capsids (EmpC). Cp is over expressed leading to assembly of EmpC. The virus has to deliver its genome into the nucleus of infected cells for replication. Nuclear transport is mediated by the capsid that interacts with nuclear import receptors. The group has recently shown that MatC need either both, importin  (Imp.) and importin ß (Imp.ß), or Imp.ß alone for transport of the capsids into the nuclear basket. In this structure where genome liberation likely occurs, the transport of the capsid is arrested by interaction between the capsid and the nucleoporin Nup153. In the thesis we demonstrate that MatC binds to Imp.α but not Imp.ß, suggesting that only the part of the CTD, which contains the NLSs is exposed on capsids’ surface. In collaboration with the Adam Zlotnick (Indiana University, U.S.A.) we showed that EmpC, in contrast, bind Imp.β directly without Imp.α acting as an adaptor. This interaction, which is stronger than the one of Imp. occurs needs IBB exposure, meaning that the entire CTD becomes externalized. Furthermore, exposure to very high Imp.ß concentration led to EmpC destabilization. The genome release within the nuclear basket implies that Nup153 is involved in genome liberation from MatC. To verify this hypothesis we used MatC with a radioactively labeled genome, which were exposed to the capsid binding-Nup153 fragment. Investigating the accessibility of the genome to nucleases we found that the Nup153 fragment had no impact on capsids stability, suggesting the need of cellular factors driving disassembly. This conclusion is in agreement with our observation that MatC added to isolated nuclei resulted in nuclear capsid entry, which requires disassembly. To further study the disassembly step and the consequent release of the viral genome, we developed a system to directly visualize the viral genome allowing investigations of genome uncoating in real time. The system is based on the cooperative binding of a fluorescent fusion protein between the bacterial protein OR with GFP to a double stranded DNA sequence called Anch. Using this model we showed that infection of OR-GFP-expressing hepatoma cells with HBV containing a modified Anch genome allowed monitoring genome release into the nucleus. In future, this system may help identifying factors involved in genome release and repair and to decipher their molecular interactions.

Parmi toutes les voies d’administration, la voie orale a toujours suscité un grand intérêt. Les formes prises par voie orale présentent une grande facilité d’administration pour le patient, tandis que pour les chercheurs, la physiologie du système gastro-intestinal peut être facilement modélisable. Malheureusement, son importante variabilité, liée principalement au temps de vidange gastrique, peut conduire à une mauvaise reproductibilité des effets thérapeutiques et à une diminution de la biodisponibilité. Ce problème est surtout rencontré dans le cas des principes actifs présentant une fenêtre d’absorption étroite au niveau de l’intestin supérieur [Deshpande et col., 1996]. Une solution a été de développer des formes galéniques à libération prolongée caractérisées par un temps de résidence gastrique accru. Ainsi, le principe actif est libéré progressivement en amont de sa fenêtre d’absorption. Dans cette optique, plusieurs systèmes ont été développés : des formes bioadhésives, expansibles, gonflantes ou à hautes densités [Singh et Kim, 2000]. Mais parmi toutes ces formes, ce sont les systèmes flottants qui semblent offrir la protection la plus efficace contre une vidange gastrique précoce [Moës, 1989]. Seth et Tossounian ont ainsi développé une gélule flottante à libération prolongée, basée sur le gonflement d’un dérivé cellulosique. Etant une forme monolithique, sa vidange gastrique était soumise au phénomène de tout ou rien. De plus, cette forme présentait un inconvénient majeur puisqu’elle était sujette à des fractionnements intra-gastriques, diminuant de ce fait la reproductibilité inter- et intra-individuelle [Seth et Tossounian, 1984]. Afin de résoudre ces problèmes de variabilité, des mini-comprimés flottants à libération prolongée ont été développés. Notre but était donc de développer des mini-comprimés capables de flotter dans l’estomac pendant une période de temps prolongée tout en assurant la délivrance progressive du principe actif. Ces mini-comprimés devaient fournir une bonne flottaison et une libération prolongée pour diverses substances actives. Nous avons également essayé d’augmenter au maximum la teneur en principe actif afin de faciliter l’administration de la gélule contenant les mini-comprimés en réduisant le volume nécessaire pour contenir la dose désirée. L’utilisation de la granulation thermoplastique [Hamdani et col., 2002] suivie d’une compression directe a permis d’obtenir un procédé de fabrication simple, rapide et peu coûteux. Les mini-comprimés contenaient au minimum un agent actif, un agent liant et un mélange effervescent. La levodopa a d’abord été sélectionnée comme modèle de principe actif hydrosoluble. La première forme développée renfermait un agent gélifiant cellulosique capable de retenir le dioxyde de carbone généré tout en assurant la libération prolongée du principe actif. En incorporant 17% (m/m) d’agents effervescents et 25% (m/m) d’agent gélifiant au sein des mini-comprimés matriciels, la libération de la levodopa s’est étendue sur une période de 8 heures. Contrairement à la Prolopa® HBS 125, ils n’ont jamais présenté de problème de fragmentation ou de « désintégration » lors des essais de dissolution. Les mini-comprimés matriciels étaient caractérisés par un faible délai de flottaison (± 1 min.) quel que soit le pH (1.2 ou 3.0), des forces de flottaison élevées et une durée totale de flottaison supérieures à 13 heures. Une évaluation par la technique du poids résultant a montré qu’ils généraient des forces de flottaison supérieures – ex. PRmax = 70mg/100mg - à la spécialité commerciale Prolopa® HBS 125 – ex. PRmax = 45mg/100mg. Suite aux bons résultats obtenus in vitro, une étude préliminaire in vivo a été effectuée sur des sujets volontaires sains. La riboflavine a été préférée à la levodopa comme modèle hydrosoluble en raison du caractère non invasif des prélèvements. L’hypothèse selon laquelle les mini-comprimés flottants offraient une rétention gastrique supérieure à celle obtenue avec les mini-comprimés non flottants semblait avoir été vérifiée. En effet, la quantité totale de riboflavine excrétée après administration concomitante des mini-comprimés flottants et d’un repas était supérieure à celle excrétée avec une forme flottante prise à jeun, ainsi qu’à celle excrétée lors de l’administration de la forme non flottante prise en même temps que le repas. De plus, quel que soit le régime alimentaire, la vitesse d’excrétion urinaire maximale et le temps nécessaire pour l’atteindre ont toujours été supérieurs après administration de la forme flottante. Une seconde technologie a ensuite permis de remplacer l’agent gélifiant par un enrobage capable de maintenir le dioxyde de carbone à l’intérieur de la forme tout en assurant la libération prolongée de la levodopa. Le but de cette substitution était de pouvoir augmenter le pourcentage de principe actif contenu dans la forme. Un dérivé acrylique insoluble – Eudragit® RL30D – a été utilisé comme agent filmogène. Un agent plastifiant peu hydrosoluble – ATEC – a permis d’obtenir un film élastique résistant aux tensions engendrées par la génération du dioxyde de carbone. En appliquant une teneur équivalente à 20% (m/m) d’enrobage autour du noyau, la libération de la levodopa n’a pas été retardée et s’est prolongée pendant plus de 20 heures. Ces mini-comprimés enrobés ont flotté en 20 minutes à pH 1.2 et ont conservé leurs propriétés de flottaison pendant plus de 13 heures. L’incorporation de lactose (10% m/m) au sein de l’enrobage a permis de libérer l’entièreté de la levodopa en 18 heures. De plus, en augmentant la teneur en acide tartrique dans le mélange permettant de générer le dioxyde de carbone (de 3 à 15 % m/m), le délai de flottaison, identique quel que soit le pH (1.2 ou 3.0), a été réduit de 20 à 8 minutes. L’influence des propriétés physico-chimiques de la levodopa et de la ciprofloxacine sur les profils de dissolution et de flottaison obtenus à partir des mini-comprimés matriciels et enrobés a ensuite été évaluée. En l’absence de ciprofloxacine dans la composition de l’enrobage, un retard de libération d’une heure est apparu. Il n’a pu être supprimé qu’en incorporant 10% (m/m) de principe actif au sein de l’enrobage. Aucun problème de ce type ne s’est présenté avec la levodopa. Quel que soit le principe actif incorporé, les mini-comprimés matriciels et enrobés ont flotté en moins de 10 minutes et pendant plus de 13 heures. Toutefois, les valeurs maximales de poids résultant obtenues ont été supérieures en présence de ciprofloxacine - 220 mg/100mg - qu’après incorporation de levodopa – 90 mg/100mg. Une étude pharmacocinétique sur volontaires sains a finalement été réalisée sur les mini-comprimés matriciels et enrobés contenant une association de levodopa et de carbidopa. Le but de cette investigation était de comparer les profils pharmacocinétiques de la levodopa et des inhibiteurs de décarboxylases périphériques obtenus à partir des mini-comprimés avec ceux relevés après administration de la spécialité commerciale Prolopa® HBS 125. Une étude scintigraphique a également été réalisée afin d’évaluer le temps de résidence gastrique des 3 formes flottantes. Cette étude a démontré que les mini-comprimés – matriciels et enrobés – présentaient un temps de rétention gastrique supérieure à 4 heures. Ils ont également fourni des concentrations plasmatiques soutenues en levodopa et carbidopa pendant plus de 12 heures. La courbe plasmatique de la levodopa obtenue à partir des mini-comprimés enrobés était similaire à celle obtenue après administration de la Prolopa® HBS 125. Dans les 2 cas, les concentrations plasmatiques en levodopa ont augmenté rapidement après 3 heures. Ce phénomène est sans doute dû aux phénomènes de désintégration observés in vitro et par scintigraphie. Les mini-comprimés matriciels ont fourni des résultats moins variables en fonction du sexe. Ils n’ont présenté aucune désintégration intra-gastrique, ce qui a évité l’apparition d’effet de pic au niveau des concentrations plasmatiques en levodopa. Comparativement à la carbidopa, les concentrations plasmatiques en bensérazide étaient inférieures et présentaient d’importantes variations en fonction du sexe. Le développement de ces nouveaux types de mini-comprimés a également requis l’examen de leur stabilité temporelle. Pour ce faire, ils ont été conservés à différentes conditions de température et d’humidité relative (25±2°C / 60±5% HR ; 30±2°C / 65±5% HR ; 40±2°C / 75±5% HR). A 25°C et 30°C, aucune diminution significative des teneurs en levodopa et carbidopa n’a été observée à partir des 2 types de mini-comprimés. De même, le profil de dissolution des 2 principes actifs sont restés similaires à celui relevé au temps zéro. Après 12 mois de stockage, les mini-comprimés matriciels et enrobés flottaient endéans 10 min et pendant plus de 13 heures. A 40°C, le profil de dissolution de la levodopa et de la carbidopa, ainsi que les propriétés de flottaison des mini-comprimés matriciels et enrobés sont restés similaires à ceux relevés juste après production. Par contre, après 6 mois de stockage, les teneurs en PA ont diminué de façon significative (p < 0.05) lorsqu’ils étaient contenus dans les mini-comprimés matriciels./ Oral sustained-drug-delivery formulations show some limitations connected with the gastric emptying time. In particular, a too rapid gastrointestinal (GI) transit can result in incomplete drug release from the device above the absorption zone, leading to diminish effectiveness of the administered dose, especially when the drug presents a narrow absorption window. A prolongation of gastric residence time of a rate-controlled oral dosage form (DF) can overcome these problems. Thus, the design of sustained-release (SR) DF requires in some cases both prolongation of GI transit time of the DF as well as controlled drug release. In this way, SR floating granulates, made by melt granulation and containing at least an active drug, a meltable lipidic binder and gas-generating agents, and compressed into minitablets (MT), were developed and evaluated in vitro. The first floating system developed contained Methocel® K15M as a swellable polymer both to trap the generated carbon dioxide and to sustain the release of the drug. For the second floating system developed, Methocel® K15M was completely replaced by the drug and a coating step was introduced in the manufacturing process in order to provide a coating capable of maintaining the generated carbon dioxide inside the DF for a prolonged period of time. Levodopa was used as a model drug. Precirol® was used as a meltable binder. Tartaric acid, sodium bicarbonate and calcium carbonate were employed as carbon dioxide-generating agents. Methocel® K15M was used as a gel-forming polymer. The insoluble polymer used to make the gas-trapping membrane was Eudragit® RL30D. Acetyl-triethyl citrate was used as plasticizer. Granulates were prepared by melt granulation, in a vertical small laboratory scale high-shear mixer. MT were prepared by direct compression. The coating was realized into a fluidized bed coating apparatus. A resultant-weight apparatus was used to determine the buoyancy capabilities of the floating minitablets (FMT). A Disteck 2100C USP 29 dissolution apparatus Type II was used for the dissolution tests. The best floating properties of the uncoated FMT were obtained with 3 mm minitablets prepared at low compression forces ranging between 50 and 100 N. When the FMT were filled into gelatin capsules, no sticking was observed. By evaluating the dissolution profiles of levodopa at different pH values, it was found that dissolution profiles depend more on the prolonged-release ability of Methocel® K15M than on the pH-dependent solubility of levodopa. On the other hand, the optimized 3mm coated FMT floated within 10 min and remained buoyant for more than 13 h, regardless of the pH of the test medium. By evaluating the dissolution profiles of levodopa at different pH, it was found that the release of levodopa was sustained for more than 12 h regardless of the pH, even if the coating did not cancel the effect of the pH-dependant solubility of the active drug. Finally, the robustness of the uncoated and the coated FMT was assessed by testing the drug release variability in function of the stirring conditions during dissolution tests. Two formulations -uncoated and coated - of new FMT were developed with success. The floating lag time of the FMT was ranged between 1 and 10 min and the FMT remained buoyant for more than 13 hours. Their ability to sustain the drug release for more than 8 hours was also demonstrated. Pharmacoscintigraphic studies were conducted on the FMT and the following in vivo results assess those obtained in vitro.