Orientador: Ljubica Tasic / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-19T12:26:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_FabioHenriquedosSantos_M.pdf: 24628982 bytes, checksum: f6b1490bc6bf2bf5497e5cad40a40daa (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A Adenosina Quinase (ADK) é uma enzima importante (EC 2.7.1.20), cuja ação pode estar relacionada a diversas doenças, tais como inflamações, derrame, infarto, entre outras. Desse modo, a inibição de sua atividade é de grande importância, e desperta interesse científico. Na tentativa de inibir a ação da ADK, houve busca por compostos orgânicos cuja capacidade inibitória seja superior comparando-se com inibidores da ADK existentes. Desse modo, derivados de 4-anilinoquinazolinas mostraram-se alvos interessantes. Foi sintetizada uma série de 22 derivados de 8-metóxi-4-anilinoquinazolinas, substituídas nas posições 3'e 4'do anel anilínico. Os compostos sintetizados foram caracterizados e testados frente à ADK, de forma a verificar seu potencial inibitório, principalmente através da técnica de fluorescência de emissão. Da série de compostos, seis apresentaram-se promissores na inibição da ADK. Ensaios in silico também foram realizados, buscando-se uma melhor compreensão do mecanismo de inibição do sistema compostos/ADK / Abstract: The Adenosine Kinase (ADK) is an important enzyme (EC 2.7.1.20) that might be related to several diseases, such as inflammation, stroke and infarct, and many others. Therefore, its activity inhibition is of great importance, arising significant scientific interest. Aiming ADKs inhibition, a search for suitable organic species was realized, in such way that 4-anilinoquinazoline derivatives showed themselves interesting targets. A serie of 22 8-methoxy-4-anilinequinazoline derivatives, substituted on the aniline ring at 3'and 4'positions, was synthesized. The compounds were characterized and tested in in vitro ADKs inhibition, in order to verify their inhibitory potentials, mainly applying emission fluorescence technique. Six compounds of this serie presented promising properties in ADKs inhibition. In silico assays were also conducted, in order to better explain the inhibitory mechanism of the system compounds/ADK / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

O foco do trabalho está direcionado para a construção da linhagem knock-out do gene ncsA de A. fumigatus, bem como a caracterização do fenótipo da linhagem DncsA e a investigação de interações deste gene com vias de sinalização importantes para o desenvolvimento do fungo. A linhagem mutante ncsA foi construída através da transformação do WT (Dku80) com o gene marcador pyrG de A. fumigatus. Foi confirmada a deleção por Southern blot e as alterações fenotípicas da linhagem foram analisadas. O gene ncsA em A. fumigatus não é essencial e a linhagem DncsA apresentou-se sensível EGTA e SDS, alé, de tolerante a altas concentrações de íons cálcio. Na linhagem NcsA:mRFP foi localizado a proteína NcsA no citoplasma das células e sua localização não é alterada pela em resposta ao aumento da concentração de cálcio. A linhagem DncsA foi sensível a drogas que afetam a biossíntese e a manutenção da membrana plasmática, tais como voriconazole, anfotericina e itraconazole. O crescimento polarizado em presença de lovastatina nessa linhagem foi consideravelmente mais afetado que no tipo selvagem. O Spitzenkörper não foi visualizado no mutante DncsA, e existe uma significante diminuição de estruturas vacuolares e endossomos. Os resultados obtidos em ensaios de TRPCR em tempo real sugerem que NcsA modula a expressão dos genes pmcA e pmcB, que codificam proteínas ATPases transportadoras de íons cálcio. Os ensaios de virulência no modelo animal revelaram que a mutação do gene ncsA não causa perda de virulência no A. fumigatus. / Here, we characterize the A. fumigatus Neuronal Calcium Sensor, ncsA homologue. We showed that ncsA is not an essential gene and ncsA growth was decreased in the presence of EGTA and SDS. Furthermore, the ncsA mutant is more resistant to calcium chloride. NcsA:mRFP localizes to the cytoplasm that its cellular localization is not affected by the cellular response to calcium chloride. The ncsA mutant strain is more sensitive to voriconazole, itraconazole, and the ergosterol intercalating agent, amphotericin. Polar growth in the DncsA mutant strain was also considerably more affected by lovastatin than in the wild type mutant strain. The Spitzenkörper cannot be visualized in the DncsA mutant, and there is a significant decrease of the endosome/vacuole structures. NcsA supports pmcA and pmcB expression therefore reduced expression of these ion pumps, and also of other genes involved in the response to calcium in A. fumigatus. The ncsA inactivation mutation is not causing loss of virulence in a low dose murine infection when compared to the corresponding wild type strain.

Avaliou-se a expressão do gene mbl2 em 79 crianças e suas mães HIV positivas com o objetivo de avaliar a sua influência na transmissão vertical. Os pacientes divididos em dois grupos: crianças HIV positivas e suas mães (n=18) e crianças HIV negativas e suas mães (n=61) foram avaliados pelo CH50 e AP50 (ensaios hemolíticos), dosagem e avaliação funcional da MBL, ativação da cascata terminal do complemento (ELISA) e o gene mbl2 (PCR). Os resultados não mostraram diferença significante entre os níveis séricos, atividade funcional e o gene da MBL entre os grupos, excluindo a sua influência sobre a transmissão materno-fetal do HIV / It was evaluated the mbl2 gene expression in 79 children and their HIV positive mothers with the aim to evaluate its influence on mother-to-child HIV. The patients were divided in two groups: HIV positive children and their mothers (n=18) and HIV negative children and their mothers (n=61) were evaluated by CH50 and AP50 (hemolytic assays); levels and functional MBL and terminal complement cascade (ELISA) and mbl2 gene (PCR). The results didn't show significant difference amons serum levels, functional activities and MBL gene between the groups, excluding the influence in the mother-to child HIV transmission.

Avaliou-se a expressão do gene mbl2 em 79 crianças e suas mães HIV positivas com o objetivo de avaliar a sua influência na transmissão vertical. Os pacientes divididos em dois grupos: crianças HIV positivas e suas mães (n=18) e crianças HIV negativas e suas mães (n=61) foram avaliados pelo CH50 e AP50 (ensaios hemolíticos), dosagem e avaliação funcional da MBL, ativação da cascata terminal do complemento (ELISA) e o gene mbl2 (PCR). Os resultados não mostraram diferença significante entre os níveis séricos, atividade funcional e o gene da MBL entre os grupos, excluindo a sua influência sobre a transmissão materno-fetal do HIV / It was evaluated the mbl2 gene expression in 79 children and their HIV positive mothers with the aim to evaluate its influence on mother-to-child HIV. The patients were divided in two groups: HIV positive children and their mothers (n=18) and HIV negative children and their mothers (n=61) were evaluated by CH50 and AP50 (hemolytic assays); levels and functional MBL and terminal complement cascade (ELISA) and mbl2 gene (PCR). The results didn't show significant difference amons serum levels, functional activities and MBL gene between the groups, excluding the influence in the mother-to child HIV transmission.

Este trabalho está focado no desenvolvimento de complexos de rutênio binucleares baseados no ligante ponte 2,6-bis(2-piridil)benzodiimidazol (dpimH2) com potencial aplicação como catalisadores para oxidação da água. O acoplamento eletrônico entre os centros metálicos bem como as propriedades eletrônicas e catalíticas podem ser controlados via reações ácido-base no ligante bis-bidentado. Dessa forma, neste trabalho descrevemos o preparo e a caracterização do respectivo composto mononuclear, bem como do complexo binuclear simétrico [{RuCl(phtpy)}2(dpimH2)](Otf) 2 (onde phtpy=4-fenil-2,2\':6\',\'\'-terpiridina), e do análogo assimétrico [{Ru(bpy)2}(dpimH2){Ru(phtpy)Cl}](ClO4)3 (onde bpy=2,2\'-bypiridina), que possui um centro catalítico e um grupo cromóforo na mesma molécula como esperado em um fotocatalisador, em que os dois centros catalíticos estão covalentemente conectados através do ligante ponte funcional. As caracterizações estrutural e eletrônica de ambos os complexos por 1H RMN, ESI-MS e espectroscopia de absorção UV-Vis indicaram a presença de isômeros geométricos com perfis eletrônicos similares. Por outro lado, a análise eletroquímica por voltametria cíclica demonstrou menores potenciais Ru(III/II) quando comparados a complexos polipiridínicos análogos. Este potencial redox pode ainda ser catodicamente deslocado através da remoção de prótons dos grupos imidazóis do ligante ponte, possibilitando, dessa forma, a modulação das propriedades eletrônicas e catalíticas destes complexos de rutênio através de reações de protonação/desprotonação dos grupos -NH. Além disso, neste trabalho é investigada a inesperada formação do complexo [Ru(phtpy)2] nas reações do complexo [RuCl3(phtpy)] puro com ligantes bidentados, utilizando-se espectroscopia UV-Vis e de 1H RMN. / This work is focused on the development of dinuclear ruthenium complexes with potential application as catalysts for oxidation of water, that are characterized by a benzobisimidazole 2,6-bis(2-pyridyl)benzodiimidazole (dpimH2) bridging ligand, whose interaction between the metal centers as well as the electronic and catalytic properties can be tuned by acid-base reactions in that moiety. Thus, the preparation and characterization of the respective mononuclear species are described. The dinuclear complex [2(dpimH2)](Otf)2(phtpy=4-phenyl-2,2\':6\',2\'\'-terpiridine), in which two catalytic centers are covalently linked through that bridging ligand, and of the [(dpimH2)](ClO4)3 complex (where bpy=2,2\'-bypiridine) integrating a chromophore and a catalytic center in the same molecule as expected for a photocatalyst. The structural and electronic characterization of both complexes by NMR, ESI-MS and UV-vis spectroscopy indicated the presence of geometric isomers with similar electronic profiles. On the other hand, the electrochemical analysis by cyclic voltammetry displayed redox potential values for the Ru3+/Ru2+ couples lower than the respective polypyridyl complex counterparts. This redox potential can be even more shifted to less positive potentials by removal of protons from the imidazole groups in the bridging ligand, opening the possibility of tuning the electronic and catalytic properties of those ruthenium complexes based on protonation/deprotonation of the -NH groups. Furthermore, in this work is analyzed the unexpected formation of the bisterpyridine [Ru(phpy)2] complex in reactions starting with pure [RuCl3(phtpy)] complex with bidentated ligands, as through UV-Vis spectroscopy and RMN.

O receptor CD40 e seu ligante CD40L possuem um papel importante na interface entre a resposta imune inata e a adaptativa. Disfunções desta via de sinalização são descritas em doenças de origem inflamatória e autoimunes. Em Lúpus eritematoso sistêmico (LES) foi descrito um aumento nos níveis séricos de CD40L solúvel, que participa na produção de autoanticorpos. Receptores ativados por proliferadores de peroxisomos (PPARs) são fatores de transcrição que inicialmente foram descritos como envolvidos apenas no metabolismo lipídico, mas que atualmente são também descritos como atuantes no controle da resposta imune. Com isso, nosso objetivo é determinar se a ativação dos PPARs modula o processo inflamatório através da interação com CD40/CD40L in vitro ou in vivo. Células de linhagem monocítica humana THP-1 foram tratadas por 24 horas com forbol-éster (PMA, 40 nM) e posteriormente estimuladas com CD40L recombinante (rhCD40L, 1 g/ml) por diferentes períodos. Transcritos de mRNA foram analisados por real time PCR e os resultados expressos como razão da expressão do gene housekeeping GAPDH. As células THP-1 apresentam um aumento na expressão de PPAR e após 16 e 2 horas de estímulo com rhCD40L, respectivamente. Estas células também foram estimuladas com LPS (10 g/ml) e LPS+rhCD40L para sabermos se a resposta obtida anteriormente era específica ao estímulo com rhCD40L. O resultado mostra que há uma diminuição na expressão de PPAR e após o estimulo com LPS ou LPS+rhCD40L, indicando que nessas condições a modulação da expressão de PPARs é especifica para a via de sinalização CD40/CD40L. Foi medida também a expressão de CD36, que é descrito na literatura como um indicador da atividade de PPARs. O resultado mostra que o estímulo com CD40L promove um aumento de CD36, o que indica indiretamente que o PPAR estava ativo neste modelo experimental. Para mostrar a interação direta destas duas vias de sinalização, silenciamos o gene de PPAR por siRNA e posteriormente anlisamos a expressão de CD80, cuja expressão encontra-se aumentada logo após a ativação do CD40 de acordo com a literatura. O resultado mostra que, com o silenciamento de PPAR , há um aumento de CD80 logo após a ativação do CD40, evidenciando assim a interação entre essas duas vias de sinalização. A fim de verificar se os achados encontrados in vitro poderiam ser observados in vivo, foi isolada a fração mononuclear de sangue periférico de pacientes com LES com a doença em atividade (n=17), a doença inativa (n=21) ou doadores saudáveis (n=12) e foi medida a expressão de PPAR e por real time PCR. PPAR apresenta um aumento em pacientes com a doença ativa ou inativa em comparação aos doadores saudáveis. Já a expressão de PPAR apresenta aumento apenas em lúpicos em atividade quando comparados com lúpicos inativos ou doadores saudáveis. Quando considerado nesta análise o efeito do tratamento dos pacientes com corticosteróides nos níveis de PPAR, obsevou-se que a expressão de PPAR apresenta o mesmo padrão anterior. Estes resultados sugerem a hipótese de que PPAR seja um possível marcador de atividade de LES. Para confirmar esta especificidade, foram adicionadas à analise células mononucleares retiradas de pacientes com tuberculose e com infecções agudas. Os dados mostram que os níveis elevados de PPAR se mantém apenas em pacientes com lúpus ativo, o que confirma nossa hipótese. Nossos achados sugerem que PPAR e são regulados especificamente em reposta a ativação da via do CD40/CD40L, em monócitos em cultura e em células obtidas de pacientes com LES. Podemos também sugerir que PPAR possa ser um marcador para a atividade de LES. Estes resultados podem representar um novo mecanismo de controle da via de sinalização do CD40/CD40L, participando no controle da resposta inflamatória em cultura e em células de pacientes lúpicos / The membrane receptor CD40 and its ligand CD40L play an important role in the interface between innate and acquired immunity. Dysfunction of this signaling pathway was described in inflammatory and autoimmune diseases. In systemic lupus erythematosus (SLE), increased serum levels of soluble CD40L have been detected, where it plays a significant role in the generation of auto-antibodies. Peroxisome proliferator activator receptors (PPARs) are transcription factors originally described in lipid metabolism. More recently, they were also characterized as inflammatory modulators. Therefore, our objective was to determine whether the activation of PPARs may modulate the inflammatory process through interaction with the CD40/CD40L signaling pathway in vitro and in vivo. Macrophages derived from the human monocytic cell line THP-1 by 24h-treatment with PMA (40 nM) were stimulated with human recombinant CD40L (rhCD40L, 1 g/ml) for different periods. Messenger RNA (mRNA) transcripts for PPAR , and were determined by real time PCR and expressed as a ratio of the housekeeping gene GAPDH transcripts. THP-1 cells express a basal level of PPAR and gene transcription, which is increased 16 and 2 hours after exposure to rhCD40L, respectively. We also stimulated the THP-1 cells with LPS (10 g/ml) and LPS+rhCD40L to see if the increase of PPAR was a response specific to the rhCD40L stimuli. The data show that there is a decrease in PPAR and genes expression upon LPS or LPS+rhCD40L stimulation, indicating that in these times (2 and 16 hours) the response is specific for the CD40/CD40L signaling pathway. Increased expression of CD36 is known as an indicator of PPARs activity. We measured CD36 and saw an increase of this receptor after rhCD40L stimulus, indicating indirectly that PPARs were active in this experimental model. To prove the direct interaction between CD40/CD40L and PPAR , we silenced the PPAR gene by siRNA and analyzed the expression of CD80, which is known to increase after CD40 activation. The results show an increase in CD40L-stimulated CD80 expression upon silencing of PPAR , showing that there is an interaction between these signaling pathways. To confirm whether these findings also occur in vivo, mononuclear cells were isolated from whole blood samples from SLE patients with active (n=17) and inactive disease (n=21), and healthy donors (n=12). The mRNA transcripts for PPARs were detected by real time PCR. In both active and inactive SLE patients, monocytes show an increase in PPAR mRNA expression, as compared to healthy donors. PPAR mRNA is increased only in active patients when compared to healthy donors and inactive lupus patients. Further in this analysis, when we separated the patients with and without the administration of corticosteroids, PPAR displayed the same pattern as above. These results suggested that PPAR may be a marker for lupus activity. To validate this hypothesis, we compared the results obtained from patients with tuberculosis and acute infections. Results showed that only active-lupus patients have an increase in PPAR , confirming the specificity of this phenomenon and hence our hypothesis Our findings suggest that PPAR and are up-regulated specifically in response to CD40/CD40L activation, in both cultured macrophages and in monocytes obtained from SLE patients. We could also suggest that PPAR may be marker for lupus activity. Our results may represent a new control mechanism of the CD40/CD40L signaling pathway and seem to be implicated in the control of the inflammatory response in both human macrophages in vitro and SLE patients

Aditivos têm sido incorporados ao ligante asfáltico no intuito de melhorar o desempenho dos pavimentos. O enrijecimento do ligante asfáltico provocado pelos aditivos, aumenta a resistência à deformação permanente das misturas asfálticas, mas ainda não se sabe qual o efeito deles sobre a resistência à fadiga e ao trincamento térmico dos ligantes asfálticos. Um dos produtos modernos mais promissores para modificação de ligantes asfálticos é o ácido polifosfórico (PPA). No entanto, o mecanismo de modificação com PPA depende fortemente da composição química do ligante asfáltico de base. Para avaliar o impacto da adição de PPA em ligantes asfálticos de diferentes fontes, dois ligantes asfálticos 50/70 (REDUC e LUBNOR), de diferentes PGs e composição química foram modificados por quatro proporções de PPA (0,5, 1,0, 1,5, 2,0%). As frações de saturados, aromáticos, resinas e asfaltenos (SARA) dos ligantes asfálticos puros e modificados foram determinadas por meio da cromatografia de camada fina. Para avaliar o efeito da adição de PPA sobre as propriedades reológicas dos ligantes asfálticos, foram analisados a viscosidade, o grau de desempenho, a rigidez, a elasticidade, a recuperação elástica, a compliância não-recuperável e o comprimento de trinca na ruptura. A viscosidade dos ligantes asfálticos e as temperaturas de usinagem e compactação aumentaram com o aumento do teor de PPA. A temperatura alta do PG aumentou com a proporção de PPA em intensidades diferentes, dependendo do ligante asfáltico de base. A adição de PPA aumenta a rigidez, a elasticidade e a recuperação elástica e diminui a compliância não-recuperável dos ligantes asfálticos. Em termos de tolerância à fadiga, a adição de PPA e o envelhecimento provocaram um aumento na tolerância à fadiga dos ligantes asfálticos. Os resultados apresentados destacam a importância da composição química do ligante asfáltico de base no grau de modificação provocado pela adição de PPA. Recomenda-se a adição de teores baixos de PPA para o LUBNOR (até 1%) e de teores altos de PPA para o REDUC (superiores a 1,0%). / Additives have been incorporated to asphalt binder in order to improve the performance of pavements. The stiffening of asphalt binders induced by additives should increases the rut resistance of asphalt concrete, unclear how PPA affects the resistance to fatigue and thermal cracking of asphalt binders. One of the most promising new products for asphalt binders modification is the polyphosphoric acid (PPA). However, the mechanism of PPA modification depends strongly on the chemical composition of the base asphalt binder. To evaluate the impact of the PPA modification in asphalt binders from different sources, two asphalt binders 50/70 penetration grade (REDUC and LUBNOR) from different crude source with different performance grades and chemical composition have been modified by four proportions of PPA (0.5, 1 0, 1.5, 2.0%). Saturated aromatics, resins and asphaltenes (SARA) fractions of neat and modified asphalt binders were determined using the thin-layer chromatography. To evaluate the effect of PPA addition on the rheological properties of asphalt binders it was analyzed the viscosity, the performance grade, the stiffness, the elasticity, the elastic recovery, the non-recoverable compliance and the crack length at failure. The viscosity of asphalt binders and the mixing and compaction temperature increased with increasing levels of PPA. The high temperature of PG increased in different magnitude with the ratio of PPA, depending on the base asphalt binder. The addition of PPA increases the stifiness, the elasticity and the elastic recovery and decrease the non-recoverable compliance of asphalt binders. With regard to the fatigue tolerance, the addition of PPA and the thermo-oxidative aging induced an increase in the fatigue tolerance of asphalt binders. The presented results show the importance of the chemical composition of the base asphalt binder on the extent of modification caused by the addition of PPA. It is recommended to use low levels of PPA to modify the LUBNOR (to 1%) and high levels of PPA to modify the REDUC (over 1.0%).

Este trabalho dedica-se ao estudo de sistemas luminescentes do tipo hóspede-hopedeiro altamente emissivos. A preparação desses materiais se deu a partir da incorporação de complexos organometálicos (Eu3+ e Ir3+) em matrizes mesoporosas inorgânicas e orgâno-modificadas preparadas via sol-gel. Um complexo de európio foi imobilizado por impregnação úmida nos mesoporos de xerogéis e de materiais derivados da peneira molecular MCM-41, enquanto um complexo-surfactante de irídio foi inserido nos canais do MCM-41 como agente diretor da estrutura durante o processo de síntese. Previamente à incorporação dos centros emissores, as matrizes hospedeiras foram caracterizadas do ponto de vista estrutural, morfológico e óptico. As propriedades fotofísicas do material final foram investigadas e comparadas com aquelas apresentadas pelos complexos em solução. Para o complexo de európio foi realizado uma modelagem de suas propriedades ópticas através da teoria do campo ligante, empregando o modelo de recobrimento simples. Nesse tratamento, a geometria do estado fundamental foi obtida pelo método semi-empírico Sparkle/AM1 e confirmada a partir de um mapeamento criterioso dos fatores de carga. Observou-se que, para as amostras dopadas com o complexo de európio, a modificação da matriz hospedeira com grupos orgânicos só leva a melhoria das propriedades ópticas do material final quando a unidade orgânica substitui grupos silanol. Para o MCM-41 preparado com o complexo-surfactante de irídio, constatou-se que as propriedades fotofísicas do material final são muito superiores àquelas apresentadas pelo complexo em solução. / This work dedicates to the study of highly emissive guest-host luminescent materials prepared by the incorporation of organometallic complexes (of Eu3+ and Ir3+) in inorganic and organically-modified mesoporous hosts, obtained via sol-gel methodology. The europium complex (tris[(4 - (4\' - tert - butylbiphenyl - 4 - yl) - 2,2\' - bipyridine - κ2N,N\' - 6 - carboxylato - κO)] europium(III)) was immobilized, via wet impregnation, in the mesopores of silica xerogels and of MCM-41 derived materials. The iridium surfactant-complex (bis[1 - benzyl 4 - (2,4 - difluorophenyl) - 1H -1,2,3 - triazole](4,4\' diheptadecyl - 2,2\' - bipyridine) iridium(III)) was inserted in the channels of MCM-41 while acting as the structure driving agent (template) during the host synthesis procedure. Prior to the incorporation of the luminescent centers in the host matrices, the latter were characterized from the structural, morphological and optical points of view. The photophysical properties of the final luminescent materials were investigated and compared to those presented by the complexes in solution. Particularly, the properties of the Eu-complex were further analyzed, via ligand field theory, employing the simple overlap model. For this treatment, the geometry of the ground state was obtained by the semiempirical Sparkle/AM1 model and confirmed by mapping out the charge factors. For the Eu-complex loaded materials it was verified that the host matrix surface modification with organic groups only results in improved photophysical properties when the organic units substitute silanol groups. For the case of the MCM-41 loaded with the Ir-surfactant-complex, the photophysical properties were found to be much superior to those presented by the complex in solution.

Simulações moleculares podem fornecer informações e detalhes mecanísticos que são difíceis de obter de experimentos. No entanto, fenômenos bioquímicos como formação de complexos proteína-ligante e desenovelamento de proteína são lentos e difíceis de amostrar na escala de tempo geralmente atingida por simulações de dinâmica molecular (MD) convencionais. Esses fenômenos moleculares foram estudados aqui pela combinação de simulações de MD com diversos métodos e aproximações para aumentar a amostragem configuracional: método de energia de interação linear (LIE), a aproximação de ensemble ponderado (WE) e dinâmica molecular dirigida (SMD). Uma equação foi parametrizada para prever afinidades entre pequenas moléculas e proteínas baseada na aproximação LIE, que foca a amostragem computacional nos estados complexado e não-complexado do ligante. A flexibilidade proteica foi introduzida usando ensembles de configurações obtidos de simulações de MD. Diferentes esquemas de média foram testados para obter afinidades totais de complexos proteína-ligante, revelando que muitas configurações de complexo contribuem para as afinidades de proteínas flexíveis, enquanto as afinidades de proteínas rígidas são dominadas por uma configuração de complexo. O mutante L99A da lisozima T4 (T4L) é provavelmente a proteína mais frequentemente usada para estudar complexação de ligantes. Estruturas cristalográficas mostram que a cavidade de ligação artificial criada pela mutação é pouco acessível, portanto movimentos proteicos ou uma respiração conformacional são necessários para permitir a entrada e saída de ligantes. Simulações de MD foram combinadas aqui com a aproximação de WE para aumentar a amostragem de eventos infrequentes de saída do benzeno de T4L. Quatro possíveis caminhos foram encontrados e movimentações de alfa-hélices e cadeias laterais envolvidas na saída do ligante foram caracterizadas. Os quatro caminhos correspondem a túneis da proteína previamente observados em simulações de MD longas de T4L apo, sugerindo que a heterogeneidade de caminhos ao longo de túneis intrínsecos é explorada por pequenas moléculas para sair de cavidades de ligação enterradas em proteínas. Experimentos de microscopia de força atômica revelaram informações detalhadas do desenovelamento forçado e da estabilidade mecânica da rubredoxina, uma proteína ferro-enxofre simples. O desenovelamento completo da rubredoxina envolve a ruptura de ligações covalentes. Portanto, o processo de desenovelamento foi simulado aqui por simulações de SMD acopladas a uma descrição clássica da dissociação de ligações. A amostragem de eventos de desenovelamento forçado foi aumentada pelo uso de velocidades rápidas de esticamento. Os resultados foram analisados usando um modelo teórico válido para regimes de desenovelamento forçado lentos e rápidos. As simulações revelaram que mudanças no ponto de aplicação de força ao longo da sequência da rubredoxina levam a diferentes mecanismos de desenovelamento, caracterizados por variáveis graus de rompimento de ligações de hidrogênio e estrutura secundária da proteína. / Molecular simulations may provide information and mechanistic insights that are difficult to obtain from experiments. However, biochemical phenomena such as ligand-protein binding and protein unfolding are slow and hard to sample on the timescales usually reached by conventional molecular dynamics (MD) simulations. These molecular phenomena were studied here by combining MD simulations with several methods or approximations to enhance configurational sampling: linear interaction energy (LIE) method, weighted ensemble (WE) approach and steered molecular dynamics (SMD). An equation was parametrized to predict affinities between small molecules and proteins based on the LIE approximation, which focus computational sampling in ligand bound and unbound states. Protein flexibility was introduced by using ensembles of configurations obtained from MD simulations. Different averaging schemes were tested to obtain overall affinities for ligand-protein complexes, revealing that many bound configurations contribute to affinities for flexible proteins, while affinities for rigid proteins are dominated by one bound configuration. T4 lysozyme (T4L) L99A mutant is probably the protein most often used to study ligand binding. Crystal structures show the artificial binding cavity created by the mutation has low accessibility, so protein movements or conformational breathing are necessary to allow the entry and egress of ligands. MD simulations were combined here with the WE approach to enhance sampling of infrequent benzene unbinding events from T4L. Four possible pathways were found and motions on alpha-helices and side chains involved in ligand egress were characterized. The four pathways correspond to protein tunnels previously observed in long MD simulations of apo T4L, suggesting that pathway heterogeneity along intrinsic tunnels is explored by small molecules to egress from binding cavities buried in proteins. Previous atomic force microscopy experiments revealed detailed information on the forced unfolding and mechanical stability of rubredoxin, a simple iron-sulfur protein. Complete unfolding of rubredoxin involves rupture of covalent bonds. Thus, the unfolding process was simulated here by SMD simulations coupled to a classical description of bond dissociation. Sampling of forced unfolding events was increased by using fast pulling velocities. Results were analyzed using a theoretical model valid for both slow and fast forced unfolding regimes. Simulations revealed that changing the points of force application along the rubredoxin sequence leads to different unfolding mechanisms, characterized by variable degrees of disruption of hydrogen bonds and secondary protein structure.

Melanoma cutâneo ainda constitui a principal causa de morte por câncer de pele nos países desenvolvidos. A variabilidade do comportamento clínico dessa neoplasia tem sido apenas parcialmente explicada pelos aspectos clínicos e histológicos, e a identificação de variáveis biológicas pode vir a ser importante na determinação de grupos de risco específicos. Foram estudados 69 pacientes com melanoma cutâneo primário de diversos graus de gravidade, tratados entre 1990 e 2007, com o intuito de verificar aspectos clínicos e epidemiológicos, preparar Tissue microarray (TMA) para estudo dos melanomas cutâneos primários com espessura maior que 1,0 mm, avaliar por análise imuno-histoquímica a expressão das proteínas da apoptose celular Bcl2, Bax, Bak, Apaf-1, Caspase 3, Caspase 9, Caspase 8, FasL e Fas em nevos-controle e em melanomas primários com espessuras menores e maiores que 1mm, e correlacionar a expressão dessas proteínas da apoptose com a evolução de melanomas cutâneos primários. Os resultados ratificaram tanto dados epidemiológicos já publicados em relação a sexo, idade e local da lesão, quanto a correlação entre a evolução da doença e os índices de Breslow. A análise dos escores compostos relativos à expressão das proteínas da apoptose revelou que o perfil imuno-histoquímico dessas proteínas parece não ter significado prognóstico, uma vez que não houve diferenças de expressão entre pacientes com e sem doença disseminada. Não foram encontradas alterações na expressão das proteínas da apoptose estudadas que pudessem sugerir o seu envolvimento tanto na gênese quanto na progressão de melanoma primário. O perfil imuno-histoquímico com tendência pró-apoptótica parece indicar que outros fatores seriam responsáveis pelo crescimento e disseminação da neoplasia / Cutaneous melanoma still constitutes the main cause of skin cancer death in developed world. Clinical behavior variability of this neoplasia has been only partially explained by clinical and histological aspects, and identification of biological variables can be important for determining specific risk groups. Sixty nine (69) patients with mild to severe primary cutaneous melanoma treated in 1990-2007 were studied aiming at (a) verifying clinical epidemiological aspects, (b) generating a Tissue microarray (TMA) for characterizing proteins expression of cutaneous melanoma > 1.0 mm, (c) analyzing the immunohistochemical expression of the apoptosis proteins Bcl2, Bax, Bak, Apaf-1, Caspase 3, Caspase 9, Caspase 8, FasL e Fas in 10 control nevi and in primary melanomas with thickness 1mm, (d) and correlating these proteins expression with the disease prognosis. Results have ratified known epidemiological date on gender, age and lesion localization as well as the correlation between the disease prognosis and the Breslow\'s indexes. Analysis of the composite scores relating to apoptosis proteins has revealed that their immunohistochemical profile seems to be not significant for determining the disease prognosis, since no differences in proteins expression were found when compared patients with and without disease dissemination. Alterations in proteins expression suggesting their role in the genesis as well as in the prognosis of primary melanoma were not evidenced. Immunohistochemical profile with pro-apoptosis trend seems to indicate other factor as responsible for the neoplasia growth and dissemination