O gênero Pestivirus, pertencente à família Flaviviridae, é constituído por espécies virais de importância na saúde animal no mundo todo, as quais podem afetar a economia dos países de forma impactante. São reconhecidas quatro espécies pelo Comitê Internacional de Taxonomia Viral (ICTV): vírus da peste suína clássica (Classical Swine Fever Virus – CSFV), vírus da doença da fronteira (Border Disease Virus- BDV), vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (Bovine Viral Diarrhea Virus 1- BVDV-1) e 2 (BVDV-2). Algumas das espécies deste gênero- CSFV e BVDV- são de notificação obrigatória na Organização Mundial de Saúde Animal (OIE), causando sanções econômicas importantes quando presentes. Recentemente, possíveis novas espécies vêm sendo caracterizadas, porém ainda não foram reconhecidas como espécies do gênero Pestivirus. Com o objetivo de gerar mais informações acerca da diversidade genética de pestivírus no país, o presente trabalho descreve os genomas completos e a caracterização genômica e filogenética de uma cepa de BVDV-1 subtipo i e duas de vírus ‘HoBi’-like. Os genomas completos foram obtidos através de sequenciamento de nova geração; as anotações, predição da poliproteína viral e dos sítios de clivagem foram feitos através do software Geneious, e a análise filogenética foi realizada através do software MEGA 6. O BVDV-1 subtipo i foi pela primeira vez isolado no Brasil, sendo também a primeira descrição de genoma completo deste subtipo de BVDV. Também foi descrito o genoma completo de duas cepas de vírus ‘HoBi’-like isolados no Brasil, além da caracterização de outras cepas de ‘HoBi’-like disponíveis em bancos de dados. Os dados moleculares destes isolados foram comparados com aqueles das demais espécies do gênero Pestivirus, e estas informações deverão auxiliar na futura classificação deste como espécie. Os resultados apresentados na dissertação adicionam conhecimento sobre a diversidade genética de BVDV-1 no Brasil além de informações acerca do vírus ‘HoBi’-like, reforçando esta espécie ainda não reconhecida como um novo membro do gênero Pestivirus, os ‘HoBi’-like vírus. / The genus Pestivirus, within the family Flaviviridae, includes species that are important pathogens affecting animal health that can cause impacting losses in the economy worldwide. According to the International Committee on Taxonomy of Virus (ICTV), there are four recognized species in this genus: Classical swine fever virus (CSFV), Bovine Viral Diarrhea Virus1 and 2 (BVDV -1, BVDV-2), and Border disease virus (BDV). Some of the species within this genus - CSFV and BVDV- are notifiable to the World Organization for Animal Health (OIE), and can cause exportation barriers or sanctions. Other putative new species have been characterized recently, but remain officially unrecognized. In order to generate data about the genetic diversity of pestivirus in Brazil, this study describes complete genomes and the genomic and phylogenetic characterization of an isolate of BVDV-1i and two isolates of ‘HoBi’-like virus. Complete genomes were sequenced through Next Generation Sequencing; genome annotations, polyprotein prediction and identification of cleavage sites were performed with software Geneious, and phylogenetic analysis with software MEGA 6. BVDV-1 subtype i was found in Brazil for the first time, and this is the first complete genome ever characterized for this subtype. Two strains of ‘HoBi-like’ virus isolated in Brazil were also described and characterized together with other ‘HoBi’-like strains available in databases. The molecular data obtained for these isolates were compared to those of other Pestivirus species. These data can help in future classification of these ‘HoBi’-like strains as a new recognized species. The knowledge on genetic diversity and the characterization of pestiviruses can contribute with surveillance programs and with appropriate animal health measures to control these viral diseases.

Le virus de l'hépatite B (HBV) infecte chroniquement près de 240 millions d'individus dans le monde. L'infection chronique par HBV est un souci de santé publique majeur puisque l'infection peut évoluer au cours du temps vers la cirrhose et/ou l'hépatocarcinome (CHC). Malgré l'existence de traitements efficaces à base d'analogues de nucléos(t)ides permettant de diminuer la charge virale chez les patients, ceux-ci nécessitent une prise médicamenteuse à vie. En effet, malgré la diminution importante du risque de développer un cancer du foie, ces traitements ne permettent pas l'élimination définitive du virus. Les cellules infectées par HBV sont les hépatocytes du foie, qui remplissent la majorité des rôles vitaux de cet organe. La formation d'un minichromosome viral au sein de ces cellules infectées appelés ADNccc (pour ADN circulaire-covalemment-clos), est majoritairement responsable de la persistance du HBV. Les traitements actuels utilisés sont principalement des analogues de nucléos(t)ides et ceux-ci n'ont pas ou peu d'effets sur l'ADNccc. La nécessité de développer de nouvelles stratégies antivirales visant à éliminer définitivement HBV a donc conduit de nombreux laboratoires, dont le nôtre, à étudier l'utilisation de stratégies immuno-thérapeutiques incluant des stimulateurs de l'immunité innée (agonistes de TLR7, TLR8, RIG-1.) dans le cadre d'infections chroniques. De nombreuses études ont démontré que l'utilisation de ligands stimulant les récepteurs de l'immunité innée promouvait un fort effet antiviral, médié par la production endogène et locale de cytokines pro-inflammatoires et l'induction de gènes régulés par l'interféron (1SG). Dans ce but, nous nous sommes intéressés plus particulièrement aux potentiels effets antiviraux de l'agonisation des senseurs de l'immunité innée les plus connus, les Toll-like récepteurs (TLR), dans le cadre de l'infection par HBV dans les cellules hépatiques. La stratégie immuno-thérapeutique envisagée, vise à stimuler aussi bien les cellules immunitaires que les hépatocytes infectés. La caractérisation de l'expression de différents senseurs de l'immunité innée, d'une part dans les cellules primaires isolées du foie et d'autre part dans certaines lignées cellulaires correspondantes, nous a permis d'avoir une vue d'ensemble 1) des récepteurs exprimés par les différentes cellules du foie notamment dans les hépatocytes (TLR2/TLR3/TLR4/TLR5) ; 2) d'évaluer la fonctionnalité de ceux-ci pour la production de cytokines (IL-6 ; IP-10) lors de leur agonisation 3) d'évaluer les modèles disponibles parmi les lignées cellulaires les plus proches immunologiquement des cellules hépatiques. Les cellules HepaRG et une nouvelle lignée dérivée des macrophages du foie les iKC par exemple sont plus proches respectivement des hépatocytes et des macrophages primaires hépatiques et sont donc des modèles relevant pour les études immuno-thérapeutiques. L'utilisation de ligands de TLR2 et TLR3 sur des hépatocytes infectés chroniquement par HBV, a montré le plus fort effet antiviral (incluant une médiation par la sécrétion de cytokines et l'induction d'1SG) aussi bien sur la réplication d'HBV que sur l'ADNccc. De plus, cet effet semble stable au cours du temps sans résurgence massive de productions virales. Cette stratégie cible non seulement les hépatocytes infectés, mais également les cellules immunitaires dont les productions cytokiniques ont également un fort effet antiviral. Bien que l'effet in vivo, dans un modèle murin, ait été plus modeste, un ajustement des doses d'agonistes utilisées ainsi qu'un meilleur moyen de délivrance au foie de ligands de TLR2 ou TLR3 pourraient être une stratégie immuno-thérapeutique intéressante. Enfin nous nous sommes intéressés au cas particulier de l'agonisation du TLR9 en présence d'HBV… [etc] / HBV chronically infects 240 million peoples around the world. HBV chronic infection is a major public health problem and can lead to cirrhosis or/and hepatocarcinoma (HCC). Even if some efficient treatments are already available, based in particular on the use of nucleos(t)ides analogues that induce a decrease of viral load in patients, these drugs do not lead to a definitive HBV cure They enable an important decrease of liver cancer risk but need to be taken life-long. HBV infects hepatocytes the major liver cells which are involve in many vital mechanisms into the organism. The HBV minichromosome, which is formed into infected cells also called cccDNA (i.e., covalently-closed-circular DNA), is not affected by nucleos(t)ides treatments and thus is responsible for HBV persistence. The use of immune receptors (e.g. Toll-like receptors/TLR) agonists can lead to 1) an important cytokines/interferon (IFN) secretion; 2) promote immune cells activation/recruitment and 3) induction of many Interferon-Stimulated Genes (ISG). These mechanisms could lead to a greater viral clearance by cccDNA degradation or silencing. The need for new strategies to permanently eliminate HBV infection led many laboratories, including ours, to explore the use of immunotherapeutic treatments in a context of chronic infection, including innate immune stimulators (e.g. TLR7, TLR8 or RIG-I agonist are under clinical trials). To this end, we got interested on the potential anti-HBV effects of many TLR agonists in liver cells. Our strategy is to stimulate both infected hepatocytes and immune cells. We first characterized the expression of innate immune sensors in primary liver cells as well as in some liver cell lines. This allowed us to: 1) identify which sensors are expressed by liver cells, especially in hepatocytes (TLR2, TLR3, TLR4, TLR5); 2) evaluate their ability to produce cytokines (IL-6, IP-10) upon agonisation; 3) evaluation of cell lines model which are immunologically closed to the primary liver cells. HepaRG and a new liver macrophage cell line call iKC are immunologically close to their primary cells and appear to be relevant models for immune-therapeutics studies. The use of TLR2 and TLR3 agonists on HBV chronically infected hepatocytes showed a strong antiviral effect (i.e., decrease of HBV replication and cccDNA level) mediated directly by NF- kB-inducible and ISG genes activation and indirectly by cytokines secretion. Furthermore, this effect was shown stable over time without any viral replication rebound. This strategy targets not only infected hepatocytes but also immune cells, whose cytokines production also has a strong antiviral effect. Despite a weak in vivo effect in mice, a tuning in agonist doses used and better liver delivery could be an interesting immune-therapeutic strategy. Finally, we were investigated the particular case of TLR9 agonisation in presence of HBV. We showed an interaction between synthetic or not DNA ligands such as CpG ODN and HBV particles. This interaction leads in one hand, to HBV entry inhibition in hepatocytes, on the other hand, to a blockage of ligand delivery to TLR9 in pDC, which is not due to an inhibition of the TLR9 pathway, but to a lack of access of the ligand to its receptor. These two mechanisms are responsible for a decrease of viral infection during its establishment and a decrease in IFN synthesis by pDC, respectively. A decrease in IFN production, which this time was linked to a bona fide inhibition of the TLR9 pathway, in the presence of the sub-viral particles HBsAg was still observed, without retention of TLR9 ligand of the latter. It would seem, therefore, that use of TLR agonists represent an interesting strategy in setting up new anti-HBV immune-therapeutic approaches. However, their improvement will depend on the evaluation of viro-induced inhibitory mechanisms as well as better ways of in vivo delivering these ligands

Submitted by PRISCILA DALMAGRO null (pridmagro@gmail.com) on 2016-02-04T21:39:33Z No. of bitstreams: 1 TESE DE DOUTORADO PRISCILA DALMAGRO - FMVA.pdf: 1395003 bytes, checksum: 7cf46631afb2b9992d84269869e9aa10 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-02-05T12:33:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dalmagro_p_dr_araca.pdf: 1395003 bytes, checksum: 7cf46631afb2b9992d84269869e9aa10 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-05T12:33:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dalmagro_p_dr_araca.pdf: 1395003 bytes, checksum: 7cf46631afb2b9992d84269869e9aa10 (MD5) Previous issue date: 2016-02-01 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A resposta imune inata é a principal responsável pela defesa do hospedeiro contra endotoxinas de bactérias Gram-negativas. Tal resposta se dá através dos receptores Toll-like-4 e -2, seja pela via MyD88–dependente, TRIF-dependente ou ambas. Entretanto, uma resposta exagerada pode resultar em muitos danos para o organismo e levar até mesmo ao choque séptico. Uma das formas de controle desta resposta se dá através da tolerância à endotoxina (TE). Por isso o presentes estudo tem por objetivo investigar a indução diferencial dos receptores TLR-4 e 2, suas vias de sinalização MyD88 e TRIF-dependentes e avaliar outros possíveis genes relacionados a estas vias após indução da TE. Foi coletado sangue total de cavalos saudáveis (n=6), o qual foram estimulados com diferentes doses (0, 1 ou 10ng de LSP/mL) LPS de E.coli no momento 0 e 4 horas após o primeiro estímulo e 4 horas após o segundo estímulo. O “pool” (n=6) de RNA das amostras, coletado 0, 2, 4 e 8 horas, foi utilizado para a transcrição do cDNA. A hibridização do cDNA marcado com Cy-3 foi realizada em uma lâmina 4x44 contendo sequências específicas da espécie equina. Foi identificado durante a TE, nas diferentes doses de LPS, um aumento de transcritos dos receptores TLR-4 e -2, TNFAIP3 e IL-10 e uma diminuição de outros transcritos de genes importantes, tais como: MyD88, IL1-B, TNF-a, TRAM2, o que caracteriza e esclarece, de certa forma, as alterações na sinalização do TLR nas condições de tolerância à endotoxina. / The innate immune response is the main responsible for the host's defense against endotoxins from Gram-negative bacteria. Such response occurs via Toll-like-4 and -2 receptors, MyD88–dependent pathway, TRIF-dependent pathway or both. However, an exaggerated reponse can induce many damages to the organism, including septic shock. One way to control this exacerbated response is through endotoxin tolerance (ET). The goals of the present study were to investigate TLR-4 and 2 receptors, their signaling through MyD88 e TRIF-dependent pathways and evaluate other possible genes related to this ways after ET induction. Blood samples were collected from healthy horses (n=6) which were stimulated with different doses (0, 1 or 10ng of LSP/mL) of LPS from E.coli, for 0 and 4 hours after the first stimulus and 4 hours after second stimulus. The pool (n=6) of RNA, extracted from the samples collected at 0, 2, 4 e 8 hours, was used for the transcription of the cDNA. The hybridization of the cDNA marked with Cy-3 was done in one slide 4x44 containing specific sequences from the equine species. We identified during the ET, on the different doses of LPS, an increase of transcripts for the receptors TLR-4 and -2, TNFAIP3 and Il-10 and a reduction of transcripts of other important genes, such as: MyD88, IL1-B, TNF-a, TRAM2, what characterizes and enlightens the changes in TLR signaling during endotoxin tolerance. / FAPESP: 2010/34567-8

Introdução: Um dos primeiros sistemas de defesa contra os microrganismos é a via dos receptores Toll-like (TLRs). A ativação destes receptores leva à síntese de citocinas, dando início à resposta imune inata. Em modelos animais, o TLR2, TLR4 e TLR9 parecem estar relacionados com o reconhecimento de antígenos de Leishmania. A relação entre TLRs e leishmânia pode ser um mecanismo chave no desenvolvimento da doença ou no controle da mesma. Até o momento não existem estudos de TLRs na leishmaniose cutânea humana. Objetivo: Determinar o padrão de expressão e as células associadas com o TLR2, TLR4 e TLR9 na leishmaniose cutânea. O objetivo secundário é correlacionar a quantidade de TLRs com a quantidade de citocinas e células inflamatórias na pele. Métodos: Cem biópsias de pacientes com leishmaniose cutânea causadas por Leishmania (V.) braziliensis foram selecionadas inicialmente. Apenas os casos confirmados (presença de amastigotas no raspado, teste de Montenegro positivo, imunoistoquímica com presença de antígenos de Leishmania e reação em cadeia da polimerase com DNA de Leishmania (V.) braziliensis foram incluídos. Um grupo controle de pele normal foi incluído para comparação (quatro casos). A expressão de TLR2, TLR4 e TLR9 foi determinada por técnica imunoistoquímica, da mesma forma que os fenótipos celulares (células NK, macrófagos, células dendríticas, células CD4 e CD8) e citocinas (IL-1, IL-6, IL-12, TNF-alfa, IFN-gama). Dupla-marcação foi realizada para identificar as células que expressaram os TLRs analisados. Análise semi-quantitativa foi utilizada para avaliação da expressão de TLRs na epiderme, enquanto na derme foi realizada análise quantitativa. O nível de significância foi estabelecido com p<0,05. Resultados: Doze casos preencheram os critérios de inclusão. Os pacientes eram todos masculinos, com lesões apenas em membros inferiores e mediana de idade de 23 anos [16-47]. A expressão de TLR2, TLR4 e TLR9 na epiderme da pele normal foi alta. Quando comparados com pele normal, tanto TLR4 quanto TLR2 mostraram menor expressão no epitélio dos pacientes com leishmaniose e não houve expressão de TLR9. A média de células expressando TLR2 na derme foi de 136,36±82,46 células/mm2, ao passo que a média de células expressando TLR4 foi de 3,21±4,11 células/mm2. A contagem de TLR9 foi de 86,15±88,36 células/mm2 predominando em áreas de formação de granulomas. A regressão linear não demonstrou relação entre a contagem de células marcadas ou citocinas com TLR2 ou TLR4. O aumento proporcional da expressão de TLR9 relacionou-se com maior expressão de IL-12 e IL-4 (p < 0,05). A dupla marcação demonstrou que os macrófagos expressaram TLR2. A dupla marcação não mostrou expressão de TLR2 nas células dendríticas e nas células NK. Conclusão: A leishmaniose cutânea localizada associa-se com a presença de TLR2, TLR4 e TLR9. No epitélio a expressão de TLR2 e TLR4 em pacientes com leishmaniose está diminuída em relação aos pacientes controles. A expressão do TLR2 na derme é estatisticamente maior que a de TLR4 e TLR9, a qual é expressa pelos macrófagos. A expressão de TLR9 ocorre principalmente nas áreas de granulomas havendo relação com a expressão de IL-12 e IL-4 / Introduction: One of the first systems of defense against microorganisms is the Toll-like receptors (TLRs) pathway. The activation of these receptors promotes the cytokine synthesis, initiating the innate immune response. In animal models, TLR2, TLR4 and TLR9 appear to be related to the recognition of antigens of Leishmania. The relationship between TLRs and Leishmania can be a key mechanism in the development of the disease or it control. Until now, there are not studies about TLRs in human cutaneous leishmaniasis. Objective: To determine the expression pattern and the cells associated with TLR2, TLR4 and TLR9 in cutaneous leishmaniasis. The secondary objective is to correlate the amount of TLRs with the amount of cytokines and inflammatory cells. Methods: One hundred biopsies from patients with cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania (V.) braziliensis were initially selected. Only confirmed cases of cutaneous leishmaniasis were included in the analysis (presence of amastigotes in the scraping, positive Montenegro test, immunohistochemistry with the presence of Leishmania antigens and polymerase chain reaction with DNA from Leishmania (V.) braziliensis. A control group (4 cases) of normal skin was included for comparison. The expression of TLR2, TLR4 and TLR9 was determined by immunohistochemistry, as well as cell phenotypes (NK cells, macrophages, dendritic cells, CD4 and CD8) and cytokines (IL-1, IL-6, IL-12, TNF-alpha, IFN-gamma). Double-staining was used to determine the cells expressing TLRs. Semi-quantitative analysis was used for evaluation of the expression of TLRs in the epidermis. Quantitative analysis was performed to evaluate the expression in the dermis. The level of significance was defined as p <0.05. Results: 12 cases fulfilled inclusion criteria. The patients were all male, with lesions in lower limbs and median age of 23 years [16-47]. The expression of TLR2 and TLR4 in the epidermis of normal skin was high. When compared with normal skin, TLR2 and TLR4 showed lower expression in the epidermis. There was no expression of TLR9 in the epidermis in cases of cutaneous leishmaniasis and normal skin. The mean number of cells expressing TLR2 in the dermis was 136.36±82.46 cells/mm2, while the average of cells expressing TLR4 was 3.21±4.11 cells/mm2. The count of TLR9 was 86.15±88.36 cells/mm2, and it was found mainly in the areas of granuloma formation. Linear regression showed no relationship between the number of labeled cells or cytokines with TLR2 or TLR4. There was an association between TLR9 and two cytokines (IL-12 and IL-4). This correlation suggested that the proportional increase in the expression of TLR9 was related to greater expression of IL-12 and IL-4 (p<0.05). The double staining showed that macrophages and endothelial cells expressed TLR2. The double staining showed no expression of TLR2 in dendritic cells and NK cells. Conclusion: The localized cutaneous leishmaniasis associated with the presence of TLR2, TLR4 and TLR9. The expression of TLR2 in the dermis was statistically greater than that of TLR4 and TLR9, which is expressed by macrophages. The expression of TLR9 occurs primarily in the areas of granulomas was associated with the expression of IL-12 and IL-4

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:36:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1875030 bytes, checksum: 2c2c1497d43bb10ad7e10f009f941c57 (MD5) Previous issue date: 2006-02-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Geminiviruses constitute a large group of plant virus whose genome is packed as single-stranded DNA circles in a small, twinned isometric particle and is converted to double- stranded forms in nuclei of differentiated plant cells. Members of the genus Begomovirus, such as Cabbage leaf curl virus (CaLCuV), possess two genomic components, DNA-A and DNA-B. The DNA-A has the potential to code for five gene products (AV1, AC1, AC2, AC3, AC4) and is involved in replication, transcriptional activation of viral genes and encapsidation of the viral genome. The DNA-B encodes two movement proteins, the movement protein MP (BC1) and the nuclear shuttle protein NSP (BV1), both required for systemic infection. NSP shuttles the viral DNA between the nucleus and the cytoplasm and then acts cooperatively with MP to move the viral DNA cell-to-cell across the wall. The localization of NSP and its proposed role in cell-to-cell movement of the viral DNA predict that interactions with host factors may occur in both the cytoplasm and the nucleus. In fact, NSP has been demonstrated to interact with a plasma membrane receptor protein, designated NIK, and a nuclear acetyltransferase. A proline-rich extensin-like receptor protein kinase (PERK) was found to interact specifically with NSP of CaLCuV and of tomato-infecting geminiviruses, through yeast two-hybrid screening. The PERK-like protein, which we designated NsAK (NSP-associated kinase), is structurally organized into a proline-rich N-terminal domain followed by a transmembrane segment and a C-terminal serine/threonine kinase domain. The viral protein interacted stably with defective versions of the NsAK kinase domain but not with the potentially active enzyme in an in vitro binding assay. In vitro translated NsAK enhanced the phosphorylation level of NSP, indicating that NSP functions as substrate for NsAK. These results demonstrated that NsAK is an authentic serine/threonine kinase and suggested a functional link for the NSP-NsAK complex formation. This interpretation was corroborated by in vivo infectivity assays showing that loss of NsAK function delays the onset of CaLCuV infection and attenuates symptom development. Our data implicate NsAK as a positive contributor to geminivirus infection and suggest it may regulate NSP function. / Geminivírus constitui um grande grupo de vírus de planta, cujo genoma é empacotado na forma de DNA circular fita simples em partículas icosaédricas geminadas e é convertido em uma forma fita dupla no núcleo de células diferenciadas de plantas. A maioria dos membros do gênero Begomovirus, como o Cabbage leaf curl vírus (CaLCuV), possuem dois componentes genômicos, DNA-A e DNA-B. O DNA-A apresenta o potencial para codificar cinco produtos gênicos (AV1, AC1, AC2, AC3, AC4) e está envolvido na replicação, ativação transcricional de genes virais e encapsidação do genoma viral. O DNA-B codifica duas proteínas de movimento, Movement Protein MP (BC1) e Nuclear Shuttle Protein NSP (BV1), ambas requeridas para o estabelecimento de uma infecção sistêmica. NSP transporta o DNA viral entre o núcleo e o citoplasma e então atua cooperativamente com MP para transportar o DNA viral de célula-a-célula através da parede celular. A localização de NSP e seu papel proposto no movimento célula- a-célula do DNA viral predizem que podem ocorrer interações com fatores do hospedeiro tanto no citoplasma quanto no núcleo. De fato, foi demonstrado que NSP interage com uma proteína receptora da membrana plasmática, designada NIK, e uma acetiltransferase nuclear. Através de ensaio de duplo híbrido, foi identificada, uma PERK quinase ( proline-rich extensin-like receptor protein kinase ) de Arabidopsis thaliana que interage especificamente com NSP de CaLCuV e, também de geminivírus que infectam tomate, a qual foi designada NsAK ( NSP-associated kinase ) e é estruturalmente organizada em um domínio N-terminal rico em prolina seguido de um segmento transmembrana e de um domínio C-terminal de serina/treonina quinase. A proteína viral interagiu estavelmente com versões defectivas do domínio de quinase de NsAK, mas não com a enzima potencialmente ativa em um ensaio de ligação in vitro. NsAK traduzida in vitro aumentou o nível de fosforilação de NSP, indicando que NSP atua como substrato de NsAK. Estes resultados demonstram que NsAK é uma autêntica serina/treonina quinase e sugerem elo funcional para a formação do complexo NSP-NsAK. Esta interpretação foi corroborada por ensaios de infectividade in vivo, demonstrando que a perda de função de NsAK reduz a eficiência da infecção por CaLCuV e atenua o desenvolvimento dos sintomas. Estes dados implicam NsAK como um contribuidor positivo para a infecção por geminivírus e sugerem que NsAK pode regular a função de NSP.

O gênero Pestivirus, pertencente à família Flaviviridae, é constituído por espécies virais de importância na saúde animal no mundo todo, as quais podem afetar a economia dos países de forma impactante. São reconhecidas quatro espécies pelo Comitê Internacional de Taxonomia Viral (ICTV): vírus da peste suína clássica (Classical Swine Fever Virus – CSFV), vírus da doença da fronteira (Border Disease Virus- BDV), vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (Bovine Viral Diarrhea Virus 1- BVDV-1) e 2 (BVDV-2). Algumas das espécies deste gênero- CSFV e BVDV- são de notificação obrigatória na Organização Mundial de Saúde Animal (OIE), causando sanções econômicas importantes quando presentes. Recentemente, possíveis novas espécies vêm sendo caracterizadas, porém ainda não foram reconhecidas como espécies do gênero Pestivirus. Com o objetivo de gerar mais informações acerca da diversidade genética de pestivírus no país, o presente trabalho descreve os genomas completos e a caracterização genômica e filogenética de uma cepa de BVDV-1 subtipo i e duas de vírus ‘HoBi’-like. Os genomas completos foram obtidos através de sequenciamento de nova geração; as anotações, predição da poliproteína viral e dos sítios de clivagem foram feitos através do software Geneious, e a análise filogenética foi realizada através do software MEGA 6. O BVDV-1 subtipo i foi pela primeira vez isolado no Brasil, sendo também a primeira descrição de genoma completo deste subtipo de BVDV. Também foi descrito o genoma completo de duas cepas de vírus ‘HoBi’-like isolados no Brasil, além da caracterização de outras cepas de ‘HoBi’-like disponíveis em bancos de dados. Os dados moleculares destes isolados foram comparados com aqueles das demais espécies do gênero Pestivirus, e estas informações deverão auxiliar na futura classificação deste como espécie. Os resultados apresentados na dissertação adicionam conhecimento sobre a diversidade genética de BVDV-1 no Brasil além de informações acerca do vírus ‘HoBi’-like, reforçando esta espécie ainda não reconhecida como um novo membro do gênero Pestivirus, os ‘HoBi’-like vírus. / The genus Pestivirus, within the family Flaviviridae, includes species that are important pathogens affecting animal health that can cause impacting losses in the economy worldwide. According to the International Committee on Taxonomy of Virus (ICTV), there are four recognized species in this genus: Classical swine fever virus (CSFV), Bovine Viral Diarrhea Virus1 and 2 (BVDV -1, BVDV-2), and Border disease virus (BDV). Some of the species within this genus - CSFV and BVDV- are notifiable to the World Organization for Animal Health (OIE), and can cause exportation barriers or sanctions. Other putative new species have been characterized recently, but remain officially unrecognized. In order to generate data about the genetic diversity of pestivirus in Brazil, this study describes complete genomes and the genomic and phylogenetic characterization of an isolate of BVDV-1i and two isolates of ‘HoBi’-like virus. Complete genomes were sequenced through Next Generation Sequencing; genome annotations, polyprotein prediction and identification of cleavage sites were performed with software Geneious, and phylogenetic analysis with software MEGA 6. BVDV-1 subtype i was found in Brazil for the first time, and this is the first complete genome ever characterized for this subtype. Two strains of ‘HoBi-like’ virus isolated in Brazil were also described and characterized together with other ‘HoBi’-like strains available in databases. The molecular data obtained for these isolates were compared to those of other Pestivirus species. These data can help in future classification of these ‘HoBi’-like strains as a new recognized species. The knowledge on genetic diversity and the characterization of pestiviruses can contribute with surveillance programs and with appropriate animal health measures to control these viral diseases.

Dentre os fatores contribuintes para o desenvolvimento do câncer de mama estão o sedentarismo, a alta ingesta calórica, o sobrepeso e a obesidade, entre outros. O objetivo do presente estudo foi avaliar a relação entre os níveis séricos de IGF-1, IGFBP3, insulina e leptina com fatores prognósticos clínicos e patológicos do câncer de mama. Foi realizado um estudo transversal com 77 pacientes com diagnóstico recente de câncer de mama e indicação de quimioterapia, atendidas no Hospital Fêmina, em Porto Alegre, de agosto de 2009 a setembro de 2010. Foram coletados dados antropométricos e revisados os prontuários para a obtenção de dados clínicos e anátomo-patológicos. Foi realizada uma coleta de sangue antes da administração do primeiro ciclo de quimioterapia, para realizar dosagens de IGF-1, IGFBP3, insulina e leptina. Os níveis de IGFBP3 foram maiores em pacientes cujos tumores expressavam receptores hormonais, em comparação àquelas cujos tumores não expressavam tais receptores (p=0,004 e p=0,005, respectivamente). Não houve diferenças nos níveis de IGF-1 e IGFBP3 em relação às classes do índice de massa corporal (IMC). Houve correlação positiva entre níveis de insulina e leptina com IMC. Houve correlação negativa entre níveis de IGF-1 e relação cintura-quadril (RCQ) (correlação de Pearson = - 0,348; p=0,007). Houve correlação positiva entre níveis de insulina e leptina com circunferências abdominal, umbilical, da cintura e do quadril. Neste estudo, foram encontradas correlações positivas entre os níveis de fatores de crescimento e leptina com medidas antropométricas em pacientes com câncer de mama, sugerindo um papel de tais fatores no sobrepeso e na obesidade. Níveis mais elevados de IGFBP3 em pacientes com expressão de receptores hormonais no tumor sugerem que o estado hormonal possa contribuir para o comportamento deste fator de crescimento e de sua cascata, embora ainda não se conheça o significado clínico de tal associação. / Introduction: There is growing evidence that sedentary lifestyle, high caloric intake, overweight, obesity and its related growth factors have an important role in the risk of developing breast cancer. Objectives: to evaluate the relation among serum levels of insulin, IGF-1, IGFBP3, leptin and VEGF with clinical and pathologic breast cancer prognostic factors. Material and methods: a transversal study was performed at a public hospital in Southern Brazil, from August 2009 to September 2010. Body composition measurements were performed, pathologic review of specimens were done and blood samples were taken before chemotherapy to evaluate insulin, IGF-1, IGFBP3 and leptin. Results: 77 patients entered the study. There were higher levels of IGFBP3 in ER-positive and PR-positive tumors when compared to those ER-negative and PR-negative (p=0.004 and p=0.005, respectively). There were no differences in the levels of IGF-1 and IGFBP3 according to BMI classification. There was a positive correlation of insulin and leptin levels with BMI classification. There was a negative correlation of IGF-1 levels and waist-to-hip (WTH) ratio (Pearson’s correlation= - 0.348; p=0.007). There was a positive correlation of insulin and leptin levels with waist, hip, abdominal and umbilical circumferences. Conclusion: we found positive correlations of growth factors and leptin with anthropometric measurements in patients with breast cancer, suggesting a role of these factors in overweight and obese patients. Higher levels of IGFBP3 were found in patients with hormone receptor-positive breast cancer when compared with those with no expression of hormone receptors. Although we need further research on the clinical significance of this finding, we suggest that hormonal status may contribute to the behavior of IGFBP3 and its pathways.

Um papel importante foi atribuído ao receptor toll-like 4 (TLR4) no desenvolvimento da placa aterosclerótica. O TLR4 foi primeiramente descrito como um receptor para bactérias gram-negativas; posteriormente foi demonstrado que sua expressão está aumentada em placas ateroscleróticas e que pacientes que possuem um polimorfismo disfuncional do TLR4 são menos suscetíveis ao desenvolvimento dessa doença. Portanto, o objetivo desse estudo foi o de investigar, em um modelo experimental de aterosclerose, a influência da deleção do TLR4 na formação e morfologia da placa aterosclerótica, no perfil lipídico e em marcadores inflamatórios. Camundongos duplo knockout (DKO), deficientes no receptor de LDL e TLR4, foram gerados cruzando-se camundongos deficientes para o receptor de LDL (LDLrKO) com camundongos deficientes para o TLR4 (TLR4KO). Todos os grupos receberam dieta rica em gordura e colesterol por 12 semanas. As concentrações plasmáticas de colesterol e triglicérides foram medidas por ensaio colorimétrico. Cortes seriados da raiz aórtica foram corados com Oil red O e as áreas de lesão quantificadas por analisador de imagens. O colágeno foi medido por coloração de picrossirius. A formação de nitrotirosina e expressão de CD40L, MMP9 e iNOS nas placas foram feitas por imunohistoquímica. As comparações foram feitas por ANOVA com pós teste de Student Newman-Keuls. Os dados foram expressos como média ± EPM. Camundongos DKO desenvolveram placas menores que camundongos LDLrKO (117.6 ±1.4 vs 198.8 ± 3.3 104m2). Camundongos TLR4KO não formaram placa. As placas dos camundongos DKO apresentaram menor núcleo lipídico que as dos LDLrKO (76.2± 13.2 vs 161.7 ± 2.9 104m2). O colágeno ao redor do núcleo lipídico é maior nos camundongos DKO do que nos LDLrKO (24.9 ± 1.8 vs 16.5 ± 2.5 % da placa). A distribuição do colágeno nos camundongos DKO ocorre principalmente ao redor da placa, de forma mais organizada, enquanto que nos LDLrKO onde sua distribuição é mais difusa. As placas dos camundongos DKO apresentaram menor expressão de CD40L e iNOS do que as dos LDLrKO (13.1 ± 0.7 vs 18.5 ± 2.5 AU e 7.7 ± 0.9 vs 10.2 ± 0.4 AU, respectivamente). A expressão de MMP9 foi menor nas placas dos camundongos DKO do que as dos LDLrKO (2.99 ± 0.3 vs 1.99 ± 0.2 AU). A marcação para nitrotirosina foi maior nos camundongos LDLrKO quando comparada com as dos grupos DKO e TLR4KO (142.89 ± 208.5, 77.16 ± 227.7 e 71.73 ± 95.9 10m2, respectivamente). Todos esses resultados sugerem que o processo inflamatório é menor na ausência do TLR4. As concentrações plasmáticas de colesterol não foram diferentes entre os grupos LDLrKO e DKO mas os camundongos LDLrKO apresentaram concentrações plasmáticas de triglicérides maiores do que os camundongos DKO após a dieta (265.2 ± 27.6 vs 150.5 ± 8.8 mg/dL). O receptor toll-like 4 influencia na estrutura e formação da placa aterosclerótica independentemente dos níveis séricos de colesterol / A crucial role has been suggested for toll-like receptor 4 (TLR4) in atherosclerotic plaque formation and development. TLR4 was described primarily, as a receptor for gram-negative bacteria lipopolisacharide; later it was showed that its expression is increased in atherosclerotic plaques and patients that carries a TLR4 dysfunctional polymorphism are less susceptible to development of this disease. Therefore, the aim of this study was to investigate, in an experimental model of atherosclerosis, the influence of TLR4 deletion in atherosclerotic plaque formation and morphology, cholesterol profile and inflammatory markers. Double knockout mice (DKO), deficient in LDL receptor and TLR4, were generated by breeding LDL receptor knockout mice (LDLrKO) with TLR4 knockout mice (TLR4KO). All three experimental groups, LDLrKO, TLR4KO and DKO were fed a high fat-cholesterol diet for 12 weeks. Plasma cholesterol and triacylglicerol concentrations were measured by colorimetric assay. Cross sections of aortic sinus were stained with Oil red O and lesion areas were quantified by an image analyzer. Collagen content was measured by picrossirius staining. We also measured nitrotyrosine formation, CD40L, MMP9 and iNOS expression by immunohistochemistry. Comparisons were made by ANOVA followed by Student-Newman-Keuls post- test. Data are mean ± SEM. DKO mice developed smaller plaques than LDLrKO mice (117.6 ±1.4 vs 198.8 ± 3.3 104m2). TLR4KO mice developed no plaque. Plaques from DKO mice have also a smaller lipid core than the ones from LDLrKO mice (76.2± 13.2 vs 161.7 ± 2.9 104m2). Collagen content around the lipid core is higher in DKO mice compared to LDLrKO mice (24.9 ± 1.8 vs 16.5 ± 2.5 % of the whole plaque). Interestingly, collagen distribution in DKO mice seems to occur mainly on the plaque periphery, in a more organized manner, while in LDLrKO mice it is fuzzier, being present also inside the plaque. Plaques from DKO present lower expression of CD40L and iNOS than LDLrKO mice (13.1 ± 0.7 vs 18.5 ± 2.5 AU and 7.7 ± 0.9 vs 10.2 ± 0.4 AU, respectively). MMP9 expression is lower in DKO mice as compared to LDLrKO mice (2.99 ± 0.3 vs 1.99 ± 0.2 AU). Nitrotyrosine staining was higher in LDLrKO mice as compared to DKO and TLR4KO groups (142. 89 ± 208.5, 77.16 ± 227.7 and 71.73 ± 95.9 10m2, respectively). All together, these findings suggest that inflammatory process is milder in the absence of TLR4. Serum cholesterol were not different between LDLrKO and DKO mice but LDLrKO presented higher triacylglicerol serum levels after 12 weeks on high fat high cholesterol diet as compared to DKO mice (265.2 ± 27.6 vs 150.5 ± 8.8). Toll like receptor 4 influences atherosclerotic plaque formation and structure independently from serum cholesterol levels

Os fibroblastos são atualmente considerados componentes ativos da resposta imune porque estas células expressam receptores do tipo Toll (TLRs), são capazes de reconhecer padrões moleculares associados a patógenos e mediar a produção de citocinas e quimiocinas durante a inflamação. A resposta imune inata do hospedeiro a lipopolissacarídeos (LPS) de Porphyromonas gingivalis é incomum, já que diferentes estudos relataram que este LPS pode ser um agonista para TLR2 e um antagonista ou agonista para TLR4. A sinalização por TLRs envolve proteínas adaptadoras, como MyD88 e TRAM, que são necessárias para a transdução do sinal até o núcleo para que ocorra a transcrição de RNAm para os mediadores da inflamação. O objetivo deste estudo foi investigar e comparar se a sinalização por meio de TLR2 ou TLR4 poderia afetar a produção de Interleucina (IL)-6, IL-8 e CXCL12 em fibroblastos humanos gengivais (HGF) e fibroblastos humanos de ligamento periodontal (HPLF). Objetivamos também comparar a participação das moléculas adaptadoras MyD88 e TRAM na expressão do RNAm dos mesmos alvos. Material e Métodos: Após silenciamento mediado por RNA de interferência de TLR2, TLR4, MyD88 ou TRAM, confirmado por RT-qPCR, HGF e HPLF, provenientes de três dadores voluntários, foram estimulados com LPS de Porphyromonas gingivalis ou com dois agonistas sintéticos de TLR2, Pam2CSK4 e Pam3CSK4, por 6 horas. A expressão do RNAm e das proteínas IL-6, IL-8, e CXCL12 foram avaliados por qRT-PCR e ELISA, respectivamente. Resultados: A expressão do RNAm de TLR2 foi regulada em HGF, mas não em HPLF por todos os estímulos. O silenciamento de TLR2 diminuiu IL-6 e IL-8 em resposta ao LPS de P. gingivalis, Pam2CSK4 e Pam3CSK4 de maneira semelhante, em ambas as subpopulações de fibroblastos (p<0,05). Por outro lado, a produção de CXCL12 permaneceu inalterada pelo silenciamento de TLR2 ou TLR4. No caso do silenciamento de MyD88 e TRAM, em ambos os subtipos de fibroblastos, o RNAm para os mesmos alvos também teve sua expressão diminuída (p<0,05). Já a expressão constitutiva de CXCL12 foi aumentada com o silenciamento de MyD88 ou TRAM (p<0,05). Conclusão: Estes resultados sugerem que a sinalização por meio de TLR2, por fibroblastos, as células residentes mais numerosas em gengiva e ligamento periodontal, pode controlar a produção de IL-6 e IL-8, que por sua vez contribuem para a patogênese periodontal, mas não interfere nos níveis de CXCL12, uma quimiocina importante no processo de reparação. Concluímos também que o silenciamento de MyD88 ou TRAM é capaz de diminuir o aumento da transcrição gênica de IL-6 e IL-8 provocado por LPS de P. gingivalis, embora a expressão constitutiva de CXCL12 seja regulada positivamente. / Fibroblasts are now seen as active components of the immune response because these cells express Toll-like receptors (TLRs), recognize pathogen associated molecular patterns and mediate the production of cytokines and chemokines during inflammation. The innate host response to lipopolysaccharide (LPS) from Porphyromonas gingivalis is unusual in that different studies have reported that it can be an agonist for TLR2 and an antagonist or agonist for TLR4. TLRs signaling pathway involves adaptor proteins, like MyD88 and TRAM, which are crucial for signal transduction to the nucleus and mRNA expression of inflammatory mediators. This study investigated and compared whether signaling through TLR2 or TLR4 could affect the production of IL-6, IL-8 and CXCL12 in both human gingival fibroblasts (HGF) and human periodontal ligament fibroblasts (HPLF). The role of MyD88 and TRAM on the mRNA expression of the same targets were also evaluated. Methods: After small interfering RNA-mediated silencing of TLR2, TLR4, MyD88 or TRAM, confirmed by RT-qPCR, HGF and HPLF from three volunteer donors were stimulated with P. gingivalis LPS or with two synthetic ligands of TLR2, Pam2CSK4 and Pam3CSK4, for 6 hours. IL-6, IL-8, and CXCL12 mRNA expression and protein production were evaluated by RT-qPCR and ELISA, respectively. Results: TLR2 mRNA expression was upregulated in HGF but not in HPLF by all the stimuli applied. Knockdown of TLR2 decreased IL-6 and IL-8 in response to P. gingivalis LPS, Pam2CSK4 and Pam3CSK4 in a similar manner in both fibroblasts subpopulations. Conversely, CXCL12 remained unchanged by TLR2 or TLR4 silencing. For MyD88 or TRAM silencing, IL-6 and IL-8 mRNA were also decreased, in both fibroblasts subtypes. However CXCL12 mRNA constitutive expression was increased by siMyD88 or siTRAM. Conclusion: These results suggest that signaling through TLR2 by fibroblasts, the most numerous resident cells in gingiva and periodontal ligament, may control the production of IL-6 and IL-8, which in turn contribute to periodontal pathogenesis, but does not interfere with CXCL12 levels, an important chemokine in the repair process. Also, MyD88 or TRAM knockdown may decrease the IL-6 and IL-8 LPS-induced upregulation and increase the constitutive CXCL12 mRNA.

Dentre os fatores contribuintes para o desenvolvimento do câncer de mama estão o sedentarismo, a alta ingesta calórica, o sobrepeso e a obesidade, entre outros. O objetivo do presente estudo foi avaliar a relação entre os níveis séricos de IGF-1, IGFBP3, insulina e leptina com fatores prognósticos clínicos e patológicos do câncer de mama. Foi realizado um estudo transversal com 77 pacientes com diagnóstico recente de câncer de mama e indicação de quimioterapia, atendidas no Hospital Fêmina, em Porto Alegre, de agosto de 2009 a setembro de 2010. Foram coletados dados antropométricos e revisados os prontuários para a obtenção de dados clínicos e anátomo-patológicos. Foi realizada uma coleta de sangue antes da administração do primeiro ciclo de quimioterapia, para realizar dosagens de IGF-1, IGFBP3, insulina e leptina. Os níveis de IGFBP3 foram maiores em pacientes cujos tumores expressavam receptores hormonais, em comparação àquelas cujos tumores não expressavam tais receptores (p=0,004 e p=0,005, respectivamente). Não houve diferenças nos níveis de IGF-1 e IGFBP3 em relação às classes do índice de massa corporal (IMC). Houve correlação positiva entre níveis de insulina e leptina com IMC. Houve correlação negativa entre níveis de IGF-1 e relação cintura-quadril (RCQ) (correlação de Pearson = - 0,348; p=0,007). Houve correlação positiva entre níveis de insulina e leptina com circunferências abdominal, umbilical, da cintura e do quadril. Neste estudo, foram encontradas correlações positivas entre os níveis de fatores de crescimento e leptina com medidas antropométricas em pacientes com câncer de mama, sugerindo um papel de tais fatores no sobrepeso e na obesidade. Níveis mais elevados de IGFBP3 em pacientes com expressão de receptores hormonais no tumor sugerem que o estado hormonal possa contribuir para o comportamento deste fator de crescimento e de sua cascata, embora ainda não se conheça o significado clínico de tal associação. / Introduction: There is growing evidence that sedentary lifestyle, high caloric intake, overweight, obesity and its related growth factors have an important role in the risk of developing breast cancer. Objectives: to evaluate the relation among serum levels of insulin, IGF-1, IGFBP3, leptin and VEGF with clinical and pathologic breast cancer prognostic factors. Material and methods: a transversal study was performed at a public hospital in Southern Brazil, from August 2009 to September 2010. Body composition measurements were performed, pathologic review of specimens were done and blood samples were taken before chemotherapy to evaluate insulin, IGF-1, IGFBP3 and leptin. Results: 77 patients entered the study. There were higher levels of IGFBP3 in ER-positive and PR-positive tumors when compared to those ER-negative and PR-negative (p=0.004 and p=0.005, respectively). There were no differences in the levels of IGF-1 and IGFBP3 according to BMI classification. There was a positive correlation of insulin and leptin levels with BMI classification. There was a negative correlation of IGF-1 levels and waist-to-hip (WTH) ratio (Pearson’s correlation= - 0.348; p=0.007). There was a positive correlation of insulin and leptin levels with waist, hip, abdominal and umbilical circumferences. Conclusion: we found positive correlations of growth factors and leptin with anthropometric measurements in patients with breast cancer, suggesting a role of these factors in overweight and obese patients. Higher levels of IGFBP3 were found in patients with hormone receptor-positive breast cancer when compared with those with no expression of hormone receptors. Although we need further research on the clinical significance of this finding, we suggest that hormonal status may contribute to the behavior of IGFBP3 and its pathways.