A Copaifera langsdorffii é uma das plantas de incentivo governamental para pesquisas científicas e possui diversas atividades biológicas. Em especial, as atividades antitumoral e tripanocida foram abordadas neste estudo tendo o ácido caurenoico (AC) como marcador. Devido à escassa literatura sobre a extração do AC e à sua baixa solubilidade, sua extração foi estudada com solvente orgânico e por fluido supercrítico. A extração por fluido supercrítico é vantajosa já que não fornece extratos com resíduos de solventes orgânicos e é ecologicamente correta. Visto as atividades antitumoral e tripanocida do AC e estas atividades serem objeto de estudo nacional e mundial, o AC foi inserido em lipossomas convencionais e furtivos com a finalidade de torná-lo mais biodisponível, permitir seu alcance ao sítio-alvo e diminuir seus efeitos adversos. Assim, os objetivos deste trabalho foram segmentados em três vertentes: a) realizar o estudo e otimização da extração do ácido caurenoico a partir das folhas de C. langsdorffii, b) obter lipossomas convencionais, secá-los pelos métodos de secagem liofilização (FD), spray drying (SD) e spray freeze drying (SFD), comparar suas características físico-químicas e avaliar suas atividade antitumoral e tripanocida, c) obter lipossomas furtivos e avaliar sua seletividade tumoral. De maneira geral, os resultados das extrações sólido-líquido e por fluido supercrítico apresentaram boa seletividade e eficiência visto que foram capazes de fornecer extratos com aproximadamente 20% de AC. A extração por fluido supercrítico foi mais eficaz extraindo 26,2% de AC. Já os lipossomas convencionais secos por SD e SFD apresentaram-se mais semelhantes entre si quanto à propriedade de fluxo e morfologia, à interação do AC com os componentes da bicamada lipídica e à dissolução/ liberação que quando secos por FD. Os três métodos de secagem foram capazes de prolongar em seis meses a estabilidade do AC nos lipossomas quando comparado com a dispersão aquosa. Os lipossomas convencionais secos apresentaram citotoxicidade maior frente a células tumorais e menor frente a células normais quando carregados com o AC e comparados com os lipossomas convencionais vazios (sem AC). Foi possível sintetizar com sucesso o lipídeo ligado ao polietilenoglicol e ao ácido fólico com o intuito de preparar os lipossomas furtivos. Entretanto, estes lipossomas não apresentaram ação antitumoral seletiva quando comparados às células normais. / Copaifera langsdorffii is one of the Brazilian plants which receives governmental support for scientific researches and also presents several biological activities. The kaurenoic acid (KA) is a diterpenic acid constituent of this specie that presents, in special, antitumoral and tripanocide activities which were taken into account in this study. Due to the lack of KA extraction from C. langsdorffii leaves in the literature and to KA low solubility, its extraction was studied using solid-liquid and supercritical fluid extraction methods. The supercritical fluid extraction is advantageous since provides solvent-free extracts and is an environment friendly method. Since KA is antitumoral and tripanocide and both activities are subject of national and internacional studies, in this study, KA was added in conventional and stealth liposomes in order to increase its biodiponibility, to allow it reaching the target tissue and decrease its adverse effects. So, this work was divided in three segments: a) study and optimize the KA extraction from C. langsdorffii leaves by solid-liquid (SLE) and supercritical fluid (SFE) extraction methods, b) obtain conventional liposomes, dry them by freeze drying (FD), spray drying (SD) and spray freeze drying (SFD), compare their physico-chemical features and evaluate their antitumor and tripanocide activities, c) obtain stealth liposomes and evaluate their selective tumor activity. In a general way, the extraction methods result in high KA selective extraction by both SLE and SFE since they were able to extract nearly 20% of KA. The SFE was a bit more efficacious than SLE providing 26,2% of KA. Conventional liposomes dried by SD and SFD were more similar in fluidity and morphology, KA and liposome lipid compounds interaction and dissolution/ release than liposomes dried by FD. The three drying methods provided more stable liposomes than the aqueous solution liposomes. Dried conventional liposomes presented higher cytotoxicity to tumor cells and lower one to normal cells when loaded with KA than unloaded conventional liposomes. The lipid linked to poliethyleneglycol and to folic acid to prepare stealth liposomes were successfully synthesized. However, the stealth liposomes did not presented selective antitumor action in relation to normal cells.

A doença de Chagas causada pelo Trypanosoma cruzi representa um grave problema de saúde pública na América Latina e cada vez mais em todo o mundo, afetando principalmente regiões de baixo poder aquisitivo, e por isso negligenciada pela indústria farmacêutica. Atualmente apenas um fármaco está disponível, o benzonidazol, o qual apresenta eficácia limitada e está associado a diversos efeitos colaterais. Estudos recentes demonstraram atividade tripanocida do ácido ursólico, entretanto sua utilização é limitada pela alta hidrofobicidade, sendo o uso dos nanocarreadores lipossomais reconhecido como uma estratégia promissora para solucionar tal limitação, além de serem sistemas altamente versáteis e biocompatíveis. Neste trabalho, foram desenvolvidos lipossomas de fosfatidilcolina e colesterol contendo ácido ursólico pela técnica da evaporação do solvente e hidratação do filme lipídico seguida de sonicação, permitindo a obtenção de vesículas unilamelares e com baixa polidispersividade. A partir da avaliação preliminar da estabilidade das dispersões, a adição do colesterol na razão molar 10:1 fosfatidilcolina:colesterol foi essencial para a manutenção do conteúdo encapsulado quando a formulação foi estocada em temperatura ambiente e melhor retenção do conteúdo a 4°C (90%). Após a liofilização o emprego de sucrose na razão molar 1:10 lipídeo:açúcar, a formulação manteve o tamanho e distribuição de tamanho e impediu a agregação das vesículas. A formulação obtida foi caracterizada por microscopia eletrônica de transmissão, apresentando diâmetro entre 100 e 120 nm, também observado pelo espalhamento dinâmico da luz. As análises por espectroscopia no infravermelho e calorimetria exploratória diferencial demonstraram uma forte interação do fármaco com a membrana fosfolipídica por interações de hidrogênio, assim como uma menor mobilidade das cadeias lipídicas e formação de uma matriz vítrea a qual foi responsável pela efetiva crioproteção das vesículas. Estudo in vitro do perfil de liberação do fármaco a partir dos lipossomas pela técnica da diálise resultou em alta retenção do conteúdo encapsulado e uma liberação sustentada deste. A partir de ensaio biológico in vitro empregando azul de trypan, a formulação liofilizada contendo ácido ursólico se mostrou segura até a concentração em que seria necessária para carrear 32 ?M do fármaco, considerando a linhagem de mamíferos LLC-MK2. Em relação à atividade tripanocida em linhagem da cepa CL da forma epimastigota empregando MTT, o lipossoma contendo o fármaco foi capaz de causar morte celular do parasita em 100%, considerando-se um possível efeito sinérgico do ácido ursólico e o colesterol, cuja seletividade à membrana do parasita tem sido recentemente demonstrada. Contudo apenas a formulação contendo o ácido ursólico apresentou índice de seletividade aceitável, o que está relacionado com o efeito citoprotetor do ácido ursólico. / Chagas disease caused by Trypanosoma cruzi is a serious public health problem in Latin America and is an increasing disease around the world, mainly affecting regions with low purchasing power, and therefore Chagas disease is considered neglected by the pharmaceutical industry. Today, only one product is available, benznidazole, which has limited efficacy and is associated with several side effects. Recent studies have shown trypanocidal activity of ursolic acid, however its use is limited by the high hydrophobicity. The use of liposomal nanocarriers is recognized as a promising strategy to address this limitation and they are highly versatile and biocompatible systems. In this study, ursolic acid loaded phosphatidylcholine and cholesterol liposomes were developed using the solvent evaporation and lipid film hydration technique followed by sonication, allowing unilamellar vesicles formation with low polydispersity. From the preliminary assessment of the dispersion stability, the addition of cholesterol allowed the encapsulation efficiency maintenance when the formulation was stored at room temperature and better drug retention at 4°C (90%). After lyophilization employing sucrose 1:10 lipid:sugar molar ratio, the formulation manteined the size and size distribution and vesicle aggregation was prevented. The formulation obtained was characterized by transmission electron microscopy, with diameter between 100 and 120 nm, also observed by dynamic light scattering. The analysis by infrared spectroscopy and differential scanning calorimetry showed a strong hydrogen interaction between ursolic acid and the phospholipid membrane, as well as a lower mobility of the lipid chains and glassy matrix formation which was responsible for the effective cryoprotection. In vitro drug release profile from liposomes by dialysis technique resulted in high retention of the encapsulated content and a sustained release. From in vitro biological assay using trypan blue, the ursolic acid loaded lyophilized liposomes proved to be safe up to a concentration that would be required to carry 32 ?M of the drug, considering the LLC-MK2 mammalians cell line. Regarding the trypanocidal activity of epimastigotes CL strain by MTT technique, the ursolic acid loaded liposomes showed greater efficacy than blank liposome able to causing 100% of parasite cell death, considering a possible synergism effect of ursolic acid and cholesterol, whose selectivity to the parasite membrane has been recently demonstrated. However, only the formulation containing ursolic acid showed acceptable selectivity index, which is related to the ursolic acid cytoprotective effect.

Incluída dentre as doenças tropicais negligenciadas (DTNs), a leishmaniose se apresenta como um complexo de doenças de variados graus de gravidade, ocasionando desde uma lesão cutânea a uma progressiva infecção visceral fatal. O desenvolvimento de novas terapias é imprescindível, devido ao limitado e complexo arsenal terapêutico. Sendo assim, o presente projeto realizou o estudo in vitro e experimental em modelo de hamster infectado com L. (Leishmania) infantum de novas terapias para a leishmaniose visceral, utilizando três abordagens: i) reposicionamento de fármacos em uso na clínica para o tratamento de outras patologias; ii) sistemas de liberação controlada e sustentada de fármacos como os lipossomos e iii) avaliação de análogos sintéticos de naftoquinonas, bem como, análogos sintéticos de quelantes de ferro. O fármaco nitazoxanida (NTZ) foi amplamente estudado, apresentando atividade anti-Leishmania contra amastigotas intracelulares e um índice de seletividade (IS) de 2,5. Quando avaliado em modelo experimental, foi incapaz de reduzir a densidade parasitária no baço e fígado na forma livre, porém a encapsulação em lipossomos (NTZ-LP) conferiu maior direcionamento, resultando em uma eficácia de 50 e 82% no baço e fígado, respectivamente. A captação, in vitro, da NTZ-LP também foi avaliada em macrófagos sadios e infectados demonstrando uma ampla distribuição no citoplasma de ambos os grupos. Os parâmetros físico-químicos avaliados da NTZLP demonstraram uma formulação unilamelar, negativa com diâmetro inferior a 200nm. Estudos farmacocinéticos em modelo murino da NTZ e NTZ-LP demonstraram uma meia vida plasmática (T1/2) similar para ambas às formulações (6,5 minutos para NTZ e 8,7 minutos para NTZ-LP), porém tanto a exposição (AUC) e concentração plasmática máxima (Cmax) resultaram em valores quatro vezes maiores para os lipossomos, justificando a eficácia da formulação no estudo préclínico. Foi realizada ainda a triagem de 10 fármacos antihistamímicos, porém somente a cinarizina apresentou atividade no amastigota intracelular. O estudo experimental demonstrou que o fármaco foi incapaz de reduzir a densidade parasitária tanto no baço como no fígado dos animais, porém quando encapsulado em lipossomos foi observada uma eficácia de 54% apenas no fígado. Outros dois fármacos estudados apresentaram atividade anti-Leishmania, a amiodarona (antiarrítmico) e a sertralina (anti-depressivo). Apesar de a amiodarona ter apresentado potente atividade contra os amastigotas, com Concentração Efetiva 50% (CE50) de 0,5 ?M e um elevado IS de 56, não demonstrou atividade tanto no baço como no fígado no modelo experimental. Sertralina foi o fármaco mais promissor do trabalho, apresentando uma CE50 de 1,8 ?M e IS de 10, alcançando níveis de tratamento de 58% no baço e 87% no fígado dos animais. Novos compostos sintéticos também foram estudados. Dentre os 36 compostos análogos sintéticos de naftoquinonas, 14 demonstraram atividade contra as formas amastigotas intracelulares, destacando cinco compostos com IS >5. Ainda, os compostos sintéticos, quelantes de ferro, não foram capazes de eliminar o amastigota intracelular. O projeto teve como objetivo primordial a obtenção de um novo candidato a fármaco, livre ou encapsulado em lipossomos, que pudesse contribuir com novas perspectivas para estudos de novas terapias para a leishmaniose visceral. / Included among the neglected tropical diseases (NTDs), leishmaniasis present itself as a complex of varying degrees of serious diseases, resulting from a skin lesion to a progressive fatal visceral infection. The development of new therapies is essential, due to the limited and complex therapeutic arsenal. Thus, this project conducted the in vitro and in vivo studies using infected hamsters with L. (L.) infantum for new therapies against visceral leishmaniasis, using the three following approaches: i) drug repurposing; ii) controlled and sustained systems for drug delivery, such as liposomes, and iii) synthetic analogs of naphthoquinones, as well as, analogs of synthetic iron chelators. The nitazoxanide drug (NTZ) has been studied extensively, showing anti-Leishmania activity against intracellular amastigotes and selectivity index (SI) of 2.5. When it was evaluated in an experimental model, was unable to reduce the parasite burden in the spleen and liver in free form. However, when was encapsulated in liposomes (NTZ-LP), it has conferred higher direction, resulting in an efficiency of 50 to 82% in the spleen and liver, respectively. The in vitro uptake of NTZ-LP was evaluated in healthy and infected macrophages demonstrating a broad distribution in the cytoplasm of both groups. The NTZ-LP physical-chemical parameters were evaluated and showed a unilamellar formulation, negative and with diameter lower than 200nm. Pharmacokinetics studies in the murine model with NTZ and NTZ-LP showed a half-life (T1/2) similar for both formulations (6.5 minutes to NTZ and 8.7 minutes to NTZ-LP). However, the exposure (AUC) and maximum plasma concentration (Cmax), resulted, for the liposomes values, four times higher, which justify the efficacy of liposomal formulation in preclinical study. Additionally, 10 antihistamines drugs were evaluated, but only cinnarizine showed activity in the intracellular amastigotes. The experimental study showed that the drug was unable to reduce the parasite burden in both, spleen and liver infected animals. Nevertheless, when it was encapsulated in liposomes, a 54% efficacy, only, in the liver was observed. Other two drugs were studied relating Leishmania activity: amiodarone (antiarrhythmic) and sertraline (antidepressant). Although amiodarone have shown potent activity against amastigotes with Effective Concentration 50% (EC50) of 0.5 ?M and a high SI of 56, no activity was seen in spleen and liver in the experimental model. On the other hand, sertraline was the most promising drug, showing an IC50 of 1.8 ?M and SI of 10, increasing the treatment levels of 58% in the spleen and 87% in the liver of the animals. Novel synthetic compounds were also studied. Among 36 synthetic analogues of naphthoquinones, 14 demonstrated activity against intracellular amastigotes, highlighting five compounds with SI>5. Moreover, synthetic analogues of iron chelators were not able to eliminate intracellular amastigotes. The project had as its primary objective the attainment of a new drug candidate, free or encapsulated into liposomes, and it could contribute with new perspectives for studies towards novel therapies against visceral leishmaniasis.

A fosfoetanolamina sintética (FO-S), um fosfomonoéster, apresenta relevante atividade antitumoral. Contudo, a utilização de um carreador para encapsular a FO-S em lipossomas poderia favorecer a sua disponibilidade no microambiente tumoral, possibilitando o aumento da sua eficácia. Desta forma, o presente estudo avaliou a eficiência de encapsulamento da FO-S em lipossomas de DODAC e o seu potencial antitumoral. Os lipossomas foram preparados por ultrasonicação e caracterizados físicoquimicamente. A citotoxidade foi avaliada nas linhagens tumorais B16F10 (melanoma murino), Hepa1c1c7 (hepatocarcinoma murino) e Skmel-28 (melanoma humano) e nas células normais HUVEC, após o tratamento com diferentes concentrações dos lipossomas DODAC/FO-S, no tempo de 24 horas. A internalização dos lipossomas e o potencial elétrico mitocondrial foram analisados por microscopia confocal a laser. Adicionalmente, a expressão das proteínas caspases 3 e 8 ativas, receptor DR4, citocromo c, p53, p21, Bax, p27, CD44, CD90, Bcl-2 e ciclina D1 foi quantificada por citometria de fluxo. Para os estudos in vivo, os camundongos C57BL/6J portadores de hepatocarcinoma foram tratados com FO-S, DODAC/FO-S e DODAC, pelas vias intraperitoneal (IP) e intrahepática (IH), durante 20 dias. Os resultados demonstraram que os lipossomas apresentaram aspecto esférico e alta eficiência de encapsulação da FO-S, como também promoveram maior citotoxicidade nas linhagens tumorais estudadas, em comparação com FO-S. Além disto, nas células B16F10 e Hepa1c1c7, ocasionou parada nas fases S e G2/M do ciclo celular. A linhagem Hepa1c1c7 foi a mais sensível ao tratamento com os lipossomas DODAC/FO-S, os quais foram internalizados em até 6 horas e promoveram a diminuição de CD90, CD44, ciclina D1 e Bcl-2, o aumento de p53, p21, p27, Bax e caspases 8 e 3 ativas e a liberação do citocromo c. O aumento significativo das caspases 8 e 3 ativas, expressão do receptor DR4 e a liberação do citocromo c também ocorreu nas linhagens B16F10 e Skmel-28. Os resultados in vivo mostraram que os lipossomas DODAC/FO-S e a FO-S não induziram hepatotoxicidade, nefrotoxicidade e caquexia. Os lipossomas DODAC/FO-S não ocasionaram mielossupressão e hemólise, apresentando menor toxicidade em relação a FO-S, administrada pelas vias IP e IH. Além disto, os tratamentos com DODAC/FO-S (IH) e FO-S (IH e IP) foram efetivos em diminuir o número de células na fase S. Contudo, apenas os lipossomas DODAC/FO-S (IH) reduziram significamente os focos tumorais, aumentando as áreas de necrose, promovendo também o aumento da expressão gênica da p53, ciclina B1 e caspases 8 e 3. O conjunto dos resultados in vivo e in vitro demonstraram que a formulação lipossomal DODAC/FO-S foi capaz de maximizar os efeitos antitumorais da FO-S, ativando as vias intrínsecas e extrínsecas da apoptose / Synthetic phosphoethanolamine (PHO-S) - a phosphomonoester - has shown relevant anticancer effects. However, the utilization of a carrier to encapsulate the PHOS in liposomes can maximize its availability in the tumor microenvironment, allowing an increase in its effectiveness. Thus, the present study has evaluated efficiency of PHO-S encapsulation in DODAC liposomes and its antitumor potential. The liposomes were prepared by ultrasonication and physico-chemically characterized. The cytotoxic effects were evaluated on B16F10 cells (murine melanoma), Hepa1c1c7 cells (murine hepatocellular carcinoma), Skmel-28 (human melanoma) and in endothelial cells HUVEC, after treatment with DODAC/PHO-S liposomes at different concentrations for 24 hours. The internalization of the liposomes and mitochondrial electrical potential were analyzed by confocal laser microscopy. Additionally, the expression of active caspases 3 and 8, receptor DR4, cytochrome c, p53 p53, p21, Bax, p27, CD44, CD90, Bcl-2 and cyclin D1 proteins was quantified by flow cytometry. For in vivo studies, C57BL/6J mice with hepatocellular carcinoma were treated with PHO-S, DODAC/PHO-S and DODAC, by intraperitoneal (IP) and intratumoral (IT) routes for 20 days. The results demonstrated that liposomes presented spherical aspect and high PHO-S encapsulation efficiency, as also promoted high cytotoxic effect - compared with PHO-S. Furthermore, in B16F10 and Hepa1c1c7 cells, the liposomes induced S and G2/M cell cycle arrest. Hepa1c1c7 cells showed greater sensitivity to the DODAC/PHO-S formulation, which were internalized until 6 hours and promoted a decrease in the expression of CD90, CD44, cyclin D1 and Bcl-2, an increase of de p53, p21, p27, Bax and active caspases 8 and 3 and the liberation of cytochrome c. The significant increase in the expression of active caspases 3 and 8, DR4 receptor and liberation of cytochrome c also occurred in B16F10 and Skmel-28 cells. In vivo results showed that DODAC/PHO-S liposomes and PHO-S did not induce nephrotoxicity, hepatotoxicity and cachexia. DODAC/PHO-S liposomes did not cause myelosuppression and hemolysis, presenting lower toxicity in relation to PHO-S - when administered by IP and IT routes. Moreover, treatment with DODAC/PHO-S (IT) and PHO-S (IT and IP) effectively decreased the number of cells in S phase. However, only DODAC/PHO-S liposomes significantly reduced the number of tumor foci, increasing area of necrosis, and also promoting an increase in gene expression of p53, cyclin B1 and caspases 8 and 3. The set of in vitro and in vivo results demonstrated that DODAC/PHO-S liposomal formulation was capable of maximizing the PHO-S antitumor effects, activating the intrinsic and extrinsic pathways of the apoptosis

O maior interesse dos consumidores por alimentos que tragam benefícios à saúde faz necessário o constante desenvolvimento de métodos de tecnologias que tornem possível a sua produção em grande escala. Dentre tais tecnologias, destaca-se a microencapsulação de componentes bioativos. Lipossomas têm sido amplamente estudados para diversos fins, dentre eles, a encapsulação e a veiculação de bioativos, pois permitem maior proteção dos bioativos encapsulados, bem como podem promover a liberação controlada dos mesmos. Dentre os bioativos de interesse da indústria de alimentos está a curcumina, que além de ser um poderoso antioxidante, pode ser uma ótima alternativa para substituição de corantes amarelos. Tais corantes amarelos possuem diversos efeitos colaterais conhecidos, como a alegernicidade. A fabricação de iogurtes no Brasil vem crescendo de maneira considerável, e a este fato pode-se atribuir o consumo por indivíduos que buscam suas características funcionais, tendo seu consumo associado a uma imagem positiva e aos benefícios que traz ao organismo. Tal produto se torna, portanto, bastante atrativo para utilização de curcumina encapsulada em lipossomas e sua utilização vai ao encontro dos interesses dos consumidores. Neste trabalho de Doutorado foram produzidos lipossomas multilamelares encapsulando curcumina, através do método inovador de hidratação de prolipossomas obtidos por recobrimento de sacarose micronizada. Os prolipossomas foram caracterizados, e constatou-se através de microscopia eletrônica de varredura que a sacarose foi completamente recoberta pelos fosfolipídios. Além disso, o pó obtido se mostrou amorfo e com solubilidade de 98% em água, fatores extremamente importantes para a etapa posterior de hidratação dos prolipossomas para formação das vesículas em dispersão. Também se mostraram com baixíssima capacidade de retenção de umidade, característica importante para aumentar sua vida de prateleira durante o armazenamento. Por sua vez, os lipossomas foram efetivos em preservar a curcumina encapsulada (70% da curcumina foi preservada após 30 dias de armazenagem sob refrigeração), com diâmetro médio aproximado de 700-800 nm. A incorporação dos lipossomas encapsulando curcumina em iogurte não alterou nenhum parâmetro físico-químico do produto, como composição centesimal, pH, acidez titulável e comportamento reológico. Os resultados da análise sensorial mostraram que o produto teve alta aceitação por parte dos panelistas, sendo que a apenas a adição de pedaços de fruta não foi bem aceito por parte dos consumidores. / The increased consumer interest in food products that produces health benefits requires constant development of methods and technologies to make possible their production on a large scale. Among these technologies, there are the processes of microencapsulation of bioactive components. Liposomes have been extensively studied for a variety of purposes, including the encapsulation and delivery of bioactives, as they allow greater protection of encapsulated bioactive substances as well as promote the controlled release of bioactive substances. Among the bioactives of interest in the food industry is curcumin, which in addition to being a powerful antioxidant, can be a great alternative for yellow dye substitution. Such yellow dyes have several known side effects, such as allergenicity. The production of yogurt in Brazil has been growing considerably, and this fact can be attributed consumption by individuals seeking their functional characteristics, having its consumption associated with a positive image and the benefits it brings to the body. Such a product, therefore, becomes quite attractive for use to test the incorporation of curcumin-loaded liposomes, to verify if their characteristics would meet the interests of consumers. In the present PhD, multilamellar liposomes were produced to encapsulate curcumin, through the innovative method of hydration of proliposomes obtained by coating of micronized sucrose. The proliposomes were characterized, and it was found by scanning electron microscopy that the sucrose was completely covered by the phospholipids. In addition, the powder obtained showed to be amorphous and with solubility of 98% in water, factors extremely important for the subsequent hydration of the proliposomes to form the vesicles in dispersion. They were also shown to have very low moisture retention capacity, an important feature to increase shelf life during storage. In turn, liposomes were effective in preserving encapsulated curcumin (70% of curcumin was preserved after 30 days of storage under refrigeration), with an approximate mean diameter of 700-800 nm. The incorporation of the liposomes encapsulating curcumin into yogurt did not change significantly any relevant physicochemical parameters of the dairy product, such as proximate composition, pH, titratable acidity and rheological behavior. The results of the sensorial evaluation showed that the product had high acceptance by the panelists, and that only the addition of pieces of fruit was not well accepted by the consumers.

Os problemas decorrentes de doenças alérgicas é tema em destaque atualmente devido ao aumento de pessoas que vêm apresentando sintomas e sofrendo as consequências de mudanças aceleradas nos costumes da nossa sociedade. Apesar das diversas terapias oferecidas, pacientes alérgicos ainda sofrem com efeitos colaterais decorrentes do uso de medicamentos anti-alérgicos. Assim, a busca por novas alternativas que possam amenizar os sintomas alérgicos torna-se relevante. As substâncias naturais tem sido alvo de intensa investigação devido às propriedades farmacológicas no tratamento de diversas doenças incluindo as alérgicas. Neste contexto, este trabalho foi focado no extrato Vimang e seu componente majoritário, a mangiferina (Mgf), que tem apresentado atividades biológicas diversas. Sabendo-se que a atividade biológica de um extrato pode ser potencializada pelo sinergismo entre seus componentes, foi avaliado o efeito sinérgico de substâncias isoladas do Vimang, tais como mangiferina, quercetina, catequina, ácido gálico e benzóico. Esses componentes foram combinados e as misturas avaliadas quanto à capacidade em inibir a desgranulação mastocitária. O Vimang, a quercetina e mangiferina inibem a desgranulação mastócitária enquanto catequina, ácido gálico e benzóico não são ativos; e porisso, não foram incluídos na determinação do isobolograma de aditividade, adotado no estudo de sinergismo. O isobolograma de aditividade mostra sinergismo para as concentrações de mangiferina iguais a 5, 10, 20 e 40 ?M e quercetina iguais a 0,2, 1 e 1,6 ?M; e mostra antagonismo para mangiferina 80 ?M e quercetina 0,4 e 0,8 ?M. Tais resultados sugerem que altas concentrações de mangiferina atrapalham a interação sinérgica entre estas substâncias e altas concentrações de quercetina exercem um efeito contrário, ou seja, favorecem o sinergismo entre quercetina e mangiferina. A baixa solubilidade de flavonóides em meio fisiológico levou ao estudo da interação da Mgf com lipossomos de Dimiristoil-L-?-Fosfatidilcolina (DMPC) para aplicação nos ensaios biológicos. A Interação da Mgf com lipossomos de DMPC, bem como a estabilidade lipossomal, foram avaliadas quanto aos efeitos de pH, força iônica e presença de colesterol. O pH influencia a eficiência de incorporação (EI) da Mgf que é maior em pHs ácidos. Em soluções de pH ácido ou fisiológico há aumento de tamanho do lipossomo na presença de Mgf, o que reforça a hipótese de interação desta com a bicamada lipídica. O aumento da força iônica, na ausência de Mgf, diminui a estabilidade do lipossomo. Na ausência de sal, a Mgf favorece a formação de agregados e diminui a estabilidade dos lipossomos e na presença de sal, a Mgf previne a agregação e estabiliza os agregados lipossomais. A EI da Mgf nos lipossomos de DMPC preparados pelo método da injeção etanólica, em pH fisiológico, foram ao redor de 13%. A tentativa de otimizar a EI foi realizada pela adição de colesterol em diferentes proporções lipídio:colesterol. Um aumento de 13% para 17% foi observado para a proporção DMPC:colesterol (9:1). A Mgf livre inibe a desgranulação dos mastócitos de forma concentração-dependente; mas a presença de lipossomos, preparados pelo método da injeção etanólica não altera significativamente esse perfil. A EI da mangiferina em lipossomos de DMPC:colesterol (9:1), preparados pelo método do filme lipídico, foi igual a 45%. Os resultados de potencial antialérgico, para este caso, mostraram que os lipossomos de DMPC favorecem o potencial antialérgico da Mgf em concentrações acima de 25 ?M. Esses resultados abrem perspectivas na busca de sistemas lipossomais mais estáveis e que possam ser aplicados em ensaios biológicos in vitro e in vivo. / The problems due to allergic diseases are currently a highlighted topic due to the increase of people who are showing symptoms and suffering the consequences of rapid changes in the habits of our society. Despite various therapies offered, allergic patients still suffer side effects from the use of anti-allergic drugs. Thus, the search for new alternatives that can alleviate the allergic symptoms becomes relevant. Natural substances have been the subject of intense research due to the pharmacological properties in the treatment of several diseases, including allergic ones. In this context, this work was focused on Vimang extract and its major component, the mangiferin (Mgf), which has shown several biological activities. Given that the biological activity of an extract can be enhanced by the synergism between its components, the synergistic effect of compounds isolated from Vimang such as mangiferin, quercetin, catechin, gallic acid and benzoic acid was evaluated. These components were combined and the mixtures tested for their ability to inhibit mast cell degranulation. The Vimang, quercetin and mangiferin inhibit mast cell degranulation while catechin, gallic acid and benzoic acid are not active and for that reason they were not included in the determination of the isobologram adopted in the synergism study. The isobologram of additivity shows synergism for the concentration of mangiferin equal to 5, 10, 20 and 40 ?M and quercetin equal 0.2, 1 and 1.6 ?M, and shows antagonism for mangiferin 80 ?M and quercetin 0.4 and 0.8 ?M. The low solubility of flavonoids in physiological medium led to the study of the interaction of Mgf with liposomes of L-?-dimyristoyl-phosphatidylcholine (DMPC) for application in biological assays. The interaction of Mgf with DMPC liposomes as well as the liposomal stability was evaluated considering the effects of pH, ionic strength and cholesterol presence. The pH influences the incorporation efficiency (IE) of mangiferin, which is higher in acidic pHs. In solutions of acidic or physiological pH, the liposome size increases in the presence of Mgf, which reinforces the hypothesis of interaction of Mgf with the lipid bilayer. The increased ionic strength in the absence of Mgf decreases the stability of the liposome. In the absence of salt, Mgf favors the formation of aggregates and decreases the stability of the liposomes. When in presence of salt, Mgf prevents the aggregation and stabilizes the liposomal aggregates. The IE of mangiferin in DMPC prepared by the ethanol injection method, at physiological pH, were around 13%. The attempt to optimize the IE was performed by the addition of cholesterol in different proportions lipid:cholesterol. An increase from 13% to 17% was observed for the proportion of DMPC:cholesterol (9:1). Free mangiferin inhibits mast cells degranulation in a dose-dependent manner, but the presence of liposomes prepared by the ethanol injection method does not significantly change this profile. The IE of mangiferin in liposomes of DMPC:cholesterol (9:1), prepared by the method of lipidic film was equal to 45%.The results of antiallergic potential in this case show that DMPC liposomes favor the mangiferin antiallergic potential at concentrations above 25 mM. These results open perspectives in the search for more stable liposomal systems and can be applied to biological assays in vitro and in vivo.

A fosfatase alcalina é uma fosfomonohidrolase inespecífica, capaz de hidrolisar monoésteres de fosfato, pirofosfato, diésteres de fosfato, bem como catalisar reações de transfosforilação, e é denominada \"alcalina\" por sua habilidade de efetuar estas reações mais eficientemente em pH acima do neutro (pH 8-11). O objetivo deste trabalho foi padronizar uma metodologia para a obtenção de uma fração de membrana rica em fosfatase alcalina a partir de culturas de células osteoblásticas, provenientes de medula óssea de rato, sem a utilização de solventes orgânicos, colagenase ou outras proteases. O procedimento padronizado é simples e reprodutível, com a vantagem da considerável redução do tempo necessário para se obter esta fração de membrana, o que contribui para um menor efeito desnaturante sobre a enzima. A fosfatase alcalina é inserida à membrana plasmática por uma âncora GPI e foi solubilizada tanto com polidocanol (1%, p/v) quanto com PIPLC (0,2 U/mL), hidrolisando diversos substratos (PNFF, ATP, PPi, ADP, ?-glicerofosfato, glicose-1-fosfato, glicose-6-fosfato e frutose-6-fosfato) e sendo inibida por inibidores clássicos deste grupo de enzimas (levanisol, teofilina, ZnCl2, vanadato, fosfato e arsenato). Os efeitos de lipossomos constituídos por DPPC, DPPC:DPPS (9:1 e 8:2, razão molar) e DPPC:DODAB (9:1 e 8:2, razão molar) na habilidade tanto de inserção da enzima nos sistemas vesiculares, bem como de modulação da atividade da enzima reconstituída, também foram avaliados. A reconstituição da fosfatase alcalina nos lipossomos mistos constituídos de DPPC:DPPS (9:1), DPPC:DPPS (8:2) e DPPC:DODAB (8:2) proporcionou máxima incorporação da atividade PNFFase da enzima (cerca de 90%, 75% e 90%, respectivamente) após 4 horas, 5 horas e 40 minutos, respectivamente, de incubação dos diversos lipossomos com a proteína. No entanto, utilizando lipossomos de DPPC:DODAB (9:1), apenas cerca de 50% da atividade PNFFase da enzima foi incorporada aos sistemas mesmo após 5 horas de incubação. Para os lipossomos com carga positiva, uma maior proporção de DODAB nos sistemas de DPPC favoreceu a inserção da fosfatase alcalina aos sistemas após um curto período de incubação. Para os lipossomos com carga negativa, as diferentes proporções de DPPS utilizadas não exerceram grande influência tanto na velocidade de incorporação quanto na quantidade de enzima incorporada aos sistemas. Para todos os sistemas utilizados, o processo de incorporação é tempo dependente. A eletroforese dos proteolipossomos de DPPC revelou a presença de uma única banda protéica bem intensa, com massa molecular ao redor de 60 kDa (quando desnaturada), que apresentou atividade de fosfomonohidrolase em condição não-desnaturante, com massa molecular de 120 kDa. Assim, com esta estratégia, foi possível obter proteolipossomos ricos em fosfatase alcalina devido à inserção preferencial da âncora de GPI às bicamadas lipídicas, em detrimento das outras proteínas que não interagem favoravelmente com os sistemas vesiculares, comprovando que a metodologia de reconstituição padronizada pode ser usada eficientemente na obtenção de sistemas de proteolipossomos sem a necessidade de uma etapa de purificação prévia da enzima solubilizada, de modo a se obter um máximo de incorporação da enzima às vesículas com mínima perda em atividade. A reconstituição da enzima empregando-se células ghost resseladas foi obtida incubando-se volumes iguais de enzima (23 ?g/mL) e células ghost (0,22 mg/mL), por 2 horas, a 25ºC, com cerca de 40% da atividade PNFFase da fosfatase alcalina incorporada às vesículas. Para verificar o efeito do microambiente da membrana sobre a atividade da enzima reconstituída, foram determinados os parâmetros cinéticos de hidrólise para diferentes substratos (ATP, PPi e PNFF). Para todos os substratos, uma única classe de sítios de hidrólise foi observada, com valores de K0,5 que variaram de 0,14 a 2,7 mM. Excesso de PPi e ATP no meio reacional inibiu as atividades PPase e ATPase da enzima reconstituída, respectivamente, em todos os sistemas estudados. A hidrólise de PPi apresentou efeitos cooperativos positivos para todos os sistemas, enquanto que para a hidrólise de ATP, uma pequena cooperatividade positiva foi observada apenas para os sistemas constituídos de DPPC e contendo DPPS em sua composição. Assim, a enzima não perdeu a habilidade de hidrolisar nenhum dos substratos quando reconstituída nos diferentes sistemas vesiculares, e todos os dados obtidos reforçam a hipótese de que a composição lipídica do microambiente onde a fosfatase alcalina se encontra exerce grande influência na modulação tanto da atividade da enzima quanto da interação da mesma com os sistemas vesiculares. Assim, os resultados obtidos fornecem novas informações que poderão contribuir tanto para a compreensão dos mecanismos de interação da fosfatase alcalina com a membrana, quanto para estudos da função da enzima durante o processo de biomineralização. / Alkaline phosphatase is a multifunctional enzyme, capable of hydrolyzing phosphate monoesters, pyrophosphate, phosphodiesters, as well as catalyzing transphosphorylation reactions, and it is named \"alkaline\" due to its ability to perform these reactions more efficiently in pH above the neutral (pH 8-11). The aim of this work was to standardize a methodology to obtain a membrane fraction rich in alkaline phosphatase from osteoblastic cells cultures, originated from rat bone marrow, without the use of organic solvents, collagenase or others proteases. The standardized procedure is simple and easy to reproduce, with the advantage of considerable reduction in the time needed to obtain this membrane fraction, which contributes to a smaller denaturing effect on the enzyme. Alkaline phosphatase is a membrane-bound enzyme attached to the cell membrane via a GPI anchor and was solubilized with both polidocanol (1%, w/v) and PIPLC (0,2 U/mL), hydrolyzing several substrates (PNPP, ATP, PPi, ADP, beta-glycerophosphate, glucose-1-phosphate, glucose-6-phosphate and fructose-6-phosphate) and being inhibited by some classical inhibitors of this group of enzymes (levamisole, theophylline, ZnCl2, vanadate, phosphate and arsenate). The effect of liposomes constituted by DPPC, DPPC:DPPS (9:1 and 8:2, molar ratio) and DPPC:DODAB (9:1 and 8:2, molar ratio) on the enzyme insertion ability in the vesicular systems and activity modulation of the reconstituted enzyme were also evaluated. The alkaline phosphatase reconstitution in the mixed liposomes constituted by DPPC:DPPS (9:1), DPPC:DPPS (8:2) and DPPC:DODAB (8:2) presented maximum incorporation of the PNPPase enzyme activity (about 90%, 75% and 90%, respectively) after 4 hours, 5 hours and 40 minutes, respectively, of incubation of the several liposomes with the protein. However, using DPPC:DODAB (9:1) liposomes, only about 50% of the PNPPase enzyme activity was incorporated in the systems, even after 5 hours of incubation. For positive charged liposomes, a higher proportion of DODAB in the DPPC systems favored the alkaline phosphatase insertion into it after a short period of incubation. For negative charged liposomes, the different proportions of DPPS used did not have a big influence in both, incorporation velocity and quantity of incorporated enzyme into the systems. For all the systems used, the incorporation process is time dependent. SDS-PAGE of the DPPC proteoliposomes revealed only a single protein band, with molecular mass of about 60 kDa (when denaturated), which presented phosphomonohydrolase activity under non-denaturing conditions, with molecular mass of about 120 kDa. Thus, using this strategy, it was possible to obtain proteoliposomes rich in alkaline phosphatase due to the preferential insertion of the GPI anchor in the lipid bilayers, since the other proteins do not interact favorably with the vesicular systems. This proves that the standardized methodology for reconstitution can be used efficiently to obtain proteoliposomes systems without prior purification of the solubilized enzyme, with its maximum incorporation in the vesicles and a minimum loss of activity. The reconstitution of the enzyme using resealed ghost cells was obtained by incubating equal volumes of enzyme (23 microg/mL) and ghost cells (0,22 mg/mL), for 2 hours, at 25ºC, with about 40% of the alkaline phosphatase PNPPase activity being incorporated into the vesicles. To verify the effect of the membrane microenvironment on the activity of the reconstituted enzyme, the kinetic parameters for the hydrolysis of different substrates (ATP, PPi and PNPP) were determined. For all the substrates, only one class of hydrolysis sites was observed, with K0,5 values that varied from 0,14 to 2,7 mM. Excess of PPi and ATP in the reaction medium inhibited the PPase and ATPase activities of the reconstituted enzyme, respectively, in all systems studied. PPi hydrolysis presented positive cooperative effects for all systems, while for ATP hydrolysis a small positive cooperativity was observed only for the systems constituted by DPPC and containing DPPS in its composition. Thus, the enzyme did not lose the ability to hydrolyse any of the studied substrates when reconstituted in the different vesicular systems and all the data obtained strengthen the hypothesis that the lipid composition of the microenvironment where the alkaline phosphatase is located plays a great influence on the modulation of both enzyme activity and enzyme interaction with the vesicular systems. Thus, the results obtained provide new information that could contribute to the comprehension of the interaction mechanisms of the alkaline phosphatase with the membrane, as well as to studies of the enzyme function during the biomineralization process.

A mineralização do esqueleto começa dentro de vesículas matriz derivadas de células (MVs); então, os minerais se propagam para a matriz de colágeno extracelular. A fosfatase alcalina não específica de tecido (TNAP) degrada o pirofosfato inorgânico (PPi), um potente inibidor da mineralização, quee contribui com Pi (Fosfato) de ATP para iniciar a mineralização. Em comparação com a membrana plasmática, as MVs são ricas em Colesterol (Chol) (32%) e TNAP, mas como o Chol influencia a atividade da TNAP ainda não está claro. Nós reconstituímos TNAP em lipossomos de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dimiristoilfosfocolina (DMPC) dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) combinada com Chol ou seus derivados Colestenona (Achol) e Ergosterol (Ergo). Comparamos as propriedades cinéticas: Velocidade máxima de hidrólise (Vmax), constante de afinidade (k0,5), cooperatividade (n) e eficiência catalítica (kcat / k0,5) da TNAP para os substratos fisiológicos ATP e PPi, quando o TNAP é incorporada nestes diferentes microambientes lípidicos. O DPPC mais 36% de esteróis em lipossomos aumentaram a atividade catalítica do TNAP em relação ao ATP. A presença de Chol também aumentou a propagação de minerais em 3,4 vezes. A eficiência catalítica da TNAP em relação ao ATP foi quatro vezes menor nos proteolipossomos de DOPC, em comparação aos proteolipossomos do DPPC. Os proteolipossomos DOPC também aumentaram a biomineralização 2,8 vezes em comparação com os proteolipossomos de DPPC. O TNAP catalisou a hidrólise do ATP mais eficientemente no caso do proteolipossomo consistindo em DOPC com 36% de Chol. O mesmo comportamento surgiu com Achol e Ergo. A organização do lipídio e a estrutura do esterol influenciaram a tensão superficial (), a atividade fosfohidrolítica do TNAP na monocamada e a eficiência catalítica do TNAP nas bicamadas. Membranas na fase L (Achol) proporcionaram melhores parâmetros cinéticos em relação às membranas na fase Lo (Chol e Ergo). a presença de SM ou Chol: SM 90:10 (mol%), proteolipossomos DPPC não alterou os valores de eficiência catalítica, para a hidrólise do ATP. No entanto, estes proteolipossomos aumentaram a propagação mineral em cerca de 4,5 e 8 vezes, respectivamente, em comparação com DPPC puro. O aumento na eficiência catalítica para proteolipossomos contendo DMPC: SM 90:10 e DMPC: Chol: SM 80:10:10 (% molar) foi observado. Em conclusão, as propriedades físicas e a organização lateral de lipídios em proteolipossomas são cruciais para o controle. propagação mineral mediada pela atividade da TNAP durante a mineralização / Mineralization of the skeleton starts within cell-derived matrix vesicles (MVs); then, minerals propagate to the extracellular collagenous matrix. Tissuenonspecific alkaline phosphatase (TNAP) degrades inorganic pyrophosphate (PPi), a potent inhibitor of mineralization, and contributes Pi (Phosphate) from ATP to initiate mineralization. Compared to the plasma membrane, MVs are rich in Cholesterol (Chol) (32%) and TNAP, but how Chol influences TNAP activity remains unclear. We have reconstituted TNAP in liposomes of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dimyristoylphosphocholine (DMPC) dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) combined with Chol or its derivatives Cholestenone (Achol) and Ergosterol (Ergo). We compare the kinetic properties: maximum rate of hydrolysis (Vmax), affinity constant (k0,5), cooperativity (n) and catalytic efficiency (kcat / k0,5) of TNAP for the physiological substrates ATP and PPi, when TNAP is incorporated in these different microenvironments lipids. DPPC plus 36% sterols in liposome increased the catalytic activity of TNAP toward ATP. The presence of Chol also increased the propagation of minerals by 3.4-fold. The catalytic efficiency of TNAP toward ATP was fourfold lower in DOPC proteoliposomes as compared to DPPC proteoliposomes. DOPC proteoliposomes also increased biomineralization by 2.8-fold as compared to DPPC proteoliposomes. TNAP catalyzed the hydrolysis of ATP more efficiently in the case of the proteoliposome consisting of DOPC with 36% Chol. The same behavior emerged with Achol and Ergo. The organization of the lipid and the structure of the sterol influenced the surface tension (), the TNAP phosphohydrolytic activity in the monolayer, and the TNAP catalytic efficiency in the bilayers. Membranes in the L phase (Achol) provided better kinetic parameters as compared to membranes in the Lo phase (Chol and Ergo). The presence of SM or Chol:SM 90:10 (mol%), DPPC-proteoliposomes did not alter the catalytic efficiency values, for the ATP hydrolysis. However, these proteoliposomes increased the mineral propagation by about 4.5 and 8-fold, respectively, compared to neat DPPC. The increase in catalytic efficiency for proteoliposomes containing DMPC:SM 90:10 and DMPC:Chol:SM 80:10:10 (mol%) was observed. In conclusion, the physical properties and the lateral organization of lipids in proteoliposomes are crucial to control mineral propagation mediated by TNAP activity during mineralization

Submitted by Angela Maria de Oliveira (amolivei@uepg.br) on 2018-05-16T14:48:48Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) JOEL TORIBIO ESPINOZA.pdf: 1421023 bytes, checksum: 0e2d3411df51b668250417f3324cb338 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-16T14:48:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) JOEL TORIBIO ESPINOZA.pdf: 1421023 bytes, checksum: 0e2d3411df51b668250417f3324cb338 (MD5) Previous issue date: 2017-03-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As nanopartículas de prata (AgNPs) são conhecidas por suas atividades antimicrobianas e antitumorais. Outro composto de grande interesse é o Lupeol, triterpeno pentacíclico, com atividades terapêuticas e quimiopreventivas para o tratamento de infeções e de câncer. Assim, os lipossomas de natureza biocompatível e biodegradável se apresentam como um veículo capaz de transportar estes dois compostos. O objetivo desse trabalho foi desenvolver e caracterizar lipossomas, carregadas com nanopartículas de prata, contendo colesterol (LAgNPs) ou lupeol (LUNP) em sua bicamada lipídica. As AgNPs foram preparadas pelo método de síntese verde com exposição à luz solar e os lipossomas foram preparados pelo método de fase reversa modificada. Foram avaliados o tamanho de partícula, índice de polidispersão, potencial zeta, assim como os aspectos morfológicos mediante microscopia eletrônica de varredura (SEM-FEG) e difração de raios X das AgNPs e dos lipossomas. Além disso, foi desenvolvido e validado um método analítico por espectroscopia de absorção atômica em chama para determinar a quantidade de prata que foi encapsulada em lipossomas. As AgNPs apresentaram-se como estruturas amorfas, polidispersas, com diâmetro médio entre 278,46 nm e potencial zeta de -18,3 mV. LAgNPs apresentaram um diâmetro médio de entre 321 e 373 nm, o índice de polidispersão próximo a 0,2 e um potencial zeta em torno de - 40 mV, indicativo de baixa polidispersão e que concede maior estabilidade às AgNPs. Foi possível obter lipossomas contendo lupeol em sua bicamada lipídica, carregando nanopartículas de prata (LUNP) com diâmetro médio de 218,8 nm, potencial zeta de -36,5 mV e de tamanhos polidispersos. As imagens obtidas por FEG mostram estruturas semicirculares para AgNPs e esféricas para LAgNPs e LUNPs bem definidas. O método analítico para quantificar Nanopartículas de prata foi desenvolvido e validado, mostrando-se linear, preciso e exato, o que possibilitou determinar a porcentagem de encapsulação sendo entre 51,81 a 58,83 % para LAgNP e de 56,08 % para LUNP. Esses resultados mostraram que LAgNPs foram obtidos com características físico-químicas adequadas como sistema de liberação, com potencial ação antimicrobiana e/ou antitumoral, como alternativa aos tratamentos convencionais. / Silver nanoparticles (AgNPs) are known for their antimicrobial and antitumor activities. Another compound of great interest is Lupeol, a pentacyclic triterpene, with therapeutic and chemopreventive activities for the treatment of infections and cancer. Thus, biocompatible and biodegradable liposomes are presented as a carrier capable of transporting these two compounds. The objective of this work was to develop and characterize liposomes, loaded with silver nanoparticles containing cholesterol (LAgNPs) or lupeol (LUNP) in their lipid bilayer. AgNPs were prepared by the green synthetic method with exposure to sunlight and the liposomes were prepared by the modified reverse phase method. Particle size, polydispersity index, zeta potential, as well as morphological aspects were determined by scanning electron microscopy (SEM-FEG) and X-ray diffraction of AgNPs and liposomes. In addition, an analytical method has been developed and validated by flame atomic absorption spectroscopy to determine the amount of silver that has been encapsulated in liposomes. The AgNPs presented as amorphous, polydisperse structures, with mean diameter between 278.46 nm and zeta potential of -18,3 mV . LAgNPs had a mean diameter between 321 and 373 nm, the polydispersity index close to 0.2 and a zeta potential around -40 mV, indicative of low polydispersity and which gives greater stability to AgNPs. It was possible to obtain liposomes containing lupeol in their lipid bilayer, loading silver nanoparticles (LUNP) with a mean diameter of 218.8 nm, zeta potential of -36.5 mV and polydisperse sizes. The images obtained by FEG show semicircular structures for AgNPs and spherical for well-defined LAgNPs and LUNPs. The analytical method to quantify silver nanoparticles was developed and validated, showing linear, precise and exact, which allowed to determine the percentage of encapsulation being between 51.81 to 58.83% for LAgNP and 56.08% for LUNP . These results showed that LAgNPs were obtained with adequate physicochemical characteristics as a release system, with potential antimicrobial and / or antitumor action, as an alternative to conventional treatments.

A mineralização do esqueleto começa dentro de vesículas matriz derivadas de células (MVs); então, os minerais se propagam para a matriz de colágeno extracelular. A fosfatase alcalina não específica de tecido (TNAP) degrada o pirofosfato inorgânico (PPi), um potente inibidor da mineralização, quee contribui com Pi (Fosfato) de ATP para iniciar a mineralização. Em comparação com a membrana plasmática, as MVs são ricas em Colesterol (Chol) (32%) e TNAP, mas como o Chol influencia a atividade da TNAP ainda não está claro. Nós reconstituímos TNAP em lipossomos de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dimiristoilfosfocolina (DMPC) dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) combinada com Chol ou seus derivados Colestenona (Achol) e Ergosterol (Ergo). Comparamos as propriedades cinéticas: Velocidade máxima de hidrólise (Vmax), constante de afinidade (k0,5), cooperatividade (n) e eficiência catalítica (kcat / k0,5) da TNAP para os substratos fisiológicos ATP e PPi, quando o TNAP é incorporada nestes diferentes microambientes lípidicos. O DPPC mais 36% de esteróis em lipossomos aumentaram a atividade catalítica do TNAP em relação ao ATP. A presença de Chol também aumentou a propagação de minerais em 3,4 vezes. A eficiência catalítica da TNAP em relação ao ATP foi quatro vezes menor nos proteolipossomos de DOPC, em comparação aos proteolipossomos do DPPC. Os proteolipossomos DOPC também aumentaram a biomineralização 2,8 vezes em comparação com os proteolipossomos de DPPC. O TNAP catalisou a hidrólise do ATP mais eficientemente no caso do proteolipossomo consistindo em DOPC com 36% de Chol. O mesmo comportamento surgiu com Achol e Ergo. A organização do lipídio e a estrutura do esterol influenciaram a tensão superficial (), a atividade fosfohidrolítica do TNAP na monocamada e a eficiência catalítica do TNAP nas bicamadas. Membranas na fase L (Achol) proporcionaram melhores parâmetros cinéticos em relação às membranas na fase Lo (Chol e Ergo). a presença de SM ou Chol: SM 90:10 (mol%), proteolipossomos DPPC não alterou os valores de eficiência catalítica, para a hidrólise do ATP. No entanto, estes proteolipossomos aumentaram a propagação mineral em cerca de 4,5 e 8 vezes, respectivamente, em comparação com DPPC puro. O aumento na eficiência catalítica para proteolipossomos contendo DMPC: SM 90:10 e DMPC: Chol: SM 80:10:10 (% molar) foi observado. Em conclusão, as propriedades físicas e a organização lateral de lipídios em proteolipossomas são cruciais para o controle. propagação mineral mediada pela atividade da TNAP durante a mineralização / Mineralization of the skeleton starts within cell-derived matrix vesicles (MVs); then, minerals propagate to the extracellular collagenous matrix. Tissuenonspecific alkaline phosphatase (TNAP) degrades inorganic pyrophosphate (PPi), a potent inhibitor of mineralization, and contributes Pi (Phosphate) from ATP to initiate mineralization. Compared to the plasma membrane, MVs are rich in Cholesterol (Chol) (32%) and TNAP, but how Chol influences TNAP activity remains unclear. We have reconstituted TNAP in liposomes of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dimyristoylphosphocholine (DMPC) dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) combined with Chol or its derivatives Cholestenone (Achol) and Ergosterol (Ergo). We compare the kinetic properties: maximum rate of hydrolysis (Vmax), affinity constant (k0,5), cooperativity (n) and catalytic efficiency (kcat / k0,5) of TNAP for the physiological substrates ATP and PPi, when TNAP is incorporated in these different microenvironments lipids. DPPC plus 36% sterols in liposome increased the catalytic activity of TNAP toward ATP. The presence of Chol also increased the propagation of minerals by 3.4-fold. The catalytic efficiency of TNAP toward ATP was fourfold lower in DOPC proteoliposomes as compared to DPPC proteoliposomes. DOPC proteoliposomes also increased biomineralization by 2.8-fold as compared to DPPC proteoliposomes. TNAP catalyzed the hydrolysis of ATP more efficiently in the case of the proteoliposome consisting of DOPC with 36% Chol. The same behavior emerged with Achol and Ergo. The organization of the lipid and the structure of the sterol influenced the surface tension (), the TNAP phosphohydrolytic activity in the monolayer, and the TNAP catalytic efficiency in the bilayers. Membranes in the L phase (Achol) provided better kinetic parameters as compared to membranes in the Lo phase (Chol and Ergo). The presence of SM or Chol:SM 90:10 (mol%), DPPC-proteoliposomes did not alter the catalytic efficiency values, for the ATP hydrolysis. However, these proteoliposomes increased the mineral propagation by about 4.5 and 8-fold, respectively, compared to neat DPPC. The increase in catalytic efficiency for proteoliposomes containing DMPC:SM 90:10 and DMPC:Chol:SM 80:10:10 (mol%) was observed. In conclusion, the physical properties and the lateral organization of lipids in proteoliposomes are crucial to control mineral propagation mediated by TNAP activity during mineralization