Ce travail démontre l'utilité des propriétés photothermiques dans le proche Infrarouge (NIR) des complexes de nickel-bis(dithiolène) neutres pour des applications en science des matériaux et biotechnologies. Des complexes Ni-bis(dithiolène) neutres hydrophiles et hydrophobes ont été élaborés et leur effet photothermique, sous irradiation laser NIR, a été quantifié pour la première fois. Grâce à cette propriété remarquable et à leur grande stabilité sous irradiation, il a été mis en évidence, que ces complexes pouvaient trouver des applications pour la thérapie photothermique, la libération contrôlée de médicament mais également pour le développement de nanomatériaux photosensibles à un stimulus externe. En effet, cet effet photothermique, sous irradiation laser NIR, permet de détruire des cellules cancéreuses, d'augmenter la perméabilité de nanoparticules polymériques ou de liposomes contenant des principes actifs et de désagréger des métallogels à base de complexes Ni-bis(dithiolène). Enfin, nous avons montré que les complexes [Ni(R2-timdt)2]0 ayant une haute efficacité photothermique sont de nouveaux candidats très prometteurs pour ce type d'applications. / The photothermal properties in the near Infrared (NIR) of neutral nickel-bis(dithiolene) complexes were used in materials science and for the first time in biotechnology. Hydrophilic and hydrophobic neutral Ni-bis(dithiolene) complexes were developped and for the first time, their photothermal effect under NIR laser irradiation was quantified. Thanks to this remarkable property and their high stability under irradiaton, it has been demonstrated that these complexes could find applications to photothermal therapy, controlled drug delivery but also in the developpement of stimuli responsive nanomaterials. Indeed, this photothermal effect, under NIR laser irradiation, allow to destroy malignant cells, increase the permeability of polymeric nanoparticles or liposomes containing active ingredients and disintegrate métallogels based on Ni-bis(dithiolene) cores. Finally, we showed that the [Ni(R2-timdt)2]0 complexes having higher phothothermal activity are very promising new candidates for these applications.

Résumé : A ce jour, lutilité des cyclodextrines comme adjuvant pharmaceutique nest plus à démontrer. En biologie cellulaire, la méthyl-b-cyclodextrine est un outil couramment utilisé par les expérimentateurs. La déstructuration quelle induit au niveau des microdomaines membranaires que sont les radeaux lipidiques ou les cavéoles est mise à profit pour létude des fonctions cellulaires qui y sont associées. Le but de notre recherche est détudier les interactions de différentes cyclodextrines couramment utilisées dans le domaine pharmaceutique avec les constituants des membranes liposomales ou biologiques afin de mieux comprendre les conséquences de ces interactions au niveau cellulaire. Lhypothèse dune interaction des cyclodextrines avec les constituants lipophiles des membranes cellulaires a souvent été énoncée pour expliquer la cytotoxicité de certains dérivés. Nous avons pu montrer à laide de liposomes unilamellaires utilisés comme modèles membranaires, que linteraction des cyclodextrines avec leurs constituants, en particulier le cholestérol, est en relation avec une perte de lintégrité de la membrane. Ces premières études nous ont permis de prédire quels seraient les dérivés qui induiraient la cytotoxicité la plus importante. La cytotoxicité importante de certains dérivés méthylés (D.S. proche de 2) a été corrélée avec une capacité dextraction du cholestérol cellulaire relativement élevée. A linverse, nous avons montré que les dérivés faiblement substitués extraient peu le cholestérol, ce qui permet dexpliquer la meilleure tolérance observée au niveau biologique avec la Crysmeb et lHP-b-CD. Nous nous sommes ensuite intéressés à leffet de la b-CD et de ses dérivés méthylés sur la déstructuration des microdomaines membranaires. Nous avons étudié la relation entre leur capacité de déstructuration des cavéoles et dextraction du cholestérol cellulaire. Une extraction relativement élevée du lipide induit un effet important au niveau des microdomaines voire très important dans le cas de la Dimeb, le dérivé ayant leffet le plus délétère sur lintégrité des membranes artificielles et biologiques. Un effet moins marqué a également pu être corrélé avec une extraction plus faible du cholestérol par certains dérivés (Crysmeb, Trimeb). Les taux dextraction du cholestérol cellulaire mesurés sont en bonne corrélation, mis à part pour la Trimeb et la b-CD, avec les résultats des diagrammes de solubilité. La capacité de solubilisation du cholestérol par les cyclodextrines est en accord avec les interactions plus ou moins importantes observées en RMN. Les résultats de mesure de lintégrité des membranes artificielles correspondent à ceux obtenus avec les membranes biologiques excepté pour la b-CD, cette dernière nayant pu être testée dans les mêmes conditions que les autres cyclodextrines sur les liposomes. Il est maintenant admis que les cyclodextrines pourraient avoir un intérêt thérapeutique potentiel. En effet, la modulation des taux de cholestérol par lutilisation de cyclodextrines pourrait être mise à profit pour traiter des maladies ou infections impliquant ces microdomaines membranaires. Summary : Nowadays, the usefulness of cyclodextrins as pharmaceutical adjuvants is obvious. In cell biology, methyl-b-CD is a tool commonly used by scientists. The disruption of membrane microdomains (such as lipid rafts and caveolae) caused by cyclodextrins is used to study cellular functions. The aim of this research is to study the interactions of various cyclodextrins currently used in pharmaceutical development with the components of liposomal and biological membranes for a better understanding of the consequences of these interactions at the cell level. The hypothesis of an interaction between cyclodextrins and lipophilic components of cell membranes has often been suggested to explain the cytotoxicity of some cyclodextrin derivatives. Using unilamellar liposomes as model membranes, this research has shown that the interaction between cyclodextrins and their components, especially cholesterol, is linked with a loss of membrane integrity. This preliminary study has allowed predicting which derivatives will be the most cytotoxic. The high cytotoxicity of some methylated derivatives (D.S. close to 2) has been correlated with a relatively strong extraction capacity of cell cholesterol. On the other hand, it has been shown that low substituted derivatives do not extract much cholesterol, which is in agreement with the better biological compatibility observed with Crysmeb and HP-b-CD. The research has then focused on the effect of b-CD and its methylated derivatives on membrane microdomains disruption. The relation between caveolae disruption and cell cholesterol extraction capacities has been studied. A relatively strong extraction of the lipid highly disturbs the microdomains and this effect is even more important for Dimeb, the derivative showing the highest loss of integrity of artificial and biological membranes. A less marked effect has also been correlated with the lowest cholesterol extraction capacities of some derivatives (Crysmeb, Trimeb). The measured cell cholesterol extraction rates are in good correlation, except for Trimeb and b-CD, with the results of the solubility diagrams. The cholesterol solubilisation capacity of cyclodextrins is in accordance with the intensity of the interactions observed by NMR. The effects on the integrity of artificial membranes correspond to those obtained with biological membranes except for b-CD, which was not tested on liposomes in the same conditions as those used for the other cyclodextrins. It is now agreed that cyclodextrins could have a therapeutical potential. Indeed, the modulation of cholesterol levels could be applied for treating raft-related infections and diseases.

Vesicular delivery systems, like liposomes, represent an attractive approach to improving skin delivery of drugs. Liposomes are composed of one or several lipid bilayers surrounding an aqueous compartment. They are able to encapsulate hydrophilic compounds into their inner compartment and lipophilic compounds into their lipid bilayers. In the first part of this thesis, we developed a new dermal delivery system combining the advantages of cyclodextrin inclusion complexes and those of deformable liposomes. This system was called drugs-in-cyclodextrin-in-deformable liposome. Betamethasone was chosen as the model drug. These systems were successfully developed and characterised. In vitro diffusion studies using Franz diffusion cells and polycarbonate membranes gave promising results. In order to better mimic the in vivo conditions, ex vivo penetration studies using pig ear skin and Franz diffusion cells were developed. The tape stripping method was used to determine the amount of drug in the stratum corneum. The amount of drug in the epidermis, dermis and receptor medium was also assayed. These methods were successfully validated. Unfortunately, ex vivo penetration studies of the developed skin delivery system could not confirm the promising in vitro results. Our research was then directed towards studies allowing a better understanding of liposome skin penetration mechanisms. In the second part of this thesis, the influence of several parameters on the skin penetration behaviour of liposomes was investigated. The formulation importance on skin penetration efficiency was highlighted by the comparison of two liposomal systems. In the first system, betamethasone is encapsulated by the help of cyclodextrin inclusion complexes in the aqueous compartment. In the second system, betamethasone is encapsulated alone in the lipid bilayer. The second system shows high membrane permeability of the encapsulated betamethasone. Despite this decreased drug retention, the second system enhances the skin penetration of betamethasone. This high membrane permeability and the better penetration of the second formulation support the mechanism of penetration as a free drug substance. In addition, no difference in penetration is observed between liposomes containing betamethasone alone and a non liposomal dispersion. Several surfactants or edge activators were incorporated in the lipid bilayer of liposomes in order to obtain deformable liposomes. Unfortunately, these deformable liposomes are unable to enhance skin penetration compared to classical non deformable liposomes. The addition of charged lipids in the lipid bilayer of liposomes encapsulating either betamethasone or betamethasone dipropionate was investigated. The addition of negatively charged lipids enhances the penetration of the encapsulated drug. The use of negatively charged liposomes enhanced the epidermis accumulation of betamethasone 9.3 times compared with the ethanolic solution. This improvement is not observed with the corresponding non liposomal dispersion, indicating that the vesicle form is of high importance. In the case of the ester, the use of negatively charged liposomes enhances the epidermis accumulation 5.5 times compared with the Diprosone® lotion and only 1.6 times compared with the ethanolic solution. The penetration of a more lipophilic drug, with a high intrinsic penetration, is less enhanceable when incorporated in liposomes. Confocal microscopy was performed to visualise skin penetration of fluorescently labelled liposomes. The lipophilic dye rhodamine B encapsulated in the lipid bilayer as betamethasone penetrates the epidermis at the same level as NBD-phosphatidylcholine. On the other hand, the hydrophilic dye calcein encapsulated in the aqueous compartment as betamethasone-cyclodextrin complexes does not penetrate the epidermis. These observations seem to confirm the ex vivo results. In addition, the skin penetration of rhodamine B seems to be improved by the incorporation in negatively charged liposomes compared with classical ones. Finally, the efficiency of the negatively charged vesicles was evaluated in vivo on volunteers by the skin blanching assay. Carbomer gel containing the negatively charged vesicles seems to enhance the blanching response of encapsulated betamethasone in comparison with the ethanolic hydroxypropylcellulose gel. However, results are not significantly different. This could be explained by the small number of volunteers. On the other hand, in the case of formulations containing betamethasone dipropionate, no tendency could be highlighted. These results seem to confirm that the use of negatively charged liposomes is more attractive for improving the efficiency of a lesser lipophilic drug, betamethasone, in comparison with the more lipophilic ester, betamethasone dipropionate. These results need to be confirmed using a higher number of volunteers./ Les systèmes vésiculaires, comme les liposomes, représentent une approche intéressante pour améliorer ladministration cutanée de médicaments. Les liposomes sont des vésicules sphériques composées dune ou plusieurs bicouches lipidiques entourant une cavité aqueuse. Ils sont capables dencapsuler des molécules hydrophiles dans leur cavité aqueuse, ainsi que de retenir des molécules hydrophobes dans leur bicouche lipidique. Dans la première partie de la thèse, nous nous sommes intéressés au développement dun nouveau système dadministration cutanée combinant les avantages des complexes dinclusion dans les cyclodextrines et ceux des liposomes déformables, aboutissant à un nouveau concept appelé : « drugs-in-cyclodextrin-in-deformable liposome». La bétaméthasone a été utilisée comme molécule modèle. Ces nouveaux systèmes ont été mis au point et caractérisés avec succès. Les premières études de diffusion réalisées in vitro, à travers des membranes synthétiques et au moyen des cellules de diffusion de Franz, étaient prometteuses. Afin de se rapprocher des conditions in vivo, des études de pénétration des liposomes ont alors été mises au point, ex-vivo, au moyen de cellules de diffusion et à travers des peaux doreilles de cochons. La méthode du « tape stripping » a permis de déterminer la quantité de bétaméthasone dans le stratum corneum. La quantité de substance active dans lépiderme, le derme et le mileu récepteur des cellules de Franz a également été déterminée. Ces méthodes ont été validées avec succés. Malheureusement, les études sur peaux doreilles de cochons nont pas permis de confirmer nos premières conclusions. Les recherches ont alors été orientées vers des études permettant de mieux comprendre les mécanismes de pénétration cutanée des liposomes. Dans la seconde partie de la thèse, linfluence de différents paramètres sur la pénétration cutanée a été étudiée. La comparaison de la pénétration cutanée de deux systèmes liposomiaux différents a mis en évidence limportance de la formulation des liposomes sur leur efficacité. Dans le premier, la bétaméthasone est encapsulée comme précédemment à laide de cyclodextrines dans la cavité aqueuse des liposomes déformables. Dans le second système, la bétaméthasone est encapsulée seule au niveau de la bicouche lipidique des liposomes. Ce second système a montré une plus grande perméabilité de la molécule modèle encapsulée. Malgré cette plus faible rétention, le deuxième système a permis daugmenter la pénétration de la molécule modèle. La plus grande perméabilité et la meilleure pénétration du deuxième système permettent de conclure que la bétaméthasone pénétrerait sous une forme non encapsulée dans les liposomes. De plus, aucune différence na été observée entre la pénétration cutanée des liposomes encapsulant la bétaméthasone dans leur bicouche et une dispersion non liposomale. Plusieurs tensio-actifs ont également été incorporés au niveau de la bicouche des liposomes afin dobtenir des liposomes déformables. Malheureusement, la faible augmentation de pénétration observée par rapport aux liposomes classiques non déformables nest pas significative. Lajout de lipides chargés au niveau de la bicouche lipidique de liposomes encapsulant soit la bétaméthasone soit le dipropionate de bétaméthasone a été investigué. Laddition de lipides chargés négativement a permis daugmenter la pénétration de la molécule encapsulée. Lutilisation de liposomes chargés négativement a permis daugmenter la quantité de bétaméthasone au niveau de lépiderme dun facteur 9,3 par rapport à une solution éthanolique de bétaméthasone. Cette augmentation na pas été observée avec la dispersion non liposomale correspondante, indiquant que la formulation sous forme de vésicules est très importante. En ce qui concerne le dipropionate de bétaméthasone, lencapsulation dans les liposomes chargés négativement a augmenté la quantité dester dans lépiderme dun facteur 5,5 par rapport à la spécialité Diprosone® lotion et seulement dun facteur 1,6 par rapport à la solution éthanolique. Lencapsulation dans les liposomes chargés négativement semble donc moins avantageuse dans le cas dune molécule plus lipophile, comme le dipropionate de bétaméthasone et qui possède déjà une bonne pénétration cutanée intrinsèque par rapport à une molécule plus hydrophile comme la bétamethasone. La pénétration de liposomes rendus fluorescents a été visualisée grâce à la microscopie confocale. Un marqueur lipophile, la rhodamine B, encapsulé dans la bicouche comme la bétaméthasone, pénètre bien dans la peau de la même façon que la phosphatidylcholine fluorescente. Par contre, un marqueur hydrophile, la calcéine, encapsulé dans la cavité des liposomes comme les complexes bétaméthasone-cyclodextrines, ne pénètre pas dans lépiderme. Ces observations confirment les résultats de dosage ex vivo au moyen des cellules de Franz. De plus, la pénétration dans la peau de la rhodamine B semble être plus importante lorsquelle est encapsulée dans les liposomes chargés négativement par rapport aux liposomes non chargés. Enfin, lefficacité des liposomes négatifs a été évaluée in vivo sur des volontaires grâce à lévaluation du pouvoir de blanchiement des corticostéroïdes. Le gel de carbomère contenant les liposomes chargés négativement semble augmenter la réponse de la bétaméthasone par rapport au gel éthanolique dhydroxypropylcellulose. Cependant, les résultats ne sont pas significatifs. Une explication pourrait être le faible nombre de volontaires. Par contre, dans le cas des liposomes contenant le dipropionate de bétaméthasone, il a été plus difficile de dégager une tendance. Ces résultats semblent confirmer que lutilisation des liposomes chargés négativement est plus intéressante dans le cas dune molécule moins lipophile comme la bétamethasone par rapport à une molécule plus lipophile comme le dipropionate de bétaméthasone. Ces résultats nécessitent cependant dêtre confirmés sur un plus grand nombre de volontaires.

Existing methods of treating glioma are not effective for eradicating the disease. Therefore, new and innovative methods of treatment alone or in combination with existing therapies are necessary. Delivery of therapeutic agents through delivery carriers such as liposomes diminishes the harmful effects of the agent in healthy tissues and allows increased accumulation in the tumor. In addition, targeted chemotherapy using liposomes provides the opportunity for further increase in drug accumulation in tumor. However, the current targeting strategies suffer accelerated plasma clearance and are not advantageous in improving efficacy. The search for new tumor targets, novel ligands, new strategies for targeting, and particle stabilization will advance our ability to improve delivery at the tumor level while decreasing toxicity to normal tissues. The global objective of this thesis was to improve the status of current liposomal therapy to achieve higher efficacy in tumors. Here, we show a novel mechanism to increase targeting to tumor while uncompromising on the long circulation of stealth liposomes. Long circulation is essential for passive accumulation of the nanocarriers due to EPR effect, in order to see benefits of targeting. Using phage display technique, a variety of tumor specific peptides were identified for use as targeting moieties. One potential advantage of the approach proposed here is the rapid identification of patient tumor specific peptide that evades the RES. This could lead to the development of a nanocarrier system with high avidity and selectivity for tumors. Therefore, tumor accumulation of the targeted formulations will be higher than that of non‐targeted liposomes due to increased drug retention at the tumor site and uncompromised blood residence time.In addition, it has been shown that the distribution of nanocarriers, spatially within the tumor, is limited that might further hinder the distribution of the encapsulated drug, thereby limiting efficacy. It is necessary to release the drug from within the nanocarrier to promote increased efficacy. Here, we were able to address the problem of drug diffusion within the tumor interstitium using a combination therapy employing a remotely triggered thermosensitive liposomal chemotherapeutic. We fabricated a thermosensitive liposomal nanocarrier that maintained its stability at physiological temperature to minimize toxicity to healthy cells. We, then, showed a remote triggering mechanism mediated by gold nanorods heated via NIR can help in achieving precise control over the desired site for drug release. These strategies enabled increased drug availability at the tumor site and contributed to tumor retardation. Additionally, we show that the synergistic therapy employing gold nanorods and thermosensitive liposomes may have great potential to be translated to the clinic.

Στην παρούσα διατριβή, μελετήθηκε η χρήση ελαστικών λιποσωμάτων στη διαδερμική χορήγηση υδατοδιαλυτών ουσιών και πραγματοποιήθηκαν επίσης μελέτες προ-μορφοποίησης αντιϋπερτασικών βιοδραστικών ενώσεων για διαδερμική χορήγηση. Αρχικά, πραγματοποιήθηκαν μελέτες της φυσιολογίας του δέρματος με τεχνικές μικροσκοπίας και μέτρησης της απώλειας ύδατος μέσω της επιδερμίδας (TEWL) με σκοπό να διαπιστωθεί η λειτουργία του φραγμού της κεράτινης στοιβάδας, καθώς και η ορθότητα χρήσης των σχετικών τεχνικών προετοιμασίας των δειγμάτων δέρματος που χρησιμοποιήθηκαν. Η οπτική μικροσκοπία ειδικά μας έδωσε πληροφορίες ως προς τη δομή της επιδερμίδας και ως προς τον πιθανό μηχανισμό μεταφοράς ουσιών μέσω της χρήσης λιποσωμάτων. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε μελέτη και σύγκριση των διαφόρων φυσικοχημικών χαρακτηριστικών ελαστικών λιποσωμάτων που μπορεί να χρησιμοποιηθούν ως πρώτοι δείκτες για πρόγνωση της διαδερμικής απορρόφησης (in vivo) των υδρόφιλων βιοδραστικών ενώσεων. Ως μοντέλα υδρόφιλων βιοδραστικών ενώσεων χρησιμοποιήθηκαν οι φθορίζουσες χρωστικές καλσεΐνη και καρβοξυφλουορεσκεΐνη. Όλες οι λιποσωμικές διασπορές (τόσο τα συμβατικά λιποσώματα-CLs, όσο και τα ελαστικά λιποσώματα τύπου transfersome-TRs και τύπου invasomes-INVs) χαρακτηρίστηκαν ως προς τα εξής φυσικοχημικά χαρακτηριστικά: Την κατανομή μεγέθους, το ζ-δυναμικό, το σφαιρικό σχήμα και τη μορφολογία τους, την ικανότητα εγκλωβισμού υδρόφιλων ουσιών, τη σταθερότητά τους (ως προς τα μορφολογικά χαρακτηριστικά, τη διασπορά μεγέθους και το φορτίο επιφανείας, και τη συγκράτηση της εγκλωβισμένης σε αυτά ουσίας) σε σχέση με το χρόνο, την ελαστικότητα και τέλος ως προς τη δυνατότητα διαπέρασης εγκλωβισμένων σε αυτές υδρόφιλων ουσιών μέσω ανθρώπινου δέρματος in vitro. Το μέγεθος των λιποσωμάτων ήταν παρόμοιο και αρκετά ομοιογενές, ενώ η προσθήκη διαφορετικών τύπων ενισχυτικών διαπέρασης στα ελαστικά λιποσώματα, στα συνήθη εύρη συγκεντρώσεων που χρησιμοποιούνται, δεν επηρεάζει καθόλου το επιφανειακό φορτίο των παραχθέντων λιποσωμάτων. Αύξηση του μεγέθους και αστάθεια ως προς τη συγκράτηση της εγκλωβισμένης ουσίας παρατηρήθηκε στην περίπτωση προσθήκης μεγαλύτερης ποσότητας ενισχυτικού διαπέρασης, η οποία αλλάζει και τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των λιποσωμάτων. Τα TRs που περιείχαν χολικό νάτριο ήταν πιο ελαστικά από τα αντίστοιχα με Tween 80, τα οποία είχαν συγκριτικά χαμηλές τιμές ελαστικότητας (<40mg/s∙cm2). Οι υψηλότερες τιμές ελαστικότητας από όλους τους τύπους ελαστικών λιποσωμάτων που παρασκευάστηκαν στα πλαίσια αυτής της διατριβής, παρατηρήθηκε στην περίπτωση των INVs με 1% w/w PE και 1% w/w LIM. Επιπλέον, τα περισσότερα λιποσώματα τύπου INVs είχαν υψηλότερες τιμές ελαστικότητας σε σχέση με τα αντίστοιχα χωρίς τερπένια (INVs αναφοράς), εκτός από την περίπτωση των INVs με citral και cineol, όπου η ελαστικότητα σημείωσε μείωση σε σχέση με τα INVs χωρίς τερπένια. Οι διάφοροι τύποι λιποσωμάτων φαίνεται να μεταβάλλουν τη διαπέραση της χρωστικής με την εξής σειρά: Διάλυμα<CLs<TRs<<INVs. H διαπερατότητα (permeability), η ροή (flux) και ο λόγος προσαύξησης (ER) δείχνουν ότι τα συμβατικά λιποσώματα αύξησαν ελάχιστα τη ροή της καλσεΐνης, ενώ τα TRs και INVs κατά 1.8 και 7.2 φορές, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν το γεγονός ότι τα συμβατικά λιποσώματα είναι ανεπαρκή συστήματα μεταφοράς υδρόφιλων μορίων μέσω του δέρματος, ενώ παράλληλα δείχνουν ότι τα ελαστικά λιποσώματα με τη μεγαλύτερη τιμή ελαστικότητας είναι πιο αποτελεσματικά στη μεταφορά της ουσίας μέσω του δέρματος. Σε επόμενα πειράματα μελετήθηκε η δυνατότητα διείσδυσης τόσο υδρόφιλων όσο και λιπόφιλων μορίων στις στοιβάδες του δέρματος, σε μια προσπάθεια να διερευνηθεί ο μηχανισμός αύξησης της διαδερμικής διαπέρασης των υδρόφιλων χρωστικών από τους διάφορους τύπους ελαστικών λιποσωμάτων. Ως μοντέλο υδρόφιλης ουσίας χρησιμοποιήθηκε η φθορίζουσα χρωστική καλσεΐνη, ενώ η λιπιδική ροδαμίνη χρησιμοποιήθηκε ως μοντέλο λιπόφιλης ουσίας (που δεν φεύγει από τα λιποσώματα και ουσιαστικά μας δείχνει το βάθος εις το οποίο εισχωρούν μέσα στο δέρμα τα αντίστοιχα είδη λιποσωμάτων). Τα λιποσώματα τύπου TR φαίνεται ότι επάγουν τη διαπέραση με το να βοηθούν τη χρωστική να προχωρά (υπό μορφή λιποσωμάτων που την εγκλωβίζουν) σε βαθύτερα στρώματα της κεράτινης στιβάδας σε σχέση με τα συμβατικά λιποσώματα όπου σε μεγάλο ποσοστό διαρρηγνύονται και απελευθερώνουν την υδρόφιλη ουσία η οποία στη συνέχεια διέρχεται μόνη της, ως ελεύθερο μόριο, στις στιβάδες του χορίου. Αντίθετα, τα λιποσώματα τύπου INV αποδείχτηκε ότι εισδύουν σε βαθύτερες στιβάδες της επιδερμίδας, φθάνοντας σε αρκετά υψηλά ποσοστά σε στιβάδες του χορίου, παρασύροντας μαζί τους και τα μόρια του εγκλωβισμένου σε αυτά υδρόφιλου φαρμάκου. Τέλος, μελετήθηκε η δυνατότητα μορφοποίησης ενός πειραματικού φαρμάκου με ανάλογη δομή γνωστού φαρμάκου προκειμένου για διαδερμική αντιϋπερτασική θεραπεία. Αρχικά, μελετήσαμε το πειραματικό φάρμακο ως προς τις φυσικοχημικές του ιδιότητες (διαλυτότητα σε διάφορα μέσα, σύνδεση με πρωτεΐνες) και στη συνέχεια μελετήσαμε τη δυνατότητα χορήγησης μιας φαρμακοτεχνικής μορφής μέσω του δέρματος σε κατάλληλο σύστημα διαλυτών. Αφού βρέθηκαν οι κατάλληλες συνθήκες, χρησιμοποιήθηκαν ενισχυτικά διαπέρασης στη φαρμακοτεχνική μορφή για να επιταχυνθεί η διαδερμική απορρόφηση του φαρμάκου, όσο είναι δυνατόν, και να ευρεθεί η βέλτιστη φαρμακοτεχνική μορφή. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν πειράματα σύγκρισης μεταξύ του πειραματικού φαρμάκου και γνωστού αντιϋπερτασικού (Los) ως προς τις φυσικοχημικές ιδιότητες και την ικανότητα μεταφοράς τους διαδερμικά. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το ΠΦ παρουσίασε μεγαλύτερη διαπέραση υπό μορφή ουδέτερου μορίου (σε σχέση με την αντίστοιχη του άλατος με TFA (όπως φάνηκε από τα αρχικά πειράματα αυτής της σειράς) ή του μετά Καλίου άλατος (όπως προκύπτει μετά από σύγκριση των σχετικών τιμών Ροής και Συντελεστή Διαπερατότητας (P). Συγκρίνοντας λοιπόν τις τιμές διαπερατότητα και ροής διαμέσου ανθρώπινης επιδερμίδας με τις αντίστοιχες τιμές του φαρμάκου Los θα πρέπει να λάβουμε υπ’ όψη και τις τιμές για το ουδέτερο μόριο. Η διαπέραση του ουδέτερου μορίου του ΠΦ είναι σημαντικά χαμηλότερη από την αντίστοιχη του μετά καλίου άλατος της los. / In this study, we investigated the use of elastic liposomes in transdermal delivery of hydrophilic substances and we studied the possibility of formulating a new antihypertensive drug for transdermal delivery. Primarily, morphological studies of human skin were conducted by the use of optical microscopy and transepidermal water loss measurements (TEWL), in order to assess the barrier function of stratum corneum (SC), and the integrity of the techniques used in this study. By optical microscopy, in particular, data concerning the skin structure and the possible mechanism by which substances can be delivered through / into the skin, were obtained. Secondly, we studied and compared various physicochemical characteristics of two different types of elastic liposomes, which could help us predict the transdermal absorption (in vivo) of hydrophilic molecules. Fluorescent markers calcein and carboxyfluorescein were used as hydrophilic model drugs. All liposomal dispersions (conventional liposomes CLs, and elastic liposomes i.e. transfersomes TRs and invasomes INVs) were evaluated in means the following physicochemical properties: size distribution, z-potential, stability upon storage, morphology by cryo-electron microscopy and membrane elasticity. Moreover, their ability to encapsulate and also to retain aqueous soluble markers, was investigated. Finally, the permeation of calcein through human skin was tested and compared by use of elastic and conventional rigid liposomes. The mean diameter was found relatively homogenous, similar for most liposomal dispersions, while the addition of different penetration enhancers during the preparation did not influence z-potential. Increase of size average and instability – as far as the retention of the encapsulated substance is concerned – was observed at higher concentrations of penetration enhancers used. Sodium cholate containing TRs were found more elastic compared to Tween 80 containing TRs, which showed relatively low elasticity values (<40mg/s∙cm2). The highest elasticity values among all types of elastic liposomes prepared, were found in the case of INVs with 1%w/w PE and 1% w/w LIM. Furthermore, most INVs showed higher elasticity values compared to the ones without terpenes (control INVs), except from citral and cineol INVs, where elasticity decreased compared to the control ones. It appears that different types of liposomes can alter fluorescent permeation in the following order: Solution<CLs<TRs<<INVs. Permeability, flux and enhancement ratio (ER) show that conventional liposomes increased slightly calcein flux, while TRs and INVs 1.8 and 7.2 times respectively. These findings confirm the fact that CLs are inefficient drug delivery systems for water soluble molecules through human skin, and show that elastic liposomes having the highest elasticity value are more efficient in delivering CF transdermally. In further experiments, the penetration of both hydrophilic and lipophilic molecules in human skin was studied, in order to investigate the mechanism of action by which liposomes could enhance the drug delivery in skin. Fluorescent marker calcein was used as a hydrophilic drug model, while lipid rhodamine-PE was used as a lipophilic model (it shows us how deeply the liposomes penetrate into the skin). Liposomes TRs seem to enhance skin permeation by helping the marker to penetrate (through liposomes) in deeper stratum corneum layers while conventional liposomes the hydrophilic substance which penetrates the skin layers as a free molecule. In contrast, INV liposomes were proved to be able to penetrate in deeper skin layers, and deliver relatively high amounts of the encapsulated substance. In the end, experiments with a new molecule with similar structure to losartan were conducted. This study aimed at discovering a new formulation for this experimental drug in order to be used as a transdermal antihypertensive. First, we studied the physicochemical properties (solubility in PBS, BSA etc, and protein binding). Secondly, we investigated the possibility of preparing a formulation to be used transdermally. After establishing the techniques and drug properties we used penetration enhancers in order to increase the transdermal absorption as possible and help find the right skin formulation. Last, we compared the experimental drug and losartan in terms of physicochemical properties and their ability to be transported through human skin. The results showed that the experimental drug had better permeation rate as a neutral molecule compared to TFA salt, (as shown in preliminary experiments) or K+ (as shown after comparing P and flux values). Therefore, the values given for the neutral molecule should be taken into consideration when comparing the two drugs. (losartan and experimental drug). The permeation of the neutral molecule nevertheless is significantly lower than the one for losartan.

L’objectif de cette thèse a été d’optimiser la réponse immunitaire anti-tumorale induite par les cellules dendritiques (DC) et les cellules iNKTs, en réponse à la prise en charge du KRN7000 (a-galactosyl-céramide) par la molécule CD1d située sur les DCs. Le premier axe de travail visait à synthétiser de nouveaux analogues du KRN7000, en fonctionnalisant la position C6 du sucre et en greffant un groupement phényl sur l’une des chaînes grasses. Les études in vitro ont montré que les modifications apportées par rapport au KRN7000 n’ont pas altéré la prise en charge des molécules obtenues par les DCs. Dans tous les cas, une sécrétion de cytokines a pu être observée. Des études complémentaires visant à décrire le profil cytokinique in vivo sont en cours. Le second axe a consisté en la mise au point d’une stratégie de vectorisation du KRN7000 afin de favoriser sa présentation aux DCs, en l’associant à des molécules d’intérêt comme un peptide spécifique d’une tumeur, une molécule de ciblage des DCs ou des ligands des TLRs. Dans les conditions utilisées, le phénomène d’anergie induit classiquement par l’administration répétée du KRN7000 n’a pas pu être levé. Cependant, nous avons montré d’une part que le KRN7000 vectorisé dans les liposomes est toujours pris en charge par les cellules dendritiques, et d’autre part qu’une réponse immunitaire se traduisant par la production de cytokines par les cellules iNKTs est induite. / The aim of this project was to optimize the anti-tumor immune response induced by dendritic and iNKTs cells, in response to KRN7000 (a-galactosyl-ceramide), which interacts with CD1d molecule situated on DCs. At first we synthesized new analogues of KRN7000, by functionalizing the C6 position of the carbohydrate moiety and by grafting a phenyl group on one of the fatty chain. In vitro studies indicated that chemical modifications of KRN7000 did not alter its interaction with CD1d. In all cases, cytokine secretion was observed. Further studies are in progress to describe the in vivo cytokine profile. In a second step, we developed liposomal constructs incorporating KRN7000 to optimize its presentation to DCs. Some constructions containing KRN7000 were able to associate a peptide, a targetting molecule of DCs or TLR ligands. Even if the anergy phenomenon induced by repeated administrations of KRN7000 could not be regulated by the use of liposomes, we have shown that encapsulated KRN7000 is still supported by DCs and that an immune response resulting in cytokines secretion by iNKT cells is induced.

Les lipides cationiques sont des molécules amphiphiles chargées positivement et couramment utilisées comme vecteur de transfection tant in vitro qu'in vivo avec une bonne efficacité. <p><p>Cependant, la transfection in vivo par voie intraveineuse à l'aide de complexes lipides cationiques/ADN (lipoplexes) induit une réponse inflammatoire, attribuée à la présence de séquences CpG dans les plasmides transportés, et qui limite l'efficacité de transfection des complexes.<p><p>Il a été montré dans notre laboratoire que la pré-injection de liposomes de diC14-amidine, un lipide cationique mis au point dans notre laboratoire, avant l'injection des lipoplexes diC14-amidine/ADN permettait d'augmenter l'efficacité de transfection tout en diminuant la production de TNF-¦Á dans le sérum [Elouahabi et al. 2003b]. Ce résultat suggérait une nouvelle propriété anti-inflammatoire de la diC14-amidine dans le cas d'une inflammation causée par les lipoplexes de diC14-amidine/ADN. <p><p>Dans le présent travail, nous d¨¦montrons que les macrophages de la rate sont les principales cellules productrices de TNF-¦Á suite à l'injection intraveineuse des lipoplexes à des souris. Ces mêmes cellules sont également la principale cible des liposomes de diC14-amidine après injection intraveineuse. Nous avons dès lors centré notre étude sur ce type cellulaire, en utilisant une lignée établie de macrophages murins. <p><p>Nos résultats ont permis de confirmer la capacité des liposomes de diC14-amidine à inhiber la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires induites par des séquences CpG, des lipopolysaccharides ou des poly(I :C). Fait intéressant, la présence de sérum est indispensable à la propriété anti-inflammatoire des liposomes de diC14-amidine. Par fractionnement successifs des composants du sérum, nous avons pu montrer que seuls les phospholipides des lipoprotéines pouvaient conférer cette propriété aux liposomes de diC14-amidine. <p> / Doctorat en sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L'objectif de ce travail de thèse a été d'élaborer et de caractériser des systèmes de nanovecteurs de nature lipidique, encapsulant le dipropionate de beclomethasone (DPB), adaptés à l'administration pulmonaire par nébulisation. Deux types de nanovecteurs lipidiques : des liposomes et des nanoparticules lipidiques incluant les nanoparticules solides (SLN) et les nanoporteurs lipidiques (NLC), ont été développés. Les liposomes ont été préparés par la technique d'injection d'éthanol. La technique appliquée pour la préparation des nanoparticules lipidiques était l'homogénéisation à haute vitesse. La taille, l'efficacité d'encapsulation du DPB ainsi que les profils de libération ont été satisfaisants. De plus la nébulisation de ces systèmes et la modélisation mathématiques de la déposition in vitro ont révélé des résultats prometteurs. Finalement, une technique de production des liposomes utilisant un réacteur membranaire a été étudiée pour une production à grande échelle / The objective of this work was to prepare and to characterize lipidic nanocarriers systems encapsulating the beclomethasone dipropionate (BDP) and adapted to the nebulized pulmonary drug delivery. Two types of lipidic carriers: the liposomes and the lipidic nanoparticles including the solid lipid nanoparticles (SLN) and the nanostructured lipid carriers (NLC) were developed. Liposomes were prepared by the optimised ethanol injection based technology. The lipid nanoparticles were prepared by using the high shear homogenization process. Small sized particles, with high BDP encapsulation efficiency as well as a prolonged release effect in vitro were successfully obtained. Furthermore, the nebulized suspensions characteristics and deposition mathematical simulation in vitro revealed promising results. Finally, a liposomes production technique using a membrane contactor was investigated in order to produce large batches

L'objectif de ce travail est de développer des vecteurs pharmaceutiques, encapsulant la vitamine E, adaptés à l'administration pulmonaire par aérosolisation. La vitamine E, antioxydant physiologique, peut être utilisée pour lutter contre les phénomènes du stress oxydatif en particulier ceux observés au niveau pulmonaire. L'encapsulation de la vitamine E dans des vecteurs inhalables a été envisagée afin d'optimiser son efficacité thérapeutique en améliorant la concentration du principe actif pouvant atteindre son site d'action, les alvéoles pulmonaires. Les différents systèmes d'encapsulation de la vitamine E ont été préparés par des méthodes utilisant des contacteurs à membrane. Le principe de préparation se résume au passage de la phase dispersée, à travers les pores d'une membrane microporeuse, au sein de la phase continue. Les avantages de cette technique sont en particulier une bonne reproductibilité et un faible apport d'énergie et par conséquent un coût d'exploitation modéré. De plus, les procédés à base de contacteurs à membrane se prêtent aisément au passage à l'échelle de production industrielle. Au cours de ce travail, les paramètres influençant le procédé de fabrication par contacteur à membrane ont été étudiés ; principalement la pression transmembranaire de passage de la phase discontinue, la force de cisaillement de la phase continue et la microstructure de la membrane utilisée. Différentes configurations membranaires ont été testées telles que (i) les modules membranaires tubulaires avec écoulement tangentiel de la phase continue, (ii) les membranes planes montées dans des cellules d'agitation et (iii) les membranes dotées d'un mouvement d'oscillation à l'intérieur de la phase continue. En cas d'émulsification directe, diverses membranes ont été utilisées : des membranes SPG, des membranes microsieves et des membranes en céramique. Pour la « premix emulsification » des membranes dites dynamiques, constituées par un lit de billes en verre, ont été étudiées / The present study investigated the preparation of pharmaceutical drug carriers encapsulating the vitamin E and intended for pulmonary administration after nebulisation. Vitamin E, a physiological antioxidant, could be used to prevent cigarette smoke toxicity since several pulmonary disorders are mainly caused by oxidative stress phenomena. The methods used for the drug carriers’ preparation were based on the membrane emulsification principle. In these methods, the to-be-dispersed phase was injected in the continuous phase through the pores of a microporous membrane. The advantages of this method are: a better control over the diffusive mixing at the liquid / membrane interface and thus a fine control of droplets size distribution, a less energy consumption and an easy extrapolation of the obtained results for an industrial large scale-up. In order to investigate the preparation processes, key parameters influence on particles characteristics was investigated. Different experimental set-ups were used: (i) tubular membranes with a cross flow circulation of the continuous phase, (ii) stirred cell device with a flat micro-engineered membrane, (iii) oscillating membrane module in a stationary continuous phase. For direct emulsification, various membranes were used such as : SPG membranes, micro-engineered membranes and ceramic membranes. For premix emulsification, a packed bed of glass beads, called dynamic membrane, was studied. Four different drug carriers were developed during this study: liposomes, micelles, nano-emulsion and solid-lipid particles. The different encapsulating systems were characterized in terms of size distribution, zeta potential, microscopic morphology, encapsulation efficiency and stability. Results showed that the obtained drug carriers presented convenient properties. After nebulization of vitamin E encapsulating systems, the obtained aerosols presented satisfying aerodynamic characteristics which allowed the prediction (using a mathematical model) of a high level of vitamin E deposit on its action site

Un des enjeux majeurs de la thérapie contre le cancer est le développement d’immunothérapies innovantes ciblées et efficaces sur le long terme. Dans ce but, nous avons tiré profit de la versatilité des liposomes pour concevoir une plateforme vaccinale modulable associant i) un épitope peptidique CD4 universel capable de stimuler les lymphocytes T CD4+, ii) un épitope peptidique CD8 dérivé de la tumeur, induisant la différenciation des lymphocytes T CD8+ en lymphocytes T cytotoxiques et iii) un ou des agonistes des récepteurs Toll-like ou NOD-like qui agissent comme des adjuvants en activant les cellules dendritiques. Après plusieurs étapes de criblage, trois vaccins ont été développés, spécifiques d’un modèle orthotopique de cancer du poumon (TC-1) et différant uniquement par leur adjuvant. Une étude comparative dans un modèle murin a été réalisée. Ces travaux ont permis de comparer leur limite temporelle d’efficacité, de mettre en évidence leur mécanismes immunitaires respectifs et de démontrer la supériorité thérapeutique des liposomes contenant un agoniste du TLR4 (MPLA). Ces travaux ont montré l’intérêt d’une plateforme liposomique modulable pour la conception de vaccins personnalisés. / Currently, a challenging goal in the area of cancer treatment is the development of innovative targeted antitumoral immunotherapies with a long-term efficiency. In this context, we took advantage of liposomal nanoparticles properties for the conception of a tunable vaccine platform allowing the strategical conception of vaccines containing: i) a CD4 epitope peptide able to stimulate CD4+ T helper cells ii) a tumor CD8 epitope peptide, which induces the differentiation of CD8+ T cells in cytotoxic T cells and iii) Toll or Nod-Like receptor agonist(s), which act as adjuvant for the activation of dendritic cell. After several screening steps, three vaccines, specific tardeting an orthotopic lung tumor model (TC-1) and differing only by their adjuvant composition, were successfully developed. Subsequently, a comparative study of their efficacy time limit and their immunologic mode of action was performed. This study showed the therapeutic supremacy of liposomal vaccines containing a TLR4 agonist (MPLA). In this work, we demonstrated the value of a customizable liposomal platform for the conception of personalized vaccines and we highlighted the necessity of immune monitoring for a better understanding of vaccines impact and the prediction of their efficacy.