Les composés amphiphiles, N-[Iodures de 3-(diméthylamino) propyl]-perfluoroalcanes amides (Fn-AH3-AmI) et Na,Nb-Bis [Iodures de 3-(diméthylamino) propyl]- perfluoroalcanes diamides (Fn(AH3-AmI)2) ont étéobtenus à partir des (di)esters et de la N,N’-diméthyl-3-propylamine puis parquaternisation par l’iodure de méthyle.Le comportement des composés à une tête cationique Fn-AH3-AmI (n = 8,10, 12, 14) en milieu aqueux a été examiné en étudiant l’effet de latempérature T, d’électrolyte KI et d’éthanol, ainsi que l’effet de la longueur etde la nature chimique de la chaîne hydrophobe (perfluorée ouhydrocarbonée) sur les propriétés de surface et d’agrégation. Les composéshydrocarbonés forment des micelles. Micelles et vésicules coexistent dans lecas des homologues fluorés.Les propriétés tensioactives et agrégatives des bolaformes Fn(AH3-AmI)2 (n =6, 8, 10) ont été examinées en fonction de T, KI et de la structure de lachaîne hydrophobe. La formation des agrégats est supposée être associée àla capacité de repliement des bolaformes.Les composés Fn-AH3-AmI et Fn(AH3-AmI)2 sont impliqués dans laformulation de vésicules dont la taille est examinée en fonction de la teneuren co-lipide 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphatidyléthanolamine (DOPE). / Amphiphilic compounds N,N,N-trimethyl-(3-N-perfluoroalkylamidopropyl)ammonium iodide (Fn-AH3-AmI) and N1,N12-Bis [3-(trimethylammonium)propyl iodide]- perfluoroalcane diamide (Fn(AH3-AmI)2) are obtained byreaction between (di)esters and 3-N,N-dimethyl-1-propylamine and thenquaternization by methyl iodide.The aqueous solution behaviour of one head compounds Fn-AH3-AmI interms of surface and aggregative properties is examined as a function oftemperature T, KI amount and ethanol, and also by varying their tail length(n = 8, 10, 12, 14) and their hydrocarbon or perfluorocarbon type.Hydrocarbon compounds associate into micelles. Micelles and vesicles cancoexist in the case of the perfluorocarbon homologues.The surface and aggregatives properties of the bolaforms Fn(AH3-AmI)2 (n =6, 8, 10) are also examinated as a function of T, KI and the hydrophobic tailstructure. The aggregate formation is thought to be attributed to the bendingability of the bolaforms.Fn-AH3-AmI and Fn(AH3-AmI)2 compounds are involved in the formulationof vesicles whose size is examinated as a function of the co-lipid 1,2-dioleoylsn-glycero-3-phosphatidylethanolamine (DOPE) amount.

Le développent des biothérapies a connu un essor sans précédent ces dernières années, permettant l'émergence de nombreuses solutions thérapeutiques répondant à de multiples défis en santé humaine et animale afin de lutter contre des maladies héréditaires ou acquises. Parmi ces stratégies, le transfert de gênes revêt un intérêttout particulier, permettant à la fois de réparer des cellules défectueuses en leur apportant une copie saine du gène, ou bien d'activer efficacement le système immunitaire par l'expression d'un antigène d'intérêt thérapeutique. Néanmoins, malgré le développement de nombreux outils de thérapie génique ou d'immunothérapie, de nombreuses limitations persistent à ce jour. Au cours de cette thèse, les résultats obtenus ont permis le développement et l'optimisation d'outils afin d'outrepasser ces limites. Tout d'abord, nous avons pu élucider les mécanismes d'actions du copolymère à blocs 704, une nouvelle classe de vecteurs qui permet d'induire une réponse vaccinale optimale en délivrant de manière directe des acides nucléiques au sein des cellules musculaires et en stimulant des récepteurs à ADN intracellulaires. De plus, ces travaux ont permis de démontrer qu'une nouvelle classe de molécules adjuvantes, les Iipoaminoglycosides, permet de stimuler efficacement le système immunitaire en plus de conduire à la régression de la croissance de tumeurs mammaires murines. Enfin, ces résultats ont pu montrer l'importance de l'assemblage supramoléculaire des lipoplexes sur l'efficacité de transfection afin de développer un vecteur universel pour la délivrance de différentes classes d'acides nucléiques. Dès lors, l'optimisation de la délivrance de macromolécules au sein de cellules et la compréhension de l'interaction entre le système immunitaire! le vecteur I les acides nucléiques nous ont permis d'établir des stratégies afin de développer des formulations spécifiques à chaque application biothérapeutique. / The development 01 biotherapies experienced an unprecedented growth in recent years, allowing the emergence al many therapeutic solutions to many challenges in human and animal health in arder to fight against hereditary or acquired diseases. Among these strategies, gene transfer is of particular interest, making it possible either to repair defective cells by providing them a healthy copy 01 the gene, ar to effectively activate the immune system by expressing an antigen of therapeutic interest. Nevertheless, despite the development of numerous tools for gene therapy or immunotherapy, many limitations persist. During this thesis, the results obtained allowed the development and optimization of tools in order to go beyond these limits. First, we have been able to elucidate the mechanism of action 01 the block copolymer 704, a new class 01 vectors which allows to induce an optimal vaccine response by directly delivering nucleic acids into muscle cells and by stimulating intracellular DNA sensors. Moreover, this work has demonstrated that a new class of adjuvant molecules, lipoaminoglycosides, can stimulate efficiently the immune system in addition to lead to the regression of murine mammary tumors growth. Finally, these results showed the importance of the supramolecular assembly of lipoplexes on the \ransfection efficiency in order to develop a universal vector for the delivery of different classes of nucleic acids. Therefore, the optimization of macromolecules delivery within cells and the understanding of the interaction between the immune system i vector I nucleic acids allowed us to establish strategies in order to develop specific formulations tor each biotherapeutic applications.

Les lipides cationiques sont des molécules amphiphiles chargées positivement et couramment utilisées comme vecteur de transfection tant in vitro qu'in vivo avec une bonne efficacité. Cependant, la transfection in vivo par voie intraveineuse à l'aide de complexes lipides cationiques/ADN (lipoplexes) induit une réponse inflammatoire, attribuée à la présence de séquences CpG dans les plasmides transportés, et qui limite l'efficacité de transfection des complexes. Il a été montré dans notre laboratoire que la pré-injection de liposomes de diC14-amidine, un lipide cationique mis au point dans notre laboratoire, avant l'injection des lipoplexes diC14-amidine/ADN permettait d'augmenter l'efficacité de transfection tout en diminuant la production de TNF-¦Á dans le sérum [Elouahabi et al., 2003b]. Ce résultat suggérait une nouvelle propriété anti-inflammatoire de la diC14-amidine dans le cas d'une inflammation causée par les lipoplexes de diC14-amidine/ADN. Dans le présent travail, nous d¨¦montrons que les macrophages de la rate sont les principales cellules productrices de TNF-¦Á suite à l'injection intraveineuse des lipoplexes à des souris. Ces mêmes cellules sont également la principale cible des liposomes de diC14-amidine après injection intraveineuse. Nous avons dès lors centré notre étude sur ce type cellulaire, en utilisant une lignée établie de macrophages murins. Nos résultats ont permis de confirmer la capacité des liposomes de diC14-amidine à inhiber la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires induites par des séquences CpG, des lipopolysaccharides ou des poly(I :C). Fait intéressant, la présence de sérum est indispensable à la propriété anti-inflammatoire des liposomes de diC14-amidine. Par fractionnement successifs des composants du sérum, nous avons pu montrer que seuls les phospholipides des lipoprotéines pouvaient conférer cette propriété aux liposomes de diC14-amidine.

La mucoviscidose est une maladie monogénique, caractérisée par des mutations survenant au niveau du gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Le clonage en 1989 du gène CFTR a permis d’envisager de traiter cette maladie par thérapie génique. Cela consiste à transférer à l’aide d’un vecteur, une version normale du gène CFTR dans les cellules atteintes des patients. En raison de la gravité des complications pulmonaires, c’est l’épithélium respiratoire qui constitue aujourd’hui le tissu cible pour le transfert de gènes. Le principe de la thérapie génique est évidemment très séduisant et un certain nombre d’essais cliniques ont d’ores et déjà été réalisés. La thérapie génique nécessite des outils de vectorisation efficaces et compatibles avec une utilisation répétée en clinique.Mon sujet de thèse a porté donc sur le développement, la biodistribution et l’optimisation de vecteurs synthétiques (lipides cationiques) pour le transfert de gènes dans l’épithélium respiratoire. Au cours de mes travaux, nous avons donc pu mettre au point des lipophosphoramidates KLN47 fluorescents utiles pour les études de biodistribution in vivo. Comparés au KLN47 non fluorescent, ces nouveaux composés présentent les mêmes propriétés physicochimiques, à savoir une taille relativement petite et un potentiel zêta positif. Sur lignées cellulaires, nous avons montré que les nouvelles formulations étaient aussi efficaces que le KLN47, et pas ou peu toxiques. Ensuite, sur modèle animal, les profils de biodistribution de lipoplexes pégylés et non-pégylés ont été comparés après injection systémique. Les profils de biodistribution des lipoplexes pégylés et non-pégylés étaient similaires, cependant, la pégylation des complexes a conduit à une circulation prolongée dans la circulation sanguine, alors que l’expression du transgène (luciférase) était équivalente dans les deux cas. De plus, l’activité luciférase était similaire à celle obtenue avec le KLN47 non fluorescent. Nous avons ainsi démontré que l’ajout des sondes lipidiques fluorescentes dans la solution liposomale du KLN47, ne modifie pas ses propriétés physicochimiques et transfectantes. L’ensemble des résultats montre que nous disposons d’outils prometteurs pour les études de biodistribution in vivo. D’autres molécules ont également été testées avec succès. / Cystic fibrosis is a monogenic disease characterized by mutations occurring at the CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) gene. The clonining in 1989 of the CFTR gene has enabled to consider treating this disease by gene therapy. This consists of transferring a normal version of the CFTR gene in the affected patients’ cells, using a vector. Due to the severity of pulmonary complications, it is obvious that the respiratory epithelium constitutes the target tissue for the gene transfer. The principle of gene therapy is indeed very attractive and a number of clinical trials have already been made. Gene therapy requires vectorization tools that are efficient and compatible with repeated clinical use.My thesis has focused on the development, biodistribution and optimization of synthetic vectors (cationic lipids) for gene transfer in the respiratory epithelium. During my work, we were able to develop useful fluorescent KLN47 lipophosphoramidates for in vivo biodistribution studies. Compared to non fluorescent KLN47, these new compounds exhibit the same physicochemical properties: a relatively small size and a positive zeta potential. On cell lines, we found that the new formulations were as effective as the KLN47, with little or no toxicity. Then, in animal models, the biodistribution profiles of pegylated and non-pegylated lipoplexes were compared after systemic injection. The biodistribution profiles of pegylated and non-pegylated lipoplexes were similar. However, the pegylation of the complex resulted in prolonged circulation in the bloodstream, whereas transgene expression (luciferase) was equivalent in both cases. In addition, luciferase activity was similar to that obtained with the non-fluorescent KLN47. We have demonstrated that the addition of fluorescent lipid probes in the liposomal solution KLN47, does not change its physicochemical and transfectant properties. The overall results show that we have promising tools for in vivo biodistribution studies. Other molecules have also been tested successfully.

Les lipides cationiques sont des molécules amphiphiles chargées positivement et couramment utilisées comme vecteur de transfection tant in vitro qu'in vivo avec une bonne efficacité. <p><p>Cependant, la transfection in vivo par voie intraveineuse à l'aide de complexes lipides cationiques/ADN (lipoplexes) induit une réponse inflammatoire, attribuée à la présence de séquences CpG dans les plasmides transportés, et qui limite l'efficacité de transfection des complexes.<p><p>Il a été montré dans notre laboratoire que la pré-injection de liposomes de diC14-amidine, un lipide cationique mis au point dans notre laboratoire, avant l'injection des lipoplexes diC14-amidine/ADN permettait d'augmenter l'efficacité de transfection tout en diminuant la production de TNF-¦Á dans le sérum [Elouahabi et al. 2003b]. Ce résultat suggérait une nouvelle propriété anti-inflammatoire de la diC14-amidine dans le cas d'une inflammation causée par les lipoplexes de diC14-amidine/ADN. <p><p>Dans le présent travail, nous d¨¦montrons que les macrophages de la rate sont les principales cellules productrices de TNF-¦Á suite à l'injection intraveineuse des lipoplexes à des souris. Ces mêmes cellules sont également la principale cible des liposomes de diC14-amidine après injection intraveineuse. Nous avons dès lors centré notre étude sur ce type cellulaire, en utilisant une lignée établie de macrophages murins. <p><p>Nos résultats ont permis de confirmer la capacité des liposomes de diC14-amidine à inhiber la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires induites par des séquences CpG, des lipopolysaccharides ou des poly(I :C). Fait intéressant, la présence de sérum est indispensable à la propriété anti-inflammatoire des liposomes de diC14-amidine. Par fractionnement successifs des composants du sérum, nous avons pu montrer que seuls les phospholipides des lipoprotéines pouvaient conférer cette propriété aux liposomes de diC14-amidine. <p> / Doctorat en sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La grande majorité des essais cliniques de transfert de gènes in vivo utilise des vecteurs viraux. Si ces derniers sont efficaces, ils présentent des risques immunogènes, toxiques, voire mutagènes avérés. Les vecteurs synthétiques (non viraux), par leur grande modularité et leur faible toxicité représentent une alternative très prometteuse. Le principal frein à leur utilisation est leur manque d’efficacité. L’objectif majeur de ce travail de thèse a été de comprendre le mécanisme de transfert de gènes associé à différents complexes vecteurs synthétiques/ADN plasmidique, ce qui est indispensable pour une conception rationnelle de nouveaux vecteurs. Nous avons étudié, sur cellules en culture, le mécanisme de transfert de gènes associé à deux lipides cationiques ; le BGTC (bis(guanidinium)-tren-cholesterol) et la DOSP (DiOleylamine A-Succinyl-Paromomycine) qui sont connus pour être des vecteurs efficaces in vitro. Nous avons ainsi pu visualiser par microscopie électronique leurs voies d’entrée, leurs remaniements structuraux ainsi que leur échappement endosomal qui représente une étape clé du processus de transfert de gènes. L’identification non ambigüe des lipoplexes tout au long de leur trafic intracellulaire a été rendue possible grâce au marquage de l’ADN par des nanoparticules de silice dotées d’un cœur de maghémite (Fe2O3) dense aux électrons. Cette stratégie de marquage a également été appliquée à l’étude du mécanisme d’action d’un autre vecteur synthétique de type polymère, le copolymère à blocs non ionique P188 ou Lutrol. Contrairement à la plupart des vecteurs synthétiques, celui-ci présente une efficacité de transfection in vivo chez la souris par injection in situ pour le tissu musculaire ou en intra trachéale dans le poumon. En revanche, il est totalement inefficace in vitro. Nous avons montré que le Lutrol permet une augmentation de l’internalisation d’ADN par les cellules mais n’induit pas son échappement endosomal, ce qui expliquerait son absence d’efficacité in vitro. D’autres voies d’entrée sont alors à envisager in vivo pour comprendre son mécanisme d’action. / The vast majority of clinical trials of gene transfer in vivo use viral vectors. Although they are effective, they induce immunogenic, toxic or mutagenic risks. Due to their high modularity and low toxicity, synthetic vectors (non viral), represent a promising alternative despite their lack of effectiveness. The major objective of this work was to understand the mechanism of gene transfer using two prototypic synthetic vectors, in the context of a rational design of new vectors. We studied on cultured cells, the mechanism of action of two cationic lipids; BGTC (bis(guanidinium)-tren-cholesterol) and DOSP (DiOleylamine A-Succinyl-Paromomycine) formulated with plasmid DNA (lipoplexes) which are in vitro efficient vectors. We have been able to visualize by electron microscopy, their intracellular pathways, their structural alterations and their endosomal escape, the latter being a key step in the process of gene transfer. The unambiguous identification of lipoplexes throughout their intracellular trafficking has been made possible thanks to the labelling of DNA by core-shell silica nanoparticles with an electron dense maghemite core (Fe2O3). The labeling strategy has also been applied to study the mechanism of action of a nonionic block copolymer (P188 or Lutrol). Interestingly, these synthetic vectors have an in vivo transfection efficiency in mice lung and muscle tissue while they are totally inefficient in vitro. We have shown that Lutrol induces an increase of DNA internalization into cells and fails to trigger endosomal escape, which would explain the lack of in vitro efficacy. These findings suggest that the in vivo mechanism of action of Lutrol would involve other internalization pathways.

Les cellules de la lignée d'hépatome HepaRG sont des progéniteurs bipotents capables de se différencier à confluence en cellules biliaires et en hépatocytes exprimant un large éventail de fonctions spécifiques du foie notamment plusieurs enzymes clés de détoxication. Ce système cellulaire constitue un modèle unique pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires régissant le processus de différenciation du progéniteur hépatique vers l'hépatocyte ou encore certains aspects de régulation du cycle cellulaire de l'hépatocyte. Par ailleurs, il offre un modèle cellulaire alternatif aux cultures primaires d'hépatocytes humains pour des applications en pharmacotoxicologie. Cependant, ces cellules expriment un niveau relativement limité d'un important cytochrome P450, le CYP2E1, restreignant leur utilisation pour les études de toxicologie des drogues métabolisées par cette voie. Nous avions comme objectif d'établir des protocoles efficaces de transfection afin d'augmenter l'expression du CYP2E1 dans les cellules HepaRG. Des protocoles de transfection efficaces ont été établis en utilisant l'électroporation et des lipides cationiques appartenant aux lipophosphonates et lipophosphoramidates. Ces approches nous ont permis d'augmenter significativement le niveau d'expression et d'activité du CYP2E1 dans les cellules HepaRG différenciées ouvrant de nouvelles perspectives pour des études de métabolisme et de toxicité des drogues dépendantes du CYP2E1. La mise au point de ces protocoles de transfection a été mise à profit pour aborder d'autres applications notamment la répression par siARN de l'expression du récepteur aux amines aromatiques hétérocycliques AhR. Nous avons pu par électroporation dans des cellules HepaRG différenciées démontrer que AhR est au moins en partie responsable de l'induction des CYP1A1 et 1A2 par les amines aromatiques hétérocycliques PhIP et MeIQx. Toujours en utilisant un protocole d'électroporation, nous avons également établi une lignée HepaRG recombinante exprimant de façon constitutive l'hepcidine en fusion avec la Green Fluorescent Protein (GFP). Cette lignée constitue un nouvel outil d'étude du processus de maturation et de sécrétion de l'hepcidine un régulateur hormonal central du métabolisme du fer. Enfin, dans une dernière partie du travail, nous avons abordé un nouveau type de vectorisation : des nanoparticules synthétisées à partir de poly-acide malique dans le but d'encapsuler des principes actifs anticancéreux pour des applications potentielles dans le ciblage du carcinome hépatocellulaire. Une première étape a consisté à étudier la toxicité in vitro de ces particules sur plusieurs lignées cellulaires puis d'évaluer leur potentiel d'encapsulation de principe actif en utilisant la doxorubicine comme molécule de référence.