[EN] Cells respond to environmental stimuli by fine tuned regulation of gene expression. In this thesis we investigate the dose dependent modulation of the genetic response upon nutrient and stress signals in yeast. A destabilized version of firefly luciferase was used in living yeast cells as a real-time reporter for gene expression. This highly sensitive and non-invasive system can be simultaneously used upon many different experimental conditions in small culture aliquots. This allows the dose-response behaviour of gene expression driven by any yeast promoter to be reported and can be used to quantify important parameters, such as the threshold, sensitivity, response time, maximal activity and synthesis rate for a given stimulus. We applied the luciferase assay to the nutrient-regulated GAL1 promoter and the stress-responsive GRE2 promoter. We find that luciferase expression driven by the GAL1 promoter responds dynamically to growing galactose concentrations, with increasing synthesis rates determined by the light increment in the initial linear phase of activation. The GAL1 gene is activated with continuously increasing synthesis rates in a well defined range of galactose concentrations, correlating with a dynamic increase of histone remodeling and subsequent association of the RNAPII complex. Dose dependent chromatin remodeling appears to be the basis for the dynamic GAL1 expression since mutants with impaired histone dynamics show severely truncated dose response profiles. In the case of the GRE2 promoter, we demonstrate that the very short-lived version of luciferase used here is an excellent tool to quantitatively describe transient transcriptional activation. The luciferase expression controlled by the GRE2 promoter responds dynamically to a gradual increase of osmotic or oxidative stress stimuli, which is mainly based on the progressive increase of the time the promoter remains active. In contrast, the GRE2 promoter operates like an off/on switch in response to increasing osmotic stress with almost constant synthesis rates and exclusively temporal regulation of histone remodeling and RNAPII occupancy. The Gal3 inducer and the Hog1 MAP kinase seem to determine the different dose response strategies at the two promoters. Our analysis reveals important differences in the way dynamic signals create dose sensitive gene expression outputs. Taken together, the luciferase assay described here is an attractive tool to rapidly and precisely determine and compare kinetic parameters of gene expression. Additionally, the function of the specific transcriptor factor Smp1 involved in the yeast osmostress response was investigated. Location analyses upon osmotic stress reveal that Smp1 associates preferentially with the whole transcribed regions (ORFs) upon stress as opposed to other transcriptional activators involved in the osmostress response. However, Smp1 seems to be important for stress-activated gene expression only in the presence of the natural induced gene and not of artificial promoter fusions. This highlights the possible role of Smp1 in regulating gene expression from ORF sequences rather than promoter regions. / [ES] Las células responden a los estímulos ambientales a través de una regulación precisa de la expresión génica. En este trabajo se investigó la modulación dosis dependiente de la expresión de genes activados en respuesta a estrés y por nutrientes. Se utilizó una versión desestabilizada de luciferasa de luciérnaga en células vivas de levadura como reportero para la detección de la expresión génica en tiempo real. Este sistema altamente sensible y no invasivo puede ser utilizado simultáneamente en diferentes condiciones experimentales a través de pequeñas alícuotas de cultivo. Esto permite la caracterización dosis-respuesta de la regulación de los promotores de levadura y puede ser utilizado para cuantificar parámetros importantes como el umbral, la sensibilidad, el tiempo de respuesta, la actividad máxima y el ratio de síntesis provocado por un determinado estímulo. Se aplicó el ensayo luciferasa al promotor GAL1 regulado por nutrientes y al promotor GRE2 activado en respuesta a estrés. Se observó que la expresión de la luciferasa activada por el promotor GAL1 responde de forma dinámica a las crecientes concentraciones de galactosa, con un incremento del ratio de síntesis determinado por el aumento de luz en la fase lineal inicial de la activación, en función de una gama de concentraciones de galactosa bien definidas. Este mecanismo de regulación depende de un aumento en la remodelación de las histonas y la consecuente asociación del complejo ARN pol II. La remodelación de la cromatina dosis dependiente parece ser la base de la expresión dinámica de GAL1, pues los mutantes relacionados con la dinámica de las histonas muestran perfiles dosis respuesta severamente afectados. En el caso del promotor GRE2, se demostró que una versión de una luciferasa desestabilizada es una herramienta excelente para describir de forma cuantitativa la activación transcipcional transitoria. La expresión de la luciferasa controlada por el promotor GRE2 responde de forma dinámica al aumento gradual de estímulo de estrés osmótico u oxidativo. La activación se observa principalmente en el incremento progresivo del tiempo en que el promotor permanece activo. Diferentemente de GAL1, el promotor GRE2 opera a través de un cambio apagado/encendido en respuesta a un aumento de estrés osmótico a través de ratios de síntesis prácticamente constantes y cuya regulación solamente depende de la remodelación de la cromatina y de la permanencia de la ARN pol II. Finalmente, se puede especular que el inductor Gal3 y la MAPK Hog1 son las moléculas determinantes para las diferentes estrategias de respuesta dinámica para los dos promotores. En este trabajo se identifican importantes diferencias en la señalización dinámica determinada por la dosis de estímulo en la expresión génica. En conjunto, el ensayo de luciferasa presentado en este trabajo puede ser una herramienta interesante para determinar y comparar de forma rápida y precisa los parámetros de la expresión génica. Adicionalmente se investigó la función del factor de transcripción Smp1 involucrado en la respuesta a osmoestrés en levadura. Un análisis de la asociación a la cromatina in vivo bajo estrés osmótico demostró que Smp1 se une preferentemente a regiones transcritas (ORFs) lo que refleja un comportamiento diferente comparando con otros activadores transcripcionales de la respuesta a estrés osmótico. Sin embargo, Smp1 parece ser importante para la expresión génica activada por estrés osmótico sólo en la presencia del gen natural inducido y no de fusiones artificiales del promotor. Esto evidencia el posible papel de Smp1 en la regulación de la expresión génica desde secuencias ORF y no en las regiones promotoras. / [CA] Les cèl·lules responen als estímuls ambientals a través d'una regulació precisa de l'expressió gènica. A aquest treball es va investigar la modulació dosi dependent de l'expressió de gens activats en resposta a estrès i per nutrients. Es va utilitzar una versió desestabilitzada de luciferasa de cuca de llum en cèl·lules vives de llevat com a reporter per a la detecció de l'expressió gènica a temps real. Aquest sistema altament sensible i no invasiu pot ser utilitzat simultàniament en diferents condicions experimentals a través de xicotetes alíquotes de cultiu. Això permet la caracterització dosi-resposta de la regulació dels promotors de llevat i pot ser utilitzat per a quantificar paràmetres importants com el llindar, la sensibilitat, el temps de resposta, l'activitat màxima i el rati de síntesi provocat per un determinat estímul. L'assaig luciferasa es va aplicar al promotor GAL1 regulat per nutrients i al promotor GRE2 activat en resposta a estrès. Es va observar que l'expressió de la luciferasa activada pel promotor GAL1 respon de forma dinàmica a les creixents concentracions de galactosa, amb un increment del rati de síntesi determinat per l'augment de llum en la fase lineal inicial de l'activació, en funció d'una gama de concentracions de galactosa ben definides. Aquest mecanisme de regulació depèn d'un augment en la remodelació de les histones i la conseqüent associació del complex ARN pol II. La remodelació de la cromatina dosi dependent sembla ser la base de l'expressió dinàmica de GAL1, ja què els mutants relacionats amb la dinàmica de les histones mostren perfils dosi-resposta severament afectats. En el cas del promotor GRE2, es va demostrar que una versió d'una luciferasa desestabilitzada és una eina excel·lent per a descriure de forma quantitativa l'activació transcripcional transitòria. L'expressió de la luciferasa controlada pel promotor GRE2 respon de forma dinàmica a l'augment gradual d'estímul d'estrès osmòtic o oxidatiu. L'activació s'observa principalment a l'increment progressiu del temps al qual el promotor roman actiu. De forma diferent de GAL1, el promotor GRE2 opera a través d'un canvi apagat/encès en resposta a un augment d'estrès osmòtic a través de ratis de síntesi pràcticament constants i als quals la seua regulació només depèn de la remodelació de la cromatina i de la permanència de l'ARN pol II. Finalment, es pot especular que l'inductor Gal3 i la MAPK Hog1 són les molècules determinants per a les diferents estratègies de resposta dinàmica per als dos promotors. A aquest treball s'identifiquen importants diferències a la senyalització dinàmica determinada per la dosi d'estímul a l'expressió gènica. En conjunt, l'assaig luciferasa presentat a aquest treball pot ser una eina interesant per a determinar i comparar de forma ràpida i precisa els paràmetres de l'expressió gènica. Addicionalment, es va investigar la funció del factor de transcripció Smp1 involucrat en la resposta a osmoestrès en llevat. Una anàlisi de l'associació a la cromatina in vivo sota l'estrès osmòtic va demostrar que Smp1 s'uneix preferentment a regions transcrites (ORFs), el qual reflecteix un comportament diferent comparant amb altres activadors transcripcionals de la resposta a estrès osmòtic. Tot i així, Smp1 sembla ser important per a l'expressió gènica activada per estrès osmòtic només en la presència del gen natural induït i no de fusions artificials del promotor. Això evidencia el possible paper de Smp1 en la regulació de l'expressió gènica des de seqüències ORF i no a les regions promotores. / Rienzo, A. (2016). Estudio de la regulación dinámica de la expresión génica en respuesta a estrés osmótico en levadura [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/62160

En la presente tesis se han estudiado los distintos mecanismos de toxicidad de las micotoxinas citrinina y ocratoxina A y la respuesta adaptativa a xenobióticos en el modelo de levadura Saccharomyces cerevisiae, concretamente la regulación de los transportadores multidrogas del sistema PDR y sus factores de transcripción. La respuesta a xenobióticos permite a las células eucariotas adaptarse y sobrevivir a la exposición de gran variedad de compuestos exógenos, como toxinas o fármacos. En esta respuesta participan distintos tipos de proteínas, principalmente transportadores de membrana y factores de transcripción. Para estudiar esta respuesta adaptativa sometimos las células de levadura a distintos tratamientos con las micotoxinas citrinina (CIT) y ocratoxina A (OTA), y los oxidantes menadiona (MEN), y peróxido de hidrógeno (H2O2). Las micotoxinas CIT y OTA son metabolitos secundarios producidos por hongos filamentosos que contaminan alimentos básicos y que son tóxicas para el ser humano. Aquí, estudiamos sus mecanismos de toxicidad a través de experimentos de expresión génica con reporteros luciferasa, ensayos transcriptómicos, y ensayos fenotípicos con mutantes de pérdida de función para determinadas proteínas involucradas en la defensa antioxidante y de transporte multidroga. Los resultados muestran diferencia de los mecanismos de toxicidad entre ambas micotoxinas. CIT induce la expresión de genes involucrados en el transporte de drogas y la respuesta a estrés oxidativo, mientras que OTA activa, principalmente, la expresión de genes implicados en el desarrollo, como meiosis o esporulación, y en menor medida, genes relacionados con la respuesta a estrés oxidativo y al transporte multidroga. En levadura, los transportadores multidroga de la membrana plasmática que eliminan compuestos tóxicos de la célula forman parte del sistema PDR (pleiotropic drug resistance). Este sistema está compuesto por proteínas conservadas de bacterias a humanos, como transportadores multidroga y factores de transcripción. Cuando estos transportadores son sobreexpresados, da lugar al fenómeno de resistencia pleiotrópica a drogas (PDR) o resistencia a múltiples drogas (MDR). Este proceso de resistencia es de gran importancia en diversos tratamientos médicos, como quimioterapia en cáncer, o antifúngicos, ya que disminuyen su eficiencia. Aquí, hemos estudiado el funcionamiento del sistema PDR en levadura de varios transportadores multidroga (Pdr5, Pdr15, Snq2, y Yor1) y factores de transcripción (Pdr1, Pdr3, Pdr8, Yrm1, Yrr1, y Stb5) mediante cuantificación de expresión luciferasa. Los resultados muestran que, de entre los transportadores estudiados, Pdr5 y Snq2 son los principales en la respuesta de adaptación frente a CIT, OTA y MEN, mientras que Pdr15 parece actuar como un transportador secundario. Además, la regulación de estos tres transportadores ante la exposición de CIT está dirigida por el factor de transcripción Pdr1. SNQ2 es el único de los cuatro transportadores que se induce al tratar las células con H2O2. Pdr1 activa la transcripción de genes en respuesta a CIT y OTA a través de los sitios específicos PDRE, mientras que Pdr8 e Yrm1, parecen actuar como reguladores negativos en respuesta a CIT. Por último, desarrollamos un sistema binario de plásmidos que nos permite definir las distintas sensibilidades y especificidad a drogas por parte de los factores de transcripción de forma individual. Pdr1 es capaz de reconocer e inducir la activación de la expresión génica en todos los tratamientos, aunque levemente con H2O2. Yrr1 presenta inducción de la expresión génica ante CIT y, especialmente, OTA, indicando su capacidad de discriminación entre estas moléculas. Por último, Stb5 reconoce e induce la expresión génica en el tratamiento con H2O2 en mayor nivel que Pdr1. Los resultados muestran un alto nivel de regulación del sistema PDR, con Pdr1 como factor de transcripción pr / In the present thesis, we have studied the different toxicity mechanisms of the mycotoxins citrinin and ochratoxin A and the adaptive response to xenobiotics in the yeast model of Saccharomyces cerevisiae, specifically the regulation of the multidrug transporters of the PDR network and its transcription factors. The response to xenobiotics allows eukaryotic cells to adapt and survive the exposure to a wide variety of exogenous compounds, such as toxins or drugs. Different types of proteins participate in this response, mainly membrane transporters and transcription factors. To study this adaptive response we subjected the yeast cells to different treatments with the mycotoxins citrinin (CIT) and ochratoxin A (OTA), and oxidants menadione (MEN), and hydrogen peroxide (H2O2). The mycotoxins CIT and OTA are secondary metabolites produced by several filamentous fungi, which contaminate staple foods and which are toxic to humans. Here, we studied their toxicity mechanisms through gene expression experiments with luciferase reporters, transcriptomic assays, and phenotypic assays with loss-of-function mutants for certain proteins involved in antioxidant defense and multidrug transport. The results show differences in the mechanisms of toxicity between both mycotoxins. CIT induces the expression of genes involved in drug transport and the response to oxidative stress, whereas OTA activates, mainly, the expression of genes involved in development, such as meiosis or sporulation, and to a lesser extent, genes related to response to oxidative stress and multidrug transport. In yeast, multidrug transporters of the plasma membrane that remove toxic compounds from the cell are part of the PDR (pleiotropic drug resistance) network. This system is composed of proteins conserved from bacteria to humans, such as multidrug transporters and transcription factors. When these transporters are overexpressed, it leads to a phenomenon known as pleiotropic drug resistance (PDR) or multidrug resistance (MDR). This resistance process is very important in various medical treatments, such as chemotherapy in cancer, or antifungals, since they reduce their efficiency. Here, we have studied the function of the PDR multidrug transporters (Pdr5, Pdr15, Snq2, and Yor1) and transcription factors (Pdr1, Pdr3, Pdr8, Yrm1, Yrr1, and Stb5) by quantifying luciferase expression in promoters or specific recognition sites. The results show that, among the studied transporters, Pdr5 and Snq2 have major roles in the adaptation response to CIT, OTA and MEN, while Pdr15 seems to act as a secondary transporter. Moreover, the regulation of these three transporters upon exposure to CIT is directed by the transcription factor Pdr1. SNQ2 is the only one of the four transporters that is induced by treating cells with H2O2. Pdr1 activates the transcription of genes in response to CIT and OTA through specific PDRE sites, while Pdr8 and Yrm1, appear to act as negative regulators in response to CIT. Finally, we developed a binary plasmid system that allows us to define the different sensitivities and specificity to drugs by the transcription factors individually. Pdr1 is able to recognize and induce the activation of gene expression in all treatments, albeit very slightly with H2O2. Yrr1 shows induction of gene expression with CIT and, especially, OTA, indicating its ability to discriminate between these molecules. Finally, Stb5 recognizes and induces gene expression in H2O2 treatment at a higher level than Pdr1. These results show an important level of regulation of the PDR network, with Pdr1 as the main transcription factor, but with the cooperation of more specific regulators. / En la present tesi s'han estudiat els diferents mecanismes de toxicitat de les micotoxines citrinina i ocratoxina A i la resposta adaptativa a xenobiòtics en el model de llevat Saccharomyces cerevisiae, concretament la regulació dels transportadors multidroga del sistema PDR i els seus factors de transcripció. La resposta a xenobiòtics permet a les cèl·lules eucariotes adaptar-se i sobreviure a l'exposició de gran varietat de compostos exògens, com toxines o fàrmacs. En aquesta resposta participen diferents tipus de proteïnes, principalment transportadors de membrana i factors de transcripció. Per estudiar aquesta resposta adaptativa vam sotmetre les cèl·lules de llevat a diferents tractaments amb les micotoxines citrinina (CIT) i ocratoxina A (OTA), i els oxidants menadiona (MEN), i peròxid d'hidrogen (H2O2). Les micotoxines CIT i OTA són metabòlits secundaris produïts per diversos fongs filamentosos que contaminen aliments bàsics i que són tòxiques per a l'ésser humà. Ací, estudiem els seus mecanismes de toxicitat a través d'experiments d'expressió gènica amb reporters luciferasa, assaigs transcriptòmics, i assajos fenotípics amb mutants de pèrdua de funció per a determinades proteïnes involucrades en la defensa antioxidant i de transport multidroga. Els resultats mostren diferència dels mecanismes de toxicitat entre les dues micotoxines. CIT indueix l'expressió de gens involucrats en el transport de drogues i la resposta a estrès oxidatiu, mentre que OTA activa, principalment, l'expressió de gens implicats en el desenvolupament, com meiosi o esporulació, i en menor mesura, gens relacionats amb la resposta a estrès oxidatiu i al transport multidroga. En llevat, els transportadors multidroga de la membrana plasmàtica que eliminen compostos tòxics de la cèl·lula formen part del sistema PDR (pleiotropic drug resistance). Aquest sistema està compost per proteïnes conservades de bacteria a humans, com transportadors multidroga i factors de transcripció. Quan aquests transportadors es troben sobreexpressats, dóna lloc al fenomen de resistència pleiotrópica a drogues (PDR) o resistència a múltiples drogues (MDR). Aquest procés de resistència és de gran importància en diversos tractaments mèdics, com quimioteràpia en càncer, o antifúngics, ja que disminueixen la seua eficiència. Ací hem estudiat el funcionament del sistema PDR en llevat de diversos transportadors multidroga (Pdr5, Pdr15, Snq2, i Yor1) i factors de transcripció (Pdr1, Pdr3, Pdr8, Yrm1, Yrr1, i Stb5) mitjançant quantificació d'expressió luciferasa. Els resultats mostren que, d'entre els transportadors estudiats, Pdr5 i Snq2 són els principals en la resposta d'adaptació davant de CIT, OTA i MEN, mentre que Pdr15 sembla actuar com un transportador secundari. A més d'això, la regulació d'aquests tres transportadors davant l'exposició de CIT està dirigida pel factor de transcripció Pdr1. SNQ2 és l'únic dels quatre transportadors que s'indueix en tractar les cèl·lules amb H2O2. Pdr1 activa la transcripció de gens en resposta a CIT i OTA a través dels llocs específics PDRE, mentre que Pdr8 i Yrm1, semblen actuar com a reguladors negatius en resposta a CIT. Finalment, vam desenvolupar un sistema binari de plasmidis que enspermet definir les diferents sensibilitats i especificitat a drogues per part dels factors de transcripció de forma individual. Pdr1 és capaç de reconèixer i induir l'activació de l'expressió gènica en tots els tractaments, encara que lleument amb H2O2. Yrr1 presenta inducció de l'expressió gènica davant CIT i, especialment, OTA, indicant la seua capacitat de discriminació entre aquestes molècules. Finalment, Stb5 reconeix i indueix l'expressió gènica en el tractament amb H2O2 en major nivell que Pdr1. Els resultats mostren un important nivell de regulació del sistema PDR, amb Pdr1 com a factor de transcripció principal, però amb la cooperació d'altres regulador / Vanacloig Pedrós, ME. (2018). Estrategias de defensa a estrés químico en Saccharomyces cerevisiae: regulación genética del transporte multidroga y mecanismos de detoxificación [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/111949

La medicina regenerativa és una disciplina que ha guanyat reconeixement en les últimes dècades pel fet que moltes malalties no són tractables amb fàrmacs convencionals. Molts grups de recerca i empreses inverteixen temps i diners en la producció de nous paradigmes per curar malalties com el Parkinson, l'artrosi o la regeneració de medul·la espinal. Aquestes propostes es basen en l'ús de teixits biomimètics per reparar òrgans danyats. En aquesta tesi es presenta un nou model experimental per estudiar la formació d'os i cartílag i eventualment la reparació d'aquests teixits. Hem utilitzat Fibroblasts Embriònics de Ratolí (MEFs) combinats amb diferents materials biomimètics per estudiar os i cartílag in vitro i in vivo. Aquests MEFs es van cultivar in vitro i in vivo en RAD16-I, un pèptid auto-ensamblable amb estructura similar a matrius extracel·lulars genèriques, amb l'objectiu d'estudiar l'evolució dels fibroblasts en aquestes dues condicions. També s'han recobert superficialment micropartícules de hidroxiapatita obtenint càrregues inorgàniques similars a l'os i biològicament actives per a utilitzar-les com a substituts d'os o cartílag. Amb la idea de millorar els recobriments superficials, hem desenvolupat una plataforma que permet dur a terme proves combinatòries amb factors de creixement i altres compostos biològicament actius. Cultius in vitro de MEFs han mostrat que quan fibroblasts embrionaris primaris de ratolí es cultiven en RAD16-I, estableixen una xarxa intercel·lular que causa una contracció cel·lular organitzada, proliferació i migració cel·lulars i culmina amb la formació d'una estructura bilateral i simètrica amb un eix central distingible. Durant aquest procés morfològic, augmenta l'expressió d'un grup de gens mesodèrmics (brachyury, Sox9, Sox5, Sox6, Runx2). L'expressió de brachyury està localitzada primer en l'eix de simetria central i després s'extén als dos costats de l'estructura. Per acabar, la formació espontània d'un teixit similar al del cartílag acompanya l'expressió de Sox9 i Runx2.L'estudi in vivo de MEFs es va fer gràcies a la tècnica de presa d'imatges no invasiva basada en bioluminiscència (BLI) que ha desenvolupat en el grup de recerca del dr. Jerónimo Blanco. Aquests experiments han mostrat que el RAD16-I és una matriu molt permissiva per a la supervivència i proliferació cel·lulars in vivo. A més, sembla que les pobres propietats mecàniques que té el RAD16-I no li suposen cap desavantatge en termes de creixement cel·lular in vivo. Finalment, hem desenvolupat diferents tipus de micropartícules de hidroxiapatita (HA) no recobertes, i recobertes mitjançant polimerització assistida per plasma. Els recobriments permeten afinar les propietats de la HA i produir partícules que satisfacin les necessitats de diferents aplicacions mèdiques en reparació d'os i cartílag. També hem desenvolupat un mètode per produir plataformes basades en plaques de 96 pous que permetin fer proves combinatòries amb compostos biològicament actius per vàries aplicacions en medicina regenerativa. En conclusió, hem aportat noves idees i eines que permetran trobar teixits regeneratius basats en l'ús de fibroblasts i materials biomimètics. / La medicina regenerativa es una disciplina que ha ganado reconocimiento en las últimas décadas porque muchas enfermedades no son tratables con fármacos convencionales. Muchos grupos de investigación y empresas invierten tiempo y dinero en la producción de nuevos paradigmas para curar enfermedades como el Parkinson, la artrosis o la regeneración de médula espinal. Estas propuestas se basan en el uso de tejidos biomiméticos para reparar órganos dañados. En esta tesis se presenta un nuevo modelo experimental para estudiar la formación de hueso y cartílago y tal vez la reparación de estos tejidos. Hemos utilizado Fibroblastos Embrionarios de Ratón (MEFs) combinados con diferentes materiales biomiméticos para estudiar hueso y cartílago in vitro e in vivo. Estos MEFs se cultivaron in vitro e in vivo en RAD16-I, un péptido auto-ensamblable con estructura similar a matrices extracelulares genéricas, con el objetivo de estudiar la evolución de los fibroblastos en estas dos condiciones. También se han recubierto superficialmente micropartículas de hidroxiapatita obteniendo cargas inorgánicas similares al hueso y biológicamente activas para utilizarlas como sustitutos de hueso o cartílago. Con la idea de mejorar los recubrimientos superficiales, hemos desarrollado una plataforma que permite llevar a cabo pruebas combinatorias con factores de crecimiento y otros compuestos biológicamente activos. Cultivos in vitro de MEFs han mostrado que cuando fibroblastos embrionarios primarios de ratón se cultivan en RAD16-I, establecen una red intercelular que causa una contracción celular organizada, proliferación y migración celulares y culmina con la formación de una estructura bilateral y simétrica con un eje central distinguible. Durante este proceso morfológico, aumenta la expresión de un grupo de genes mesodérmicos (brachyury, Sox9, Sox5, Sox6, Runx2). La expresión de brachyury está localizada primero en el eje de simetría central y después se extiende a los dos lados de la estructura. Para terminar, la formación espontánea de un tejido similar al del cartílago acompaña a la expresión de Sox9 y Runx2.El estudio in vivo de MEFs se hizo gracias a la técnica de toma de imágenes no invasiva basada en bioluminiscencia (BLI) que han desarrollado en el grupo de investigación del dr. Jerónimo Blanco. Estos experimentos han mostrado que el RAD16-I es una matriz muy permisiva para a la supervivencia y proliferación celulares in vivo. Además, parece que las pobres propiedades mecánicas que tiene el RAD16-I no le suponen ninguna desventaja en términos de crecimiento celular in vivo. Finalmente, hemos desarrollado diferentes tipos de micropartículas de hidroxiapatita (HA) no recubiertas, y recubiertas mediante polimerización asistida por plasma. Los recubrimientos permiten afinar las propiedades de la HA y producir partículas que satisfagan las necesidades de diferentes aplicaciones médicas en reparación de hueso y cartílago. También hemos desarrollado un método para producir plataformas basadas en placas de 96 pozos que permitan hacer pruebas combinatorias con compuestos biológicamente activos para varias aplicaciones en medicina regenerativa. En conclusión, hemos aportado nuevas ideas y herramientas que permitirán hallar tejidos regenerativos basados en el uso de fibroblastos y materiales biomiméticos. / Regenerative medicine is a discipline that has gained recognition in the last decades because many diseases are not treatable with traditional drugs. Many research groups and companies invest time and money in the production of new paradigms to cure conditions such as Parkinson's, arthrosis or spinal cord injuries. These approaches are based in the use of biomimetic tissues to replace damaged organs. In this work we present a new experimental model to study the formation of bone and cartilage and eventually to repair these tissues. We have used Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) combined with different biomimetic materials to study bone and cartilage formation in vitro and in vivo. MEFs have been cultured in vitro and in vivo in RAD16-I, a synthetic self-assembling peptide with structure similar to generic extracellular matrix milieu, to study the evolution of these fibroblasts in both conditions. Also, hydroxyapatite microparticles have been surface coated to produce biologically active bone-like inorganic charges for use in cartilage or bone substitutes. In order to improve the particles' coatings, we have developed a platform that allows us to perform combinatorial testing of growth factors and other biologically active compounds. In vitro cultures of MEFs has shown that when primary mouse embryonic fibroblasts are cultured in a soft nanofiber scaffold, they establish a cellular network that causes an organized cell contraction, proliferation, and migration that ends in the formation of a symmetrically bilateral structure with a distinct central axis. A subset of mesodermal genes (brachyury, Sox9, Sox5, Sox6, Runx2) is upregulated during this morphogenetic process. The expression of brachyury was localized first at the central axis, extending then to both sides of the structure. The spontaneous formation of cartilage-like tissue mainly at the paraxial zone followed the expression of Sox9 and Runx2.In vivo study of MEFs was facilitated by a non-invasive bioluminescence imaging (BLI) technique to detect luciferase-expressing cells, developed by Dr. Blanco's research group. These experiments showed that RAD16-I is a very permissive scaffold for cell survival and proliferation in vivo. Furthermore, it seems that the poor mechanical properties of RAD16-I are no disadvantage in terms of cell growth in vivo.Finally, we have developed different types of coated and uncoated hydroxyapatite (HA) microparticles by plasma polymerization. The coatings permit to tune the properties of HA and produce particles that suit the needs of different medical applications in bone and cartilage repair. Moreover, we have developed a method to produce platforms based on 96-well plates that allow the combinatorial testing of biologically active compounds for various applications in regenerative medicine. In conclusion, we have supplied new insights and tools that will enhance the finding of new regenerative tissues based on fibroblasts and biomimetic materials.

We have investigated genetic variation in microRNA-mediated regulation as a susceptibility factor for anxiety disorders following two different approaches. We first studied two isoforms of the candidate gene NTRK3 by re-sequencing its different 3'UTRs in patients with Panic (PD) and Obsessive Compulsive disorders (OCD) as well as controls. Two rare variants that altered microRNA-mediated regulation were identified in PD. Conversely, association of a common SNP with OCD hoarding subtype was found. Moreover, we have also studied a possible involvement of microRNAs in anxiety disorders. Consequently, we have analysed the genomic organisation and genetic variation of miRNA-containing regions to construct a panel of SNPs for association analysis. Case-control studies revealed several associations. However, it is worth remarking the associations of miR-22 and miR-488 with PD; two microRNAs for which functional assays and transcriptome analysis after microRNA overexpression showed significant repression of a subset of genes involved in physiological pathways linked to PD development. / Hem investigat la variació genètica a la regulació mediada per microRNAs com a factors de susceptibilitat pels trastorns d'ansietat seguint dues aproximacions diferents. Primer vam estudiar dues isoformes del gen candidat NTRK3 mitjançant la reseqüenciació dels seus diferents 3'UTRs a pacients de pànic (TP), a pacients amb trastorn obsessiu compulsiu (TOC) i a controls. Dues variants rares que alteren la regulació mediada per microRNAs foren identificades per TP. D'altra banda, es trobà associació d'un SNP comú amb el subtipus acumulador de TOC. A més, també hem estudiat la possible implicació dels microRNAs als trastorns d'ansietat. Conseqüentment, hem analitzat l'organització genòmica i la variació genètica a regions que contenen microRNAs per construir un panell d'SNPs per fer anàlisis d'associació. Els estudis cas-control van revelar algunes associacions. Tanmateix, val la pena destacar les associacions del miR-22 i el miR-488 amb TP; dos microRNAs pels quals assajos funcionals i anàlisis de transcriptoma després de la seva sobreexpressió han mostrat una repressió significativa d'un grup de gens implicats en vies fisiològiques lligades al desenvolupament del TP.