Le PAF (Platelet-Activating Factor) est un médiateur reconnu pour son implication dans plusieurs effets physiologiques et pathologiques, particulièrement les états inflammatoires. À l'instar du PAF, les lymphocytes T Th17 sont aussi reconnus comme exerçant un rôle majeur dans la physiopathologie des maladies auto-immunes. L'objectif de ce projet est de déterminer s'il existe un lien entre ces deux composants. En fait, nous avons émis l'hypothèse que le PAF pourrait provoquer une production de cytokines spécifiques par les cellules présentatrices d'antigène qui elles, interagissant avec les lymphocytes T, pourraient mener ultimement à une différentiation en Th17. En effet, les cellules T ne peuvent interagir directement avec le PAF puisqu'elles n'expriment pas de récepteur pour celui-ci à leur surface. Les cellules T Th17 expriment un facteur de transcription spécifique RORr, nécessitent absolument la sous-unité IL-23p19 pour leur expansion et produisent IL-17. Nous avons donc, dans un premier temps, regardé la capacité d'un type de cellules présentatrices d'antigène, les cellules de Langerhans à produire IL-23p19 en réponse au PAF. Ensuite, nous avons mis en contact ces cellules de Langerhans pré-stimulées au PAF avec des lymphocytes T activés pendant 5 jours pour vérifier l'expression de RORII et la production d'IL-17 dans ces lymphocytes T, plus précisément les lymphocytes T CD4 + . Cette étude nous a permis de mettre en évidence que certains éléments impliqués dans les processus inflammatoires sont possiblement inséparables et interagissent probablement les uns avec les autres pour mener aux séquelles multiples de l'inflammation.

Lors de l'infection par le VIH-1, l'intégrité de la barrière immunitaire muqueuse est altérée du fait d'une profonde déplétion des lymphocytes T CD4+ intestinaux, notamment des lymphocytes Th17, une sous population de lymphocytes exerçant un rôle majeur dans la lutte contre les bactéries et certains champignons. La translocation de produits microbiens de la lumière intestinale dans la circulation sanguine systémique, liée à la perte des lymphocytes Th17, est une source d'inflammation généralisée délétère. Malgré la mise en place d'un traitement antirétroviral, chez la plupart des patients, la reconstitution des lymphocytes T CD4+ de la lamina propria est différée et incomplète par rapport à celle du sang périphérique. Les travaux exposés dans ce manuscrit suggèrent que chez les patients VIH-1+ traités, une diminution de la production de la chimiokine CCL20 altère l'axe de chimiotactisme CCR6-CCL20, particulièrement important pour les lymphocytes Th17, affaiblissant ainsi l'adressage de ces cellules à la muqueuse intestinale. Les résultats obtenus ne sont pas en faveur d'un rôle direct du virus dans la diminution observée de CCL20. L'infection par différentes souches virales d'un système d'histocultures de tissu intestinal développé au laboratoire induit, au contraire, une augmentation de la production de la chimiokine CCL20. La stimulation de cultures de cellules épithéliales intestinales primaires, spécialement mises au point lors de ce projet, par différentes protéines virales ne montrent pas non plus d'effet négatif sur la production de la chimiokine CCL20. La stimulation des cellules épithéliales intestinales primaires par différents ligands des récepteurs de l'immunité innée aux pathogènes (PRR) a également permis d'écarter la potentielle responsabilité de la translocation résiduelle de produits microbiens observée chez les patients VIH-1+ dans la diminution de la production de CCL20. L'analyse de la distribution des différentes populations lymphocytaires dans les compartiments sanguin et intestinal des patients VIH-1+ traités a mis en évidence une augmentation d'une population de lymphocytes T régulateurs dans l'intestin grêle, qui n'expriment pas le récepteur CCR6 (Treg CCR6-). L'étude présentée souligne la persistance d'un déséquilibre du ratio lymphocytes Th17/Treg CCR6- malgré un traitement antirétroviral. La perturbation de l'environnement cytokinique, conséquence de la modification du ratio lymphocytes Th17/Treg CCR6- semble impliquée dans la diminution de la chimiokine CCL20 observée chez les patients VIH-1+ traités. La stimulation des cellules épithéliales intestinales primaires par l'IL-17A, synthétisée par les lymphocytes Th17, augmente la production de CCL20, alors que la stimulation par l'IL-10 et le TGF-ß1, produites par les lymphocytes Treg, diminue cette production. La co-culture de cellules épithéliales primaires avec différents ratio de lymphocytes T triés et stimulés, reproduisant ex vivo l'interaction entre l'épithélium intestinal et la lamina propria sous jacente, confirme l'influence du ratio lymphocytes Th17/Treg CCR6- sur la production de CCL20 par les cellules épithéliales intestinales. Ces travaux démontrent que l'axe de chimiotactisme CCR6-CCL20 est altéré chez les patients VIH-1+ malgré le traitement antirétroviral prolongé et que la persistance d'un déséquilibre du ratio lymphocytes Th17/Treg CCR6- dans la lamina proria pourrait contribuer à la diminution de la production de CCL20 par les entérocytes, soulignant l'existence d'un cercle vicieux entre la diminution de l'expression de CCL20 et le défaut d'adressage des lymphocytes Th17 à la muqueuse intestinale. / During HIV-1 infection, the integrity of the intestinal immune barrier is disrupted due to a deep depletion of CD4+ T cells in the gut, especially Th17 cells, a T cell subset exerting a major role in antimicrobial immunity. The translocation of microbial products from the gut lumen into the bloodstream, associated with Th17 cells loss, has been linked to systemic inflammation. Despite effective cART, CD4+ T cells restoration in the lamina propria is postponed and incomplete compared with peripheral blood of most individuals. The works exposed in this manuscript suggest that treated HIV-1-infected individuals display a reduced CCL20 production altering the CCR6-CCL20 chemotactic axis, which drives Th17 cells trafficking to the gut. Our results do not support a direct role of the virus in the decreased production of the CCL20 chemokine. The infection of small bowel explants by various viral strains rather leads to an increase of CCL20 production. The stimulation of primary intestinal epithelial cells cultured ex vivo by a technique specially worked out during this project by various viral proteins do not show any negative effects on the production of CCL20. Stimulation of primary intestinal epithelial cells by several ligands of innate microbial sensors (PRR) also allows to rule out a potential responsibility of the residual microbial translocation observed in treated HIV-1-infected individuals in the decreased production of the CCL20 chemokine. The detailed analysis of various lymphocyte populations distribution in the blood and intestinal compartments of treated HIV-1-infected individuals highlights an increase of a regulatory T cell subset in the small intestine, which do not show the CCR6 chemokine receptor (CCR6- Treg). Despite antiretroviral therapy, the presented study underlines the persistence of an imbalanced Th17/CCR6- Treg ratio. The cytokinic microenvironment disruption, as a consequence of the modification of the Th17/CCR6- Treg ratio seems involved in the decrease of the CCL20 chemokine observed in treated HIV-1-infected individuals. Stimulation of primary intestinal epithelial cells with IL-17A produced by Th17 cells increases CCL20 production whereas Treg cytokines both IL-10 and TGF-ß1 decrease it. Ex vivo co-culture of primary small intestine epithelial cells with various proportions of T lymphocytes sorted by flow cytometry, activated and placed into the bottom chamber of the transwell to mimic lamina propria-epithelium interactions, confirms the influence of the Th17/CCR6- Treg ratio on the production of CCL20 by the intestinal epithelial cells. All together, our data demonstrate that the CCL20-CCR6 axis driving Th17 cells gut homing is altered in HIV-1-infected individuals despite antiretroviral therapy, and the persistence of an imbalanced Th17/CCR6- Treg ratio into the lamina propria could contribute to the decrease of the CCL20 chemokine production by enterocytes, highlighting the existence of a vicious circle between the decrease of the CCL20 expression and the defective gut homing of CD4+ T cells, notably Th17 cells.

Les lymphocytes Th17 forment une population de cellules T CD4+ pro-inflammatoires, impliqués non seulement dans l'élimination d'agents pathogènes, mais ayant aussi un rôle délétère dans l'induction de maladies inflammatoires chroniques. Ils expriment spécifiquement le récepteur de chimiokines CCR6, qui a pour ligand le CCL20 mais aussi les β-defensine-1, 2 et 3, peptides ayant une activité antimicrobienne. Les cellules souches mésenchymateuses (CSMs) représentent une population cellulaire hétérogène exerçant diverses propriétés immunomodulatrices.Les résultats obtenus dans ce travail de thèse montrent que l'environnement inflammatoire contribue à augmenter l'adhésion des lymphocytes Th17 aux CSMs, et qu'elle est régulée par l'interaction du CCR6 avec ses ligands ; que les CSMs exercent, en partie via la sécrétion de PGE2, des effets anti-inflammatoires en faisant acquérir un phénotype régulateur aux lymphocytes Th17 différenciés, soulignant ainsi la plasticité de ces derniers.De plus, nous avons montré que les lymphocytes Th17 activés par l'antigène produisent du CCL20 et induisent, via la production de l'IL-17 et de l'IL-22, la sécrétion d'hBD-2, mais pas celle des hBD-1 et 3, par des kératinocytes épidermiques humains et de la peau reconstituée; que le CCL20, ainsi que la hBD-2, induisent l'arrêt de ces cellules sur l'endothélium enflammé in vitro en conditions de cisaillement. Finalement, l'activation spécifique d'antigène des lymphocytes Th17 entraîne une perte de l'expression de CCR6, ce qui provoque ainsi un état transitoire de non réponse à une nouvelle stimulation de ces cellules avec les ligands de CCR6, permettant leur migration ultérieure hors du tissu enflammé. / Th17 cells form a population CD4+ T cells with strong pro-inflammatory properties that are not only involved in the clearance of pathogens, but also play a deleterious role of in the pathogenesis of inflammatory disease. Th17 cells specifically express CCR6, a chemokine receptor that binds to its unique chemokine ligand, CCL20, as well as to human β-defensin (hBD)-1, 2 and 3, peptides with anti-microbial activity. Mesenchymal stem cells (MSC) represent a heterogenous population that exert broad immunomodulatory effects.The results from the studies carried out during this thesis show that the inflammatory environment contributes to increased adhesion of Th17 cells to MSCs, which is mediated via the interaction of CCR6 with its ligands, and that MSCs exert, in part via the secretion of PGE2, anti-inflammatory effects through the induction of a T regulatory cell phenotype in fully differentiated tissue-infiltrating Th17 cells, thereby underscoring the plasticity of the latter cells.Furthermore, the results show that antigen-activated Th17 cells produce CCL20 and induce, via the production of both IL-17 and IL-22, the secretion of hBD-2, but not 1 and 3, by normal human epidermal keratinocytes and reconstituted skin, and that CCL20, as well as hBD-2, induce arrest of these cells onto inflamed endothelium in vitro under conditions of shear stress. Finally, antigen-specific activation of Th17 cells also causes a loss of CCR6 expression from their cell surface and thus results in a transitory state of non-responsiveness to further stimulation of these cells with CCR6 ligands, which is likely to permit their subsequent migration out of inflamed tissue.

Ce travail de thèse a été axé sur l’étude de la réponse immunitaire T chez des patients atteints d’artérite à cellules géantes (ACG) et de pseudo-polyarthrite rhizomélique (PPR). Plusieurs études cliniques successives interrégionales ont permis d’inclure de nombreux patients (57 ACG et 27 PPR) des Centres Hospitaliers (CH) Universitaires et des CH de l’interrégion Est. Les échantillons sanguins ont été étudiés dans le laboratoire de l’unité INSERM U1098. Tout d’abord, nous avons confirmé l’implication des lymphocytes Th17 dans la pathogénie de l’ACG et avons montré pour la première fois leur implication au cours de la PPR. De plus, notre étude des lymphocytes T (LT) CD4+CD161+ a permis de mieux comprendre les mécanismes de plasticité entre les réponses Th1 et Th17 au cours de ces deux pathologies. Nous avons complété ces travaux par l’étude de la réponse T régulatrice en montrant qu’il existe un déficit quantitatif en Treg au cours de l’ACG et la PPR. Dans la suite de ce travail, nous avons mis en évidence, chez des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, que le blocage de la voie de signalisation de l’IL-6 par un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur de l’IL-6 permet de corriger le déséquilibre de la balance Th17/Treg, en diminuant la réponse Th17 et en augmentant simultanément la réponse T régulatrice, à l’inverse des corticoïdes qui diminuent le pourcentage de Th17 sans corriger le déficit en Treg. Enfin, dans la dernière partie de ce travail, nous avons montré pour la première fois que les LT CD8+ étaient également impliqués dans la pathogénie de l’ACG et la PPR. Ces résultats ont permis de progresser dans les connaissances physiopathologiques de l’ACG et la PPR en évoluant d’un modèle articulé autour d’un déséquilibre de la balance Th1/Th2 vers celui d’un déséquilibre de la balance Th17/Treg et permettent de proposer des thérapeutiques mieux ciblées pour l’ACG et la PPR. / The aim of this thesis was to investigate the T-cell immune response in the course of giant-cell arteritis (GCA) and polymyalgia rheumatica (PMR). Several studies conducted by our team allowed us to obtain blood samples from many patients affected by GCA (n=57) and PMR (n=28). Immunological studies were performed in INSERM U1098, University Of Burgundy, Dijon, France. We firstly demonstrated the implication of Th17 and CD4+CD161+ T cells in the pathogenesis of these two diseases, thus extending the knowledge in the plasticity mechanisms arising between Th1 and Th17 cell-immune responses in GCA and PMR. Furthermore, we investigated the regulatory T cell immune response in these two affections, demonstrating that although being functional, the percentage of circulating Treg was decreased in GCA and PMR patients. As interleukin-6 (IL-6) had been shown to control the Th17/Treg balance, we studied Th17 and Treg frequencies in rheumatoid arthritis patients treated with an anti-IL-6 receptor antibody (tocilizumab). We showed that the blockade of the IL-6 pathway was able to correct the Th17/Treg imbalance by decreasing the number of Th17 cells and simultaneously increasing that of Treg. Finally, we demonstrated for the first time the implication of CD8+ T cells in the pathogenesis of GCA and PMR. This thesis allowed us to progress in the knowledge of the pathogenesis of GCA making the pathogenesis model progress from a Th1/Th2 to a Th17/Treg imbalance model. Altogether, these data deciphering the immune response in the pathogenesis of GCA and PMR bring new knowledge which will lead to better targeted therapies.

L’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques limitant le succès de ce traitement.La GVHD aiguë est liée à la reconnaissance et la destruction par les lymphocytes Talloréactifs du donneur des tissus cibles du receveur (peau, tube digestif et foie), aprèsactivation par les cellules dendritiques du receveur. Si le rôle des lymphocytes Th17dans la GVHD aiguë a été mis en évidence dans des modèles murins, leur rôle chezl’homme est moins clair. Nous avons exploré la présence des lymphocytes Th17 dansla muqueuse digestive de 23 patients et dans la peau de 38 patients lors du diagnosticde GVHD aiguë, au moyen de 2 marqueurs des Th17, CCR6 et CD161 et du facteurde transcription des Th17, RORγt. Il existe une augmentation significative descellules CCR6+, CD161+ et RORγt+ dans la muqueuse digestive et la peau des patientsavec une GVHD aiguë. De plus, comme il a été rapporté que les cellules dendritiquesplasmocytoïdes (PDC) favorisent la différenciation des lymphocytes Th17, nousavons voulu quantifier chez ces patients les PDC au moyen des 2 marqueurs, CD123et BDCA2. Il existe une augmentation des PDC dans la muqueuse digestive et la peaudes patients avec une GVHD aiguë. De plus la forte expression de la protéine induitepar l’IFN de type I Mx1 dans la peau des patients avec une GVHD aiguë suggère queles PDC sont fonctionnelles et produisent de l’IFN de type I. L’ensemble de cesrésultats suggère l’existence d’une réponse médiée par les lymphocytes Th17 dans laGVHD aiguë digestive et cutanée ainsi qu’un nouveau lien physiopathologique entreles PDC et les lymphocytes Th17. / Acute graft-versus-host disease (GVHD) remains a major complication followingallogeneic stem cell transplantation (allo-SCT) limiting the success of the therapy.GVHD is the result of alloreactive donor T cells attacking host tissues: the skin, gutand liver after activation by the recipient dendritic cells. The contribution of Th17cells in acute GVHD has been demonstrated in mouse models. However theircontribution in human acute GVHD remains unclear. We evaluated the presence ofTh17 cells in the intestinal mucosa of 23 patients and the skin of 35 patients atdiagnosis of acute GVHD using CCR6 and CD161, 2 markers of Th17 cells, andRORγt the key transcription factor of Th17 cells. CCR6+, CD161+ and RORγt+ cellswere significantly increased in the intestinal mucosa and the skin of patients withacute GVHD. Since plasmacytoid dendritic cells (PDC) have been reported to drivethe differentiation of the Th17 subset, we quantified PDC using 2 markers CD123 andBDCA. PDC were significantly increased in the intestinal mucosa and the skin ofpatients with acute GVHD. Moreover, we observed a strong expression of the type IIFN-inducible protein Mx1 in the skin of patients with acute GVHD, suggesting thatPDC produce type I IFN. Overall this study provides evidence for a Th17-mediatedresponse and a potential pathophysiological link between PDC and Th17 in humanacute GVHD.

Prediction of clinical outcome in cancer is usually achieved by histopathological evaluation of tissue samples obtained during surgical resection of the primary tumor. Traditional tumor staging (AJCC/UICC-TNM classification) summarizes data on tumor burden (T), presence of cancer cells in draining and regional lymph nodes (N) and evidence for metastases (M). However, it is now recognized that clinical outcome cansignificantly vary among patients within the same stage. Data collected from largecohorts of human cancers has demonstrated the impact of immune-classification, which has a prognostic value that may add largely to the significance of the AJCC/UICC TNM-classification. In our study we examined the immune cells that infiltrated the tumor tissues of colorectal and ovarian cancer patients. In a cohort of newly diagnosed colorectal cancer patients we examined the correlations between the KRAS mutational status, patterns of tumor-infiltrating immune cells and the presence of tumor recurrence. Our data suggest that colorectal cancer patients with low levels of tumor-infiltrating lymphocytes, a high CD1a/DC-LAMP tumor-infiltrating dendritic cells ratio, and a KRAS mutation in codon 13 are at a high risk of disease recurrence. In ovarian cancer patients we focused on the dynamics of the tumor-infiltrating...

L'épilepsie est un trouble chronique du système nerveux central qui touche 70 millions de personnes dans le monde. Un tiers des patients souffrent d'épilepsie réfractaire (ER), caractérisée par des crises récurrentes malgré l’utilisation de médicaments antiépileptiques (MAE) appropriés. Plusieurs données soutiennent un lien biologique entre la neuroinflammation et l'épilepsie chronique. De plus, des études suggèrent que certains MAE de nouvelle génération comme le brivaracétam présentent des propriétés immunomodulatrices qui pourraient contribuer à leur bénéfice dans l’ER et d’autres pathologies neurologiques. Les objectifs de cette thèse étaient tout d’abord de caractériser ex vivo le profil des cellules immunitaires périphériques, les niveaux de cytokines pro- et anti-inflammatoires et les biomarqueurs neurodégénératifs dans le sang périphérique de sujets souffrant d’épilepsie (ER vs. bien contrôlée) en comparaison à celui de donneurs sains. Par la suite, nous avons évalué l’impact du brivaracétam sur l’activation des cellules immunitaires humaines in vitro et son potentiel immunomodulateur et neuroprotecteur in vivo dans le modèle de l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) active, un modèle animal de la sclérose en plaques, la pathologie inflammatoire du SNC la plus fréquente. Méthodologie : Après isolation des cellules mononucléées et du sérum à partir du sang périphérique d'adultes souffrant d'épilepsie focale et de donneurs sains, nous avons effectué des analyses par cytométrie en flux ex vivo, ELISA multiplex et technique ultrasensible de détection de biomarqueurs par technologie single molecule array (SIMOA). Nous avons comparé l'influence du brivaracétam et du lacosamide sur l'activation des cellules immunitaires périphériques humaines in vitro et in vivo dans l'EAE active induite par immunisation avec le MOG, le modèle animal le plus commun de la sclérose en plaques. Résultats : Nous avons rapporté une augmentation de la proportion des lymphocytes T CD4 dans le sang périphérique des adultes souffrant d’ER, avec une fréquence plus élevée de lymphocytes pro-inflammatoires Th17/Th1 en comparaison avec les contrôles. Nous avons également rapporté des niveaux significativement plus élevés du marqueur de lésion neuronale sNfL chez les sujets plus âgés avec l’ER par rapport aux témoins appariés pour l’âge. De plus, nous avons montré que l'administration prophylactique du brivaracétam ou du lacosamide ne retardait pas l'apparition de l'EAE mais était associée à une évolution clinique significativement moins sévère dans la phase chronique de l'EAE active chez les souris femelles C57BL/6 par rapport au contrôle (véhicule). Conclusion : Dans l'ensemble, nos données soutiennent d'une part que l’ER est associée à un profil immunitaire pro-inflammatoire des lymphocytes Th17/Th1 dans le sang périphérique et à des niveaux pathologiques de sNfL, soutenant la présence de composantes inflammatoire et neurodégénérative potentielles dans l’ER. D'autre part, les MAE de nouvelle génération (brivaracétam et lacosamide) n'altèrent pas de façon importante la réponse à l'immunisation avec le peptide MOG, mais améliorent l'évolution de l'EAE par le biais principalement de mécanismes neuroprotecteurs. / Epilepsy is a chronic central nervous system condition affecting 70 million people around the world. One third of patients suffer from drug-resistant epilepsy (DRE), characterized by recurrent seizures despite appropriate trials of anti-epileptic drugs (AEDs). Accumulating data support a biological link between neuroinflammation and chronic epilepsy. Recent studies suggest that some of the new generation AEDs, like brivaracetam, can display immunomodulatory properties that could contribute to their beneficial impact in DRE and other neurological disease. We aimed to investigate differences in immune cell populations, cytokines, and neurodegenerative biomarkers in the peripheral blood of subjects with epilepsy (DRE vs. well-controlled) compared to healthy controls and to assess the impact of brivaracétam on activation of human immune cells in vitro and its immunomodulatory and neuroprotective potential in vivo in the active experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a common model of the prototypical CNS neuroinflammatory disease multiple sclerosis. Methodology: Using peripheral blood mononuclear cells and serum isolated from the peripheral blood of adults suffering from focal onset epilepsy and healthy donors, we performed flow cytometry analysis ex vivo, multiplex immunoassays, and ultrasensitive single molecule array. We compared the influence of brivaracetam and lacosamide on activation of human peripheral immune cells in vitro and in vivo in MOG-induced active EAE, the most common animal model of multiple sclerosis. Results: We observed an increased proportion of CD4 T cells in the peripheral blood compartment of adults suffering from DRE, with a higher frequency of proinflammatory Th17/Th1 cells compared to controls. We also reported significantly higher levels of the marker of neuronal injury sNfL in aging subjects with DRE compared to age-matched controls. Furthermore, we showed that prophylactic administration of brivaracetam or lacosamide did not delay EAE onset but was associated with a significantly less severe clinical course in the chronic phase of active EAE in C57BL/6 female mice compared to control (vehicle).Conclusions: Taken together, our data support that DRE is associated with a proinflammatory Th17/Th1 CD4 T cell immune profile in peripheral blood and pathological levels of sNfL, supporting both potential inflammatory and neurodegenerative components in DRE. On the other hand, the novel generation AEDs (brivaracetam and lacosamide) do not impair the response to immunization with MOG peptide but improve the course of EAE through mostly neuroprotective mechanisms.

Le récepteur de mort CD95 participe à de nombreuses fonctions physiologiques en transmettant des signaux apoptotiques. Son ligand membranaire, CD95L, est principalement exprimé à la surface des lymphocytes et contrôle ainsi l’homéostasie cellulaire et l’élimination des cellules infectées ou transformées. Certaines situations pathologiques conduisent à une expression ectopique du CD95L par d’autres types cellulaires,associé à son clivage par des métalloprotéases (cl-CD95L). La forme soluble ainsi libérée perd sa capacité à transmettre l’apoptose mais déclenche l’activation de voies non-apoptotiques induisant l’inflammation dans des maladies inflammatoires chroniques comme le lupus érythémateux systémique (LES) ou encore les formes métastatiques du cancer du sein. Dans ces deux pathologies, de fortes quantités de cl-CD95L sont détectées dans le sérum de ces patients et ont été associés à la progression des pathologies. Dans le LES, nous établissons que cl-CD95L contribue au processus inflammatoireen favorisant la transmigration endothéliale des lymphocytes Th17. Cette migration cellulaire dépendante de CD95 nécessitele recrutement de la PLCγ1 sur le domaine juxta-membranaire de CD95 qui induitl’activation du signal calcique. Pour identifier d’autres partenaires moléculaires de CD95, une analyse protéomique a été réalisée et a permis d’identifier une association entre CD95 et la machinerie traductionnelle. Cette interaction nécessite le recrutement d’eIF4A1 au niveau du domaine juxta-membranaire de CD95. Nous avons par ailleurs montré que dans des lignées cancéreuses mammaires, eIF4A1 participe à la traduction de certaines protéines comme la sérine-thréonine kinase Akt pour faciliter l’activation de la voie de signalisation PI3K et la migration cellulaire induite par CD95. Cette étude a donc mis en évidence l’implication d’un nouveau domaine de CD95 dans l’induction des signaux non-apoptotiques. Ce domaine juxta-membranaire a été nommé CID pour « calcium inducing domain ». De plus, ce domaine fusionné à un peptide perméant provenant de la protéine TAT appelé TAT-CIDa montré son efficacité pour inhiber la migration lymphocytaire chez les souris lupiques et offre de nouvelles perspectives pour le développement de traitements améliorants les symptômes inflammatoires du LES. / The death ligand CD95L, mainly expressed by immune cells, contributes to the elimination ofinfected and transformed cells. In pathological contexts, CD95L can be expressed by others cell types such as endothelial cells.CD95L can be cleaved by metalloproteases to generate a soluble CD95L (cl-CD95L) failing to trigger the apoptotic signaling pathwaybutinducing non-pro-apoptotic signaling pathways. cl-CD95L promotes inflammation in chronic inflammatory disorders such as systemic lupus erythematosus (SLE) and increases risks of metastatic dissemination in breast cancer patients. In SLE patients, we established that high amounts of cl-CD95L fuels inflammation by promoting endothelial transmigration of activated Th17 cells. This CD95-drivencell migration requires PLCγ1 recruitment by CD95 and the subsequentimplementation of the calcium signal. To identify in an exhaustive fashion, all molecular partners of CD95, a global proteomic analysis was undertaken. This TAP-Tag approach highlighted a strong association between the translational machinery and CD95. This analysis was confirmed by a two-hybrid approach revealingthat the translation initiation factor eIF4A1 directly interactedwith CD95.In breast cancer cells, we established that eIF4A1 was instrumental in the translation of certain genes such as Akt contributing to the implementation of the CD95-mediated PI3K signaling pathway and cell migration. In this study, we identifiedthe CD95 domaininvolved in the induction of the non-apoptotic signaling pathway. This domain was named CID for “calcium inducing domain”.Moreover, wegenerated a therapeutic molecule consisting of theCID fused to the cationic cell-penetrating HIV TAT domain. TAT-CID prevented the accumulation of Th17 cells in inflamed organs of lupus-prone mice and could turn out to be an original therapeutic molecule to alleviate clinical symptoms in SLE patients.

La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative causée par la destruction des neurones dopaminergiques. La cause sous-jacente de cette perte neuronale est inconnue. La maladie de Parkinson peut se développer tôt dans la vie (forme juvénile autour de 40 ans) ou sporadiquement (après l’âge de 60 ans).PINK1 (PTEN-induced putative kinase 1) et Parkin sont des gènes liés à la forme juvénile de la maladie de Parkinson. Ils influencent la réponse inflammatoire et la dysfonction mitochondriale. PINK1 et Parkin ont été impliqués dans la régulation négative de la présentation de protéines mitochondriales (MitAP). Ces protéines répriment la présentation de protéines mitochondriales sur les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CMH I) à la suite d’un stress. MitAP est dépendant de la formation de vésicules mitochondriales (MDVs). La formation des MDVs est dépendante des protéines de trafic telles que de Snx9, Rab9, et Rab7. La diminution des niveaux d’expression de ces protéines induit une inhibition de MitAP. L'instabilité mitochondriale augmente également la fuite d'ADN mitochondrial dans le cytosol (à travers un mécanisme inconnu), ce qui entraîne l'activation du capteur d'ADN cytosolique tel que cGAS / STING. L’implication de MitAP dans l’auto-immunité a été démontrée. En effet, les souris PINK1 KO infectées par une bactérie intestinale Gram négatif, développe des lymphocytes T autoréactifs spécifiques aux antigènes mitochondriaux et des symptômes de type Parkinson. Des données récentes ont par ailleurs appuyé cette hypothèse en démontrant la présence de lymphocytes T autoréactifs spécifiques de l’alpha-synucléine, une protéine dont le dysfonctionnement est fortement associé à la maladie. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que les patients qui souffrent de la maladie de Parkinson ont un niveau plus élevé de MitAP. L’augmentation de MitAP, notamment au niveau des cellules présentatrices d’antigènes (CPA), entraînerait une autoréactivité mitochondriale et aussi une dérégulation inflammatoire causée par une augmentation de la production de MDVs. Cette production accrue de MDV entraînerait une augmentation des fuites d'ADN mitochondrial détecté par la voie cGAS/STING et induirait l’augmentation de la production de cytokines pro-inflammatoires impliquées dans la polarisation des lymphocytes T vers un phénotype auto-immun. Ici, nous montrons que les patients possèdent dans le sang, des lymphocytes T autoréactifs spécifiques aux antigènes mitochondriaux et que ces cellules expriment spécifiquement l’IL-17 (un marqueur des lymphocytes Th17 et Tc17, des types de lymphocytes qui est sont fortement liés aux maladies auto-immunes). Par ailleurs, nous montrons qu’en absence de PINK1, le traitement par endotoxine bactérienne (LPS) ou par la bactérie EPEC (Enteropathogenic Escherichia coli) des CPA a comme conséquence une surproduction d’un ensemble de cytokines pro-inflammatoires. Ces cytokines (IL-6, IL-23 et IL-1β) sont impliquées dans la polarisation des cellules Th17. Nous démontrons également que les CPA PINK1 KO traitées par le LPS induisent une polarisation biaisée des lymphocytes T vers un phénotype Th17. Nous démontrons également, dans une lignée de CPA déficientes pour des gènes associés à la biogenèse des MDVs, des niveaux d’expression réduits de cytokines pro-inflammatoires après infection par l’EPEC ou traitement avec le LPS. Ces données soulignent l’importance de la voie MitAP dans la pathophysiologie de la maladie Parkinson à travers la régulation de l’auto-immunité et de l’inflammation. / Parkinson's disease (PD) is a neurodegenerative disease caused by the destruction of dopamine neurons, yet, the underlying cause of this neuronal loss is still unknown. Parkinson's disease can be juvenile or early onset (before age 40) and sporadically (after the age of 60). PINK1 (PTEN-induced putative kinase 1) and Parkin are genes implicated in the juvenile form of PD that have also been shown to influence inflammatory responses and mitochondrial dysfunction. PINK1 and Parkin negatively regulate mitochondrial antigen presentation (MitAP). These proteins suppress the presentation of mitochondrial proteins on Major Histocompatibility Complex (MHC) Class I following stress. MitAP is dependent on the formation of mitochondrial vesicles (MDVs). These MDVs utilize traffic proteins such as Snx9, Rab9, and Rab7. Decreased levels of expression of any of these proteins inhibit MitAP. Mitochondrial instability also increases mitochondrial DNA leakage into the cytosol (through and unknown mechanism) resulting in activation of cytosolic DNA sensors like cGAS/STING. MitAP's implication in autoimmunity has been demonstrated in PINK1 KO mice infected with gram-negative intestinal bacteria resulting in auto-reactive T-cells specific to mitochondrial antigens and Parkinson's-like symptoms. In PD patients, auto-reactive T cells specific for alpha-synuclein, a protein whose dysfunction is associated with PD, have been found, suggesting that auto-reactive T-cells are present in PD. Thus, we hypothesized that PD patients would have increased levels of MitAP in antigen presenting cells (APCs) resulting in mitochondrial self-responsiveness as well as an inflammatory deregulation. This increased production of MDVs would result in an increase mtDNA leakage and ultimately be detected by the cGAS/STING pathway inducing the production of proinflammatory cytokines. Ultimately, these proinflammatory cytokines would induce the polarization of T-cells towards an autoimmune phenotype (Th17). Here, we show that APCs deficient in genes associated with MDVs biogenesis have reduced expression levels of pro-inflammatory cytokines after infection with Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) or the bacterial endotoxin LPS. We determine that in the absence of STING there is a strong inhibition of MitAP and cytokine expression in raw 264.7 macrophages after LPS treatment. Furthermore, we validate that in the absence of PINK1, LPS or EPEC treated BMDCs overproduce a set of pro-inflammatory cytokines (IL-6, IL-23 and IL-1β) that induce a biased polarization of T-cells to a Th17 phenotype. Finally, we observed mitochondrial antigen specific T-cells expressing IL-17 (a marker of Th17 and Tc17 lymphocytes, the types of lymphocytes that are strongly related to autoimmune diseases) in PD patients. This data highlights the importance of the MitAP pathway in the pathophysiology of Parkinson's disease through the regulation of autoimmunity and inflammation.

La fibrose kystique (FK) est la maladie autosomique récessive la plus fréquente chez les individus de race caucasienne. Elle est secondaire à la mutation du gène Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR). Grâce à des traitements plus agressifs, la médiane de l’espérance de vie des individus atteints de la FK a augmenté et cette augmentation est associée à l’émergence du diabète secondaire ou associé à la FK (DAFK), une complication associée à une augmentation du taux de mortalité. La pathophysiologie du DAFK n’est pas parfaitement comprise. Par exemple, la cause de l’accélération de la perte de la fonction pulmonaire, qui débute des années avant l’apparition du DAFK, n'est pas élucidée. Tous les patients atteints de la FK, même ceux sans le DAFK, présentent de l’hyperglycémie et des fluctuations glycémiques. D’ailleurs, une étude a démontré que la réactivité immunitaire est affectée par l’hyperglycémie dans un modèle animal de la FK et il y a des évidences que les lymphocytes sans CFTR fonctionnel ou en présence d’un excès de glucose ont des réactions inflammatoires anormales. Donc, nous avons émis l’hypothèse que les patients atteints de la FK, surtout ceux non-diabétiques et pré-diabétiques, auront une plus grande proportion de lymphocytes Th17 et Treg produisant la cytokine pro-inflammatoire IL-17A comparativement aux sujets sains et que l’augmentation de cette cytokine pourrait influencer la chute accélérée des fonctions pulmonaires avant l’apparition du DAFK. Des niveaux élevés d’IL-17A sont retrouvés dans les poumons des patients atteints de la FK et dans le sang périphérique des patients avec le diabète de type 1 (DT1) et de type 2 (DT2). L’IL-17A peut aussi être produite par les lymphocytes Treg dysfonctionnels. Habituellement, ces lymphocytes atténuent les réponses inflammatoires excessives, mais lorsqu’ils sont dysfonctionnels, ils peuvent produire de l’IL-17A, contribuant ainsi à l’état inflammatoire. De plus, nous avons supposé que les proportions de Th17 et Treg produisant de l’IL-17A seront associées aux fonctions pulmonaires des patients atteints de la FK et que l’alimentation, l’activité physique et la composition corporelle influenceraient ces relations. Les résultats de cette thèse ont montré que, malgré une association entre la proportion de lymphocytes dans le sang périphérique et les indices de fluctuations glycémiques, celles-ci n’influençaient pas les proportions de lymphocytes Th17 et Treg produisant de l’IL-17A lorsqu’ils étaient mis en culture pour 24 ou 48 heures dans des milieux contenant soit 5 mM ou 25 mM de glucose et stimulés par le phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) et le phytohemagglutinine (PHA) ou, encore, non stimulés. De plus, ces proportions étaient semblables entre les patients atteints de la FK et les individus en santé. Toutefois, les proportions de lymphocytes Treg stimulés produisant de l’IL-17A des sujets sains étaient plus élevées que les proportions de lymphocytes Treg non stimulés de tous les participants (patients atteints de la FK et individus en santé). Tout ceci suggérant donc que les Treg des sujets sains et atteints de la FK ne réagissaient pas de la même façon à la stimulation. D’ailleurs, la durée d’incubation affectait les proportions de Th17 produisant de l’IL-17A, mais elle n’avait aucun effet sur les proportions de Treg produisant cette cytokine. Donc, ces types cellulaires réagissaient différemment dans les mêmes milieux de culture. De plus, nous avons observé que seulement l’énergie provenant des glucides affectait modestement les indices de fluctuations glycémiques et que les proportions de Th17 et Treg produisant de l’IL-17A n’étaient pas associées aux fonctions pulmonaires des patients atteints de la FK. En conclusion, les patients atteints de la FK avaient plus d’hyperglycémie et de fluctuations glycémiques, mais elles n’influençaient pas les proportions de lymphocytes Th17 et Treg produisant de l’IL-17A ex vivo. Dans des études futures, il faudrait étudier le rôle de l’IL-17A dans les poumons des patients avec et sans le DAFK et réaliser une étude prospective pour déterminer si une augmentation des niveaux d’IL-17A chez les patients sans le DAFK se traduit par une chute accélérée des fonctions pulmonaires avant l’apparition de cette complication. / Cystic fibrosis (CF) is the most common autosomal recessive genetic disease among Caucasians and it is cause by a mutation in the Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR) gene. With the emergence of more aggressive therapies to treat CF, the median life expectancy of patients with CF has increased and new complications, such as CF-related diabetes (CFRD), have emerged. CFRD is associated with increased mortality. The physiopathology of this complication is not fully understood. For instance, the reason why people with CF have an accelerated decline in lung functions years before the diagnosis of CFRD is not known. Patients with CF, even those without CFRD, have increased hyperglycemia and glucose fluctuations. In addition, a study has reported that hyperglycemia affected immune reactivity in a mouse model of the disease. Furthermore, studies have shown that lymphocytes without a functional CFTR or that have increased uptake of glucose have abnormal immune responses. Therefore, we hypothesized that patients with CF, specifically those with normal and impaired glucose tolerance, would have increased proportions of Th17 and Treg lymphocytes producing the pro-inflammatory cytokine IL-17A and that the increase in IL-17A levels would contribute to the accelerated decline of lung functions before the onset of CFRD. Increased levels of IL-17A have been found in the lungs of patients with CF and the peripheral blood of patients with type 1 (T1D) and 2 diabetes (T2D). Dysfunctional Treg lymphocytes can also produce IL-17A. These lymphocytes usually attenuate excessive immune responses but, in certain cases, can be dysfunctional and produce the pro-inflammatory cytokine IL-17A. Moreover, we hypothesized that the proportions of these cells producing IL-17A would be associated to lung functions in patients with CF and that nutrition, physical activity and body composition could influence the relationship between inflammation and glucose fluctuations. Although an association between the proportion of lymphocytes in the peripheral blood of participants and glucose fluctuations was observed, glucose fluctuations did not affect the proportions of Th17 and Treg lymphocytes producing IL-17A stimulated with PHA and PMA or not stimulated in media containing either 5 or 25 mM of glucose for 24 or 48 hours. Furthermore, these proportions were similar between healthy individuals and patients with CF with the exception of the proportion of stimulated Treg lymphocytes producing IL-17A of healthy individuals that was greater than the proportions of non-stimulated Treg lymphocytes producing IL-17A of all participants (patients with CF and healthy individuals). This suggests that Treg lymphocytes of healthy individuals and CF patients do not respond in the same manner to stimulation by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and phytohemagglutinin (PHA). Also, the duration of incubation affected the proportions of Th17 cells producing IL-17A but did not affect the proportion of Treg producing this cytokine. Therefore, these two types of lymphocytes are differently affected in the same culture media. Also, only the proportion of calories from carbohydrates affected modestly glucose fluctuations and the proportions of Th17 and Treg lymphocytes producing IL-17A were not associated to lung functions in CF patients. To conclude, patients with CF had increased hyperglycemia and glucose flucutations when compared to healthy individuals but this glucose variability did not affect the proportions of Th17 and Treg lymphocytes producing IL-17A ex vivo. Future studies are needed to explore the role of IL-17A in the lungs of patients with CFRD and a prospective study would be important in order to determine if an increase in IL-17A in patients without CFRD is associated to an accelerated decrease in lung functions before the onset of this complication.