Le développement de la résistance aux drogues chimiothérapeutiques ou la chimiorésistance est un obstacle majeur dans les thérapies anti-cancer et représente un facteur important dans la rechute des patients. L'un des mécanismes majeurs impliqués dans la chimiorésistance est la capacité des cellules cancéreuses à adhérer aux cellules stromales et à la matrice extracellulaire de leurs microenvironnements. Dans ce contexte, les cellules leucémiques lymphoblastiques aiguës de type T (T-ALL) sont connues pour interagir avec la matrice extracellulaire via les molécules d'adhésion de la sous-famille des intégrines β1. Cependant, le rôle et l'importance de ces intégrines dans la chimiorésistance des cellules T-ALL restent encore mal compris. Dans ce travail, nous avons montré que l'adhésion des lignées cellulaires T-ALL humaines et des cellules T-ALL primaires aux matrices extracellulaires tridimensionnelles comme le matrigel et le gel de collagène de type I, favorise leurs résistances à la doxorubicine via l'intégrine β1. De plus, le blocage de l'intégrine β1 avec un anticorps bloquant spécifique sensibilise les xénogreffes de cellules T-ALL CEM à la doxorubicine. En effet, l'utilisation de l'anticorps AIIB2 bloquant l'intégrine β1 combiné à la doxorubicine diminue la charge leucémique dans la moelle osseuse et prolonge la survie des souris. En analysant les mécanismes impliqués, nous avons trouvé que l'adhésion au matrigel induisait la chimiorésistance des cellules T-ALL en favorisant l'efflux de doxorubicine via l'activation du transporteur de drogue ABCC1 (ATP Binding Cassette Subfamily C Member 1). Par ailleurs, le matrigel induit la phosphorylation de la tyrosine kinase d'adhésion focale PYK2 (FAK-related proline-rich tyrosine kinase 2) et l'inhibition de PYK2 avec l'inhibiteur VS-6063 ou un siRNA spécifique a montré que cette dernière était impliquée dans l'efflux de doxorubicine et la chimiorésistance induite par le matrigel. En plus des intégrines qui lient la matrice extracellulaire, nous avons également montré que l'intégrine α4β1 ou VLA-4 (Very late antigen 4) qui lie la molécule d'adhésion VCAM-1 (Vascular cell adhesion molecule 1) induisait également la chimorésistance des cellules T-ALL et ce, en activant l'efflux de doxorubicine qui est dépendante de PYK2 et non de la tyrosine kinase d'adhésion focale FAK. En conclusion, l'ensemble des résultats de cette thèse indique que la voie des intégrines β1 joue un rôle majeur dans la chimiorésistance des T-ALL. Nous avons également identifié un nouveau mécanisme de chimiorésistance activé par les intégrines et qui consiste dans l'activation de la tyrosine kinase PYK2 qui augmente la fonction du transporteur des drogues ABCC1. Finalement, nos résultats suggèrent que le ciblage thérapeutique de la voie intégrine β1/PYK2/ABCC1 dans les cellules T-ALL pourrait réduire la chimiorésistance des cellules T-ALL et la rechute des patients.

Le microbiote intestinal humain est un important réservoir de gènes de résistance aux antibiotiques qui demeure toutefois méconnu. Dans cette étude, nous avons exploré les gènes de résistance du microbiote intestinal de participants sains avant et après une exposition à l’antibiotique cefprozil. Trois approches ont été utilisées pour caractériser ces gènes et examiner leur altération par les antimicrobiens : la métagénomique, la culturomique et la sélectomique recombinante. Le séquençage métagénomique et la culturomique ont permis d’identifier plusieurs gènes de résistance aux β-lactamines et à d’autres antibiotiques. Cependant, la culturomique a permis d’identifier ces gènes chez un plus grand nombre de participants. La culturomique a mis en évidence la présence de gènes de résistance à la vancomycine de type vanD dans les microbiotes de 46% des participants comparativement à 8% avec le séquençage métagénomique. La culturomique a aussi montré que l’exposition in vitro et in vivo à une β-lactamine stimule l’émergence des gènes vanD. La sélectomique recombinante, qui repose sur la construction de banques d’expression à partir de l’ADN des bactéries, a été utilisée pour caractériser de manière fonctionnelle les gènes de résistance aux β-lactamines chez les bactéries cultivables de l’intestin. Elle a permis d’identifier et caractériser cinq β-lactamases différentes dont deux montrant une activité à spectre étendu. La majorité des gènes de β-lactamases étaient associés à d’autres gènes de résistance et/ou des éléments mobiles. Ces travaux ont montré que la culture favorise l’identification de gènes non détectés par le séquençage métagénomique et que la sélectomique recombinante est un outil puissant pour caractériser les fonctions des gènes. Cette étude a aussi révélé que la prise d’une β-lactamine communément utilisée peut influencer l’abondance des bactéries qui contiennent des gènes de résistance à un antibiotique d’une autre classe, comme la vancomycine, un antibiotique de dernier recours dans l’arsenal des antimicrobiens. / The human intestinal microbiota is an important and poorly known antibiotic resistance genes reservoir. In this study, we explored resistance genes from the microbiota of healthy volunteers before and after exposure to the β-lactam cefprozil antibiotic. Three approaches were used to characterise resistance genes in the human microbiota and examine alteration by antimicrobials: metagenomics, culturomics and recombinant selectomics. Metagenomic and culturomic sequencing of intestinal microbiota enabled identification of several genes for resistance to β-lactams and other antibiotics. However, culturomics allowed identification of these genes in more participants than metagenomics. Culturomics highlighted the presence of the clinically important vancomycin resistance vanD-like genes in the microbiota of about 46% of participants compared to 8% with metagenomics. Culturomics also showed that in vitro and in vivo β-lactams exposition stimulates the emergence of vanD genes. Recombinant selectomics, which is based on the construction of expression libraries made with bacterial DNA, was also used to functionally characterise β-lactam resistance genes from the cultivable intestinal bacteria. It allowed identification and characterisation of five different β-lactamases including two with an extended-spectrum activity. The majority of β-lactamases genes was associated with other resistance genes and/or mobile elements. This study demonstrated that culture favors the identification of genes undetected by direct metagenomic sequencing and selectomics was a powerful tool to characterise gene functions. It also demonstrated that intake of a commonly used antibiotic of the β-lactam family can influence the abundance of bacteria containing resistance genes to an antibiotic from another class, such as vancomycin, which is a last resort antibiotic.

Les protozoaires du genre Leishmania sont responsables de différentes pathologies présentant des taux importants de morbidité et de mortalité à travers le monde. En l'absence de vaccin efficace, le contrôle de ces infections repose sur l'utilisation d'agents chimiothérapeutiques. Ce parasite étant dépourvu de promoteurs classiques, la régulation génique repose essentiellement sur des mécanismes post-transcriptionnels, ce qui rend l'étude des protéines primordiale. Toutefois, les protéines peu abondantes sont souvent sous-représentées avec les méthodes protéomiques classiques et le fractionnement protéique est donc à privilégier. L'étude des protéines exprimées de manière préférentielle chez l'un des deux stades de vie, soit les promastigotes présents chez l'insecte-vecteur et les amastigotes présents dans les macrophages de l'hôte mammifère infecté, peut mener à l'élaboration de vaccins et/ou de nouveaux traitements. Il est également essentiel de mieux caractériser les mécanismes de résistance aux médicaments actuels. Les objectifs de cette thèse étaient i) de mieux caractériser le protéome des deux stades de vie du parasite en étudiant les protéines basiques, membranaires et de haut poids moléculaire par la mise au point de méthodes protéomiques innovantes et ii) d'étudier les mécanismes de résistance de Leishmania à l'antimoine trivalent et l'amphotéricine B par protéomique quantitative et par séquençage à haut débit du génome complet. Les travaux effectués dans le cadre de cette thèse ont permis l'élaboration de méthodes de fractionnement protéique permettant une meilleure représentation des protéines peu abondantes chez Leishmania. Les analyses protéomiques subséquentes des protéines basiques, membranaires et de haut poids moléculaire ont permis l'identification de nombreuses protéines impliquées dans la différenciation entre les deux formes de vie du parasite. Des études de protéomique quantitative ont également permis de découvrir des protéines impliquées dans la résistance à l'antimoine trivalent et à l'amphotéricine B. De plus, l'aneuploïdie a également été impliquée dans la résistance à ces deux molécules. La formation d'amplicons circulaires extrachromosomiques a été observée en lien avec la résistance à l'antimoine trivalent. Finalement, deux nouvelles mutations ponctuelles ont été impliquées dans la résistance aux médicaments chez Leishmania, soit LinJ.33.1810-E629K dans le cas de l'antimoine trivalent et LinJ.13.1590-G433S dans le cas de l'amphotéricine B.

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est une barrière quasiment imperméable assurant la protection du cerveau. Elle limite très fortement le passage de diverses molécules au cerveau, dont les molécules thérapeutiques. Les cellules endothéliales des capillaires cérébraux (CECC), principal constituant de la BHE, présentent abondamment à leur surface plusieurs transporteurs dont le récepteur de la transferrine (RTf). Le RTf est un récepteur qui pourrait potentiellement permettre l’apport de molécules thérapeutiques au cerveau via le mécanisme de transcytose médiée par récepteur (TMR). L’objectif général de ce projet est de développer, caractériser et valider une approche pharmaceutique non virale et non invasive de ciblage thérapeutique à l’aide de fragment Fab d’anticorps monoclonaux visant la libération de molécules thérapeutiques dans le parenchyme cérébral. Tout d’abord, des essais in vitro et in vivo ont été entrepris afin d’évaluer le transport des fragments Fab au cerveau. Les fragments Fab, obtenus par digestion enzymatique à la papaïne, n’ont malheureusement été détectés ni in vitro ni in vivo. Puis, nous avons étudié l’internalisation in vitro et in vivo de micelles polyioniques (MP) conjugués à des fragments Fab’ et renfermant un analogue d’un pARNi fluorescent. A ce jour, les résultats obtenus in vivo avec les MP ne permettent pas d’envisager l’utilisation de ce vecteur comme usage thérapeutique dans le cas de thérapie ciblant le parenchyme cérébral, mais les MP s’avèrent être très prometteurs dans le cas de thérapie génique ciblant les CECC impliquées dans plusieurs maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer, la sclérose en plaques, les accidents vasculaires cérébraux etc. / The blood-brain barrier (BBB) is an almost impermeable barrier protecting the brain. It greatly limits the passage of blood-borne molecules to the brain, including therapeutic molecules. Brain capillary endothelial cells (BCEC), forming the BBB, express transporters including the transferrin receptor (TfR) on their surface. The TfR is a receptor that could potentially allow the delivery of therapeutic molecules to the brain via receptor-mediated transcytosis (RMT). The main objective of this project is to develop, characterize and validate a non-viral noninvasive therapeutic targeting pharmaceutical approach with Fab fragments of monoclonal antibodies for the delivery of therapeutic molecules in the brain parenchyma. First, in vitro and in vivo experiments were done to assess the transport of Fab fragments into BCEC. Fab fragments, obtained by enzymatic digestion with papain, were detected neither in vitro nor in vivo. Then, we studied the internalization of polyion micelles (MP) conjugated to Fab' fragments and encapsulating an analog of a fluorescent siRNA in vitro and in vivo. The results obtained in vivo with MP conjugated with Fab’ fragments do not suggest penetration into the brain parenchyma, but are promising for gene therapy targeting BCEC to treat Alzheimer disease, multiple sclerosis or stroke.

Le cancer du poumon atteint une large population partout à travers le monde. En plus d'être un cancer qui se détecte souvent très tard et qui métastase fréquemment, certains cas de cancer du poumon répondent très peu à la chimiothérapie. De fait, le tissu pulmonaire normal possède une résistance intrinsèque basale élevée aux xénobiotiques. Cette résistance intrinsèque du tissu pulmonaire, nous a inspirés grandement lors du choix du thème principal de cette thèse de doctorat : la caractérisation de lignées cellulaires cancéreuses du poumon chimiorésistantes. Bien que de nombreux travaux aient étudié la chimiorésistance dans des lignées cellulaires cancéreuses du poumon déjà chimiorésistantes, nos travaux ont plutôt porté sur la caractérisation de lignées cellulaires cancéreuses du poumon A549 lors du développement de cette chimiorésistance. Les premiers concepts abordés seront le cancer en général puis le cancer du poumon. Suivront les différents concepts de fonctionnement de la chimiothérapie. Par la suite, nous aborderons les cavéolines, une famille de gènes dont les membres ont un effet suppresseur de tumeur et dont l'expression est modulée dans des cellules cancéreuses naïves et chimiorésistantes. Nous décrirons aussi le concept de chimiorésistance, à laquelle plusieurs auteurs réfèrent par phénotype MDR (de l'anglais « Multidrug-resistance »). Nous aborderons ainsi les échangeurs multidrogues de la famille ABC (ATP-Binding Cassette), dont certains membres impliqués dans l'efflux d'agents antinéoplasiques, sont surexprimés dans plusieurs lignées cellulaires cancéreuses chimiorésistantes. Finalement, nous traiterons d'un autre type de changement cellulaire observé dans des cellules chimiorésistantes, soit les modifications lipidiques à la membrane plasmatique. Plusieurs études ont démontré que la quantité de certains types de lipides présents à la membrane plasmatique, par exemple le cholestérol et plusieurs sphingolipides, était modulée dans des cellules cancéreuses chimiorésistantes. De plus, plusieurs de ces lipides sont maintenant considérés comme des seconds messagers cellulaires et reconnus pour leur rôle dans la localisation membranaire de plusieurs molécules de la signalisation cellulaire. Nous avons tenté de faire un lien entre la présence de certains lipides dans nos lignées cellulaires chimiorésistantes et leur phénotype MDR.

Le rôle de la matrice extracellulaire (MEC) du microenvironnement médullaire dans la chimiorésistance des leucémies lymphoblastiques aiguës de type T (T-ALL) n’est pas encore établi. Nos travaux ont permis de démontrer que le collagène, mais pas la fibronectine, induit la résistance des cellules T-ALL contre l’apoptose induite par la chimiothérapie. L’effet anti-apoptotique du collagène est induit par l’intégrine α2β1. L’activation par le collagène de la voie MAPK/ERK mais pas PI3K/AKT est requise pour l’inhibition de l’apoptose mitochondriale induite par la doxorubicine et ceci grâce au maintien de la stabilité de la protéine anti-apoptotique Mcl-1 et à l’augmentation de l’expression du transporteur d’efflux des drogues ABCC1 (MRP-1). Le maintien de Mcl-1 par le collagène est dû à l’inhibition de la voie pro-apoptotique Rac1/ JNK induite par la doxorubicine. L’activation de la voie α2β1/ERK/Mcl-1 permet également la survie des cellules T-ALL en absence de facteurs de croissance. En conclusion, nos données suggèrent que l’intégrine α2β1 serait une voie importante dans l’induction de la chimiorésistance et la progression des leucémies T-ALL. / The role of the extracellular matrix (ECM) of the tumor microenvironment in the chemoresistance of T cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) is not yet established. Through our results, we demonstrate that collagen, but not fibronectin, induces the resistance of T-ALL cells against apoptosis induced by chemotherapy. The anti-apoptotic effect of collagen is mediated by α2β1 integrin and is dependent on the activation of the MAPK/ERK pro-survival pathway but not of the PI3K/AKT pathway. Collagen induced MAPK/ERK pathway is required for the inhibition of the mitochondrial apoptosis induced by doxorubicin through the maintenance of the stability of the anti-apoptotic protein Mcl-1 and the up-regulation of doxorubicin efflux by the drug transporter ABCC1. Mcl-1 stabilization by collagen is du to the inhibition of Rac1/JNK pro-apoptotic pathway induced by doxorubicin. In addition to its role in chemoresistance, α2β1 integrin ligation allows the survival of T-ALL cells in the absence of growth factors via ERK/Mcl-1 pathway. In conclusion, our data indicate that α2β1 integrin may constitute an important pathway favoring T-ALL leukemia chemoresistance and progression.

OBJECTIFS : Le Bortezomib (Velcade©) est un inhibiteur de protéasome présentement utilisée en chimiothérapie pour soigner les cas de myélomes multiples et de lymphomes. Les tumeurs solides sont souvent résistantes à ce type de traitement. Mon laboratoire d’accueil à récemment déterminé que le traitement de cellules cancéreuses issues de tumeurs solides avec le Bortezomib induit une réponse de stress caractérisée par la phosphorylation du facteur d’initiation à la traduction eIF2α. Cette phosphorylation est médiée par une protéine kinase, nommée Heme Regulated Inhibitor (HRI). La phosphorylation du facteur eIF2α par HRI occasionne la formation de granules de stress (GS); corps cytoplasmiques renfermant les protéines ribosomales, les ARNms, et des molécules de signalisation. La formation des GS est associée à une résistance à la mort cellulaire induite par différents types de stress, tels qu’un choc oxydatif, l’hypoxie ou les radiations. Nous avons ainsi impliqué la formation des GS dans la résistance des cellules cancéreuses au Bortezomib. En effet, nous avons démontré que la suppression des GS en interférant avec l’expression d’HRI sensibilisait les cellules cancéreuses au traitement de Bortezomib. Ce résultat dénote aussi un nouveau rôle potentiel de HRI dans la chimiorésistance. Mon projet consistait donc à tester cette hypothése in vivo en utilisant des cellules cancéreuses déplétées de manière stable en HRI. MÉTHODES : D’abord, en surexprimant de manière transitoire la protéine HRI grâce à un plasmide GFP-HRI, nous avons pu évaluer l’effet de sa surexpression sur la viabilité cellulaire. D’autre part, en créant des lignées stables exprimant des Small hairpin RNA (shRNA) dirigés contre l’ARNm HRI, nous avons pu étudier l’effet de l’absence de cette kinase sur la physiologie cellulaire et ce, en condition normale et en condition de traitement au Bortezomib. RÉSULTATS : La surexpression de la protéine HRI cause l’induction de granules de stress dépendant de la phosphorylation du facteur eIF2α. Ce résultat valide nos résultats de déplétion démontrant un rôle majeur de HRI dans la formation des GS en condition de Bortezomib via la phosphorylation de son substrat eIF2α. De façon surprenante, nous avons également constaté une morphologie cellulaire ainsi qu’un taux de croissance différents en condition non traitée, comparativement aux contrôles shRNA non effecteurs. Ceci suggère un rôle nouveau de HRI dans la croissance cellulaire, indépendamment de la phosphorylation d’eIF2a. L’injection sur la membrane chorioallantoique d’un fœtus de poulet (in ovo) de cellules cancéreuses déplétées en HRI occasionne une diminution de développement tumoral. Inversement, on observe la formation d’une masse apparente pour les contrôles non effecteurs et ce, toujours en condition non traitée. Ceci suggère donc un rôle de HRI dans la croissance tumorale. CONCLUSION : La kinase HRI est impliquée dans la résistance des cellules cancéreuses à la mort cellulaire engendrée par le Bortezomib, mais semble également jouer un rôle physiologique dans la croissance tumorale.

Ce mémoire présente une étude transversale de corrélation cherchant à préciser dans quelle mesure les habiletés cognitives sont liées à l’adhésion à la médication et à identifier un outil de dépistage de difficulté à prendre sa médication. Cinquante-huit participants ont été recrutés lors de leur séjour en Unité de courte durée gériatrique. Les analyses par régression logistique ont démontré que les habiletés cognitives globales, plus particulièrement la mémoire et les habiletés opératoires sont reliées à la capacité à prendre sa médication. L’Assessment of Motor and Process Skills possède un bon potentiel comme outil de dépistage de difficultés à gérer sa médication. Comme résultats complémentaires, il a été démontré que la complexité de la médication, le changement de mode de médication ainsi que la présence d’un problème psychologique n’ont pas d’effet sur la capacité à prendre sa médication. Enfin, l’erreur la plus fréquemment commise est la non initiation de la prise. / The goals of the study were to acquire better knowledge about the relationship between cognitive abilities and adherence to medication and to identify a screening tool for people having difficulties to take their medication. To reach this goal, a cross-sectional study, with fifty-eight participants, was conducted in two geriatric units. A logistic regression model showed that global cognitive abilities, memory and process skills are related with the taking of medication. The Assessment of Motor and Process Skills showed a good potential as a screening tool for medication intake difficulties. As complementary results, we found that complexity of medication, medication intake method changes as well as psychological problems are not in related to the taking of medication. Finally, the most frequent error made by participants is the non initiation of the medication intake.

Le cancer carcinoïde est une maladie rare caractérisée par des tumeurs neuroendocrines résistantes aux agents chimiothérapeutiques occasionnant un traitement difficile de celles-ci. Notre laboratoire travaille sur l'enzyme poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1) impliquée dans différentes voies de réparation de l'ADN. La grande efficacité de ces voies est une des raisons pouvant expliquer la résistance observée des tumeurs neuroendocrines. Le but de ce projet était de déterminer le rôle de la PARP-1 dans le traitement du cancer carcinoïde par chimiothérapie. Nous avons obtenu un effet de potentialisation de la streptozotocine caractérisé par un ralentissement de la croissance cellulaire et de la réparation des dommages lors de l'inhibition de la PARP-1. D'un autre côté, nous avons constaté que le «knock down» de la PARP-1 résulte en une diminution du volume tumoral in vivo. Nos résultats montrent donc que la PARP-1 peut devenir une cible thérapeutique dans le traitement du cancer carcinoïde.

La thérapie génique, appelée aussi génothérapie, est une stratégie thérapeutique utilisable en principe pour traiter de nombreuses maladies génétiques. Une variation récente de cette approche thérapeutique utilise le système bactérien CRISPR/Cas9 (The Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)) pour modifier les gènes défectueux des patients atteints d'une maladie héréditaire. Ce système a déjà démontré sa grande capacité à modifier l'ADN chromosomique in vitro ainsi que in vivo mais le problème majeur réside au niveau de la livraison des composantes du système CRISPR, soit la Cas9 et un ARN guide (ARNg). Malgré l'existence de plusieurs vecteurs de livraison viraux ou non viraux, les Adeno-associated virus (AAV) sont les virus les plus utilisés pour livrer des gènes thérapeutiques aux cellules in vitro et aux animaux et aux humains in vivo. Malheureusement, cet outil de livraison commence à démontrer ses limites à cause de sa capacité d'empaquetage très limitée (environ 4.8 kb) par rapport à d'autres outils de livraison et à cause de son immunogénicité. Ces limitations nous amènent à développer une nouvelle approche qui pourrait être plus puissante et beaucoup moins immunogène soit l'utilisation des vésicules extracellulaires produites par toutes les cellules de l'organisme et qui constituent un outil de communication cellulaire. Les travaux de ce mémoire démontrent qu'il est possible d'introduire la protéine Cas9 et plus spécifiquement la Cas9 du Streptococcus pyogène (SpCas9) dans les vésicules extracellulaires. L'utilisation de ces vésicules nous a permis de livrer la SpCas9 à des cellules in vitro et d'induire une édition génique. / Gene therapy, also called genotherapy, is a therapeutic strategy used to treat many genetic diseases. A recent variation of this technology uses the bacterial CRISPR/Cas9 system, The Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) to modify the defective genes of affected patients. This system has already demonstrated its great capacity to modify chromosomal DNA in vitro as well as in vivo, but the major problem lies in the delivery of the CRISPR components (i.e., the Cas9 gene or protein and its guide RNA (gRNA)). Despite the existence of several viral and non-viral delivery vectors, Adeno-associated viruses (AAV) are the most used vector to deliver therapeutic genes to cells in vitro and to animals and humans in vivo. Unfortunately, this delivery vector is starting to demonstrate its limitations due to its very limited packaging capacity (about 4.8 kb) compared to other delivery vectors and due also to its immunogenicity. These limitations lead us to develop a new approach that could be more powerful and much less immunogenic such as extracellular vesicles, which are produced by all cell types in the body, and which constitute an inter-cellular communication tool. Our work demonstrates that we are able to introduce the Cas9 protein, more specifically the Streptococcus pyogene Cas9 (SpCas9) into extracellular vesicles. These vesicles allowed us to deliver the SpCas9 to cells in vitro and to induce genetic editing.