El decaïment de l'avet (Abies alba) va començar als anys 90 als Pirineus espanyols sense unacausa clara que l'expliqués. Les condicions climàtiques de la darrera part del segle XX semblen estar associades al començament d'aquest fenomen. Paral·lelament als processos de decaïment, apareixen nombroses alertes de plagues i patògens que afecten aquests boscos, fet que fa necessari conèixer la relació entre aquests agents biòtics i l'actual decaïment. Els Pirineus han estat utilitzats per l'home durant segles; la gestió i la dinàmica dels Pirineus, han de ser també considerats quan es pretén i) entendre si les condicions ambientals, la gestió i la dinàmica forestal estan associades a l'actual decaïment de l'avet, parant especial atenció al paper que determinats patògens com ara Viscum àlbum, Armillaria, Heterobasidion annosum i Melampsorella caryophyllacearum puguin tenir en el procés, mitjançant; ii) l'estudi de la seva epidemiologia i la identificació de quina és la gestió associada a la seva incidència i severitat.Es van mesurar 29 parcel·les escollides a l'atzar en avetoses dels Pirineus. A cada una de les parcel·les es va mesurar el decaïment dels arbres i la presència de patògens o plagues. Es vamesurar, també, la incidència d'Armillaria i H.annosum a l'interior dels arbres, mitjançant el cultiu de cilindres de fusta extrets de l'interior del tronc. Es va mesurar la presència de patògens a les soques i als arbres morts. Les soques i els arbres morts van ser utilitzats per estimar la composició d'espècies arbòries que hi havia en un passat. Es van mesurar 42 variables per tal de descriure els arbres, les condicions ambientals i la gestió que s'havia dut a terme en cada una de les parcel·les. Es van recollir mostres d' Armillaria i H. annosum, es van cultivar i es van identificar mitjançant tècniques moleculars d'anàlisi de l'ADN. Per examinar algunes de les hipòtesis plantejades va ser necessari emprar models mixtos no lineals a causa de la falta de normalitat i de la correlació espacial de les dades. Un 15% i un 10% dels avets dels Pirineus estaven defoliats i cloròtics, respectivament. Els arbres de l'estrat dominant eren els que presentaven més decaïment. Cap característica de la massa es va trobar associada al decaïment dels arbres. Es va observar que l'avet havia augmentat la seva àrea basimétrica en els últims anys i que els pins (Pinus sylvestris i P. uncinata) n'havien perdut. Les pèrdues d'àrea basimétrica de l'avet van ser, en la majoria dels casos, degudes a augments d'àrea basimétrica de faig (Fagus sylvatica); aquest fet es va trobar associat a la presència de danys sobre la regeneració d'avet produïts per ungulats. La presència de V. album es va veure associada a la mortalitat i al decaïment de l'avet. En boscos purs es va observar que V. album s'havia dispersat fàcilment entre i dins dels arbres, però en masses mixtes la dispersió de V. album semblava significativament reduïda. H. abietinum va ser identificat als Pirineus i la seva severitat a les soques era més alta en aquells boscos on les tallades havien afectat un major percentatge d'avet respecte a altres espècies forestals. La presència de H. abietinum es va veure associada amb la presència de V. album. La mortalitat d'avet era més gran quan els dos patògens apareixien junts. El rovell M. caryphyllacearum es va trobar associat al decaïment de l'avet. Aquest és un fong comú als Pirineus i la seva severitat era més alta en masses amb una major presència de plantes tolerants a l'ombra al sotabosc. A. cepistipes és l'espècie del gènere Armillaria més freqüent a les avetoses. A. ostoyae es va trobar més freqüentment en masses situades a major altitud, i on l'avet estava colonitzant més ràpidament altres tipus de bosc. El decaïment de l'avet és relativament baix i és més evident en els arbres dominants de la massa, cosa que suggereix que es podria tractar d'aquells arbres deixats després de les tallades com a arbres de llavor. V. album sembla ser el patogen amb un paper més important en el decaïment de l'avet. La seva severitat podria estar associada a l'augment de la temperatura als Pirineus i podria haver estat afavorida per la presencia de H. abietinum. Armillaria sembla tenir un paper notable en la dinàmica dels boscos de pi i avet. M. caryophyllacearum sembla trobar unes millors condicions per infectar avets en masses tancades que en masses obertes. Un augment de la sequera als Pirineus sembla que ha incitatel decaïment de les avetoses. La gestió sembla que en general ha afavorit l'avet, però podria haver predisposat determinats arbres a decaure. L'augment de la diversitat d'espècies i la reducció de la competència s'haurien d'examinar com a possibles tècniques per augmentar la salut d'aquests boscos. / El decaimiento del abeto (Abies alba) empezó en los años 90 en los Pirineos sin una causa clara que lo explicara. Las condiciones climáticas de la última parte del siglo XX parecen asociadas al comienzo de este proceso. Paralelamente al proceso de decaimiento aparecieron numerosas alertas de plagas y patógenos que estaban afectando estos bosques. Los Pirineos han sido usados durante siglos por el hombre, la gestión y la dinámica de estos debe ser tenida en cuenta cuando se pretende i) entender si las condiciones ambientales, la gestión y la dinámica forestal están asociadas al presente decaimiento del abeto, haciendo hincapié en el papel que determinados patógenos como Viscum album, Armillaria, Heterobasidion annosum y Melampsorella caryophyllacearum podrían tener en el proceso, mediante ii) el estudio de su epidemiología y mediante la identificación de cual es la gestión asociada a su incidencia y severidad. Se midieron 29 parcelas escogidas al azar en abetales del Pirineo. En cada una de las parcelas se midieron los síntomas de decaimiento y la presencia de signos y síntomas de ataques de plagas y patógenos en todos los árboles vivos. Se midió también la presencia de Armillaria y H. annosum mediante el cultivo de cilindros de madera extraídos del interior del tronco. Se midió la presencia de patógenos y plagas en árboles muertos y tocones. Los árboles muertos y los tocones se usaron para estimar la composición de especies arbóreas que tenían las parcelas en el pasado. Se midieron 42 variables para describir los árboles, las condiciones ambientales y la gestión que se había practicado en las parcelas. Se recogieron muestras de Armillaria y H. annosum, se cultivaron y se identificaron mediante técnicas moleculares de análisis del ADN. En ciertos casos fue necesario usar modelos mixtos no lineales, debido a la falta de normalidad y a la correlación espacial de los datos. Un 15% y un 10% de los abetos del Pirineo fueron considerados defoliados y cloróticos, respectivamente. Los árboles del estrato dominante fueron aquellos que mostraron un mayor decaimiento. Ninguna característica de masa se vio asociada al decaimiento de los árboles. Se observó que el abeto había aumentado su área basimétrica en los últimos años, y que la de los pinos (Pinus sylvestris y P. uncinata) había disminuido. Las perdidas de área basimétrica del abeto se debieron en la mayoría de los casos a un aumento de área basimétrica del haya (Fagus sylvatica), este hecho se vio también asociado a la presencia de daños sobre la regeneración de abeto producidos por ungulados. La presencia de V. album se encontró asociada al decaimiento y a la mortalidad del abeto. En masas puras se vio que V. album se había dispersado fácilmente entre y dentro de los árboles, pero en masas mixtas esta dispersión se había visto significativamente reducida. H. abietinum fue identificado en los Pirineos y su severidad era mayor en aquellos bosques donde las cortas habían afectado a un mayor porcentaje de abeto respecto a otras especies forestales. La presencia de H. abietinum se vio asociada a la presencia de V. album y la mortalidad de abeto fue mayor donde ambos patógenos ocurrían juntos. La roya M. caryophyllacearum se vio asociada al decaimiento del abeto. Este hongo pareció ser común en los Pirineos, pero su severidad era más alta en aquellas masas con un sotobosque con un mayor porcentaje de plantas tolerantes a la sombra. A. cepistipes fue la especie del género Armillaria más frecuente en los abetales. A. ostoyae se observó más frecuentemente en masas situadas a mayor altitud, y en aquellas en las que el abeto estaba colonizando más rápidamente otros tipos de bosque.El decaimiento del abeto es relativamente bajo en los Pirineos, afecta a los árboles dominantesde la masa, lo que sugiere que podría tratarse de aquellos árboles dejados después de las cortas como árboles de semilla. V. album parece el patógeno con un papel más importante en el decaimiento del abeto. Su severidad podría estar asociada al aumento de temperatura registrado en los Pirineos, y podría haber estado favorecida por la presencia de H. abietinum. Armillaria parece tener un papel notable en la dinámica de los bosques de pino y abeto, y podría estar asociada al aumento de F. sylvatica observado en los abetales. M. caryophyllacearum parece encontrar mejores condiciones para infectar el abeto en masas cerradas que en masas abiertas. El aumento de la sequía registrado en el Pirineo parece que ha incitado el decaimiento en el Pirineo. La gestión en general ha favorecido al abeto, sin embargo podría haber predispuesto a determinados árboles a decaer. El aumento de la diversidad de especies así como una reducción de la competencia deberían examinarse como posibles técnicas para aumentar la salud de estas masas. / Silver fir (Abies alba) decline was reported in the 1990s in the Spanish Pyrenees without a clearexplanation of its occurrence. Climatic conditions of the last part of the 20th century seem associated with the onset of the decline. In parallel with the decline process numerous reports of high incidences of pest and pathogen appeared making necessary to understand the role of the biotic factors in this process. Pyrenean forests have been used for centuries by humans, the role of management and the dynamics of this forests should also be considered when aiming to i) elucidate whether the environmental conditions, the management and the forest dynamics are associated to the fir decline in the Spanish Pyrenees, paying special attention to the role of the critical pathogens Viscum album, Armillaria, Heterobasidion annosum and Melampsorella caryophyllacearum, by means of ii) studying their epidemiology and to identify the management practices that are associated to their incidence and severity. Twenty nine randomly selected stands were measured throughout the Pyrenees. In each stand all living trees were observed for symptoms of decline and for pathogen evidences. Armillaria and H. annosum incidence in living trees was also assessed by culturing inner wood cores. Stumps and dead trees were observed for the presence of pathogen signs, and were used for assessing the past species composition of present fir stands. Up to 42 variables were measured describing the trees characteristics and the environmental conditions and the management practised in the stands. Armillaria and H. annosum samples were collected, cultured and afterwards typed by molecular techniques. Hypotheses were often tested by means of non-linear mixed models due to the lack of normality and the spatial correlation of the data. Defoliation and chlorosis were observed in 15% and 10% of trees respectively. Decline symptoms appeared more often in the dominant layer trees. No stand variables seemed associated with the decline. Silver fir basal area increases were observed coupled with pines (Pinus sylvestris and P. uncinata) basal area losses. Fir losses were mostly due to beech (Fagus sylvatica) colonisations and correlated with ungulate browsing of fir seedlings. V. album correlated with both decline and mortality of fir. V. album was found spreading easily between and within trees in pure fir stands, whilst in mixed stands seemed to find significant difficulties of spread. H. abietinum was identified in the Pyrenees and its severity on stumps was higher where cuttings had focussed more in silver fir than in other tree species. H. abietinum presence related with V. album presence and the silver fir mortality was higherwhere both species appeared together. M. caryophyllacearum was also found associated to fir decline. This rust fungus was frequent in Pyrenees and its severity appeared associated with the presence of shade tolerant plants in the understory of the stands. A. cepistipes was the most frequent Armillaria species in silver fir stands. A. ostoyae was more frequent in higher elevations and related to the increase of silver fir against other tree species. Silver fir decline incidence is relatively low and is more evident on dominant trees. Their characteristics suggest that they were those left after cuttings. V. album was the most likely pathogen implied in the decline of silver fir. Its severity could associate to the warming conditions of Pyrenees, and might be enhanced by the presence of H. abietinum in the stands. Armillaria seems to play a role in the dynamics of silver fir-pine forests. M. caryophyllacearum infection could find better infection chance in thick than in open stands. Aridity conditions of the second half of the 20th century seem to have incited the onset of decline. Management practices seem to have favoured silver fir in the Pyrenees, but also might have predisposed some trees to decline.Altogether, either the promotion of mixed stands or the reduction of the competition could betested to improve the health of these forests.

Las especies de pulgones más abundantes en los campos de maíz de Lleida sonRhopalosiphumpadi (L.), Sitobion avenas (F.) y Metopolophium dirhodum (Walker).La dinámica poblacional de los pulgones viene definida por tres fases, 1)Colonización: Desde la nascencia de las plantas de maíz hasta finales de junio esta fasey caracterizada por la presencia de las tres especies y colonias formadas por alados yninfas jóvenes. 2) Escasez de las poblaciones: Desde julio hasta mediados o finales deagosto. 3) Recuperación de las poblaciones de pulgones, con la presencia casi exclusivade R. padi.A lo largo de todo el ciclo se constató la presencia de fauna auxiliar formada enmayor número por depredadores polífagos. En las primeras semanas se contabilizanbásicamente arañas, carábidos y dermápteros, posteriormente el cultivo es colonizadopor heterópíeros, coccinélidos, neurópteros y otras especies de menor importanciarelativa (sílfidos, cecidómidos e himenópteros parasitoides).La importancia de los enemigos naturales en la dinámica de los pulgones esfundamental tal y como se demuestra en un experimento de exclusión en campo y untest de depredación en laboratorio. Esta importancia viene marcada por una presenciacontinua y abundante, por el carácter polífago de los depredadores, por la grancapacidad depredadora de algunos de ellos y por la capacidad de regular las poblacionesde pulgones.Otro elemento esencial en la evolución de las poblaciones de pulgones es latemperatura, siendo R. padi la especie más adaptada a las altas temperaturas, seguida deSLavenae y de M. dirhodum, lo que explicaría que R, padi es prácticamente la únicaespecie a partir de julio. La temperatura puede ser la responsable en mayor grado deldescenso poblacional en las últimas semanas de la primera fase de colonización de lospulgones y, sobre todo, en la fase de disminución o desaparición de las poblaciones depulgones.Las dos medidas de control estudiadas (tratamientos insecticidas al suelo ymanejo de la fecha de siembra) no parecen ser opciones idóneas para el control de lospulgones del maíz. En el primer caso por su escasa efectividad en el tiempo (máxima de8 días) y por provocar un aumento posterior de las poblaciones de pulgones, debido enparte a un efecto de los tratamientos insecticidas sobre los depredadores contabilizadosen las trampas de gravedad. En el caso del manejo de la fecha de siembra, se ha podidocomprobar que siembras tardías escapan parcialmente a la colonización de los pulgonesdel maíz, lo que podría ser interesante como medida de control de daños directosprovocados por los pulgones, pero probablemente de escasa eficacia en el caso delcontrol de las virosis transmitidas por los pulgones.

El desenvolupament de resistència als fungicides per part de molts patógens enpostcollita de fruites i vegetals, conjuntament amb una preocupació creixent de lasocietat respecte als perills sanitaris i mediambientals que comporten els pesticides i elsseus residus, han generat un gran interès pel desenvolupament de mètodes alternatiusals productes químics de síntesi. El control biològic mitjançant la utilització demicroorganismes antagònics s'ha presentat com una de les alternatives mésprometedores al control químic. L'esforç que la investigació dedica a aquesta àrea haincrementat d'una manera espectacular, i així s'està començant a reflexar en el nombred'agents de biocontrol disponibles en el mercat o en fase de recerca. Entre ells destacala soca CPA-1 del llevat Candida sake, aillada de la superfície de pomes en ellaboratori de Patologia del Centre UdL-IRTA. Aquesta soca ha demostrat tenir unabona capacitat antagònica enfront els principals fongs patògens en postcollita de fruitade llavor. Fins al moment, C. sake ha estat patentada a Espanya i cinc països més. Noobstant, cara a la comercialització d'aquest biofungicida és necessari obtenir unaformulació, que permeti una presentació adequada del producte, amb una alta viabilitati estabilitat en el temps i que faciliti la seva distribució i aplicació mitjançant lestécniques ja existents. Ademes, aquesta formulació ha de tenir una efectivitatcomparable a les cèl·lules fresques.L'objectiu de la present tesi ha estat l'estudi de les bases per a la formulació d'aquestagent de biocontrol. En primer lloc, es va estudiar la possibilitat de deshidratar aquestagent mitjançant la liofilització, avaluant els diferents factors que poden contribuir aincrementar la viabilitat, com el mètode de congelació i l'addició de substànciesprotectores (Capítol 3), i el medi utilitzat en la rehidratació de les cèl·lules liofilitzades(Capítol 4). També es va avaluar l'efectivitat de les cél·lules liofilitzades contraPínicillium expansion en pomes "Golden Delicious" i la seva estabilitat en condicionsd'emmagatzematge (Capítol 4). Ja que la manipulació fisiològica de les condicions decreixement pot afectar significativament la qualitat de les cél·lules i la sevacompetència ecològica, es van dur a terme estudis per avaluar l'efecte que té lamodificació de l'activitat aigua (ow) d'un medi de cultiu a base de melassa de sucre decanya en el potencial hídric de les cèl·lules (Capítol 5), en el creixement de C. sake, enl'acumulació de reserves endígenes i en la resistència a l'estrés hídric (Capítol 6).Finalment, basant-nos en aquests resultats, es va estudiar per primer cop la possibilitatde conservar les cèl·lules de C. sake en solucions líquides isotòniques (Capítol 7).Les cèl·lules de C. sake es van mostrar molt sensibles al procés de liofilització. La lleten pols desnatada, utilitzada al 10%, va presentar-se com un bon protector i va donarun producte sec porós i fàcilment rehidratable. Amb la utilització d'una solució protectora que contenia el 10% de llet en pols i el 10% de lactosa, es va aconseguiraugmentar la viabilitat de les cèl·lules fins el 40%. El medi de rehidratació també es vapresentar com un factor important per a la reactivado del llevat. Així, utilitzant el 10%de llet en pols com a medi de rehidratació enlloc de la solució amortidora de fosfat, laviabilitat va augmentar del 40 al 85%. Les cèl·lules liofòlitzades van reduir elpercentatge de podridures causades per P. expansion en pomes "Golden Delicious". Noobstant, la seva efectivitat va ser menor que la de les cél·lules fresques. La viabilitat delproducte liofòlitzat va disminuir fins el 10% després de 2 mesos de conservació a 4C.El potencial hídric de les cèl·lules crescudes en el medi a base de melassa amb awmodificada i sense modificar, va disminuir en disminuir l'aw del medi de cultiu.Ademes, aquesta modificació de l'aw del medi de cultiu va provocar un canvi en lesreserves endògenes de les cèl·lules de C. sake, sense afectar significativament el seucreixement quan l'aw del medi va ser de 0,98. Les cèl·lules crescudes durant 48 h en elmedi de melassa no modificat i els modificats a aw de 0,98 mitjançant l'addició deglicerol o NaCl, van presentar gran resistència a l'estrés hídric. Els principals solutsacumulats en les cèl·lules de C. sake quan Vaw del medi de cultiu es va reduir van ser elglicerol i l'arabitol.El medi de cultiu, el solut utilitzat per a disminuir el potencial hídric de les solucionslíquides i la temperatura de conservació, van influir en la viabilitat de C. sakeconservada en medi líquid, essent el medi de melassa no modificat i els modificats a aw0,98 amb glicerol o sorbitol els millors. S'ha aconseguit una formulació isotònica quedesprés de 7 mesos de conservació a 4C manté la seva viabilitat, i efectivitat contraP. expansion en pomes "Golden Delicious". Aquesta formulació es va preparar fentcrèixer les cèl·lules en el medi de melassa modificat amb sorbitol (aw 0,98) iconservant-les amb una solució isotònica de trealosa. / El desarrollo de resistencias a los fungicidas por parte de muchos patógenos,conjuntamente con un creciente interés social sobre los riesgos medioambientales ypara la salud que tienen estos pesticidas, han generado un gran interés en el desarrollode métodos alternativos a los productos químicos de síntesis. El control biológico delas enfermedades de postcosecha en fruta de pepita se ha mostrado como una de lasalternativas más prometedoras al control químico. El esfuerzo que la investigacióndedica a esta área ha incrementado de manera espectacular, y eso se está empezando areflejar en el número de agentes de biocontrol disponibles en el mercado o en fase deestudio. Entre ellos destaca la cepa CPA-1 de la levadura Candida sake aislada de lasuperfície de manzanas en el laboratorio de Patología del Centro UdL-IRTA. Esta cepaha demostrado tener gran actividad antagónica contra los principales patógenos de frutade pepita. Hasta el momento se ha patentado en España y cinco países más. Sinembargo, para su aplicación comercial, es necesario formular este agente de biocontrol,con la finalidad de presentar el producto, con una alta viabilidad y estabilidad a lo largodel tiempo y que facilite su distribución y aplicación con las técnicas ya existentes.Además, esta formulación ha de tener una efectividad comparable a la de las célulasfrescas.El objetivo de la presente tesis ha sido el estudio de las bases para la formulación deeste agente de biocontrol. En primer lugar se estudió la posibilidad de deshidratar esteagente mediante liofilización, evaluando los diferentes factores que puedan contribuir aincrementar su viabilidad, como el método de congelación y la adición de sustanciasprotectoras (Capítulo 3), y el medio utilizado para la rehidratación de las célulasliofilizadas (Capítulo 4). Se evaluó la efectividad de las células liofilizadas contraPínicillium expansion en manzanas "Golden Delicious" y su estabilidad encondiciones de almacenamiento (Capítulo 4). Como la manipulación fisiológica de lascondiciones de crecimiento pueden influir significativamente en la calidad de lascélulas y en su competencia ecológica, se llevaron a cabo estudios para evaluar elefecto que tiene la modificación de la actividad de agua (aw) de un medio de cultivo abase de melaza de azúcar de caña en el potencial hídrico de las células (Capítulo 5), enel crecimiento de C. sak�, en la acumulación de reservas endígenas y en la resistenciaal estrés hídrico (Capítulo 6). Finalmente, basándonos en estos resultados, se estudiópor primera vez la posibilidad de conservar las células de C. sak� en solucioneslíquidas isotónicas (Capítulo 7).Las células de C. sak� se mostraron muy sensibles al proceso de liofilización. La lecheen polvo desnatada utilizada al 10% se presentó como un buen protector. Además elproducto obtenido fue poroso y fácilmente rehidratable. Con la utilización de una solución protectora, que contenía el 10% de leche en polvo y el 10% de lactosa, seconsiguió aumentar la viabilidad de las células hasta el 40%. El medio de rehidratacióntambién se presentó como un factor importante para la reactivación de la levadura trassu Hofllización. Así, la viabilidad de las células de C. sake utilizando el 10% de lecheen polvo como medio de rehidratación en vez de tampón fosfato, aumentódel 40 al85%. Las células liofilizadas redujeron el porcentaje de podredumbre causado porP. expansum en manzanas "Golden Delicious". Sin embargo, su efectividad fue menorque la de las células frescas. La viabilidad del producto liofllizado disminuyó hasta el10% después de dos meses de conservación a 4C.El potencial hídrico de las células crecidas en un medio a base de melaza con awmodificada y sin modificar, disminuyó al disminuir la aw del medio de cultivo.Además, esta modificación de la aw del medio de cultivo, provocó un cambio en lasreservas endógenas de las células de C. sake sin afectar significativamente a sucrecimiento cuando la aw del medio de cultivo fue 0,98. Las células que crecierondurante 48 h en el medio de melaza no modificado y en los modificados a aw 0,98 conglicerol o NaCl presentaron una gran resistencia al estrés hídrico. Los principalessolutos acumulados en las células de C. sake cuando la aw del medio de cultivo seredujo fueron el glicerol y el arabitol.El medio de cultivo, el soluto utilizado para disminuir el potencial hídrico en lassoluciones líquidas y la temperatura de conservación, influyeron en la viabilidad deC. sake conservada en medio líquido, siendo los mejores el medio de melaza nomodificado y los modificados a aw 0,98 con glicerol o sorbito!. Se consiguió unaformulación isotónica que, después de 7 meses de conservación a 4C, mantuvo suviabilidad y efectividad contra P. expansum en manzanas "Golden Delicious". Estaformulación se preparó haciendo crecer las células en el medio de melaza modificadocon sorbitol (aw 0,98) y conservándolas con una solución isotónica de trealosa. / Biological control has emerged as the most promising alternative to chemicals incontrolling postharvest diseases of fruit and vegetables. The development of resistanceto many fungicides by major postharvest pathogens and concern for public safety havebeen the main driving force in the search for new and safer methods. The researcheffort expended in this area has increased dramatically and this is beginning to bereflected in the number of biocontrol agents available in the marketplace or in study.Among them stands out the strain CPA-1 of the yeast Candida sake, which wasisolated from the apple surface in the Pathology laboratory of the UdL-IRTA Centre.This strain has demonstrated to have antagonistic activity against the major postharvestpathogens of pome fruits. C. sake has been patented in Spain and in five othercountries. However, for commercial application, this antagonist should be formulatedin order to present the product in a usable form, with high viability, stability, safety,ease of distribution and application, and with retained biocontrol activity similar to thatof fresh cells.The objectives of the present work were to carry out fundamental and applied studiesto enable effective formulations of C. sake. Thus, dehydration of this biocontrol agentusing freeze-drying was studied. The effect of freezing method and protectants wasevaluated (Chapter 3), and the effect of rehydration media on viability examined(Chapter 4). Subsequently, the efficacy of such treatments against P�nicilliumexpansion on Golden Delicious apples, and stability of the freeze-dried C. sake cellswas also investigated (Chapter 4). Because physiological manipulation of growthconditions can significantly affect quality of cells and ecological competence studieswere carried out on the effect of different water activity (aw) treatments in molassesbasedmedia on changes in internal water potentials (Chapter 5), and on growthparameters, accumulation of endogenous reserves and water stress tolerance identified(Chapter 6). Finally, based on these studies the potential for preserving C. sake cells inisotonic solutions to conserve viability and shelf-life were evaluated for the first time(Chapter 7).C. sake cells were very sensitive to the freeze-drying process. Powdered skimmed milk(SM) used at 10% concentration was shown to give good protection to cells of C. sakeagainst freeze-drying, providing the freeze-dried product with a porous structure thatmade rehydration easier. The combination of 10% SM + 10% lactose was the bestcombination tested, with 40% of cells remaining viable after freeze-drying. Therehydration medium was shown to be a critical factor influencing the recovery ofC. sake cells. Using 10% SM as a rehydration medium instead of potassium phosphate,cell viability increased from 40 to 85%. Freeze-dried C. sake cells reduced theincidence of decay caused by P. expansum in Golden Delicious apples. However, itsefficacy was lower than that obtained with fresh cells. Stability of freeze-dried cellsdecreased during their preservation, and their viability was reduced to 10% after 2months storage at 4�C.Water potential of C. sake cells grown in molasses-based media with modified awdecreased with decreasing aw of medium. Moreover, modification of the a� of theculture medium changed the concentration of endogenous sugars and polyols withoutaffecting significantly its growth when the aw of the medium was 0.98. Cells grown for48 h in the unmodified molasses-based medium, and in those modified to 0.98 aw withthe addition of NaCl or glycerol showed high water stress resistance. The main solutesaccumulated in C. sake cells in response to lowered aw of molasses media wereglycerol and arabitol.Culture and preservation medium and temperature greatly influenced the viability ofC. sake cells in isotonic liquid solutions. Unmodified molasses medium and thosemodified to 0.98 aw with the addition of glycerol or sorbitol were shown to be the bestculture medium for cells of C. sake. This study enabled an isotonic liquid formulationof C. sake cells with retained viability and efficacy against P. expansum on GoldenDelicious apples after 7 months of storage at 4�C to be achieved. This formulation wasprepared by growing the cells in sorbitol-modified molasses medium (aw 0.98) andpreserving them in an isotonic trehalose solution.

La presente tesis doctoral aporta el primer estudio que analizó las respuestas fisiológicas durante la prueba de marcha de seis minutos en pacientes con EPOC. Los resultados indican que se trata de un protocolo de ejercicio submáximo de elevada intensidad que presenta, de forma consistente, una meseta en el consumo de oxígeno, ventilación y frecuencia cardíaca durante los últimos 3 minutos de la prueba. Este comportamiento generó la hipótesis de que la intensidad de ejercicio durante la 6MWT podría corresponder a la carga crítica del individuo. Entendemos como carga crítica, la máxima intensidad de ejercicio submáximo sostenible. Esta está próxima al consumo máximo de oxígeno aunque resulta difícil de estimar en la práctica y a menudo presenta una amplia variabilidad interindividual. En realidad, la carga crítica se corresponde con la situación en que el sistema de transporte/utilización de oxígeno se ajusta a la demanda bioenergética del organismo y, por tanto, presenta una cierta sostenibilidad en el tiempo. El segundo estudio de la tesis se diseño para evaluar dicha hipótesis y los resultados obtenidos parecen confirmarla. En consecuencia, aporta elementos de carácter fisiológico que dan soporte a los datos clínico-epidemiológicos indicativos de un alto valor pronóstico de la 6MWT. Estos resultados son altamente estimulantes en lo que respecta a la utilización de la 6MWT como prueba estándar de evaluación de la tolerancia al ejercicio de una forma extensiva en la clínica. En este sentido, se debería entender como una prueba complementaria a la evaluación de la tolerancia al ejercicio efectuada en los 68 Laboratorios de Función Pulmonar. La relativa buena reproducibilidad y practicabilidad de la 6MWT abonan este planteamiento. Un problema práctico en los programas de rehabilitación pulmonar es la evaluación de los casos llamados no respondedores. El tercer estudio de la tesis aborda este problema desde una perspectiva fisiológica utilizando pruebas cuya aplicabilidad en la clínica resultado dudosa. Sin embargo, nos aportan datos contundentes confirmando que aún y existir pacientes no respondedores a nivel de pulmonar, todos los enfermos estudiados presentaron una buena respuesta muscular al programa de entrenamiento físico. Esto plantea el reto de identificar pruebas utilizables en el ámbito clínico para evaluar de forma no invasiva y fácil los cambios en la respiración muscular generados por el entrenamiento. Este estudio, se acompaña de un cuarto manuscrito en el que se analizan las relaciones entre la masa y la resistencia musculares. En dicho trabajo también se analiza la contribución relativa de los componentes centrales (pulmonares) y periféricos en la tolerancia al ejercicio. En el último estudio presentado en esta tesis se evalúa el papel de dos cuestionarios para el análisis de la actividad física. En él, se confirma que los pacientes con EPOC presentaban un importante grado de sedentarismo. Durante estos últimos años, la importancia del factor actividad física diaria en el curso de la enfermedad y la utilización de recursos sanitarios ha sido bien demostrada en la literatura. Nuestro estudio valida los cuestionarios utilizados pero al mismo tiempo pone en evidencia algunas de las limitaciones de este tipo de herramientas para cuantificar la actividad física. Esto plantea su papel complementario con tecnologías actuales que nos permiten una medición directa de la actividad física.

Tesi realitzada al Centre de Recerca en Salut Internacional de Barcelona (CRESIB) - Hospital Clínic / La diarrea és la segona causa de mortalitat infantil a nivell mundial, essent també una de les afectacions més freqüent en viatgers després d’un viatge a zones tropicals. Els patògens implicats de manera més freqüent són d'origen bacterià, destacant per la seva rellevància soques diarreogèniques d'Escherichia coli i Shigella spp. Aquesta patologia usualment sol ser de caràcter autolimitant, però a vegades requereix de l'ús d'antimicrobians, ja sigui per la seva durada o severitat. Lamentablement al llarg dels últims anys els nivells de resistència a antimicrobians no han fet més que incrementar, dificultant els tractaments i fent precís la introducció de noves alternatives de tractament. En la present tesi s'analitzen tant els nivells com els mecanismes de resistència a antimicrobians en soques bacterianes causants de diarrea infantil en zones periurbanes de Lima (Perú), així com de mostres causants de diarrea en viatgers. Els resultats mostren elevats nivells de resistència als antimicrobians que s’usen actualment en el tractament d’aquesta patologia, especialment a ampicil·lina, cotrimoxazol i les quinolones. En aquest últim cas, el resultats obtinguts en analitzar les mostres d'origen infantil van mostrar uns nivells inusualment elevats de resistència, donat el fet que les quinolones no s'usen en aquest segment d'edat. Aquest fet indica que les soques han estat en contacte amb formes residuals, el que fa suposar que l'adquisició de la resistència s’ha produït de manera exògena, potser com a conseqüència d’un ús elevat de quinolones en altres ambients. Així en aquestes soques es constatà una elevada proporció de mutacions als gens gyrA i parC, així com la presència d'elements de resistència transferibles: qnrB o aac (6 ') Ib-cr. Es determina l’us potencial de la rifaximina com una alternativa als tractaments actuals, tant les dades obtingudes in vitro, com la seva baixa capacitat de desenvolupar mutants in vitro resistents als antimicrobians van mostrar la seva potencial utilitat en el tractament de la diarrea d’origen bacterià. A més a més es va observar que les soques que esdevenien resistents, aquesta selecció perdurava en el temps, essent de caràcter estable. No obstant els resultats obtinguts en analitzar les soques comensals i diarreogèniques d'E coli aïllades de nens menors de 2 anys de la zona de Chorrillos (Lima) es va veure que presentaven elevades proporcions de resistència a antimicrobians, associats sobretot a sobreexpressió de bombes d’expulsió inhibibles per Phenyl-Argynil-beta- Naphtylamyda (un inhibidor de bombes), fet que suggereix la presència de factors ambientals que afavoreixin la desregulació d'aquestes bombes fent que els bacteris esdevinguin resistents. / Diarrhea is the second leading cause of child mortality worldwide, being also the most common of the effects on travelers after trip to the tropics. The most frequent pathogen isolated are bacteria, and among these diarrheogenic Escherichia coli and Shigella spp are relevant. Usually diarrhoea is a self-limiting disease, but sometimes depending of the duration or severity, the use of antimicrobials is required. Unfortunately, over in the last years, the levels of antimicrobial resistance have been increased and the introduction of alternatives of treatment are necessary. In this thesis both the levels and mechanisms of antimicrobial resistance in bacterial strains causing childhood diarrhea in peri-urban areas of Lima (Peru) are analyzed, as well as samples causing diarrhea in travelers. The results show high levels of antimicrobial resistance in use, especially ampicillin, co-trimoxazole and quinolones. In the latter case, the obtained results showed unusual high levels of resistance because quinolones are not used in this age, which suggests the acquisition of resistant strains was exogenously, perhaps due to the high use of quinolones is done in other environments. In these strains the high frequency of mutations in genes gyrA and parC as well as the presence of transferable mechanisms as qnrB or aac (6 ') Ib-cr was verified. The potential of rifaximin as an alternative to current treatments are evaluated. The data from in vitro development of antimicrobial resistant mutants showed its potential usefulness, although the selected strains the resistance was stable. However the results obtained by analyzing diarrheogenic and commensal strains of E. coli isolated from children under 2 years in the area of Chorrillos (Lima) showed elevated levels of antimicrobial resistance associated with efflux pumps overexpression (inhibitable by Argynil-Phenyl-beta- Naphtylamyda). This fact suggests the presence of environmental factors such as toxic, that favoring deregulation of these efflux pumps.

Los Papilomavirus Humanos (VPHs) son virus que causan enfermedades proliferativas en el epitelio de piel y mucosas. Su relación con el cáncer de cuello de útero se conoce desde la década de los 70 y actualmente está ampliamente aceptado que los papilomavirus humanos son el único agente etiológico causante del cáncer cervical. Constituyen un grupo de virus muy heterogéneo, dentro del cual destacan por cuestiones de tipo clínico algunos genotipos que presentan un alto potencial oncogénico y que son los causantes de la mayoría de los carcinomas invasores de cérvix. Se han desarrollado vacunas contra algunos de estos genotipos, y actualmente se están incluyendo en los programas nacionales de vacunación de un gran número de países. La tesis describe un trabajo de investigación que ha aportado tres aspectos novedosos que se presentan en los tres capítulos en los que está estructurada. En el primer capítulo se describe un nuevo sistema de detección e identificación de papilomavirus humanos de amplio espectro. El método está basado en la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y en RFLPs (análisis de fragmentos de restricción). Permite la identificación de los genotipos víricos presentes en las muestras clínicas con lesiones precursoras de cáncer de cuello de útero. De esta forma permite valorar el potencial evolutivo de las lesiones pre-cancerosas, ya que cada genotipo vírico presenta un nivel de riesgo específico. Asimismo, el método incorpora un mecanismo molecular desarrollado especialmente para el presente trabajo que permite detectar las eventuales inhibiciones de las reacciones de amplificación. En el segundo capítulo se describe la utilización del método presentado, para el estudio de 9.734 muestras clínicas procedentes de varios hospitales y centros sanitarios españoles. Se esta forma se consiguió detectar e identificar el genotipo vírico en un gran número de muestras y obtener información estadísticamente significativa respecto a la distribución de los diferentes genotipos en la población. También se estudió la relación entre la gravedad de la lesión y la edad con el genotipo presente en la muestra. En el tercer capítulo se describe el trabajo de caracterización de dos nuevas variantes detectadas con el método presentado en el primer capítulo. Este sistema de identificación permite la detección de un gran número de genotipos conocidos de papilomavirus, así como de variantes no descritas previamente. Esto permitió la detección de dos nuevos genotipos, que fueron secuenciados completamente y clasificados taxonómicamente como dos nuevos subtipos de tipos actualmente conocidos. En la presente tesis se ha desarrollado un sistema de detección e identificación de papilomavirus que ha sido comercializado como un producto para diagnóstico in vitro. Por otro lado, este sistema también ha sido comercializado como un servicio de laboratorio, consistente en la realización de una prueba y la emisión de un informe clínico. En total se han podido analizar aproximadamente unas 26.000 muestras clínicas utilizando este sistema El aspecto más destacado de este trabajo de tesis es el desarrollo de un sistema de detección e identificación de papilomavirus y su demostrada aplicabilidad clínica, así como su utilidad como método para la realización de estudios estadísticos sobre la distribución de genotipos víricos. / The Human Papillomaviruses (HPVs) cause proliferative diseases in the epithelium of skin and mucous membranes. The relationship between them and cervical cancer has been known since the early ‘70s and now is widely accepted that human papillomaviruses are the only etiologic agent of cervical cancer. They are a very heterogeneous group of viruses. Some of them are very important so have a high oncogenic potential and they are responsible for most invasive cervical carcinomas. It has been developed vaccines against some of these genotypes, and currently are used in national immunization programs of many countries. The thesis describes a research project which has provided three new issues that arise in the three chapters in which it is structured. In the first chapter it is described a new system of detection and identification of human papillomavirus of broad spectrum. The system is based on PCR (polymerase chain reaction) and RFLPs (restriction fragment length polymorphism). It allows the identification of the viral genotypes present in clinical samples with precursor lesions of cervical cancer. Thus, it allows to assess the potential of the evolution of pre-cancerous lesions, because each viral genotype has a specific level of risk. Further, the method includes a molecular mechanism specially developed for this project to detect the eventual inhibition of the amplification reactions. In the second chapter it is described the utilization of the presented method to the analysis of 9.734 clinical samples from several hospitals and Spanish health centers. Thus, it was possible to detect and identify the viral genotype of a large number of samples and to obtain statistically significant information regarding the distribution of the different genotypes in the population. It was also studied the relation between the severity of the lesion and the age with the genotype present in the sample. In the third chapter it is described the project of the characterization of two new variants detected with the method presented in the first chapter. This identification method allows the detection of many papillomavirus of known genotype as well as variants not described previuosly. This allowed the detection of two new genotypes, which were completely sequenced and taxonomically classified as two new subtypes of the currently known types. In the present thesis it has been developed an identification and detection system of papillomavirus which has been commercialized as an in vitro diagnostic product. On the other hand, this system has also been commercialized as a laboratory service, consisting in the realization of a test and the emission of a clinical report. In total, it has been able to analyze about 26.000 clinical samples using this system. The highlight of this thesis is the development of an identification and detection system of papillomavirus and its proved clinical applicability, as well as its utility as a method for the realization of statistics studies about the distribution of viral genotypes.

El càncer colorectal és la segona causa de mort per càncer al món i el tumor més freqüent a l’Estat Espanyol englobant ambdós sexes. El tractament de la malaltia avançada es basa en la combinació de fàrmacs citotòxics, citostàtics i noves molècules anti-diana, assolint-se medianes de supervivència al voltant dels 2 anys. Encara que les darreres tendències de tractament del càncer estan enfocades principalment cap al desenvolupament de molècules anti-diana, l’administració d’oxaliplatí continua essent clau i essencial en el tractament en el CCR avançat. Malgrat els grans avenços que s’han donat en el tractament del càncer de còlon metastàtic, tots ells estan al voltant de la introducció de nous medicaments i seguim indefensos pel que fa a l’aparició de resistències, que són la causa fonamental del fracàs del tractament. Per tant, l’objectiu principal d’aquesta tesi doctoral és conèixer millor els mecanismes de resistència adquirida a oxaliplatí mitjançant l’estudi de perfils d’expressió proteica en models cel·lulars in vitro per després traslladar els resultats a la selecció del tractament de primera línia en pacients amb càncer colorectal avançat. Així, a partir d’una aproximació de proteòmica comparativa, s’ha identificat la proteïna piruvat quinasa M2 (PKM2) en relació amb el procés d’adquisició de resistència a oxaliplatí en el nostre model cel·lular. PKM2 catalitza l’últim pas de la glicòlisi i regula de manera clau la glicòlisi aeròbica o efecte Warburg en les cèl·lules canceroses. Recentment, se li han atribuït altres funcions no-glicolítiques; així, pot translocar al nucli i activar la transcripció gènica interaccionant i modificant proteïnes nuclears participant en funcions tant dispars com la supervivència o la mort cel·lular. Els nostres resultats demostren que PKM2 es troba infraexpressada en les línies resistents, també a nivell d’ARNm i que després del tractament amb oxaliplatí, els nivells d’expressió disminueixen. Mitjançant tècniques d’ARN d’interferència hem demostrat que la inhibició de l’expressió de PKM2 augmenta la viabilitat de les cèl·lules sensibles, amb p53 mutada, quan es tracten amb el fàrmac en un 50% mentre que l’efecte és oposat en un model amb p53 salvatge. Tanmateix no hem pogut demostrar que aquest augment en la viabilitat sigui conseqüència d’una disminució en la mort cel·lular. D’altra banda, hem pogut observar un canvi en la compartimentació de la proteïna que només es dona en les cèl·lules sensibles a oxaliplatí, donat que PKM2 és capaç de translocar al nucli de les cèl·lules sensibles al llarg de 72 hores de tractament continu però no en les cèl·lules derivades resistents. En tercer lloc, a partir d’una aproximació de silenciament gènic i proteòmica comparativa en 2 dimensions, s’han pogut establir els perfils proteics associats a la presència/absència de PKM2 i determinar possibles proteïnes vinculades a l’expressió d’aquesta com son, FKBP4 i HSC70. Finalment, pel que fa a l’estudi en pacients, hem demostrat que el grup de pacients amb els nivells més baixos de PKM2 presenten pitjors ràtios de resposta a la quimioteràpia basada en oxaliplatí i que aquest fet també pot tenir relació amb l’estat mutacional de p53 en aquests pacients, correlacionant aquests resultats amb els obtinguts a l’estudi in vitro. Així doncs, en aquesta tesi doctoral es descriu un nou mecanisme d’adquisició de resistència a oxaliplatí i se li atribueix un nou paper a la proteïna PKM2. Tanmateix, s’obren noves vies d’investigació, tant a nivell de funcionalitat de dita proteïna com també de noves vies d’intervenir en la resistència adquirida a aquest fàrmac platinat. / Colorectal cancer is the second most common cause of cancer death in the world and the most frequent tumor in Spain including both genders. Survival of the advanced disease has increased from 12 months with monotherapy to roughly 2 years with the addition of cytotoxic and cytostatic drugs combined with targeted drugs. Despite the state of the art in cancer treatment is mainly focused on the development of target molecules, oxaliplatin administration remains essential in the treatment of advanced CRC. Regardless of the great improvements achieved in the treatment of metastatic CRC, all of them are focused in the introduction of new drugs and we are still defenseless in front of resistance appearance, which is the main cause of treatment failure. According to this, the main objective of this doctoral thesis is to better know and understand oxaliplatin acquired resistance mechanisms by studying protein expression profiles in in vitro models in order to translate these results in a better selection of first line treatment in advanced CRC patients. Thus, from a comparative proteomic study, we have identified the protein M2 pyruvate kinase (PKM2) related to the oxaliplatin resistance acquisition process in our cellular model. PKM2 catalyzes the last step of glycolysis and is a key enzyme in the regulation of aerobic glycolysis (known as a Warburg effect) in cancer cells. Recently, other non-glycolytic functions have been assigned to PKM2. It has been shown this protein can translocate to the nucleus and, consequently, it activates transcription of several genes. PKM2 can also interact and modify nuclear proteins taking part in different and opposed cellular processes such as proliferation or death. Our results have demonstrated that PKM2 expression is down-regulated in oxaliplatin resistant cells as compared to sensitive cells, also at mRNA level. Moreover, we have shown that oxaliplatin treatment decreases PKM2 levels. By using RNA interference techniques, we have shown that PKM2 gene silencing increases cell proliferation of sensitive cells harboring p53 mutation in about 50% when those cells are treated with the drug, while PKM2 silencing in sensitive and wild type p53 cells has the opposite result. The effect in increased cell proliferation was not related to a cell death decrease, though. On the other hand, we could observe a change in the subcellular localization of PKM2 only in treated sensitive cells, done by the fact that this protein is able to translocate to the nucleus of these cells in response to the drug and this is not observed in oxaliplatin resistant cells. Moreover, by using gene silencing and a 2-D DIGE approach, we obtained protein profiles associated to PKM2 presence/absence and we have determined possible proteins whose expression depends on that of PKM2 such as FKBP4 and HSC70. Finally, we have demonstrated that patients with the lowest PKM2 mRNA levels showed the worst response ratios to oxaliplatin-based first line treatment. Tumors from these patients presented more frequently p53 mutations linking these results with our in vitro study. To conclude, in this doctoral thesis we describe a new mechanism of oxaliplatin resistance acquisition in which PKM2 is an important player. Further investigations are guaranteed to elucidate molecular mechanisms underlying PKM2 functionality as well as to discover new pathways to interfere in acquired resistance to this platinum agent.

El manejo de la leishmaniosis visceral sigue siendo un desafío sobre todo en los casos de coinfección con el VIH. El principal reto aparece una vez el paciente ha sido diagnosticado y tratado por primera vez de leishmaniosis visceral. La evolución natural de la enfermedad en estos pacientes, va a estar determinada por las recidivas clínicas en mayor o menor medida. La escasez de trabajos y por tanto de evidencia científica deja desamparados a los clínicos que han de hacer frente a esta realidad. El TARGA únicamente va a espaciar los periodos entre recidiva y recidiva, ya que no será hasta que el paciente adquiera una inmunidad protectora suficiente y mantenida (que se ha establecido en 200 linfocitos CD4/mL mantenidos durante un mínimo de 6 meses) que puede estar en riesgo de desarrollar un nuevo episodio. Por ese motivo parece razonable que hasta que no se alcance ese umbral los pacientes van a necesitar en primer lugar, la instauración de una quimioprofilaxis secundaria seguido de un estrecho seguimiento para así poder detectar los futuros nuevos episodios. En nuestro medio, los medicamentos que tenemos disponibles con esta indicación son la Amfotericina B Liposomal y las sales de antimonio, en concreto el Antimoniato de meglumina. Estos medicamentos son diferentes tanto en mecanismo de acción, perfil de seguridad y sobre todo precio. No existen datos sobre la efectividad de Amfotericina B Liposomal como quimioprofilaxis secundaria para prevenir nuevos episodios de LV. Los argumentos para la elección de cualquiera de ellos se basan en experiencias marginales y comentarios de expertos. Por otra parte, el seguimiento de los pacientes y por tanto el diagnóstico de las nuevas recidivas se basa actualmente en la repetición de los procedimientos diagnósticos utilizados en el diagnóstico inicial (aspirado de médula ósea, cultivo de tejidos o diagnóstico histológico de biopsias). Estos métodos son cruentos, molestos para el paciente y no exentos de complicaciones. Desafortunadamente, técnicas menos invasivas como la serología no han demostrado su utilidad en este contexto. Incorporar técnicas de biología molecular como lo es la PCR ha demostrado ser muy útil en el diagnóstico inicial de estos pacientes. El problema surge al interpretar los resultados en pacientes que habitan en zonas endémicas del parásito, dónde la población general está naturalmente expuesta a través de la picadura del phlebotomo. Conocer la cinética del parásito y por tanto una cuantificación del mismo una vez tratado el paciente, sería de gran utilidad para hacer un enfoque adecuado de su seguimiento. / The management of visceral leishmaniasis remains a challenge especially in cases of co-infection with HIV. The main challenge appears once the patient has been diagnosed of visceral leishmaniasis and treated for the first time. The natural history of the disease in these patients will be determined by clinical relapses greater or lesser extent. The scarcity of clinical trials and therefore an adequate level of evidence left clinicians helpless, when they have to face this reality. The TARGA only will space the periods between relapse and recurrence, and it will not be until the patient acquires a sustained sufficient protective immunity (which is set to 200 lymphocytes CD4 / mL maintained for at least 6 months) which may be at risk of developing a new episode. Therefore, it seems reasonable that until that threshold is reached patients will need first, the establishment of a secondary chemoprophylaxis followed by a closed monitor in order to identify future new episodes. In our environment, we have available drugs for this indication are Liposomal Amphotericin B and antimony salts (meglumine antimoniate). These drugs are different in mechanism of action, safety profile and especially price. There are no data on the effectiveness of Liposomal Amphotericin B as secondary chemoprophylaxis to prevent new episodes of LV. The arguments for choosing any of them are based on marginal experiences and opinions of experts. Moreover, monitoring of patients and therefore the diagnosis of new relapses is currently based on the repetition of diagnostic procedures used in the initial diagnosis (bone marrow aspirate, tissue culture or histologic diagnosis of biopsies). These methods are invasive, uncomfortable for the patient and not without complications. Unfortunately, less invasive techniques such as serology have not proven useful in this context. Incorporating molecular biology techniques such as the PCR has been proved to be very useful in the initial diagnosis of these patients. The problem arises when interpreting results in patients living in endemic areas of the parasite, where the general population is naturally exposed through the bite of phlebotomus. To understand the kinetics of the parasite and therefore a quantification of that once treated the patient, it would be useful to make a suitable approach monitoring.

L'hepatitis E es presenta de forma esporàdica als països industrialitzats i es creu que el porc és el seu principal reservori. La possibilitat que l'origen de l'infecció o el seu manteniment en una regió sigui la població animal cal estudiar-la més a fons a causa que no es coneix de forma clara el risc de transmissió del porc a les persones. D'altra banda, encara no es coneixen exactament els mecanismes d'infecció del virus de l'hepatitis E (VHE) tan a les persones com en els animals. Així doncs, els objectius principals d'aquesta tesi s'han centrat a conèixer els aspectes epidemiològics d'aquesta infecció a la població porcina espanyola i a desenvolupar un model animal que permeti estudiar millor la infecció natural del virus en el porc. Per tal d'assolir els objectius anteriors, es varen dissenyar quatre estudis. En primer lloc, es va dur a terme un estudi serològic retrospectiu amb l'objectiu de conèixer la prevalença de la infecció del VHE en el porc i poder determinar el moment d'aparició de la infecció a Espanya (Estudi I). S'analitzaren un total de 2871 mostres de sèrum corresponents a 208 granges porcines espanyoles des de l'any 1985 fins el 1996. Els resultats demostraren que l'infecció pel VHE ha estat present a la població porcina espanyola almenys des de l'any 1985. El fet que no hi haguessin diferències significatives entre les prevalences al llarg dels anys analitzats, indicava probablement que la circulació del VHE ha estat endèmica a les explotacions porcines des de fa dècades. En segon lloc, per tal de conèixer millor la dinàmica d'infecció i mode de manteniment del VHE a les granges porcines es realitzà un estudi longitudinal prospectiu en sis granges de cicle tancat, amb sistemes de producció i densitats d'animals semblants (Estudi II). Els animals se seguiren fins a escorxador per determinar-ne el percentatge d'infectats i poder valorar el possible risc del VHE per a les persones. Els resultats mostraren que les granges podien tenir dinàmiques d'infecció diferents i que en alguns casos els animals podien arribar a l'edat de sacrifici sent seronegatius però havent-se infectat al final de l'engreix. A l'escorxador, es va detectar el virus en un 12% dels animals, dels quals un 6% eren fetges i l'altre 6% eren bilis. La presència del VHE en aquests òrgans podria representar un risc per a les persones especialment durant la seva manipulació i per la possible contaminació creuada amb altres aliments frescos. En tercer lloc, es comparà l'utilització del suc de diafragma i el sèrum per la detecció d'anticossos, amb l'objectiu d'investigar mètodes de diagnòstic immunològic alternatius pel VHE a l'escorxador (Estudi III). L'anàlisi de les mostres per ELISA anti-IgG demostrà que el sèrum i el suc muscular tenien resultats comparables i que per tant, ambdues podien ser utilitzades pel control serològic del VHE a les granges porcines. La simplicitat de la recollida de la mostra de diafragma a l'escorxador, podria facilitar en un futur el monitoratge de l'estatus de les granges en relació a la infecció pel VHE. Finalment, es dugué a terme una infecció experimental amb l'objectiu d'estudiar la via de transmissió natural en el porc per inoculació oral d'un nombre significatiu d'animals i alhora investigar la possibilitat d'infecció per contacte directe amb animals sentinella (Estudi IV). Els resultats demostraren la dificultat de reproduir la infecció oral del VHE ja que només 4 de 16 animals inoculats desenvoluparen infecció. Per altra banda, els animals que es varen infectar van ser capaços de transmetre amb èxit la infecció per contacte directe a porcs sentinella. / Hepatitis E is a human infection which is thought to have the pig as the main animal reservoir. The possibility that swine might be the responsible of hepatitis E virus (HEV) circulation in these regions and what is more, the potential zoonotic transmission from pigs to humans, has to be further studied. On the other hand, the lack of a practical animal model has hindered a better knowledge of human and animal HEV infection mechanisms. Thus, the main objectives of the present thesis were to go in depth in the epidemiological situation of HEV in the Spanish pig livestock and to develop an animal model that would allow a better study of the natural HEV infection in swine. To achieve these goals four studies were designed. Firstly, a retrospective serological study was developed to determine the HEV infection prevalence in swine in order to elucidate when HEV appeared in Spain (Study I). A total of 2871 serum samples corresponding to 208 farms of Spain gathered between 1985 and 1997 were tested. The results showed that HEV was widespread in Spanish swine farms at least since 1985. The infection within the farms seems stable throughout years, thus HEV infection in swine should be considered enzootic in Spain. In a second part, a longitudinal study was carried out in six Spanish farrow-to-finish swine herds, with similar production systems and size, in order to determine the infection dynamics and the persistence way of HEV in swine farms (Study II). Animals were followed until the slaughterhouse to know the proportion of HEV infected animals and evaluate the possibility of human transmission. Slight differences in antibody dynamics of HEV infection were found in the 6 studied farms and in some cases, animals infected at the latest production stage could arrive seronegative at the abattoir. The virus was detected in a total of 12% of slaughter pigs where 6% corresponded to positive livers and the other 6% to positive biles. Manipulation and cross-contamination of these infected organs with other fresh food may represent a risk for human population. A third study (Study III) was carried out to investigate the use of the diaphragm muscle fluid sample as an alternative to serum for detecting anti-HEV antibodies by ELISA in slaughter pigs. The study showed that both tests had global agreement of results; therefore, muscle fluid can be used as an alternative to serum for serologic detection of HEV antibodies in slaughter pigs. The simplicity of sample collection of this method offers new possibilities which will facilitate monitoring of pig herds regarding HEV infection. Finally, an experimental infection was performed to explore the most likely natural route of infection by oral inoculation of a larger group of pigs and to investigate the possibility of infection by direct contact to sentinel animals (Study IV). The results from this study demonstrated the difficulty to reproduce the oral HEV infection since only 4 out of 16 inoculated animals got infection. Although few animals had evidence of infection, those animals were able to successfully transmit the virus to direct contact exposure sentinels.

Los metales son ubicuos y su acumulación cada vez mayor en el ambiente conduce a serias preocupaciones en términos de seguridad ambiental, ocupacional y del consumidor. Entre otros efectos potenciales sobre la salud, la carcinogenicidad y la neurotoxicidad inducidas por los metales representan un riesgo importante para la sociedad humana y, por lo tanto, merecen ser determinadas completamente. En este contexto, se necesita llevar a cabo un amplio proyecto de investigación in vitro en estas áreas en compuestos metálicos seleccionados. El trabajo se refiere a investigaciones en metalómica destinadas a estudiar las rutas metabólicas de compuestos caracterizados de As, Cd, Cr, Pt, Mn y V mediante modelos experimentales desarrollados en ECVAM, como las líneas celulares de fibroblasto de ratón (Balb/3T3), las variedades de células del feocromocitoma de la rata (PC12) y reagregados de cerebro de rata y sus tipos celulares individuales. Los estudios se han realizado usando técnicas nucleares y radioanalíticas (análisis por activación de neutrones (NAA), radiotrazadores con alta radiactividad específica) y técnicas espectrométricas avanzadas (HPLC-ICPMS y GFAAS). Incluyen la especiación en relación al comportamiento de los compuestos metálicos en los medios de cultivo celular, su absorción, distribución intracelular del metal, y unión con los componentes celulares.Etapas del proyecto de investigación:(i) preparación de los radiotrazadores para etiquetar las diferentes concentraciones de los compuestos metálicos(ii) exposición de modelos in vitro estandardizados a los compuestos estables y/o metales marcados radioactivamente para diferentes periodos de tiempo y rango de concentración(iii) estudios mecanísticos que permitan establecer la relación dosis-efecto en cuanto a la absorción del metal estudiado por todos los compartimentos celulares, como se obtiene por centrifugación diferencial y por técnicas de filtración de gel. Determinación del estado de oxidación del metaloma en los compartimentos de la célula (iv) tratamiento estadístico de los datos y desarrollo de modelos metabólicos. / Metals are ubiquitous and increasing accumulation in the environment raises serious concerns in terms of environmental, occupational and consumer safety. Among other potential health effects, metal-induced carcinogenicity and neurotoxicity represent a major risk to the human society and therefore deserves to be fully assessed. In this context, a comprehensive in vitro research project in these areas needs to be conducted on selected metal compounds.The work concern in vitro metallomics investigations concerning metabolic pathways of chemically-characterized As, Cd, Cr, Pt, Mn and V compounds by experimental models developed at ECVAM, such as mouse fibroblast (Balb/3T3), rat pheochromocytoma (PC12) cell lines and rat brain re-aggregates and their individual cell types. The studies will be carried out by using nuclear, radioanalytical (neutron activation analysis (NAA) and use of radiotracers with high specific radioactivity) and advanced spectrochemical (HPLC-ICPMS and GFAAS) techniques. They will include metal speciation concerning behaviour of test metal compounds in cell culture media, uptake, intracellular distribution, binding with cell components.Steps of the research project:(i) preparation of radiotracers for labelling of different concentrations of metal compounds(ii) exposure of standardised in vitro models to stable and/or radiolabelled metal compounds for different time periods and range of concentration(iii) mechanistic studies involving the establishment of dose-effect relationship in relation to uptake of metal tested by whole cell compartments as obtained by differential centrifugation as well as gel filtration techniques. Determination of the oxidation state of metallome in cell compartments(iv) statistical treatment of the data and development of metabolic models.