Les glycosaminoglycanes (GAG) forment une famille de polysaccharides linéaires retrouvés dans tous les tissus, au niveau des matrices extracellulaires et des surfaces cellulaires. Les héparanes sulfates (HS) sont des membres importants de cette famille et sont liés à une protéine dite cœur pour former ensemble le protéoglycane (PG). Selon le tissu et la nature de la protéine cœur, les HS, composés d'unités disaccharidiques de N-acétylglucosamine (GlcNAc) et d'acide glucuronique (GlcA) [-4GlcAβ1-4GlcNAcα1-] vont subir de nombreuses modifications. En effet, les HS sont modifiés par différentes sulfatations au niveau des deux oses et une épimérisation de l'acide glucuronique en acide iduronique (IdoA). Les différentes structures saccharidiques élaborées vont pouvoir être alors interagir avec une très grande quantité de protéines et jouer des rôles divers dans l'inflammation, la prolifération cellulaire, l'angiogenèse, la réponse immunitaire, l'attachement viral…L'étude de la structure des HS, du fait de la nature flexible et hétérogène de ces molécules, a été principalement focalisée sur des analyses fragmentaires du polysaccharide au niveau des séquences d'interaction avec les protéines. Lors de ces dépolymérisations, des informations sur le polysaccharide, notamment l'épimérisation, sont perdues.Dans ce travail, nous avons développé une approche basée sur la résonance magnétique nucléaire (RMN) bidimensionnelle 1H-13C pour l'étude de la composition saccharidique des HS réalisée directement à partir des HS isolés de cellules marquées au 13C. Pour cela, un protocole efficace de marquage et de purification des polysaccharides a été mis en place. En intégrant le volume des pics à différents déplacements chimiques par RMN, cette analyse non-destructive permet de déterminer à la fois le profil de sulfatation et d'épimérisation des HS. Cette analyse est appliquée efficacement à différents types cellulaires et est de grand intérêt pour mieux comprendre les changements dans les structures d'HS qui ont lieu lors de régulations physiologiques ou lors de développement pathologiques.Ces résultats ont permis d'ouvrir la voie à l'analyse des HS directement au niveau des cellules par RMN du solide. Les études dans ce contexte représentent un enjeu majeur pour la compréhension des différents rôles des HS et leur capacité à interagir avec une myriade de protéines in vivo. / Glycosaminoglycans (GAGs) belong to a linear polysaccharide family which are found within all tissues, at the extracellular matrix and cell surfaces levels. Heparan Sulfates (HS) are one of the major members of this family, they are bound to a core protein to form altogether the so-called proteoglycan (PG). Depending on the localization and on the core protein, the HS – composed of a N-acetylglucosamine (GlcNAc) and a glucuronic acid (GlcA) [-4GlcAβ1-4GlcNAcα1-] building block – undergo various modifications. Indeed, HS can be sulfated at different positions on both monosaccharide and the GlcA can be epimerized into an iduronic acid (IdoA). The fine structures of the polysaccharide will be able to interact with a large range of proteins and play a plethora of roles such as in inflammation processes, cell proliferation, angiogenesis, immune responses, viral attachment…The HS structural studies, due to the flexibility and heterogeneity of the polysaccharide, have so far been restricted to HS fragments able to bind proteins. The depolymerization techniques induce valuable information losses such as epimerization.In this work, we have successfully developed a nuclear magnetic resonance (NMR)-based approach to study HS features from 13C metabolically enriched cells. For this, an effective protocol to label and purify HS has been set up. By integrating peaks' volumes at well-resolved 1H-13C chemical shifts by NMR, the sulfation, epimerization and disaccharide profile can be determined from full-length HS. This method has been used to study HS from various cell types and is of important interest to better understand changes in HS structures that occur through physiologic and pathologic events.The results obtained open the way to analyze HS directly at the cell surface via solid state NMR techniques. In this context, these studies are a major challenge to decipher the different roles of HS and their ability to interact with so many partners in vivo.

Au cours de ces travaux de thèse, la synthèse de BODIPYs émettant dans le rouge et le proche infrarouge a été réalisée. Un premier travail d’extension de la conjugaison électronique (soit par introduction de groupements aromatiques sur le corps du BODIPY, soit par dimérisation) a permis d’atteindre les basses énergies du spectre électromagnétique. La validation d’une méthode de synthèse de BODIPYs à l’aide d’orthoesters a permis une mise en oeuvre aisée et une nette amélioration de leurs rendements. Parmi les fluorophores obtenus, les dithiényl-BODIPYs émettant dans la fenêtre thérapeutique (650-900 nm) présentent des propriétés optiques et électrochimiques intéressantes. Ils ont été utilisés pour des applications dans le domaine biologique. Après leur solubilisation dans les milieux aqueux par introduction de groupements ammoniums, la détection d’un acide aminé, la cystéine, a pu être réalisée par spectroscopies d’absorption et de fluorescence mettant en évidence un système ratiométrique. De plus, le marquage d’une protéine modèle, le sérum d’albumine bovine, permet d’envisager l’utilisation de ce type de BODIPYs pour l’imagerie biologique grâce à un rendement quantique de fluorescence élevé en milieu physiologique. / During this thesis the synthesis of red and near-infrared emitting BODIPYs was realized. First, the electronic conjugaison was extended by introducing aromatic groups on the BODIPY core or by dimerization in order to archieve these low energies of the electromagnetic spectrum. The validation of a synthetic method of BODIPYs with orthoester allowed to have an efficient synthesis with a clear enhancement of the reaction yield. Among the obtained dyes dithienyl-BODIPYs which display an emission in the therapeutic window (650-900 nm) present interesting optical and electrochemical properties. They have been used for applications in the biological field. After their water-solubilization with ammonium groups the detection of an amino-acid (the cysteine) was archieved with a ratiometric system observed in absorption and fluorescence spectrocopies.Moreover the labelling of a model protein, the bovin serum albumine, allows to consider the use of this type of BODIPYs in biological imaging because of a red emission and a high quantum yied in physiologic medium.

Le travail de thèse décrit plusieurs sources lasers originales spécifiquement développées pour deux applications particulières que sont la spectroscopie LIBS (Laser Induced Breakdown Spectroscopy) et le marquage de câbles par laser. Les travaux sur la LIBS ont eu pour principaux objectifs de proposer de nouvelles solutions pour rapprocher les performances de la LIBS portable de celles de la LIBS de laboratoire et d’évaluer leur potentiel sur des applications géologiques. De nouvelles solutions de spectromètres (technologie SWIFTS) et de lasers compacts ont ainsi été évaluées et ont conduit par exemple à la réalisation d’un nouveau pistolet d’analyse LIBS portable. Les deux sources laser disposent de performances spécifiques : une première source compacte de très bonne qualité de faisceau émettant à 532 nm permettant d'obtenir une forte résolution spatiale adaptée à de la cartographie chimique de surface et une deuxième source infrarouge d'encombrement minimum et de qualité de faisceau plus faible mais d'une grande robustesse. La source laser développée pour le marquage par balayage est donc un laser Nd:YVO4 impulsionnel, quelques watts moyens, émettant dans l’ultraviolet à 355 nm. L’architecture originale utilisée, le « Cavity-Dumped », permet d’obtenir une durée d’impulsion constante (2 ns) quelle que soit la fréquence de répétition et donc une puissance crête élevée même à cadence importante. La très bonne qualité de faisceau observée a aussi permis d’obtenir un spot laser de très faible diamètre compatible avec un marquage précis et bien contrasté. / This work describes three original laser sources developed specifically for Laser Induced Breakdown Spectroscopy (LIBS) and wire marking. The main goal of the work on the LIBS was to propose new solutions to make portable LIBS as efficient as laboratory LIBS and to evaluate their potential in geological applications. New spectrometers (based on SWIFTS technology) and compact lasers were evaluated and they led to the realization of a portable LIBS gun. The two types of analyze possible which are in situ analysis and chemical cartography of the sample surface led to design two specific lasers: a first compact source emitting at 532 nm with a high beam quality allowing a high spatial resolution and a second one with a lower beam quality but much more robust. The laser developed for marking is a Q-switched Nd:YVO4 emitting in the UV at 355 nm. The original architecture used, the “Cavity-Dumped”, make the pulse duration constant (2 ns) with any repetition rate so that the peak power is high even if the repetition rate is important. The very good beam quality observed makes the laser spot very small so that the marking is very precise and contrasted.

Les cytochromes P450 (CYPs) jouent un rôle essentiel dans le métabolisme oxydatif de nombreux composés endogènes et exogènes. L’expression de CYPs est extrêmement variable en fonction de facteurs physiopathologiques, génétiques et environnementaux. Le métabolisme des xénobiotiques par les CYPs dépend en partie de la nature, de la quantité et de l’activité d’isoformes des CYPs impliqués. L'analyse quantitative de l'expression de CYP dans les organes du métabolisme, tels que le foie, sont d'une importance particulière étant donné que la biotransformation réalisée par les CYPs est souvent un facteur critique qui affecte l'efficacité, la disponibilité et la toxicité des médicaments chez l'homme. La technique actuelle de dosage la plus courante est l’immunoquantification par Western Blot. Cette technique est limitée par la disponibilité et la spécificité de l'anticorps. Les techniques de protéomique par spectrométrie de masse, permettant d’analyser de très faibles quantités de protéines en mélange, sont les méthodes de choix pour l’identification et la quantification des CYPs dans différents organes. Nous avons développé et validé une méthode pour doser 6 CYPs (1A2, 2C9, 2D6, 2J2, 3A4 et 3A5) par spectrométrie de masse en couplage chromatographique. Cette méthode, simple, rapide de sensibilité satisfaisante et peu coûteuse, a été validée dans différents types de matrices biologiques (lignées cellulaires hépatiques et neuronales, baculosomes). Ensuite, elle a été appliquée à grande échelle pour l’analyse de 50 foies humains (microsomes et mitochondries) afin d’étudier la relation phénotype/génotype pour les CYPs. Cette méthode pourra être appliquée à d’autres CYPS, est un outil utile qui permettra d’améliorer la compréhension et la prédiction pharmacocinétique et toxique de médicaments et d’autres produits chimiques. / Cytochromes P450 (CYPs) play a key role in the oxidative metabolism of many endogenous and exogenous compounds. The expression of CYPs is extremely variable depending on patho-physiological, genetic and environmental factors. The metabolism of xenobiotics by CYPs depends on the nature the quantity and the activity of CYP isoforms involved. Quantitative analysis of CYP expression in organs such as liver, are of particular importance since the biotransformation performed by CYPs is often a critical factor that affects the efficiency, availability and drug toxicity in humans. The most common technique is the immune-quantitation (Western Blot). This technique is limited by the availability and specificity of the antibody. Mass spectrometry-based proteomics, able to analyze very small amounts of protein in a mixture, are the methods of choice for identification and quantification of CYPs in different organs. We developed and validated a method for dosing 6 CYPs (1A2, 2C9, 2D6, 2J2, 3A4 and 3A5) by liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This simple, rapid, low-cost method has an adequate sensitivity, and has been validated in different types of biological matrices (liver and neuronal cell lines, baculosomes). It has been applied at large-scale to analyze these 6 CYPs in 50 human livers samples (microsomes and mitochondria) to study the phenotype/genotype relationship. This method, which could easily be applied to other CYPs, provides an important tool to improve the understanding and prediction of pharmacokinetics and toxicity profile of drugs and other chemicals.

Un (bio)capteur classique est principalement composé de deux éléments essentiels : une couche réceptrice sensible à l’analyte à laquelle on s’intéresse et un transducteur qui permet de convertir une stimulation chimique / biologique en un signal physique mesurable. Dans le cas idéal, un capteur ne doit pas nécessiter de marquage de la cible, doit posséder de très grandes sensibilité et sélectivité envers elle, ne requiert qu’une faible quantité de cette dernière et doit présenter un temps de réponse très court. Au vu de ces critères, les microsystèmes électromécaniques (MEMS) sont des candidats très prometteurs dans le développement de capteurs. Les polymères fonctionnels, tels que les polymères à empreinte moléculaire (MIPs), sont une approche très intéressante dans l’utilisation des MEMS car ils peuvent être intégrés dans des technologies existantes de MEMS à base de silicium ou complètement remplacer ces technologies. Le but de cette thèse porte sur le développement d’un capteur MEMS composé de polymères (fonctionnels). Un chapitre initial (chapitre 2) introduit des nouveaux systèmes de fabrication de polymères fonctionnels. Des biopuces composées de MIPs imprimés par jet d’encre sont présentées ainsi qu’une technique basée sur la polymérisation radicale contrôlée qui permet le dépôt d’un fin enrobage de MIPs sur des microstructures. La deuxième partie de ce chapitre présente la fabrication de polymères à empreinte moléculaire par stéréolithographie deux-photons, qui peut être vue comme une extension de l’impression 3D. Afin d’illustrer cette technologie de prototypage rapide, deux capteurs composés de MIPs sont présentés : un capteur à grille de diffraction et un capteur en microlevier. Les deux principaux chapitres de ce manuscrit (chapitre 3 et 4) se focalisent sur le développement d’un nouveau concept de fabrication pour les capteurs MEMS. Ce concept est basé sur la polymérisation d’une poutre à fort ratio de forme à l’extrémité d’une fibre optique de télécommunication. Cette poutre a été mise en vibration à sa résonnance et a ainsi pu être utilisée comme un capteur à base de levier. Le capteur en polymère a permis l’intégration de MIPs comme élément récepteur et la reconnaissance sélective de l’antibiotique enrofloxacine. De plus, un nouveau système de mesure intégré est présenté dans le chapitre 4. Ce système de mesure intègre la fibre optique en guidant un rayon laser à travers elle ainsi qu’à travers le levier qui y est attaché.Le rayon lumineux sortant est ensuite focalisé sur une photodiode sensible à la position du rayon lumineux, permettant ainsi la mesure du spectre de résonance de la poutre en polymère. Ce système de mesure est caractérisé et ses performances sont présentées au travers de la détection de masse du levier en polymère et de mesures faites en milieu liquide. / A classical (bio)sensor consists of two key components: A receptor layer that detects the analyte of interest and the transducer which converts the chemical / biological stimuli into a physical measurable signal. Ideally a sensor is label-free, highly sensitive and selective towards the target, requires low sample amount and shows a fast response time. Regarding these criteria microelectromechanical systems (MEMS) offer great potential for the sensor development. One interesting approach for this development are functional polymer materials, such as molecularly imprinted polymers (MIPs), that can be either integrated to existing MEMS based on silicon or completely replace the silicon technology. The emphasis of this thesis is focused on the development of a MEMS sensor based on (functional) polymers. In an initial chapter (chapter 2) new fabrication schemes for functional polymers are introduced. Inkjet-printed biochips based on MIPs are presented and a technique based on controlled radical polymerization is shown that allows the deposition of thin MIP shells on a microfabricated pattern. In the second part of this chapter the fabrication of molecularly imprinted polymers by two-photon stereolithography is shown which can be seen as an extension of 3dimensional printing. As possible application of this rapid prototyping technology two sensors based on MIPs are introduced a diffraction grating sensor and a microcantilever sensor. The two main chapters of this manuscript (chapter 3 and chapter 4) report the development of a new fabrication concept for MEMS sensors. It is based on the polymerization of a high aspect ratio beam on the extremity of an optical telecommunication fiber which was actuated at resonance and thus could be used as a cantilever sensor. The polymer sensor allowed the integration of MIPs as sensing element and the selective recognition of the antibiotic enrofloxacin. Furthermore, is a new, integrated read-out scheme presented in chapter 4. This read-out scheme integrates the optical fiber, by guiding a probe laser beam through it and attached cantilever beam. The output light beam is then focused on a position sensitive photodiode and thus enabled to monitor the resonance spectra of the polymer beam. The read-out scheme is characterized and its performance is shown by demonstrating the mass sensitivity of the polymeric cantilever beam and by measurements in liquid environments.

L'imagerie a pris une importance croissante dans l'étude des processus biologiques. L'utilisation de la microscopie de fluorescence a notamment favorisé le développement de nombreuses molécules sondes pour le marquage et la visualisation de biomolécules en milieu biologique complexe. D'autre part, des techniques d'imagerie complémentaires émergent, comme la microspectroscopie infrarouge. Les complexes organométalliques ont un potentiel important comme outils pour l'imagerie biologique, car ils peuvent combiner sur un même cœur moléculaire des propriétés permettant leur détection par différents types d'imagerie. En particulier, des complexes rhénium tricarbonyl ont été utilisés comme sondes pour l'imagerie multimodale. Ces " SCoMPIs " (Single Core Multimodal Probes for the Imaging) sont luminescents et présentent des signaux infrarouge et de fluorescence X intenses et qui permettent leur détection spécifique en milieu biologique. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés aux possibilités d'imagerie multimodale de peptides et de protéines exogènes ou endogènes. Différents SCoMPIs ont été préparés et caractérisés, permettant le marquage N-terminal de peptides, le marquage d'une protéine exogène (homéodomaine) via une réaction thiol-maléimide ou le marquage par affinité d'une protéine endogène (anhydrase carbonique). L'évolution des propriétés de luminescence de SCoMPIs en fonction de l'environnement a été étudiée. Les imageries de luminescence et infrarouge ont permis la détection des peptides en contexte cellulaire, mais pas des protéines marquées avec des SCoMPIs. En revanche, il a été possible de détecter ces faibles quantités par microspectroscopie de fluorescence X. / Bioimaging is now widely used for the study of biological processes. The expansion of fluorescence microscopy has led to the development of small chemical probes for the labelling and imaging of biomolecules in complex biological environments. Alternative imaging techniques, such as infrared microspectroscopy, are also emerging. Organometallic complexes have a great potential as tools for bioimaging, since they can combine on a single molecular core properties enabling their detection by various imaging techniques. In particular, rhenium tricarbonyl complexes have been used for multimodal imaging. These “SCoMPIs” (Single Core Multimodal Probes for the Imaging) are luminescent and exhibit intense, specific infrared and X-ray fluorescence signals, which make possible their multimodal detection in biological media. In this study, we focused on the possibility to perform the multimodal imaging of SCoMPI-labelled peptides and proteins in cells. Various SCoMPIs were prepared and characterized, that were suitable for N-terminal labelling of peptides, labelling of an exogenous protein (homeodomain) through thiol-maleimide labelling, or the affinity-guided labelling of endogenous proteins (carbonic anhydrases). Dependance on the luminescence properties of SCoMPIs with their environment was investigated. SCoMPI-labelled peptides could be easily detected by luminescence and infrared imaging, which was not the case for SCoMPI-labelled proteins. However, it was possible to detect these small amounts of proteins by X-ray fluorescence microspectroscopy.

La dispersion est définie comme le mouvement fait par un individu entre son lieu de naissance et le site de sa première reproduction (dispersion natale) ou entre deux sites de reproduction successifs (dispersion de reproduction). Il possède de nombreuses causes (proximales et ultimes) et conséquences (fitness, etc.), peu étudiées à des échelles spatiotemporelles larges. Cette thèse souligne le rôle de la densité, du climat, et des populations considérées, avec une approche dynamique des échanges et un rôle de la migration, sur la dispersion de la Cigogne blanche (Ciconia ciconia) en France. La dispersion influence la survie et la reproduction chez le Cincle plongeur (Cinclus cinclus) et est héritable, ce qui souligne le processus évolutif sous-jacent à l’apparition de ce comportement. Ces travaux recontextualisent le rôle de l’environnement sur la dispersion à une échelle inter-populationnelle, en soulignant les liens avec la migration, ainsi que le contexte évolutif de ce trait. / Dispersal is defined as the movement made by an individual between his birthplace and the site of his first breeding attempt (natal dispersal) or between successive breeding sites (breeding dispersal). It has many causes (proximate and ultimate) and consequences (fitness, etc.), rarely studied in large spatial and temporal scales. This thesis emphasizes the role of density, climate, and populations, with a dynamic approach and the role of migration, on the dispersal of the White Stork (Ciconia ciconia) in France. Dispersal influences survival and reproduction in the White-throated Dipper (Cinclus cinclus) and is heritable, highlighting the underlying evolutionary process of this behavior. This work recontextualized the role of the environment on the dispersal in an inter-population level, as long as the links with migration and the evolutionary context of this trait.

Les objectifs de mes travaux de thèse étaient de développer de nouvelles méthodes d’identification, de caractérisation et de quantification de protéines, mieux adaptées à la diversité des études en protéomique, ce dont la biologie a besoin aujourd’hui. L’analyse protéomique par spectrométrie de masse est apparue comme un outil précieux et pertinent pour évaluer la qualité de l’isolement d’un complexe spécifique, et pour guider les biologistes dans les choix de la stratégie à adopter. La stratégie de marquage de N-terminomique développée a permis de caractériser un processus de maturation biologique en déterminant précisément les sites d’activation de la protéine Perséphone par marquage spécifique des extrémités N-terminales. Ce travail a permis d’élucider un nouveau mécanisme fin de régulation dans l’immunité innée chez la drosophile. De nouveaux modes de marquages ont été mis au point et les familles chimiques des réactifs de marquage étudiés permettront d’adapter au mieux les études de quantifications protéomiques à la nature et aux contraintes des études biologiques à mener. / The aim of this work was to develop new methods for the identification, characterization and quantification of proteins best suited to a large diversity of proteomics studies, which is nowadays essential to biology. Our work has shown that proteomic analysis based on mass spectrometry can be a valuable and relevant tool to evaluate the isolation strategy efficiency set up for a specific complex and thus guide the biologists in their choice. The N-terminomic labeling strategy developed allowed us to describe a biological maturation process by determining precisely the Persephone protein activation sites using specific labeling of the successively generated N-terminal extremities. This work allowed elucidating a new regulation mechanism in the Drosophila innate immunity system. New chemical labeling reagents to target specific amino acids (cysteine, tyrosine and tryptophan) have been set up for fast mass-spectrometry based proteomics. These labeling strategies combined with proteomic tools will allow developing a robust and quantitative approach essential for biological studies.

Les taillis à courte rotation (TCR) permettent de produire de la biomasse ligneuse, alternative aux combustibles fossiles. L'intégration d’espèces d’arbres fixateurs d'azote atmosphérique en mélange avec les essences à croissance rapide peut être un moyen de limiter le risque d'appauvrissement des sols dans les TCR. Le succès d'un tel mélange va dépendre des interactions entre les deux espèces : facilitation, compétition ou complémentarité pour la lumière et les ressources du sol (eau, nutriments). L’objectif de cette étude était d’évaluer l’impact du mélange peuplier / robinier, sur la croissance, la production de biomasse et l'acquisition de l'azote d'une plantation à courte rotation. Un dispositif instrumenté composé de monocultures de peuplier et robinier et le mélange des deux espèces a été étudié pendant quatre ans. La quantification répétée des biomasses aériennes et souterraines associée au suivi des dimensions des arbres a permis de mettre en évidence que la présence des robiniers n'avait pas d'influence sur la croissance, la production et l'allocation de biomasse des peupliers à l'échelle de l'arbre comme à l'échelle du peuplement. En revanche, les robiniers souffraient de la compétition interspécifique : mortalité augmentée, croissance et production de biomasse diminuée. De plus, une approche isotopique (15N) couplée à l'analyse des minéralomasses a montré que les teneurs en azote des robiniers dans le mélange étaient plus faibles que dans la monoculture dues à une fixation de l'azote atmosphérique réduite. Le stock global d'azote dans le milieu était comparable dans les mélanges et les monocultures de chaque espèce. Le mélange n'a pas montré d'intérêt sur la période d'étude en raison notamment des conditions pédoclimatiques inappropriées (en particulier pour le robinier) et d'une incompatibilité entre les deux espèces sur ce site / Biomass from short rotation coppice (SRC) plantations may help reducing fossil fuel consumption. The development of mixed-species plantations, introducing a nitrogen-fixing species could be a solution to reduce the risk of fertility decline in SRC. Nevertheless, the success or failure of the mixture will depend on the competition and complementarity processes, for light and soil resources (water and nutrients), between both species. The objectives of this study were to determine the impact of a mixture of poplar and black locust, on growth, biomass production and nitrogen uptake in the plantation. Instrumented monocultures and mixed plantations of both species have been studied during four years. Repeated above-and belowground biomass estimations associated with tree dimension monitoring have shown that the presence of black locust affected neither growth, nor biomass production and allocation of poplar trees both at tree and plot level. On the other hand, the black locusts trees suffered from interspecific competition: high mortality, decrease in growth and biomass production. Moreover, an isotopic approach (15N) coupled with mineralomass analyses allowed to highlight that nitrogen concentration in black locust trees in the mixture was lower than in the monoculture due to a reduction of the percentage of nitrogen derived from atmospheric fixation. The total nitrogen contents were close in the mixture and in the monocultures of each species. No advantage of the mixture was found during the study period because of inappropriate pedoclimatic conditions (especially for the black locust) and incompatibility between both species on this site

Une méthode permettant de caractériser l’ensemble du métabolome secondaire de moisissures a été appliquée à la caractérisation des métabolomes de Penicillium nordicum, Penicillium verrucosum et Fusarium graminearum. Le substrat représentant l’unique source de carbone et d’azote des moisissures, chacun des champignons ont été mis en culture sur trois types de grains de blé: (i) grains naturels, (ii) grains marqués à 97% de 13C, et (iii) grains marqués à 53% 13C et 97% de 15N. Les extraits ont été analysés par HRMS. Les métabolites secondaires ont été spécifiquement détectés et leurs formules brutes ont été caractérisées. La caractérisation de nouveaux métabolites secondaires a ensuite été assistées par la génération de réseaux moléculaires de similarités MS/MS. L’étude de P. verrucosum et P. nordicum a permis de détecter 98 et 92 métabolites secondaires respectivement. Parmi eux, 80% étaient inconnus. La génération de réseaux moléculaires a permis de mettre en évidence un groupe de 25 composés se fragmentant de manière similaire. Seize de ces composés ont été identifiés comme étant des dérivés de fungisporines, des métabolites suspectés d’intervenir dans la croissance aérienne des champignons. Des analyses structurales ont permis de caractériser de nouveaux composés potentiellement impliqués dans l’infestation des denrées alimentaires. Le marquage du métabolome de F. graminearum par des isotopes stables a permis de mettre en évidence la production de 37 métabolites secondaires dont 29 inconnus lorsque le champignon se développe in vitro. Des analyses par MSn ont permis d’élucider les structures des fusaristatines C et D. / Characterization of fungal secondary metabolomes became a great challenge in the last decades due to both the emergence of fungal threats, and the industrial interest of many natural products; In view of this, we recently developed an analytical strategy for fungal secondary metabolome characterization (Cano P. et al. Anal. Chem. (2013) 85:8412) based on untargeted MS metabolomics applied to labeled samples. This strategy has been here validated by application to the analysis of the complex secondary metabolomes of Penicillium verrucosum and Penicillium nordicum. HRMS acquisitions performed on specific isotopically labelled samples, MS/MS experiments and in-silico emerging tools such as molecular networks, allowed to characterize 181 metabolites, including 80% of new compounds, and the structural determination of seven potential new mycotoxins. Penicillium verrucosum (NRRL 5571) and Penicillium nordicum (NRRL 6062) were grown on wheat grains (Triticum aestivum) presenting different isotopic enrichments: (i) naturally enriched grains, (ii) 97% 13C, and (iii) 53% 13C / 97% 15N. Extracts of each culture were analyzed by HPLC coupled to a LTQ-Orbitrap mass spectrometer equipped with electrospray ionization, operating in the positive or the negative mode. Metabolites were then specifically detected according to the specific isotopic pattern of their respective isotopic enrichments. Known secondary metabolites were annotated using the Antibase database, then identified by comparison with standard compounds when available. Unknown secondary metabolites were annotated using molecular networks of MS/MS similarities (Watrous J. et al.; PNAS (2012) 109 E1743). Wheat grains representing the only source of carbon and nitrogen for fungal growth, the produced fungal secondary metabolites were either unlabeled (naturally enriched cultures), singly labeled (13C cultures) or doubly labeled (13C/15N cultures). This feature allowed discrimination of fungal metabolites against non-fungal compounds which remained unlabeled in the three substrates. Fungal origin was further confirmed by analysis of a control 12C wheat extract (without fungus). Furthermore, the comparison of m/z ratios of a same metabolite detected in the three different cultures, led to the unambiguous determination of the number of carbon and nitrogen atoms and therefore to the unambiguous characterization of its chemical formula. This approach previously developed and validated on a well characterized fungus, has been here successfully applied to the characterization of the complex and unknown secondary metabolomes of P. verrucosum and P. nordicum. Analyses of the two studied fungal strains allowed the detection of 181 secondary metabolites. Interestingly, only 20% of them are suspected to match known metabolites according to databases, meaning that 80% of this metabolome is unknown. To enhance unknown identification efficiency, a molecular network of MS/MS similarities has been generated from our data. A group of 24 metabolites with highly similar MS/MS spectra was highlighted on P. nordicum and P. verrucosum. Fifteen of them were identified as cyclic tetrapeptides from the fungisporin family. Tandem mass spectrometry experiments were performed to characterize the structure of these secondary metabolites. To the best of our knowledge, this is the first time these molecules are pointed out on these Penicillium species. More interestingly, seven of the other metabolites display some similarities with fungisporins, but have never been detected on fungal metabolomes. Furthermore, although the two studied strains are genetically close, these new metabolites seem to be strain specific.