L’entérotoxine B staphylococcique (SEB) est une toxine entérique hautement résistante à la chaleur et est responsable de plus de 50 % des cas d’intoxication d’origine alimentaire par une entérotoxine. L’objectif principal de ce projet de maîtrise est de développer et valider une méthode basée sur des nouvelles stratégies analytiques permettant la détection et la quantification de SEB dans les matrices alimentaires. Une carte de peptides tryptiques a été produite et 3 peptides tryptiques spécifiques ont été sélectionnés pour servir de peptides témoins à partir des 9 fragments protéolytiques identifiés (couverture de 35 % de la séquence). L’anhydride acétique et la forme deutérée furent utilisés afin de synthétiser des peptides standards marqués avec un isotope léger et lourd. La combinaison de mélanges des deux isotopes à des concentrations molaires différentes fut utilisée afin d’établir la linéarité et les résultats ont démontré que les mesures faites par dilution isotopique combinée au CL-SM/SM respectaient les critères généralement reconnus d’épreuves biologiques avec des valeurs de pente près de 1, des valeurs de R2 supérieure à 0,98 et des coefficients de variation (CV%) inférieurs à 8 %. La précision et l’exactitude de la méthode ont été évaluées à l’aide d’échantillons d’homogénat de viande de poulet dans lesquels SEB a été introduite. SEB a été enrichie à 0,2, 1 et 2 pmol/g. Les résultats analytiques révèlent que la méthode procure une plage d’exactitude de 84,9 à 91,1 %. Dans l’ensemble, les résultats présentés dans ce mémoire démontrent que les méthodes protéomiques peuvent être utilisées efficacement pour détecter et quantifier SEB dans les matrices alimentaires. Mots clés : spectrométrie de masse; marquage isotopique; protéomique quantitative; entérotoxines / Staphylococcal enterotoxin B is a highly heat-resistant enteric toxin and it is responsible for over 50% of enterotoxin food poisoning. It represents a particular challenge during food processing since, even if the bacteria have been destroyed, the biological activity of the toxin remains unchanged. The objective of this study was to develop and validate a new method based on a novel proteomic strategy to detect and quantify SEB in food matrices. Tryptic peptide map was generated and 3 specific tryptic peptides were selected and used as surrogate peptides from 9 identified proteolytic fragments (sequence coverage of 35%). Peptides were label with light and heavy form of acetic anhydride to create an isobaric tag that will allow quantification. The linearity was tested using mixtures of different molar ratios and the results showed that measurements by LC-MS/MS were within generally accepted criteria for bioassays with slope values near to 1, values of R2 above 0.98 and less than 8% coefficient of variation (%CV). The precision and accuracy of the method were assessed using chicken meat homogenate samples spiked with SEB at 0.2, 1 and 2 pmol/g. The results indicated that the method can provide accuracy within 84.9 – 91.1% range. Overall, the results presented in this thesis show that proteomics-based methods can be effectively used to detect, confirm and quantify SEB in food matrices. Keywords: mass spectrometry; stable isotope labeling; quantitative proteomics; enterotoxins

Le nombre croissant de médicaments protéiques utilisés en thérapeutique a créé des besoins dans le domaine de leur quantification, principalement dans le plasma, un milieu de composition protéique complexe. Le dosage, essentiel aux études pharmacocinétique/pharmacodynamique, ainsi qu’à l’optimisation de ces traitements, est compliqué par la nature protéique de ces médicaments et par les faibles concentrations auxquelles ils sont attendus dans ces milieux complexes. La méthodologie proposée se démarque des méthodes de dosage usuelles par son caractère universel. Elle fait appel à la spectrométrie de masse adaptée à la quantification des protéines grâce à l’utilisation d’un marquage isotopique différentiel des peptides : après enrichissement et protéolyse, l’échantillon à doser est marqué sur les lysines par la version légère d’un réactif de dérivation. En parallèle, les peptides de la protéine médicament pure marqués par la version lourde du réactif, servent d’étalon interne. La possibilité de quantifier la protéine à partir de plusieurs de ses peptides améliore la fiabilité du dosage. Appliquée à l’epoetin beta aux concentrations attendues en thérapeutique (autour de 0,5 femtomole/µL de plasma), la stratégie proposée permet de situer la limite de quantification à environ 50 attomoles d’epoetin beta/µL de plasma avec une méthodologie de spectrométrie de masse nano-LC-ESI-Q-TRAP fonctionnant en mode MRM. Pour étendre l’universalité de cette approche au champ des protéines médicaments pégylées, une seconde molécule a été étudiée. Il s’agit de l’interféron alfa-2b pégylé qui a permis de mettre en place une stratégie d’extraction spécifique du médicament utilisant sa pégylation. / The growing number of therapeutic proteins has created needs in the field of their quantification, mainly in plasma, which is a complex protein environment. Quantitative analysis of these proteins is essential for pharmacokinetics/pharmacodynamics studies, and for the optimization of treatments. However, the nature itself of the analyte and the low concentrations that are expected in plasma complicate the quantitative analysis. The proposed methodology differs from usual methods on its universal applicability. It relies on mass spectrometry adapted to the quantification of proteins by using peptides differential isotope labelling : after enrichment and proteolysis, the therapeutic protein and the plasmatic proteins are labelled on lysine residues by the light reagent. In parallel, peptides of the pure therapeutic protein, labelled by heavy version of reagent, are used as internal standard. The ability to quantify the protein with several of its peptides improves the reliability of the analysis. When applied to epoetin beta at expected therapeutic concentrations (about 0.5 femtomole/µL of plasma), the proposed strategy leads to a quantification limit close to 50 attomoles of epoetin beta/µL plasma, with a nano-LC-ESI-Q-TRAP mass spectrometry methodology operating in MRM. To extend the universal character of this approach to the field of pegylated protein drugs, a second therapeutic protein model has been studied. This model is a pegylated interferon alfa-2b which allowed developing a strategy for specific extraction of the drug relying on its pegylation.

En Europe, la présence de grands carnivores dans des paysages anthropisés entraîne une forte compétition avec l'homme et alimente d'importantes polémiques concernant leur protection légale. La perception antagoniste de ces espèces à la fois emblématiques pour certains et sources de conflits pour d'autres, rend la gestion de leurs populations très délicate. Depuis la recolonisation spontanée du loup (Canis lupus) dans les Alpes françaises au début des années 1990, la population s'est accrue numériquement et spatialement. Parallèlement, les dégâts occasionnés par le loup sur la filière élevage ont suivi la même tendance. L'Etat met en place aujourd'hui un contrôle raisonné de la population, sous réserve que les objectifs de conservation, exigés par la Directive Habitat, soient respectés. En s'inspirant du cas d'étude du loup en France, nous proposons dans cette thèse un cadre de prise de décision structurée adapté pour la gestion et la conservation d'espèces rares et difficilement observables, protégées par des accords législatifs mais qui, dans un contexte social conflictuel, peuvent être régulées. La modélisation séquentielle du processus décisionnel s'est déroulée dans un contexte de forte incertitude selon plusieurs étapes : 1) appréhender les objectifs de conservation et/ou contrôle du loup en France pour les formaliser sous forme mathématique via une fonction d'utilité, 2) suivre la population par une méthode non-invasive pour définir des indicateurs de gestion fiables et évaluer le statut de conservation de la population, 3) coupler les mesures létales adoptées actuellement à un modèle démographique décrivant la dynamique du loup et intégrant sa structure sociale, 4) et déterminer la décision. Cette dernière étape est réalisée à l'aide d'une méthode d'optimisation qui calcule la stratégie optimale de gestion en fonction de la structure sociale de la population et des différentes sources d'incertitude accumulées à chaque étape du processus décisionnel. Nous avons choisi comme indicateur de gestion le taux de croissance, à partir duquel nous avons défini l'utilité. Cet indicateur était robuste à l'incertitude d'échantillonnage émergeant de la détection partielle et hétérogène des individus. Des analyses de sensibilité de la décision ont montré une forte influence de la fonction d'utilité sur la stratégie optimale, soulignant ainsi l'importance de définir correctement les objectifs. Nous avons également montré que la stratégie optimale était sensible aux variations des paramètres démographiques, montrant ainsi l'intérêt des méthodes de capture-marquage-recapture pour les estimer correctement. Nous discutons enfin de l'extension de notre approche à un cadre décisionnel de gestion adaptative pour traiter des problèmes de conservation dans un contexte conflictuel. / Large carnivore management in Europe is controversial because of conflictive objectives arising from the legal protection of threatened species vs. the possible necessity of culling individuals to prevent severe damages on human activities. Since the wolf recovery in the French Alps in the early 90's, the population has been numerically and spatially increasing. In parallel, livestock depredations have been following the same trend. As an EU member state, France is bound to the European Habitat Directive, which provides full protection of wolf populations and their habitat. Nevertheless, derogatory killings are allowed for individuals causing problems on livestock and some lethal control is now incorporated into the national management plan, as long as the population growth and its distribution range are not being threatened. Illustrating with the case study of the wolf in France, my dissertation proposes a structured decision making framework for the management and the conservation of elusive species that are legally protected but, in a conflictive context, are subject to population control. The sequential modeling of our decision process occurred in the following steps: 1) define the multiple objectives and formulate them in terms of a utility function, 2) monitor the population through a non-invasive approach in order to define the population conservation status, 3) build a demographic model to predict the consequences of harvesting on population dynamics and social structure, 4) obtain optimal state-dependent decisions. The last step is done with stochastic dynamic programming (SDP), acknowledged to be one of the most useful optimization methods in decision making. We provide an optimal solution for wolf management that gives the highest chance of meeting objectives, defined on population growth rate. This demographic indicator was found to be robust to sampling uncertainty arising from partial and heterogeneous detection of individuals. We ran decision sensibility analyses and found a strong effect of the utility function on the optimal strategy, highlighting the importance of defining explicit objectives. We also found that the optimal strategy was sensitive to demographic parameters, which demonstrate the general need of using solid statistical approaches to estimate them properly. This structured decision making framework can further be extended to adaptive management, acknowledged as being a convenient framework for wildlife management.

Les recherches sur les interactions porte-greffe/greffon chez la vigne en relation avec l’environnement perdurent depuis plusieurs décennies, mais les mécanismes physiologiques sous-jacents de la vigueur conférée sont toujours incompris. Ce manque de connaissance constitue un frein dans le développement des porte-greffes existants pour contrôler la vigueur et la productivité, ou dans la recherche de nouveaux génotypes de porte-greffe mieux adaptés aux conditions futures de production. L’objectif de ce travail est de comprendre par une approche de biologie intégrative couplant expérimentation et modélisation comment le porte-greffe interagit spécifiquement avec son greffon (et vice versa) pour modifier dès les premières étapes du greffage, les caractéristiques physiologiques de la plante entière afin de coordonner le développement et la croissance des parties aériennes avec celle des parties racinaires. L’azote étant considéré comme un élément-clef de contrôle de la croissance et de l’allocation de la biomasse au sein d’une plante, un accent particulier est porté sur le rôle de la nutrition azotée dans le contrôle trophique de la croissance du couple porte-greffe/greffon. Un travail expérimental en serre a été mené pour caractériser par marquage isotopique les flux d’azote (15N) et de carbone à l’échelle de la plante entière au sein de deux combinaisons de porte-greffe/greffon au stade végétatif : l’une conférant une forte vigueur (CS/1103P), l’autre une faible vigueur (CS/RGM), en réponse à une variation de la disponibilité externe en nitrate. Cette étude sur le couplage entre fonctions d’acquisition et d’utilisation des ressources azotées et carbonées a été complétée par un phénotypage dynamique de la croissance aérienne, de la répartition de biomasse entre les organes et de la composition biochimique et minérale des principaux organes de la plante. Nous avons ainsi pu appréhender les signaux de communication entre la partie aérienne et la partie racinaire de la vigne greffée, ce qui a abouti à l’élaboration d’un modèle conceptuel simplifié du fonctionnement de la vigne greffée. Une première version d’un modèle mécaniste basé sur un formalisme source-puits prenant en compte l’acquisition et l’allocation de C et N au sein de deux compartiments aérien et racinaire, ainsi que leur plasticité vis-à-vis de la disponibilité exogène et endogène en ressources a été élaborée. A terme, le modèle devrait permettre d’identifier des paramètres génétiques clef au niveau racinaire explicitant les différences de croissance et vigueur conférée observées selon les combinaisons porte-greffe/greffon / Research on rootstock/scion interactions in grapevine in relation to the environment persisted for several decades, but the physiological mechanisms determining the rootstock effect on scion vigour are still misunderstood. This lack of knowledge hampers the development of existing rootstocks to control the vigor and productivity, or research new rootstock genotypes better adapted to future conditions of production. The objective of this work is to understand by an integrative biology approach coupling experimentation and modeling how the rootstock interacts specifically with the scion (and vice versa) to change in the early stages of grafting , the physiological characteristics of the whole plant to coordinate the development and growth of the aerial parts with the root parties. Nitrogen is considered a key element in the control of the growth and the biomass allocation within a plant, and a particular emphasis is placed on the role of nitrogen nutrition in the nutritional control of the grafted grapevine growth. Experimental work was conducted in a greenhouse to characterize by isotopic labeling nitrogen (15N) and carbon flow within the whole plant for two rootstock/scion combinations at vegetative stage : one giving a strong vigour (CS/1103P), the other a low vigour (CS / RGM), in response to a change in the external nitrate availability. This study on the coupling between acquisition functions and use of nitrogenous and carbonaceous resources was completed by a dynamic phenotyping aerial growth, the distribution of biomass between the organs and the biochemical and mineral composition of the principal organs of plant. We were able to understand the communication signals between the aerial part and the root part of grafted vines, which led to the development of a simplified conceptual model of the functioning of the grafted vines. A first version of a mechanistic model based on a source-sink formalism taking into account the acquisition and allocation of C and N in both aerial and root compartments and their plasticity to the availability of exogenous and endogenous resource was developed.

L’athérosclérose est une maladie inflammatoire, caractérisée par une accumulation lipidique et cellulaire, dont le macrophage est l’acteur principal. Dans l’athérosclérose, le macrophage sécrète des cytokines qui favorisent le chimiotactisme et donc la migration et l’internalisation des cellules immunitaires, accentuant le processus pro-inflammatoire et accélérant l’évolution des plaques athéromateuses et leur instabilité jusqu’à éventuellement la rupture et/ou la formation de thrombus. Il est donc important de développer une technique d’imagerie cellulaire permettant de visualiser les macrophages et leur migration dans divers contextes pathologiques pour mieux comprendre leur implication, permettre le suivi thérapeutique et probablement leur utilisation dans la thérapie vectorisée. Le but de ce travail vise principalement à marquer aux nanoparticules de fer des macrophages activés de manière classiques (macrophages dits « M1 ») pour l’évaluation du statut inflammatoire dans un premier temps au sein des plaques d’athérome, et la visualisation de la dynamique de leur recrutement par IRM. Dans un deuxième temps, la méthode est exploitée pour montrer in vivo l’effet d’un traitement permettant de diminuer l’inflammation dans la plaque chez des souris invalidées pour le gène de l’apolipoprotéine E (ApoE-/-). Enfin, l’utilisation du protocole de marquage des macrophages M1 et leur suivi par IRM sont appliqués au diagnostic par imagerie d’une inflammation transitoire et circonscrite au poumon, induite par les lipopolysaccharides (LPS). En conclusion, le marquage des monocytes dirigés vers la voie M1 pour leur détection par IRM représente une méthode solide pour étudier différents phénomènes immunologiques en particulier le processus inflammatoire, et peut être un outil ou une approche de vectorisation permettant le suivi thérapeutique, cellulaire ou génique / Atherosclerosis is an inflammatory disease characterized by vessel wall lipids and cells accumulation, for which the macrophage acts as a central actor. In atherosclerosis the macrophage secretes cytokines that promote chemotaxis and thus migration and internalization of immune cells. This phenomenon emphasizes pro-inflammatory processes and accelerates the development of atherosclerotic plaque unstability to potentially its rupture with or without thrombus formation. It is therefore important to develop a technique for cell imaging to visualize macrophages and their migration in various pathological contexts to better understand their involvement, to allow therapeutic drug monitoring and probably their use in vectorized therapy. The aim of this work is mainly to label activated macrophages in classical way (macrophages called "M1") by iron nanoparticles, first to evaluate the inflammatory status within atherosclerotic plaques, and visualize their dynamic recruitment by MRI. In a second step, the method is used to show in vivo the effect of a treatment to reduce inflammation in the plaque, in mice invalidated for the gene for apolipoprotein E (ApoE-/ -). Finally, the protocol for M1 macrophages labelling and MRI tracking, was used for diagnostic imaging of a transient inflammation confined to the lung induced by lipopolysaccharide (LPS). In conclusion, the labelling of monocytes headed towards M1 polarization for their detection by MRI is a robust method to study various immunological phenomena in particular the inflammatory process, and can be an approach to vectorization and monitoring for gene or cell therapy

La perfusion est un facteur important dans la viabilité et la fonction du myocarde. Des atteintes microvasculaires diffuses, précédant l'infarctus ou l'insuffisance cardiaque sont impliqués dans bon nombre de pathologies cardiaques. Ce travail vise à améliorer les techniques existantes de mesure quantitatives et non-invasive de la perfusion myocardique par marquage de spins artériels (ASL). La première partie de mon travail de thèse a consisté en la mise place chez la souris d'une technique alternative pour mesurer la perfusion myocardique. Celle-ci est basée sur un marquage pulsé et régulièrement répété afin de construire un état d'équilibre de l'aimantation sous l'influence de la perfusion (approche steady-pulsed ASL). Le modèle théorique associé à cette technique spASL a été développé en parallèle afin de quantifier le flux sanguin tissulaire. Il a été montré que spASL permettait d'obtenir un résultat similaire aux techniques existantes avec en plus, les avantages d'améliorer la sensibilité au signal de perfusion ainsi que de réduire le temps d'acquisition. Dans un second temps, un transfert vers l'imagerie clinique pour une application chez l'homme a été entrepris. Le marquage de type spASL a été conservé et le module de lecture a été adapté aux spécificités de l'imagerie cardiaque chez l'homme pour une acquisition en respiration libre. Un post-traitement dédié qui comprend une correction de mouvement rétrospective a ensuite vu le jour afin d'améliorer la robustesse de nos mesures. Parallèlement aux développements conduits chez l'homme, nous avons exploité l'approche spASL chez l'animal en proposant diverses améliorations en fonction des études menées. / Myocardial blood flow is an important factor of tissue viability and function. Diffuse changes in microcirculation preceding heart failure are involved in various cardiac pathologies. This work aim at improving existing techniques allowing quantitative and non-invasive myocardial perfusion assessment using arterial spin labeling. The first step of my work was to design an alternative approach to quantify myocardial blood flow in mice. The so called steady-pulsed ASL (spASL) is based on a regularly repeated pulsed labeling in order to build up a stationary regime of the magnetization under the influence of perfusion. The associated theoretical model has been developed in parallel to quantify tissue blood flow. We have shown that spASL allows to obtain similar results than the previously employed techniques, with the additional advantages of an increased sensitivity to the perfusion signal and a reduced acquisition time. A transfer towards clinical imaging for human applications was then undertaken. The spASL labeling scheme has been preserved while adapting the readout module to the specificities of cardiac MRI when applied to free-breathing human acquisitions. A dedicated post-processing, which includes a retrospective motion correction, has emerged subsequently to improve the robustness of our measurements. In parallel to the developments made for human studies, some optimization of the spASL technique when applied to rodent have been carried out depending on the conducted studies.

Depuis le début des années 1960, la croissance de l'albacore fait l'objet d'une attention particulière tant dans le domaine de la recherche que pour la gestion des pêcheries. Dans l'océan Indien, la gestion du stock d'albacores, sous la juridiction le Commission Thonière de l'Océan Indien (CTOI), souffre de nombreuses incertitudes associées à la courbe de croissance actuellement considérée. En particulier, des lacunes subsistent dans notre connaissance des processus biologiques et écologiques élémentaires régulant la croissance. Leur connaissance est pourtant fondamentale pour comprendre la productivité des stocks et leur capacité de résistance à la pression de pêche et aux changements océanographiques en cours. À travers la modélisation, cette étude se propose d'améliorer les connaissances actuelles sur la croissance de la population d'albacore de l'océan Indien et de renforcer ainsi les avis scientifiques sur l'état du stock. Alors que la plupart des études sur la croissance de l'albacore s'appuient sur une seule source de données, nous avons mis en œuvre un modèle hiérarchique Bayésien qui exploite diverses sources d'informations sur la croissance, i.e. des estimations d'âge obtenues par otolithométrie, des analyses de progressions modales et les taux de croissance individuels issus du marquage-recapture, et intègre explicitement des connaissances d'experts et les incertitudes associées à chaque source de données ainsi qu'au processus de modélisation. En particulier, le modèle de croissance a été couplé un à modèle d'erreurs dans les estimations d'âge par otolithométrie apportant une amélioration significative des estimations d'âge et des paramètres de croissance en résultant et permettant une meilleure évaluation de la fiabilité des estimations. Les courbes de croissances obtenues constituent une avancée majeure dans la représentation du patron de croissance actuellement utilisé dans les évaluations de stock d'albacore. Elles démontrent que l'albacore présente une croissance en phases, caractérisée par une forte accélération en fin de phase juvénile. Cependant, elles n'apportent aucune information sur les mécanismes biologiques et écologiques à l'origine de ces phases de croissance. Afin de mieux comprendre les facteurs impliqués dans l'accélération de la croissance, nous avons mis en œuvre un modèle bio-énergétique s'appuyant sur les principes de la théorie des bilans dynamiques d'énergie (DEB). Deux hypothèses apparaissant comme les plus pertinentes ont été testées : (i) une faible disponibilité alimentaire liée à une forte compétition inter et intra-spécifique chez les jeunes albacores formant des bancs et (ii) un changement dans le régime alimentaire des adultes s'accompagnant de la consommation de proies plus énergétiques. Il apparait que ces deux hypothèses sont susceptibles d'expliquer, au moins partiellement, l'accélération de la croissance. / Since the early 1960s, the growth of yellowfin has been enjoyed a particular attention both in the research field and for fisheries management. In the Indian Ocean, the management of yellowfin stock, under the jurisdiction of the Indian Ocean Tuna Commission (IOTC), suffers from much uncertainty associated with the growth curve currently considered. In particular, there remain gaps in our knowledge of basic biological and ecological processes regulating growth. Their knowledge is however vital for understanding the stocks productivity and their resilience abilities to fishing pressure and oceanographic changes underway.Through modelling, this study aims to improve current knowledge on the growth of yellowfin population of the Indian Ocean and thus strengthen the scientific advice on the stock status. Whilst most studies on yellowfin growth only rely on one data source, we implemented a hierarchical Bayesian model that exploits various information sources on growth, i.e. direct age estimates obtained through otolith readings, analyzes of modal progressions and individual growth rates derived from mark-recapture experiments, and takes explicitely into account the expert knowledge and the errors associated with each dataset and the growth modelling process. In particular, the growth model was coupled with an ageing error model from repeated otolith readings which significantly improves the age estimates as well as the resulting growth estimates and allows a better assessment of the estimates reliability. The growth curves obtained constitute a major improvement of the growth pattern currently used in the yellowfin stock assessment. They demonstrates that yellowfin exhibits a two-stanzas growth, characterized by a sharp acceleration at the end of juvenile stage. However, they do not provide information on the biological and ecological mechanisms that lie behind the growth acceleration.For a better understanding of factors involved in the acceleration of growth, we implemented a bioenergetic model relying on the principles of Dynamic Energy Budget theory (DEB). Two major assumptions were investigated : (i) a low food availability during juvenile stage in relation with high intra and inter-specific competition and (ii) changes in food diet characterized by the consumption of more energetic prey in older yellowfin. It appears that these two assumption may partially explain the growth acceleration.

Ces travaux de thèse, consacrés à l'étude et analyse quantitative d'images de phase obtenues par interférométrie à décalage quadri-latéral, ont pour but la caractérisation d'un point de vue métrologique d'un outil de mesure et de ses différentes applications. Cette technique d'interférométrie, développée initialement par la société Phasics pour les marchés de la métrologie optique et de la caractérisation de faisceaux laser essentiellement, peut aussi permettre d'obtenir la cartographie d'un champ électromagnétique complexe grâce à une mesure de front d'onde. En l'utilisant sur un microscope en condition d'imagerie, ont été obtenues des images de l'intensité et de la différence de chemin optique introduite par un échantillon semi-transparent, définissant ainsi une nouvelle technique de contraste de phase quantitatif. La première partie de cette thèse sera consacrée aux techniques en microscopie qui permettent une quantification. Nous verrons les enjeux de l'obtention de ce caractère quantitatif et ce qu'il signifie dans le cadre de différentes techniques utilisant la fluorescence. On étudiera la mesure dans le cadre d'une approximation dite "projective" réalisant certaines hypothèses. On verra quelles sont les grandeurs accessibles grâce à une mesure dans le cadre de cette approximation et quelles applications en biologie peuvent être développées concernant les éléments isotropes dans une première partie et les éléments anisotropes dans une seconde partie.Nous démontrerons la possible transposition de ces applications réalisées en deux dimensions en trois dimensions avec une résolution axiale suffisante permettant une reconstruction tomographique. / The aim of this thesis, dedicated to the study and quantitative analysis of phase images obtained thanks to quadri-wave lateral shearing interferometry, is to caracterize a metrological tool and its three proposed different applications.This work has been done in collaboration between Institut Fresnel (Marseille, France) and Phasics company (Palaiseau, France) and continues that of Pierre Bon who has been in charge the application this technique to microscopy. This interferometric technique, developped by Phasics, for optical metrology and lasers characterization, allows to record complex eletromagnetic field maps thanks to a wave front measurement. By using it in the microscope image plane, one can obtain inetnsity and optical path difference images of a semi-transparent biological sample. this technique is now considered as a new quantitative phase contrast technique.The first part of this manuscript will be a state of the art of quantitative microscopy techniques. The issues of quantification and its meanings in the framework of different fluorescent and phase based techniques will be discussed.A description of the technique that is used and its comparison with similar phase techniques will be done.The measurement, under the projective approximation, is studied leading to different variables. We show different applications concerning isotropic elements in a first part and anisotropic elements in the second one.We show how this measurement is trnasposed to the third dimensions allowing three dimensional imaging and complete reconstruction of refractive index maps of biological samples.

Ces travaux de recherche s’intéressent à la conception de nouvelles méthodologies analytiques destinées à mesurer le bénéfice d’une transplantation hépatique ou bien encore à l’évaluation de nouvelles voies thérapeutiques à l’essai pour des patients atteints de la polyneuropathie amyloïde familiale à transthyrétine (TTR). Cette maladie rare se caractérise par une déstabilisation structurale du tétramère de TTR qui aboutit à l’agrégation de fibrille dans les tissus du système nerveux autonome, au niveau des nerfs périphériques et autour de certains organes dont le cœur. Dans le cadre d’une collaboration entre hospitalo-universitaires, chimistes analystes, électrochimistes, physico-chimistes et technologues, nous nous sommes attachés à développer des séparations en électrophorèse capillaire couplée avec une détection optique de peptides natif et muté qui sont directement associés à une variente de cette maladie rare. La difficulté première de cette recherche concerne le choix même de ces biomarqueurs qui s’est finalement révélé pertinent grâce de la réalisation de cartes peptidiques à partir du sérum. Ensuite deux voies ont été explorées : une séparation électrocinétique avec une détection spectrométrique d’absorbance dans l’ultra-violet et l’autre nécessitant le marquage préalable de peptides par des molécules fluorophores ou fluorogènes pour ensuite faire une séparation en électrophorèse couplée LIF (laser induced fluorescence). Dans les deux cas le critère principal de séparation, la résolution, autorise une quantification et surtout les validations analytiques associées montrent une réelle robustesse des méthodologies développées. L’autre signe encourageant pour la transposition des ces méthodes à l’analyse de prélèvements issus de patients, concerne la limite de quantification qui est inférieure à celle couramment mesuré dans le sérum. La spectrométrie de masse, moyen d’investigation physico-chimique puissant à permis de suivre et de comprendre d’un point vue plus fondamental le produit des réactions de chimie organique de dérivation des peptides par trois marqueurs fluorescents : le TAMRA-SE, le NDA et le FQ. La possibilité de proposer un outil d’analyse miniaturisé et simple d’utilisation pour le monde hospitalier a également été étudiée. Un poste d’analyse sur puce microfluidique permettant l’analyse quantitative et qualitative a été installé pour permettre la réalisation de premiers essais expérimentaux de séparations électrocinétiques sur puce microfluidique. Ces travaux jettent les bases d’une nouvelle voie analytique pour séparer et quantifier les différents biomarqueurs caractéristiques de la polyneuropathie amyloïde familliale à TTR. / The purpose of our work was the development of new analytical methodologies to measure the benefit of liver transplantation and also the evaluation of new therapeutic approaches under testing on patients with Transtyretin (TTR) familial amyloid polyneuropathy. This rare disease is characterized by a structural destabilization of TTR tetramer leading to it’s aggregation into amyloïd fibrils that accumulate in the tissues of the autonomous nervous system, peripheral nerves and around certain organs, including the heart. As part of a collaboration between university, hospital, analytical chemists, electrochemist, physical chemists and technologists, we are committed to develop separations in capillary electrophoresis coupled with optical detection of native and mutated peptides that are directly associated with a variant of this rare disease. The first challenge of this research is the choice of these biomarkers that ultimately proved relevant with the realization of peptide maps from the serum. Then two approaches have been explored: electrokinetic separation with absorbance spectrometric detection in the ultraviolet and the other requiring the prior labeling peptides with fluorescent molecules and then to a separation on electrophoresis coupled with LIF (Laser induced fluorescence). In both cases the main criterion of separation, resolution, allows quantification and especially analytical validations show actual strength associated methodologies developed. Another encouraging sign for the transposition of these methods to the analysis of samples from patients regarding the quantification limit is lower than commonly measured in serum. Mass spectrometry, using physico-chemical investigation powerful allowed to follow and understand a more fundamental viewpoint the product of organic chemistry reactions bypass peptides by three fluorescent dyes: TAMRA-SE, the NDA and FQ. The ability to provide a miniaturized analysis and easy to use tool for the hospital environment was also studied. A post analysis on microfluidic chip for quantitative and qualitative analysis was installed to allow the realization of the first experimental tests of electrokinetic separations on microfluidic chip. These studies lay the foundation for a new analytical way to separate and quantify the different characteristics biomarkers family TTR amyloid polyneuropathy.

Le Sélénium (Se) est un oligo-élément essentiel qui est incorporé dans une famille indispensable de protéines, les sélénoprotéines, sous la forme d’un résidu acide aminé rare, la sélénocystéine. Dans les études épidémiologiques, il apparait clairement que des faibles niveaux de sélénium dans les fluides biologiques sont associés avec (i) une augmentation du risque de cancers (colon, prostate, poumon) et de maladies cardiovasculaires, (ii) une altération de la fonction immunitaire et (iii) finalement une réduction de l’espérance de vie. Dans le génome humain, vingt-cinq gènes de sélénoprotéine ont été identifiés. Ces gènes expriment, de par la complexité de la régulation du génome, de nombreuses isoformes de chacun des 25 gènes pour constituer le sélénoprotéome. Quand la fonction est connue, ces protéines participent à des processus essentiels de défense antioxydante, d’homéostasie redox et de signalisation redox. Ces enzymes sont finement régulées par l’apport en sélénium et d’autres stimuli cellulaires. Pour comprendre la fonction et la régulation du sélénoprotéome humain, qui est exprimé à un niveau trace, il s’avère critique de développer une stratégie innovante basée sur une approche multidisciplinaire de détection et quantification du sélénium par différents outils de spectrométrie de masse élémentaire (ICP MS) et moléculaire (ESI-MS/MS). Tout d’abord, le sélénium possède un profil isotopique bien particulier avec six isotopes stables (74Se, 76Se, 77Se, 78Se, 80Se and 82Se) qui sert de signature dans nos analyses en ICP-MS ou en ESI-MS/MS. En parallèle, l’utilisation de sélénium isotopiquement enrichi permet également des marquages cellulaires en multiplexing. Ainsi, en couplant des méthodes de séparation en phase liquide (HPLC) ou en gel d’électrophorèse (IEF ou SDS-PAGE échantilloné par ablation laser) avec l’ICP MS, nous avons mis au point plusieurs méthodes permettant la détection de plusieurs sélénoprotéines de manière simultanée dans différentes lignées cellulaires. De plus, un médicament sélénié sous forme de triglycéride obtenu via un mélange d’huile de tournesol et de sélénite a été testé comme source de sélénium non toxique pouvant stimuler la production de sélénoprotéines. Plusieurs lignées cellulaires humaines cancéreuses et non-cancéreuses ont été expérimentées avec succès permettant de valider cette nouvelle source de sélénium dans la synthèse des sélénoprotéines. / Selenium (Se) is an essential trace element, which is incorporated as a rare aminoacid, selenocysteine, in twenty five selenoproteins, to constitute the selenoproteome. Selenoprotein family is one of the most important bioactive form of selenium in human health. Initially demonstrated in Kashin Beck and Keshan diseases, selenium deficiency is associated with several pathological conditions, including cancer, neurodegenerative diseases, immune and muscular disorders. Chronic selenium deficiency is hypothesized to decrease antioxidant defenses and redox regulatory pathways through a dysregulation of selenoprotein expression. We are interested in understanding the synthesis and regulation of human selenoproteins, which is critically dependent on the availability of adequate analytical methodology. To understand the function and regulation of human selenoproteome, which is expressed at a trace levels, it appears critical to develop innovative strategies based on a multidisciplinary approach to detect and quantify selenium by various elemental and molecular mass spectrometer tools. First, selenium has a particular isotopic profile with six stable isotope (74Se, 76Se, 77Se, 78Se, 80Se and 82Se) used as a signature in our analysis with ICP-MS or ESI-MS/MS. In parallel, the use of isotopically enriched selenium also allows cellular labelling and tracing of selenoproteins and other seleno-coupounds. By coupling liquid phase separation methods (HPLC) with specific mass spectrometry analytical tools, we have developed several methods for detecting several selenoproteins simultaneously in various human cell lines.