L'objectif de la thèse était d'étudier la dynamique des molécules biologiques in vivo, sur l'échelle de la pico- à la nanoseconde (ps-ns), en combinant la diffusion incohérente de neutrons et le marquage isotopique hydrogène/deutérium.<br /> Les mouvements diffusifs de l'eau ont été explorés dans le cytoplasme d'E. coli. L'étude a établi que la diffusion de l'eau intracellulaire est similaire à celle de l'eau pure, à température physiologique. Ce travail infirme le paradigme établi, selon lequel l'eau cellulaire est fortement ralentie par l'encombrement macromoléculaire.<br /> Les mouvements moléculaires internes et la diffusion globale des macromolécules ont été étudiés in vivo. Les résultats montrent que la proportion d'eau intracellulaire est un facteur déterminant dans la dynamique interne des macromolécules in vivo. L'encombrement macromoléculaire atténue cependant l'effet lubrifiant de l'eau sur les mouvements moléculaires internes. L'étude témoigne du fait que les échantillons standards (poudres et solutions) ne miment pas l'environnement physiologique.<br /> L'effet isotopique du solvant et l'influence de la deutériation sur la dynamique macromoléculaire moyenne, ont été explorés in vivo. Les macromolécules natives sont moins flexibles et moins résilientes en D2O. La deutériation augmente légèrement la flexibilité structurale et diminue faiblement la résilience, ce qui suggère que l'utilisation du marquage isotopique est justifiée pour les études dynamiques.<br /> Ce travail souligne l'importance du contrôle négatif lors des mesures sur des échantillons sélectivement marqués et montre qu'un taux de marquage conséquent (> 10 %) est nécessaire pour observer la dynamique d'un composant spécifique.

Le génome de différents organismes contient près de 30% de séquences codantes pour des protéines membranaires. Celles-ci sont impliquées dans des processus biologiques tels que la signalisation cellulaire, la transduction énergétique ou le transport des métabolites. Cependant, leur étude structurale se heurte souvent aux problèmes de surexpression, ainsi qu'aux différents inconvénients liés à leur extraction de leur environnement natif. Le canal mécanosensible à large conductance MscL d'Escherichia coli est une protéine intrinsèque de la membrane interne de la bactérie. L'activité de cette protéine est fortement dépendante de la membrane ; en effet, le canal s'ouvre lorsque la pression au niveau de la membrane augmente, lors d'un choc hypoosmotique, relarguant de l'eau et différents substrats afin que la bactérie retrouve un état osmotique adéquat à sa survie. Il est donc essentiel de recueillir des données structurales de la protéine dans son environnement natif. Pour cela, nous proposons une étude structurale de la protéine par résonance magnétique nucléaire en phase solide. La surexpression de la protéine et son marquage aux isotopes 13C et 15N sont deux étapes clés d'un tel projet. Une surexpression bactérienne et un marquage uniforme de la protéine ont été effectués. Les données spectrales obtenues montrent une bonne résolution, mais l'imbrication des corrélations ne permet pas d'en extraire des données structurales. Afin de réduire le nombre de résidus marqués, un marquage spécifique a été appliqué par la voie de la synthèse in vitro. Le premier test a montré que l'approche permettait de réduire le temps d'acquisition, tout en diminuant la quantité d'informations. Différentes méthodes ont ensuite été appliquées pour trouver les meilleures combinaisons d'acides aminés à marquer spécifiquement en synthétisant la protéine in vitro. Ces approches utilisent les programmes de prédiction de déplacements chimiques ou l'analyse de la séquence à la recherche de paires d'acides aminés uniques. Une approche combinatoire a été également testée. Les différents échantillons synthétisés ont montré une bonne résolution, et ont permis l'identification de plusieurs corrélations. Les méthodes développées au cours de ce travail pourront aider progressivement à déterminer la structure de la protéine MscL. Elles pourront également servir à d'autres protéines membranaires pour leur étude par résonance magnétique nucléaire.

Les performances de la microscopie biphotonique sont fortement corrélées au développement de marqueurs fluorescents spécifiques. Dans le cadre d'un précédent travail, les dérivés triphénylamines (TP) substitués par des groupements cationiques vinyl-pyridinium, se sont révélés être des candidats particulièrement intéressants : bonne solubilité dans l'eau, taille réduite, photostabilité élevée, forte brillance moléculaire, exaltation de fluorescence en présence d'ADN, émission dans le rouge... L'objectif du travail présenté a consisté à la fois à mieux comprendre l'origine de ces propriétés assez rarement réunies et à explorer les voies d'optimisation potentielles. Dans ce but, nous avons mis en place un banc de microscopie de fluorescence à deux photons résolue en temps. Différents dérivés ont été étudiés de façon à établir des corrélations entre leurs structures et leurs propriétés. De même, différents environnements ont été considérés (tampon, ADN naturel et de synthèse). Nous avons pu mettre en évidence que les dérivés TP interagissent spécifiquement avec l'ADN, vraisemblablement via une insertion dans le petit sillon du double brin d'ADN. Cette insertion entraine une très forte restriction des mouvements intramoléculaires ainsi qu'un changement d'environnement du fluorophore (passage d'un environnement aqueux propice à des effets dits de " quenching" à un environnement organique) : il en résulte, à la fois, une réduction du taux de relaxation non radiative et une augmentation du taux de relaxation radiative. Afin de pouvoir caractériser ces interactions fluorophore-ADN à l'échelle nanométrique, des études complémentaires de microscopie à effet tunnel (STM) sous UHV ont également été entreprises sur ces dérivés. Nous avons par ailleurs essayé de tirer parti des interactions spécifiques TP-ADN pour immobiliser l'ADN sur des substrats d'or atomiquement plans.

Ce travail a pour objet la résolution d'un problème combinatoire posé dans le cadre de la régulation court terme (ou dynamique) du trafic aérien. On cherche à déterminer pour chaque vol régulable une trajectoire en 4 dimensions réalisable de manière à respecter les contraintes de capacité des secteurs tout en minimisant la somme des coûts des trajectoires choisies. Le problème est modélisé par un programme linéaire mixte. Une représentation ad hoc du système aérien sert de support à la modélisation fine des trajectoires. Un processus global de résolution basé sur la génération de colonnes couplée à la technique de branch-and-bound est détaillé. Les colonnes du problème représentant des trajectoires, la génération de colonnes par le sous problème de tarification se traduit par la recherche de chemins quadridimensionnels sur un réseau continu et dynamique. Un algorithme spécifique basé sur les algorithmes de plus court chemin par marquage et sur la programmation dynamique est développé et testé. Toute la méthode est évaluée sur des instances réelles représentant l'espace aérien géré par la CFMU, l'organisme européen de gestion des flux de trafic aérien. Les résultats obtenus en un temps de calcul compatible avec le contexte opérationnel valident finalement la méthode développée.

les insectes saproxylophages forment une part importante de la biodiversité des forêts tempérées et jouent un rôle biogéochimique fondamental en participant à la dégradation du bois mort. Le complexe saproxylique européen est aujourd'hui perturbé par les modifications anthropiques des forêts. De nombreuses espèces de ce complexe sont menacées de disparition et leur conservation nécessite de connaître les causes de leur vulnérabilité. Nous avons étudié l'écologie d'un coléoptère saproxylophage cavicole, Osmoderma eremita, espèce qui se raréfie à l'échelle de son aire de distribution et présente de faibles capacités de dispersion. Nous avons suivi ses populations par capture-recapture et pistage-radio. Des mesures complémentaires ont été réalisées au laboratoire (manège de vol). Nos objectifs étaient d'expliquer la distribution de l'espèce dans un bocage, d'étudier ses capacités de dispersion et d'analyser ses autres caractéristiques démographiques. Nous avons révélé l'influence de l'ouverture du paysage et de la densité de microhabitats sur la présence de l'espèce, avec une préférence pour les zones ayant subi la plus faible perte d'habitat en 60 ans. Nous avons mesuré des capacités de dispersion trois fois supérieures à celles alors relevées in natura. Les capacités des femelles étaient liées à leur condition. Les analyses démographiques ont révélé des sex-ratios biaisées en fonction de la population et de l'année. Nous avons démontré le rôle du sexe dans la démographie de l'espèce, facteur qui devrait intervenir dans les analyses de viabilité. De telles analyses permettent de proposer des mesures de conservation d'O. eremita adaptables à d'autres espèces saproxylophages.

L'objectif est de développer des méthodes permettant de suivre et de quantifier la réactivité chimique de surface à l'échelle micrométrique. Nous proposons une approche optique qui utilise une détection sans marquage basée sur un changement d'indice de réfraction. Le principe repose sur le couplage entre techniques d'imagerie, de microscopie optique et de micro-électrochimie pour étudier et cartographier en temps réel et in situ des processus (électro)chimiques interfaciaux. Les potentialités de ces techniques sont mises en évidence sur un système modèle : l'électrogreffage de films minces organiques sur des surfaces par réduction de sels de diazonium. La réactivité (bio)chimique est étudiée ex situ et in situ sur différentes surfaces d'or : des microélectrodes ou des macroélectrodes décorées par impression par microcontact ou par lithographie. La méthode est intéressante pour examiner la réactivité chimique de diverses molécules immobilisées vis-à-vis de radicaux électrogénérés. Ces microscopies opto-électrochimiques montrent que la microlithographie modifie la réactivité de surface et qu'elle doit donc être réalisée soigneusement quand on cherche à déterminer la réactivité de la surface. Finalement, ces travaux sont appliqués au développement d'une méthode analytique par microscopie électrochimique (SECM) pour détecter des mouvements mécaniques de microleviers suite à un changement de tension de surface.

La technologie de l'électrolyse de la vapeur d'eau à haute température (EVHT) est unesolution alternative à la production d'hydrogène. Le principe est inversé à celui d'une pile àcombustible de type SOFC : on utilise la vapeur d'eau et de l'électricité afin de produire del'hydrogène. Une difficulté technique majeure repose sur la mise au point d'interconnecteursfonctionnant efficacement sur le long terme. Sur le plan électrique, l'interconnecteur doitprésenter une valeur de résistance de contact aux électrodes la plus faible possible, car elleaffecte directement le rendement de conversion électrochimique (eau en hydrogène) et peutpénaliser le procédé. Il ne doit donc pas présenter une cinétique d'oxydation élevée ni formerdes oxydes isolants électriquement. Sur le plan chimique, l'interconnecteur doit être résistantà l'oxydation sous atmosphère riche en oxygène côté anode et riche en vapeur d'eau côtécathode. De plus, le problème de la volatilisation des oxydes de chrome, qui peuvent diffuseret empoisonner les électrodes, déterminant ainsi une réduction de l'activité électrochimique etdes performances du " stack " sur des longues durées de fonctionnement, doit être réduit. Latempérature de fonctionnement comprise entre 700 et 900°C permet l'utilisationd'interconnecteurs métalliques, qui présentent l'avantage d'une mise en oeuvre plus facile etd'un coût plus faible par rapport aux interconnecteurs céramiques.Dans cette étude, deux matériaux ont été testés en tant qu'interconnecteurs pour lessystèmes EVHT : un acier ferritique chromino-formeur K41X et un alliage Fe-Ni-Co necontenant pas de chrome. Le comportement envers la corrosion à haute température et laconductivité électrique des deux alliages ont été évalués à 800°C sous un mélange 95%O2-5%H2O, pour le côté anodique, et 10%H2-90%H2O, pour le côté cathodique. Pour l'alliageK41X, l'effet de l'état initial de la surface des échantillons sur la nature des oxydes formés àhaute température sous mélange H2-H2O a été pris en compte, à travers une comparaison desalliages bruts de laminage avec des surfaces polies miroir. L'effet d'une pré-oxydation decourte durée à 800°C sur le comportement à haute température de l'alliage K41X brut deréception sous atmosphère H2-H2O a également été évalué. Mais, le travail le plus original decette étude a consisté à effectuer des essais de marquage à l'or et des marquages isotopiquessous mélange H216O-H218O, H2-D2O et D2-H2O. Ces tests ont permis d'étudier lesmécanismes responsables de la croissance de la couche de corrosion de l'alliage K41X brut deréception et poli miroir à 800°C sous atmosphère H2-H2O et d'évaluer le rôle de la vapeurd'eau et de l'hydrogène dans le mécanisme d'oxydation

L'analyse quantitative de la fonction contractile myocardique constitue un enjeu majeur pour le dépistage, le traitement et le suivi des maladies cardiovasculaires, première cause de mortalité dans les pays développés. Dans ce contexte, l'Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) s'impose comme une modalité privilégiée pour l'exploration dynamique du coeur, renseignant, d'une part, sur l'évolution des parois (ciné IRM), et permettant, d'autre part, d'accéder à des informations cinématiques au sein du myocarde (IRM de marquage). L'exploitation quantitative de ces données est néanmoins actuellement limitée par la quasi-absence de méthodologies fiables, robustes et reproductibles d'estimation de mouvement non rigide à partir de séquences d'images acquises dans cette modalité. Cette thèse se propose de démontrer que les techniques de recalage non rigide statistique constituent un cadre approprié pour l'estimation des déformations myocardiques en IRM, leur quantification à des fins diagnostiques, et leur modélisation en vue d'établir une référence numérique de normalité. <br /><br />Ses contributions concernent :<br />- l'élaboration d'une méthode robuste non supervisée d'estimation des déplacements myocardiques à partir de séquences d'IRM de marquage. Elle permet l'obtention de mesures de mouvement fiables en tout point du myocarde, à tout instant du cycle cardiaque et sous incidence de coupe arbitraire.<br />- le développement d'un outil de quantification dynamique des déformations à l'échelle du pixel et du segment myocardique, intégrant une étape de segmentation automatique du coeur par recalage d'images ciné IRM acquises conjointement aux données de marquage. Pour le coeur sain, la comparaison des mesures obtenues à des valeurs de référence issues d'une synthèse approfondie de la littérature médicale démontre une excellente corrélation. Pour des coeurs pathologiques, les expériences menées ont montré la pertinence d'une analyse quantitative multiparamétrique pour localiser et caractériser les zones atteintes.<br />- la construction d'un modèle statistique (atlas) de contraction d'un coeur sain. Cet atlas fournit des modèles quantitatifs de référence locaux et segmentaires pour les paramètres de déformation. Son intégration, en tant que modèle de mouvement, au processus de recalage des données d'IRM de marquage conduit en outre à une description très compacte des déplacements myocardiques sans perte de précision notable.

Depuis son isolement en 1977, les épidémies de pneumopathies à Legionella pneumophila (Lp) sont en constante progression. La contamination se fait essentiellement par inhalation d'aérosols contaminés, générés à partir de l'eau des réseaux de distribution. L'écologie de Lp est complexe, faisant intervenir des protozoaires dans lesquels elle se multiplie et des biofilms dans lesquels elle persiste à l'état viable mais non cultivable.<br />L'objectif de ce travail était de mieux comprendre cette écologie. Des incubateurs permettant le prélèvement de biofilm ont été installés in situ dans un réseau, la colonisation en eau froide et en eau chaude a été suivie pendant 1 an. Par ailleurs, un pilote reproduisant un réseau intérieur permis de comparer l'efficacité de différents traitements de désinfection. Enfin, la recherche de molécules auto-inductrices qui pourraient expliquer l'exacerbation de la virulence lors de la multiplication intra-cellulaire a été menée dans différentes conditions.<br />Les incubateurs ont permis l'amplification de la quantité de légionelles, rendant possible la détection par culture en eau froide et entraînant une stabilisation de la population en eau chaude. L'utilisation de sondes spécifiques n'a pas permis d'améliorer la détection dans les biofilms.<br />Lors des essais sur pilote, les populations des biofilms ont été analysées grâce à des méthodes moléculaires (FISH, marquage de vitalité) et par culture. Le classement des traitements par ordre d'efficacité décroissante est le suivant : dioxyde de chlore > chlore > ozone > monochloramine > cuivre-argent. Seul le dioxyde de chlore montre une activité résiduelle dans les bras morts rincés quotidiennement avec de l'eau traitée. Les amibes résistent aux traitements, et Lp retrouve son niveau de population initial quelques jours seulement après leur interruption.<br /> Enfin, aucune sécrétion d'auto-inducteur n'a été mise en évidence, et l'incubation de Lp avec ces molécules ne semble pas modifier l'invasion des amibes.

L’entérotoxine B staphylococcique (SEB) est une toxine entérique hautement résistante à la chaleur et est responsable de plus de 50 % des cas d’intoxication d’origine alimentaire par une entérotoxine. L’objectif principal de ce projet de maîtrise est de développer et valider une méthode basée sur des nouvelles stratégies analytiques permettant la détection et la quantification de SEB dans les matrices alimentaires. Une carte de peptides tryptiques a été produite et 3 peptides tryptiques spécifiques ont été sélectionnés pour servir de peptides témoins à partir des 9 fragments protéolytiques identifiés (couverture de 35 % de la séquence). L’anhydride acétique et la forme deutérée furent utilisés afin de synthétiser des peptides standards marqués avec un isotope léger et lourd. La combinaison de mélanges des deux isotopes à des concentrations molaires différentes fut utilisée afin d’établir la linéarité et les résultats ont démontré que les mesures faites par dilution isotopique combinée au CL-SM/SM respectaient les critères généralement reconnus d’épreuves biologiques avec des valeurs de pente près de 1, des valeurs de R2 supérieure à 0,98 et des coefficients de variation (CV%) inférieurs à 8 %. La précision et l’exactitude de la méthode ont été évaluées à l’aide d’échantillons d’homogénat de viande de poulet dans lesquels SEB a été introduite. SEB a été enrichie à 0,2, 1 et 2 pmol/g. Les résultats analytiques révèlent que la méthode procure une plage d’exactitude de 84,9 à 91,1 %. Dans l’ensemble, les résultats présentés dans ce mémoire démontrent que les méthodes protéomiques peuvent être utilisées efficacement pour détecter et quantifier SEB dans les matrices alimentaires. Mots clés : spectrométrie de masse; marquage isotopique; protéomique quantitative; entérotoxines / Staphylococcal enterotoxin B is a highly heat-resistant enteric toxin and it is responsible for over 50% of enterotoxin food poisoning. It represents a particular challenge during food processing since, even if the bacteria have been destroyed, the biological activity of the toxin remains unchanged. The objective of this study was to develop and validate a new method based on a novel proteomic strategy to detect and quantify SEB in food matrices. Tryptic peptide map was generated and 3 specific tryptic peptides were selected and used as surrogate peptides from 9 identified proteolytic fragments (sequence coverage of 35%). Peptides were label with light and heavy form of acetic anhydride to create an isobaric tag that will allow quantification. The linearity was tested using mixtures of different molar ratios and the results showed that measurements by LC-MS/MS were within generally accepted criteria for bioassays with slope values near to 1, values of R2 above 0.98 and less than 8% coefficient of variation (%CV). The precision and accuracy of the method were assessed using chicken meat homogenate samples spiked with SEB at 0.2, 1 and 2 pmol/g. The results indicated that the method can provide accuracy within 84.9 – 91.1% range. Overall, the results presented in this thesis show that proteomics-based methods can be effectively used to detect, confirm and quantify SEB in food matrices. Keywords: mass spectrometry; stable isotope labeling; quantitative proteomics; enterotoxins