INTRODUCTION Estrogen is implicated as an important factor in stimulating breast cancer cell proliferation, and presence of estrogen receptor (ER) is an indication of a good prognosis in breast cancer patients. Mcl-1 is an anti-apoptotic Bcl-2 family member that is often overexpressed in breast tumors, correlating with poor survival. Estrogen has been previously shown to regulate Bcl-2 family members, leading to an evasion of apoptosis, however the role of estrogen in regulating Mcl-1 expression is unclear. I hypothesize that estrogen increases the expression of anti-apoptotic gene Mcl-1 through binding of ERα to a half estrogen response element (ERE) site within the promoter of Mcl-1 gene. This leads to increased Mcl-1 expression in breast cancer cells, ultimately contributing to an evasion of apoptosis. METHODS Four distinct breast cancer cell lines: MCF-7 and ZR-75, which both express ERα, and SKB-BR-3 and MDA-MB-231, which do not express ERα, to investigate the role of estrogen plays in regulating Mcl-1 expression. Cells were grown in serum-starved white media with charcoal-stripped FBS for five days prior to treatment with estrogen. Cells were treated with ERα antagonists Tamoxifen and Fulvestrant in combination with estrogen. Also, siRNA knockdown of ERα was performed and mRNA expression was evaluated. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) was used to investigate if ERα binds to a specific ERE halfsite within the Mcl-1 promoter. To further validate this data, a streptavidin pull-down assay was performed using a biotinlabeled probe specific to this region. RESULTS In ERα positive cell lines, estrogen treatment increased Mcl-1 expression at both the protein and mRNA level. In two ERα negative cell lines, SK-BR-3 and MDA-MB-231, estrogen failed to increase in Mcl-1 protein expression. ERα antagonists decreased estrogen mediated Mcl-1 expression at both the protein and message level. Upon knockdown of ERα, Mcl-1 mRNA expression after estrogen treatment was also decreased. ChIP showed an enrichment of ERα to the Mcl-1 promoter at a region 3683 bp upstream of the translation start site containing a half ERE site. Streptavidin-pull down assay showed both ERα and transcription factor Sp1 bind to this region and mutation of the half ERE site eliminated this binding. CONCLUSIONS These results suggest that estrogen is involved in regulating Mcl-1 expression specifically through a mechanism involving ERα. Ultimately, a better understanding of the role of estrogen in regulating Mcl-1 expression will determine whether Mcl-1 is a valid molecular target for breast cancer therapy.

Myeloid Cell Leukemia-1 (Mcl-1) is a widely expressed anti-apoptotic member of the Bcl-2 family that is elevated in a variety of tumour types including breast cancer. Mcl-1 promotes tumour cell survival and drug resistance and was a mechanism of resistance to first generation Bcl-2 family inhibitors. To determine the significance of Mcl-1 in breast cancer, we evaluated the regulation of Mcl-1 by signalling via the epidermal growth factor receptors (EGFRs). EGFR signalling is frequently deregulated in breast cancer and leads to increased proliferation and survival of tumour cells. We aimed to determine whether Mcl-1 is a critical downstream effector of this pathway and therefore an important therapeutic target. We found that Mcl-1 protein and messenger RNA levels were rapidly induced upon stimulation of breast cancer cells with epidermal growth factor. This induction was blocked by inhibitors of the Ras/Raf/Mek/Erk signalling cascade and was dependent upon activation of the transcription factor Elk-1. We found Mcl-1 to be an essential survival protein, as targeted knock-down with small interfering RNA alone was sufficient to induce apoptosis. Mcl-1 may be critical for the survival advantage conferred by EGFR activation, as prevention of its up-regulation by Mek/Erk inhibitors significantly reduced the drug resistance conferred by EGF. Furthermore, we found a correlation between phosphorylated Elk-1 and Mcl-1 protein levels in breast tumour samples. Therefore, we conclude that Mcl-1 is an important downstream effector of survival and drug resistance mediated by elevated EGF signalling, making it an important therapeutic target in breast cancer.

Yes / Although the ability of bioactive lipid sphingosine-1-phosphate (S1P) to positively regulate anti-apoptotic/pro-survival responses by binding to S1P1 is well known, the molecular mechanisms remain unclear. Here we demonstrate that expression of S1P1 renders CCL39 lung fibroblasts resistant to apoptosis following growth factor withdrawal. Resistance to apoptosis was associated with attenuated accumulation of pro-apoptotic BH3-only protein Bim. However, although blockade of extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation could reverse S1P1-mediated suppression of Bim accumulation, inhibition of caspase-3 cleavage was unaffected. Instead S1P1-mediated inhibition of caspase-3 cleavage was reversed by inhibition of phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) and protein kinase C (PKC), which had no effect on S1P1 regulation of Bim. However, S1P1 suppression of caspase-3 was associated with increased expression of anti-apoptotic protein Mcl-1, the expression of which was also reduced by inhibition of PI3K and PKC. A role for the induction of Mcl-1 in regulating endogenous S1P receptordependent pro-survival responses in human umbilical vein endothelial cells was confirmed using S1P receptor agonist FTY720- phosphate (FTY720P). FTY720P induced a transient accumulation of Mcl-1 that was associated with a delayed onset of caspase-3 cleavage following growth factor withdrawal, whereas Mcl-1 knockdown was sufficient to enhance caspase-3 cleavage even in the presence of FTY720P. Consistent with a pro-survival role of S1P1 in disease, analysis of tissue microarrays from ER þ breast cancer patients revealed a significant correlation between S1P1 expression and tumour cell survival. In these tumours, S1P1 expression and cancer cell survival were correlated with increased activation of ERK, but not the PI3K/PKB pathway. In summary, pro-survival/anti-apoptotic signalling from S1P1 is intimately linked to its ability to promote the accumulation of pro-survival protein Mcl-1 and downregulation of pro-apoptotic BH3-only protein Bim via distinct signalling pathways. However, the functional importance of each pathway is dependent on the specific cellular context. / Diabetes UK; British Heart Foundation

La leucémie lymphoïde chronique (LLC), hémopathie lymphoïde fréquente, se caractérise par une évolution clinique extrêmement variable. Bien que les marqueurs de pronostic soient nombreux dans la LLC, aucun n'est univoque. Dans ce contexte, identifier de nouveaux facteurs prédictifs et comprendre la pathophysiologie de marqueurs pronostiques déjà établis constituent deux objectifs importants pour améliorer la prise en chargethérapeutique de cette hémopathie. Nous avons tout d'abord choisi d'étudier la valeur pronostique et les mécanismes de régulation de l'expression du gène anti-apoptotique MCL1. Nous avons montré que l'expression de MCL1 est un marqueur prédictif de la survie globale parmi l'ensemble despatients et parmi les stades précoces ; ce marqueur est également prédictif de la survie sans traitement des patients en stade A. Ainsi, l'expression de MCL1 permet d'identifier précocement les formes de LLC à haut risque et faible risque d'évolution défavorable. Nous avons également démontré que l'expression de MCL1 est fortement corrélée à l'expression de VEGF, confirmant le rôle de cette voie de signalisation dans la survie des lymphocytes tumoraux et suggérant que VEGF pourrait réguler positivement l'expression de MCL1 selon un mode autocrine. Nous avons ensuite exploré la fonction télomérique en rapport avec les anomalies chromosomiques à valeur pronostique, reflets de l'instabilité génomique. Notre travail a contribué à démontrer la relation entre l'instabilité génomique et le statut télomérique, évalué par la longueur des télomères et l'expression de hTERT et des gènes du complexe shelterin. Nous avons ainsi mis en évidence trois groupes de patients présentant des profilscytogénétiques et télomériques distincts : le premier groupe combine une cytogénétique favorable, des télomères longs, une expression faible ou absente de hTERT et une expression forte des gènes du complexe shelterin ; le troisième groupe se caractérise par de multiples aberrations chromosomiques (notamment délétions 17p et 11q), une augmentation de l'expression de hTERT et une diminution de la longueur des télomères et des niveaux d'expression de TRF1, TRF2 et POT1 ; le deuxième groupe est intermédiaire. Ces résultats confirment l'existence d'un lien entre statut télomérique et instabilité génomique au cours de la LLC et soulignent le rôle de la perte de TP53 ou ATM dans cette dysfonction télomérique. L'altération du statut télomérique est par ailleurs associée à des caractéristiques de pronostic défavorable, comme l'absence de mutation des IgVH, l’expression de CD38 et le doublement rapide de la lymphocytose. Enfin, nous avons évalué l’intérêt de la technique de MLPA pour la mise en évidence des anomalies cytogénétiques récurrentes à valeur pronostique de la LLC. Nous avons montré qu'il existe une bonne concordance entre la technique de référence et la MLPA, qui constitue une approche rapide et peu coûteuse pour la recherche d'anomalies génomiques présentes dans une majorité de cellules malignes. Nous avons cependant mis en évidence des cas intéressants de faux-positifs et de faux-négatifs avec la MLPA, indiquant que cette méthode ne peut pas remplacer les techniques classiques, mais constitue une approche complémentaire permettant une évaluation simultanée de divers déséquilibres. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a frequent lymphoid hemopathy characterized by an extremely variable clinical course. Although there are numerous prognostic markers in CLL, none is univocal. In this context, identifying new predictive factors and understanding the pathophysiology of previously established prognostic markers represent two important aims to improve therapeutic management of this hemopathy. We first chose to study the prognostic value and mechanisms of regulation of antiapoptotic MCL1 gene expression. We showed that MCL1 expression is a predictive marker of overall survival within the whole patient cohort and among early stages; this marker is also a predictor of treatment free survival of stage A patients. Thus, MCL1 expression allows early identification of CLL forms with high risk and low risk of unfavourable evolution. We alsodemonstrated that MCL1 expression is strongly correlated to VEGF expression, confirming the role of this signalling pathway in tumour lymphocytes survival and suggesting that VEGF may be a positive autocrine regulator of MCL1 expression. We then explored telomeric function regarding prognosis-related chromosomal anomalies, reflecting genomic instability. Our work contributed to demonstrate the relationship between genomic instability and telomeric status, evaluated by telomere length and expression of hTERT and shelterin complex genes. We described three groups of patients with distinct cytogenetic and telomeric profile: first group combines good-prognosis cytogenetics, long telomeres, low or negative hTERT expression and high expression of the shelterin complex genes; third group displays multiple chromosome aberrations (particularly 17p and 11q deletions), increased hTERT expression and decreased telomere length and TRF1, TRF2 and POT1 expression levels; second group is intermediate. These results confirm the relationship between telomeric status and genomic instability in CLL and underline the role of TP53 or ATM loss in this telomeric dysfunction. The alteration of telomeric status is also associated with poor-prognosis features, such as unmutated IgVH, CD38 expression and rapid lymphocytosis doubling time. Finally, we evaluated the contribution of MLPA approach for detection of recurrent prognosis-related cytogenetic anomalies. We found a good concordance between the goldstandard technique and MLPA, which represent a time and cost-effective approach for the detection of genomic aberrations affecting most malignant cells. We however described interesting MLPA false-positive and false-negative cases, indicating that this method may not replace classic techniques, but may constitute a complementary approach allowingsimultaneous evaluation of various imbalances.

La Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC) est caractérisée par l’accumulation dans le sang de lymphocytes B/CD5+ qui sont déficients pour leur programme de mort apoptotique. Malgré les progrès thérapeutiques récents, la LLC est une maladie toujours incurable. La stratégie de rétablissement des processus apoptotiques semble pertinente pour améliorer les traitements des patients, et cette stratégie nécessite l’identification de cibles spécifiques. Dans ce but, nous avons développé une recherche du mécanisme d’action de l’hyperforine, un phloroglucinol purifié à partir de la plante Millepertuis, qui est un inducteur d’apoptose des cellules de LLC ex vivo par la voie mitochondriale dépendante des caspases. Les résultats montrent que le traitement des cellules primaires de LLC régule positivement Noxa, une protéine de la famille Bcl-2 du type « BH3-only » qui est un ligand antagoniste spécifique de Mcl-1, la protéine de survie majeure pour le défaut d’apoptose dans les LLC. Nous montrons que Noxa interagit effectivement avec Mcl-1, ce qui entraine la dissociation du complexe que Mcl-1 forme avec Bak, et l’activation de cette protéine responsable de la libération par la mitochondrie des facteurs d’activation des caspases. La régulation positive de Noxa ne résulte apparemment pas d’une activation transcriptionnelle mais plutôt d’une régulation au niveau protéique comme le suggère la capacité de l’hyperforine à inhiber l’activité protéolytique du protéasome dans les cellules de LLC. Par ailleurs, l’apoptose induite par l’hyperforine est réduite en partie par l’extinction de Noxa avec des ARN interférents. Nos résultats indiquent donc que la régulation positive de Noxa est un des mécanismes qui permet à l’hyperforine de déclencher l’apoptose des cellules de LLC. Ce mécanisme semble être commun à d’autres composés d’origine végétale, comme nous l’avons observé avec l’extrait M2Yn dans la seconde partie de notre travail qui a permis de mettre en évidence que cet extrait de plantes d’Asie centrale est capable lui aussi d’induire l’apoptose des cellules de LLC par la voie mitochondriale dépendante des caspases. Enfin, nous avons contribué à la mise en évidence des propriétés pro-apoptotiques de l’hyperforine dans un autre modèle de leucémie, la leucémie myéloïde aiguë, grâce en partie à la régulation positive de Noxa ainsi qu’à l’inhibition de l’activité kinasique de Akt-1.En conclusion, nos travaux de thèse décrivent des nouvelles étapes dans le mécanisme d’action de l’hyperforine et permettent d’établir que la protéine « BH3-only » Noxa est une cible majeure pour la stratégie thérapeutique du rétablissement d’apoptose dans les LLC, ce qui devrait susciter le développement de nouveaux agents capables d’imiter spécifiquement l’action de Noxa. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by blood accumulation of CD5+/B lymphocytes which are deficient in their apoptotic program. Despite recent therapeutic advances, CLL remains an incurable disease. Treatment strategy based on the re-establishment of apoptotic processes has retained much attention, and such a strategy requires the identification of specific targets. To this aim, we have investigated the mechanism of action of hyperforin, a phloroglucinol purified from St John’s wort, capable of inducing apoptosis of CLL cells ex vivo via the caspase-dependent mitochondrial pathway. Our results show that treatment of CLL patients’ cells upregulates the BH3-only protein Noxa that is a specific antagonist ligand of Mcl-1, the crucial prosurvival protein for apoptosis deficiency in CLL. We find that hyperforin provokes both the interaction of Noxa with Mcl-1 and the dissociation of Mcl-1/Bak complex, leading to Bak activation responsible for the release of apoptogenic factors from mitochondria. Noxa upregulation does not seem to result from transcription activation but rather from a regulation at the protein level, as suggested by the ability of hyperforin to inhibit proteasome activity in CLL cells. Using siRNA, Noxa silencing partially reduces hyperforin-induced apoptosis. Our data indicate that Noxa upregulation is one of the mechanisms through which hyperforin triggers CLL cell apoptosis. This mechanism appears to be shared with other plant-derived compounds, as observed with M2Yn, an extract from central Asia plants, that we show here to be an inducer of apoptosis in CLL cells by activating the caspase-dependent mitochondrial pathway. Finally, we have participated in highlighting the proapoptotic properties of hyperforin in another leukemia model, acute myeloid leukemia, via in part Noxa upregulation and Akt1 kinase activity inhibition.In conclusion, our data describe new steps in the mechanism of action of hyperforin and favor that the BH3-only protein Noxa is a major target for the therapeutic strategy based on apoptosis induction in CLL. Thus, this thesis should prompt the development of new BH3 mimetics specific for Noxa.

L'apoptose, appelée aussi mort cellulaire programmée, est un processus physiologique qui permet d'éliminer les cellules endommagées ou superflues lors du développement cellulaire. Le phénomène d'échappement à l'apoptose est une caractéristique fondamentale d'une cellule cancéreuse. Une des voies d'induction principale de l'apoptose est contrôlée par la famille des protéines Bcl-2 qui comprend des protéines pro-apoptotiques (comme Bak ou Bid) et des protéines anti-apoptotiques (comme Bcl-xL, Bcl-2 et Mcl-1). Dans de nombreux cancers, certaines protéines anti-apoptotiques de cette famille sont surexprimées ce qui induit une inhibition de l'apoptose et une résistance aux traitements classiques. Cette famille de protéines est une cible stratégique et prometteuse pour développer une nouvelle classe d'agents anticancéreux. Notre équipe a entrepris un criblage d'extraits bruts de plantes d'origine géographique variée sur l'interaction Bcl-xL/Bak. Cette étude préliminaire a conduit à la caractérisation de la meiogynine A, un sesquiterpène dimère isolé des écorces de Meiogyne cylindrocarpa, une plante de Malaisie. Ce composé est un inhibiteur naturel de l'interaction entre Bcl-xL et le peptide Bak et entre Mcl-1 et le peptide Bid. La synthèse totale de la meiogynine A a été développée dans l'équipe et repose sur une cycloaddition de Diels-Alder entre un triène et un diénophile. Deux analogues de 1ère génération, où le cyclohexane a été remplacé par un cycle aromatique, ont été synthétisés et ont montré une bonne activité in vitro et in cellulo. Cependant, la cycloaddition de Diels-Alder est très longue. Dans un premier temps, afin d'améliorer la réactivité des triènes cibles et d'effectuer des relations structure activité au niveau de la partie "Sud" de la meiogynine A, la synthèse de triènes chlorés originaux diversement fonctionnalisés au niveau de la partie aromatique a été réalisée. Deux diénophiles différents ont également été synthétisés en vue de modifier la partie "Est" de la meiogynine A. Plusieurs analogues ont ainsi été obtenus et ont été évalués biologiquement sur les protéines anti-apoptotiques Bcl-xL et Mcl-1 sur des tests in vitro. Dans un deuxième temps, des études préliminaires de l'interaction protéine/ligand ont été commencées en synthétisant deux sondes photoactivables. / Apoptosis, or programmed death, is used by multicellular organisms to regulate tissue homeostasis through the elimination of useless or potentially harmful cells. One of the main apoptotic pathways is controlled by the Bcl-2 family of proteins. These proteins are divided into pro-apoptotic members (as Bak or Bid) and anti-apoptotic members (as Bcl-xL, Mcl-1 or Bcl-2). In some cancers, they are often overexpressed in many kinds of cancer or are involved in the resistance to chemotherapy. Targeting these proteins is a highly promising strategy for anticancer therapy that has emerged over the last decades. Our team underwent a bioassay-guided screening of various plants extracts. A few years ago, meiogynin A, a dimeric sesquiterpenoid was isolated from a Malaysian tree bark using a bioassay-guided screening. This compound is a natural bcl-xL and Mcl-1 inhibitor. Total synthesis of meiogynine A was developped by our team and the final step is a Diels-Alder cycloaddition reaction between a triene and a dienophile. Then, the synthesis of two anlogues was performed, where the cyclohexane is replaced by an aromatic, and they shown a good biological activity in vitro and in celullo. Nevertheless, the Diels-Alder reaction is very slow. In order to improve triene reactivity and to perform structure activity relationship in the south part of meiogynine A, the synthesis of various original chlorinated triene functionnalized in the aromatic was realised. Two differents dienophiles was synthesized in order to modify the east part of the molecule. Several analogues were obtained et were evaluated on Bcl-xL and Mcl-1 proteins.Also, preliminary studies on protein/ligand interaction was started by the synthesis of two photoactivable probes.

La mitochondrie joue un rôle capital dans la mort cellulaire programmée ou apoptose par l’intermédiaire des protéines de la famille Bcl-2. Le dérèglement de l'apoptose dans de nombreux cancers fait de cette voie et des protéines de la famille Bcl-2 des cibles prometteuses pour la thérapie anti-cancéreuse. Le développement de petites molécules ciblant les protéines de la famille Bcl-2 s’est toutefois révélé être un grand défi, et peu d’entre elles ont atteint des études de phase clinique. Cependant, depuis une quinzaine d’années, grâce à des approches variées et souvent innovantes, des composés très actifs ont été développés. Plusieurs composés sont actuellement en essais clinique et une molécule, le venetoclax, a obtenu la première autorisation de mise sur le marché en avril 2016. Ce succès thérapeutique démontre que les protéines de la famille de Bcl-2 sont des cibles potentielles pour la thérapie anticancéreuse.Les substances naturelles sont une source importante de nouvelles molécules à structures originales, et de nombreux médicaments utilisés actuellement en chimiothérapie sont d’origine naturelle. La meiogynine A est un triterpène dimère qui a été isolé et synthétisé dans notre équipe. Ce composé possède une activité inhibitrice duale des protéines anti-apoptotiques Bcl-xL et Mcl-1. Des analogues de première et deuxième génération ont été élaborés par la suite, parmi lesquels, certains présentent une activité duale sub-micromolaire. Contrairement aux analogues de première génération, ces composés ne sont cependant pas cytotoxiques, probablement en raison de la présence d’une fonction ester sur la chaine latérale qui peut s’hydrolyser en un métabolite inactif.Mon projet de thèse vise à élaborer des analogues de troisième génération de la meiogynine A possédant une activité inhibitrice multiple sub-micromolaire des protéines anti-apoptotiques Bcl-xL, Mcl-1, Bcl-2 et cytotoxiques sur des lignées cellulaires surexprimant ces mêmes protéines. Pour cela, un essai biologique de mesure d’inhibition de l’interaction Bcl-2/Bim a été mis en place et robotisé afin d’évaluer l’activité biologique des composés synthétisés. De plus, la voie de synthèse bioinspirée d’un précurseur commun des nouveaux analogues a été mise au point à l’échelle de plusieurs grammes. Ce précurseur a permis d’élaborer différents analogues de troisième génération de la meiogynine A en réalisant des pharmacomodulations sur la chaîne latérale afin de remplacer la fonction ester des analogues de deuxième génération par un groupement stable et résistant in cellulo. Différentes séries ont été envisagées (alcènes, amines, amides, carbamates et triazoles). L’activité biologique des composés synthétisés a été évaluée sur les trois cibles in vitro. Finalement, des analyses de cytotoxicité pour les analogues les plus actifs ont été réalisées par nos collaborateurs à l’Institut Gustave Roussy. / Apoptosis is used by multicellular organisms to regulate tissue homeostasis through the elimination of useless or potentially harmful cells. The key players of apoptosis are caspases, a family of proteases whose activation is induced by two major signalling pathways. One of these pathways (the intrinsic pathway) is regulated by the Bcl-2 family of proteins. In recent years, numerous studies have shown that overexpression of the antiapoptotic Bcl-2, Bcl-xL or Mcl-1 proteins is involved in the development of many kinds of cancers or confers resistance to apoptosis induced by standard anticancer therapies. Consequently, targeting this family of proteins is a highly promising strategy for tumour treatment.The feasibility of disrupting protein-protein interactions between anti- and pro-apoptotic members of the Bcl-2 family, using small-molecule inhibitors has been successfully established, and venetoclax was the first to obtain the FDA authorisation in April 2016 as an inhibitor of anti-apoptotic proteins of Bcl-2.Natural products are still playing a significant role in drug discovery and development process. Thus, from the 1940’s to date, 75% of the 175 small molecules used in cancer therapy, are either natural products or derivatives of natural compounds. Screening of plant extracts, marine organisms or microorganisms can provide highly original and functionalized bioactive molecules that are unlikely obtained by screening synthetic libraries. In fact, structural complexity is often a criterion of specificity for biological target.Meiogynin A is an original molecule isolated from a Malaysian Annonaceae and synthesized in our team in 2009. It exhibited a promising inhibitory activity of Bcl-2, Bcl-xL and Mcl-1, three anti-apoptotic proteins of Bcl-2 family whose overexpression is correlated with many cancers. 1st- and 2nd-generation analogs were further elaborated. Despite their remarkable affinity towards target proteins, 2nd-generation analogs lacked cytotoxicity, probably due to the presence of an ester linker that could undergo competitive hydrolysis in cellulo, leading to an inactive metabolite.We aim to develop 3rd-generation analogues of meiogynine A exhibiting high affinity towards multiple anti-apoptotic members of Bcl-2 family as well as cytotoxicity on cancer cells that overexpress these proteins. For this, a new fluorescence polarization inhibition test for Bcl-2/Bim interaction has been implemented, and meiogynine A and its analogues have been tested against the new interaction. In addition to Bcl-xL/Bak and Mcl-1/Bid interaction inhibition, these molecules showed an ability to inhibit Bcl-2/Bim interaction. Thus, they are considered multiple inhibitors.3rd-generation analogues of meiogynine A were obtained by pharmacomodulation of a common precursor that was synthesized on a gram-scale through a bioinspired Diels-Alder reaction. Several functional groups that have better stability in vivo than the ester group were anticipated, such as the amines, amides, carbamates and triazoles. Biological activity of the synthesized analogues was evaluated, and those presenting the best inhibitory profile were evaluated in cellulo by our collaborators in the Institut Gustave Roussy.

Chlamydien durch die Modulation spezifischer Wirtszellproteine verschiedene Wege der Apoptose verhindern können. Mcl-1 und cIAP-2 erwiesen sich als bedeutende Faktoren, die durch die Infektion hochreguliert und absolut notwendig für die Inhibierung der Apoptose durch Chlamydien waren. Hochregulation der Mcl-1 Expression führte zu einem Block im apoptotischen Weg oberhalb der Mitochondrien. cIAP-2 zusammen mit anderen Inhibitor of Apoptosis Proteins (IAP) verhinderten die Aktivierung von Caspase-3, denfinalen Schritt in der apoptotischen Kaskade. Weiterhin wurde beobachtet, dass die Aktivierung des MAPKinase-Signalweges durch die Infektion wichtig war für die Hochregulierung von Mcl-1 und cIAP-2. Ein Hochdurchsatz-Screen wurde durchgeführt, um andere Wirtszellfaktoren, die für die Apoptoseinhibierung durch die Chlamydien verantwortlich sind, zu identifizieren. Neben Mcl-1 waren die identifizierten Faktoren hauptsächlich Mitglieder des MAPKinase-Signalweges. Dabei wurde deren Rolle für die Apoptoseresistenz bestätigt. Eine weiterführende Analyse der im Screen ermittelten Faktoren identifizierte eine Funktion von HIF-1a bei der Modulation der Expression anti-apoptotischer Faktoren während der Infektion. Es wurde beobachtet, dass HIF-1a stabilisiert und zum Nukleus transloziert wird. Es ist bekannt, dass HIF-1a HIF-1a im Nukleus binden kann, um den funktionalen Transkriptionsfaktor HIF zu bilden. Dieser reguliert die Expression verschiedener Überlebensfaktoren, unter anderem Mcl-1. HIF-1a Knockdown inhibierte die Chlamydien-induzierte Hochregulation von Mcl-1 mRNA-Expression. / chlamydial infection blocked the apoptotic pathway at multiple levels by modulation of specific host cell proteins. Mcl-1 and cIAP-2 were two most prominent factors that were up-regulated during the infection, and absolutely required for apoptosis inhibition. Increased expression of Mcl-1 led to a block in the apoptotic pathway upstream of the mitochondria. cIAP-2, together with other inhibitor of apoptosis proteins (IAPs), blocked the activation of caspase-3 at the final step of the apoptosis cascade. Further, it was observed that the activation of the MAPK pathways during infection was needed for the up-regulation of Mcl-1 and cIAP-2. A high throughput RNAi screen was performed to identify other host factors required for the apoptosis resistance during the infection. Besides Mcl-1, the targets from the screen prominently included members of the MAPK pathways, confirming their role in the apoptosis resistance. Pathway analysis of the targets identified the role of HIF-1a in modulating the expression of the anti-apoptotic factors during infection. It was observed that during infection, HIF-1a gets stabilized and translocates to the nucleus. It is known that HIF-1a can bind to HIF-1a in the nucleus to form the functional transcription factor HIF, which can regulate the expression of survival factors like Mcl-1. This was seen to be the case, because knock down of HIF-1a abrogated the infection induced up-regulation of Mcl-1 at the mRNA levels.

Les lymphomes non hodgkiniens (LNH) regroupent un panel hétérogène de pathologies originaires de cellules lymphatiques. Parmi les LNH à cellules B matures, la leucémie lymphoïde chronique (LLC) constitue la forme de leucémie de l’adulte la plus fréquente en Occident. La physiopathologie des LNH à cellules B matures est marquée par l’inhibition des mécanismes de la mort cellulaire, notamment via la surexpression de la protéine MCL-1. Une première partie de ce travail de thèse a été de déterminer quelles pouvaient être les enzymes de déubiquitination (DUBs) impliquées dans la survie des LNH à cellules B matures et la stabilisation de MCL-1. Notre étude a permis d’identifier la DUB USP14, qui est liée au système ubiquitine-protéasome, comme capable de réguler MCL-1 et la survie cellulaire. Nos travaux montrent également pour la première fois que l’activité DUB des cellules, ainsi que l’activité d’USP14, sont directement régulées par la signalisation du BCR via l'activité de la tyrosine kinase SYK. Le FTY720, un analogue de la sphingosine utilisé comme immunosuppresseur dans la sclérose en plaques, a montré un effet cytotoxique dans des hémopathies malignes sans toutefois que son mécanisme d’action soit clairement expliqué. Une deuxième partie de ce travail de thèse a été de caractériser la mort induite par le FTY720. Notre étude montre que la caractérisation de la morphologie cellulaire et des marqueurs induits par la mort due au FTY720 dans les LLC correspond en fait à une nécrose cellulaire programmée indépendante de RIPK1, mais dépendante d'une enzyme régulatrice de la fission mitochondriale, DRP1. / Non-Hodgkin lymphoma (NHL) include a diverse range of pathologies originate from the lymphatic cells. Among the mature B-cell NHL, chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common adult leukemia in the western countries. The pathophysiology of mature B-cell NHL is marked by the inhibition of cell death mechanisms, particularly through the overexpression of MCL-1 protein. The first part of this thesis was to determine which deubiquitinating enzymes (DUBs) are involved in the survival of mature B-cell NHL and in the stabilization of MCL-1. Our study identified the DUB USP14, which is linked to the ubiquitin-proteasome system, as able to regulate MCL-1 and cell survival. Our work also shows for the first time that the DUB activity of the cells and the activity of USP14 are directly regulated by BCR signaling through the activity of the SYK tyrosine kinase. FTY720, a sphingosine analog used as an immunosuppressive drug in multiple sclerosis, showed a cytotoxic effect in hematological malignancies but its mechanism of action is not well understood. A second part of this thesis was to characterize the death induced by FTY720. Our study shows that the characterization of the cellular morphology and markers induced by death due to FTY720 in the LLC corresponds in fact to a programmed RIPK1-independent necrosis cell death, but dependent on DRP1, a regulatory enzyme of the mitochondrial fission.

L'insuffisance rénale est un problème majeur de santé publique et la transplantation rénale est l’option thérapeutique principale, mais elle comporte le risque de rejet d'organe. Les cellules B jouent un rôle important dans le rejet médié par les anticorps (AMR). Au cours de l'AMR chronique, les structures lymphoïdes tertiaires, semblables aux centres germinatifs (GC), apparaissent dans l'organe rejeté, associées à la production des plasmocytes et des lymphocytes B mémoires spécifiques du donneur. Ces populations de lymphocyte B sont souvent mal contrôlées par les traitements actuels. La myeloid cell leukemia 1 (Mcl-1), un membre anti-apoptotique de la famille de B-cell lymphoma 2 (Bcl-2), est essentiel pour maintenir l’organisation de GC et de la différenciation des cellules B. Nous rapportons ici l'infiltration de cellules B exprimant Mcl-1 dans le rein de patients atteints d'AMR chronique, comme cela a été observé pour les cellules (pré) GC. Suite à l’abrogation de la signalisation du récepteur des cellules B (BCR), par l'inhibition de la spleen tyrosine kinase (SYK) nous avons observé une diminution de la viabilité des cellules GC, par l'intermédiaire d'une régulation de Mcl-1. La régulation négative de Mcl-1 est coordonnée au niveau de la transcription, potentiellement par l'intermédiaire du transducteur de signal et de l'activateur de la transcription 3 (STAT3), comme cela a été observé par (1) une translocation altérée de STAT3 dans le noyau suivant l'inhibition de SYK, et (2) les niveaux inférieurs de transcription de Mcl-1. Par ailleurs, la surexpression de Mcl-1 inhibe l'apoptose après l'inhibition du SYK. Des études avec des cellules B primaires, issues d'amygdales, ont confirmé que l'inhibition de SYK a diminué la survie cellulaire. Nous avons également constaté que l'inhibition du SYK a diminué les niveaux de protéines Mcl-1 dans les cellules B primaire, et que l’activation de ces cellules a été inhibée, tel que déterminé par l'expression de CD80 et des taux inférieurs de sécrétion d'IgG dans les cellules B primaires activées in vitro. Nos travaux suggèrent que la voie SYK-Mcl-1 peut offrir de nouvelles opportunités pour le traitement et la prévention de l'AMR / Renal failure is a major public health concern and renal transplantation is the main therapeutic option, however it comes with the risk of organ rejection. B-cells play an important role in antibody-mediated rejection (AMR). During chronic AMR, tertiary lymphoid germinal center (GC)-like structures appear in the rejected organ, associated with de novo production of donor-specific plasma and memory B-cells. Which are B-cell populations that are often poorly controlled by current treatments. Myeloid cell leukemia-1 (Mcl-1), an anti-apoptotic member of the B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) family, is essential for maintaining the GC reaction and B-cell differentiation. We report here the infiltration of B-cells expressing Mcl-1 in the kidney of patients with chronic AMR, as observed for (pre-)GC cells. The impairment of B-cell receptor (BCR) signaling, by inhibition of spleen tyrosine kinase (SYK), reduced viability and Mcl-1 protein levels in GC like cells. This downregulation is coordinated at the transcriptional level, potentially via signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), as shown by (1) impaired translocation of STAT3 to the nucleus following SYK inhibition, and (2) the lower levels of Mcl-1 transcription upon STAT3 inhibition. Moreover, overexpression of Mcl-1 prevented cells from entering apoptosis after SYK inhibition. In vitro studies with primary tonsillar B-cells confirmed that SYK inhibition decreased cell survival. We also found that SYK inhibition decreased Mcl-1 protein levels in primary B-cells, and that B-cell activation was inhibited, as determined by CD80 expression and lower levels of IgG secretion in tonsillar B-cells activated in vitro. Overall, our data suggest that the SYK-Mcl-1 pathway may provide new opportunities for the treatment and prevention of AMR