A membrana amniótica é uma membrana translucida sendo a membrana mais interna da cavidade amniótica, formada por uma monocamada de células epiteliais disposta sobre uma membrana basal. Com o crescente interesse na utilização de células-tronco provenientes de anexos fetais, esta se torna uma promissora fonte de células-tronco. Sendo assim em trabalho anterior realizado pelo nosso grupo tivemos como objetivo, o estabelecimento da cultura celular e caracterização das células-tronco fetais de membrana amniótica de cão para verificar se a mesma pudesse ser uma nova fonte celular a ser usada nos protocolos de terapia celular, uma vez que os cães têm sido considerados modelos animais atraentes para avaliar novas drogas ou realizar ensaios pré-clínicos. As células de membrana amniótica obtidas a partir do trabalho anterior foram caracterizadas in vitro, observando-se características semelhantes a outras células-tronco mesenquimais. Porém, quando foi analisado o seu o seu potencial carcinogênico observamos a formação de um tumor de crescimento rápido, aproximadamente um mês, após o inóculo dessas células em 10 camundongos imunossuprimidos nude, sendo o tumor identificado histologicamente como um carcinoma embrionário. Diante deste comportamento acreditamos ser de extrema importância analisar células provenientes de novas coletas verificando se a mesmas podem se comportar como as anteriormente estudadas. Com isso, temos como objetivo deste trabalho estabelecer e caracterizar as células provenientes de duas novas coletas em diferentes períodos gestacionais visando verificar se estas células se comportam da mesma que as anteriores isso é se quando inoculadas nos animais formam tumor e assim poder ter certeza de que essas células são ou não, boas alternativas para terapia celular. As células obtidas nestas novas coletas têm características de células-tronco mesenquimais expressando alguns marcadores, tem curva de crescimento semelhante às células-tronco mesenquimais, se aderem ao plástico e se diferenciaram em adipócitos. Diferentemente das células obtidas no estudo anterior estas células não geraram tumor quando injetadas em camundongos imunossuprimidos, nude em até 60 dias após inoculação. / Amniotic membrane is a membrane translucent with the inner membrane of the amniotic cavity, formed by a monolayer of epithelial cells disposed on a basal membrane. With the growing interest in the use of stem cells from fetal membranes, this becomes a promising source of stem cells. So in a previous study conducted by our group we aim, the establishment of cell culture and characterization of fetal stem cells from amniotic membrane from dog to see if it could be a new source cell to be used in cell therapy protocols, Once the dogs have been considered attractive animal models to evaluate new drugs or performing pre-clinical tests. The cells from amniotic membrane obtained from previous work were characterized in vitro, observing characteristics similar to other mesenchymal stem cells. But when it was analyzed its its carcinogenic potential observed the formation of a fast-growing tumor, approximately one month after inoculation of these cells into immunocompromised nude mice 10, and the tumor identified histologically as embryonal carcinoma. Given this behavior we believe is extremely important to analyze cells from new collections by checking if the same can behave like those previously studied. With this, we aim of this work to establish and characterize the cells from two new collections at different gestational periods to verify whether these cells behave the same as the previous ones is that when inoculated into animals form tumor and thus be able to make sure that these cells are either not good alternatives for cell therapy. The cells obtained in these new collections has characteristics of mesenchymal stem cells expressing some markers, growth curve is similar to mesenchymal stem cells, adhere to plastic and differentiated into adipocytes. Unlike the cells obtained in the previous study these cells did not generate tumors when injected into immunocompromised mice, nude within 60 days after inoculation.

Este trabalho tem como foco dois aspectos principais: i) O processamento e caracterização de elementos porosos vítreos, a partir de vidro reciclado e ii) A deposição de filmes de quitosana (CHI) e carboximetilcelulose (CMC). O objetivo é a avaliação da interação superficial desses filmes com o herbicida atrazina (ATZ) em meio aquoso. O processamento seguiu o princípio do preenchimento (filler principle), fazendo uso dos sais NaCl e o MgCO3 como fases formadoras de poros. A caracterização mostra que o NaCl, age como um elemento solúvel, inerte, exceto na interface NaCl-matriz vítrea, cuja estrutura cristalina final é a cristobalita. Contrariamente, o MgCO3 reage com a matriz introduzindo novas fases como o CaMg(SiO3)2. A estrutura final, de poros e da matriz, é distinta para cada um dos sais utilizados, principalmente quanto ao aspecto morfológico dos poros e as análises semiquantitativas mostraram que o cátion Na+ na interface vidro-NaCl e o íon Mg++ atuam como modificadores de cadeia. Medidas de porosimetria indicam que nos materiais processados com NaCl apresentam estruturas dos poros abertos com uniformidade na distribuição dos tamanhos e com certa regularidade de formatos quando comparados com os materiais processados com MgCO3. Com respeito à interação herbicida - materiais vítreos, esta foi avaliada por técnicas espectroscópicas, podendo-se inferir que há interação entre as superfícies ativadas quimicamente e a ATZ. A remoção do herbicida por filtragem simples através dos filmes de CHI e filmes de CHI+CMC depositados sobre as membranas foram inferiores numericamente aos valores obtidos pela ação da superfície vítrea ausente de filmes. Entretanto, os resultados indicam que ocorre uma melhor interação entre a CHI e o ATZ, quando ambos estão em solução a pH = 3,0. Por espectroscopia de fotoelétrons excitada por raios-X (XPS) houve o aumento das espécies O (1s), C (1s), N (1s) e Cl (2s) confirmando as interações com o herbicida, porém não sendo possível inferir se esta se dá por algum grupo proveniente da CHI ou por sítios livres disponíveis na superfície vítrea. Análises numéricas indicam remoções de ATZ na ordem de 10-12% com respeito às medidas realizadas em sistemas contendo uma única membrana. Avaliação complementar da remoção do metal (Cd) confirmam a vantagem das superfícies depositadas com CHI, para este tipo de interação, indicando que sistemas compostos podem ser vantajosos na remoção de diversos contaminantes. / This work is focused in two main aspects: i) The processing and characterization of porous vitreous pieces, produced from waste glass and ii) The deposition of chitosan (CHI) and carboximethilcelullose (CMC) on the vitreous surface. The evaluation of the active aspects aiming at interactions with the herbicide atrazine (ATZ) was realized in aqueous medium. The processing follows the filler principle making use of NaCl and MgCO3 as porous phases formation. Characterization showed that NaCl acts as a soluble, inert phase, with interaction over NaCl-Matrix interface, resulting in cristobalite phase as final structure. Conversely, the MgCO3 reacts along the matrix generating new phases such as CaMg(SiO3)2. The final porous and matrix structure also differs to each used salt, mainly concerning morphological aspects of the porous where semiquantitive analysis point to the Na+ in glass-NaCl interface and to Mg++ as the main chain modifiers. Measurements by porosimetry has showed that in the materials processed with NaCl the porous structure are typically open with uniform size distribution and present a certain regularity of forms when compared with the membranes processed with MgCO3. Concerning an herbicide interaction, which was evaluated by spectroscopic techniques inferring interaction between chemically active surfaces and ATZ. The herbicide removal through CHI and CHI+CMC deposited films resulted numerically lower than those values attained to glass surface absent of films. Nevertheless, the results point that to a better interaction between CHI and ATZ when both are dissolved at pH 3,0. By XPS scanning it was possible to follow the variation of the surface concentration with increasing of the elements O (1s), C (1s), N (1s) e Cl (2s) confirming surface interaction, despite not being feasible to define what functional groups take place in the interaction. Numerical analysis presents herbicide removal in the order of 10-12% concerning measure performed over a single membrane. Complementary tests of metal removal (Cd) confirmed the advantage of CHI surface in this type of interaction, making evident that composed filtration system could be ideal in the removal of distinct contaminants.

Objetivo: O presente estudo avaliou, clinica e histomorfometricamente, a matriz dérmica acelular (MDA) como barreira física na regeneração óssea guiada. Materiais e Métodos: Inicialmente foram extraídos, em seis cães, os quatro prémolares mandibulares bilateralmente. Após um período de seis semanas, foram analisadas a quantidade e qualidade de mucosa ceratinizada (Exame Clínico 1). Duas semanas depois, os animais foram submetidos a um segundo procedimento cirúrgico (Confecção do defeito e Regeneração Óssea Guiada ROG), no qual foi criado um defeito ósseo padronizado em cada lado da mandíbula. Sobre o defeito de um hemiarco, escolhido aleatoriamente, foi posicionada e fixada a membrana absorvível de copolímeros de ácido polilático e poliglicólico e carbonato trimetileno (Grupo Controle - GC) e no defeito do hemiarco oposto, a matriz dérmica acelular - MDA (Grupo Teste - GT). Imediatamente após a sutura, foram feitas tomadas radiográficas padronizadas através de raio-X digital, as quais foram novamente realizadas 8 e 16 semanas após a cirurgia de colocação das membranas. Após quatorze semanas de cicatrização, a quantidade e qualidade da mucosa ceratinizada foram novamente avaliadas (Exame Clínico 2). Dezesseis semanas depois da ROG os animais foram sacrificados e foi então realizado o preparo histológico das peças. A análise histomorfométrica, em microscopia óptica, avaliou a quantidade e qualidade de osso neoformado. A neoformação óssea também foi quantificada através das imagens radiográficas. Resultados: Em relação aos parâmetros clínicos, o GT e o GC apresentaram aumento na EMQ e redução na AMQ. Na análise radiográfica, após o período de 16 semanas, as radiografias de subtração apresentaram ganho médio de área radiopaca em relação ao defeito inicial de 83,38 % para o GT e de 83,68% para o GC. Houve um aumento progressivo da densidade radiográfica para ambos os grupos, sem diferenças estatisticamente significantes. Histologicamente, após 16 semanas o tecido ósseo apresentou características de um osso predominantemente maduro. Histomorfometricamente, a ANO correspondeu a 58,99% da ANT no GT e a 61 % da ANT no GC. A altura óssea máxima no GT foi de 7,21 ± 0,80 mm e no GC de 7,70 ± 1,21 mm. A porcentagem de osso cortical na ANO foi de 42,47 % no GT e 38,08 % no GC. Não foram observadas diferenças estatisticamente significantes entre os grupos para nenhum destes parâmetros. Conclusão: A MDA atuou como barreira mecânica na ROG com resultados clínicos, radiográficos e histomorfométricos similares aos obtidos com a membrana absorvível. / Objective: The purpose of this study was to evaluate the acellular dermal matrix (ADM) as membrane for guided bone regeneration (GBR), comparing it to a bioabsorbable membrane. Material and Methods: In six dogs, the mandibular premolars were extracted. After 8 weeks, bone defects were surgically created bilaterally and the GBR was performed. Each side was randomly assigned to the control group (CG: bioabsorbable membrane made of glycolide and lactide copolymer) or test group (TG: ADM as a membrane). Immediately following GBR, standardized digital X-Ray radiographs were taken, and were repeated at 8 and 16 weeks post-operatively. Previously to the GBR and to euthanasia, clinical measurements of the width and thickness of the keratinized tissue (WKT and TKT, respectively) were performed. The dogs were sacrificed 16 weeks following GBR, and histomorphometric analysis was made. Area measurements of new tissue and new bone, and linear measurements of bone height were performed. Results: There were no statistically significant differences between groups for any histomorphometric measurement. Clinically, both groups showed an increase in the TKT and reduction program in the WKT. Radiographically, it could be observed an image suggestive of new bone formation in both groups 8 and 16 weeks following GBR. Conclusion: ADM acted as a mechanical barrier in GBR, with clinical, radiographic and histomorphometric results similar to those obtained with the bioabsorbable membrane.

A membrana amniótica humana vem assumindo um papel de extrema importância na medicina regenerativa nos últimos anos, principalmente na área de dermatologia e oftalmologia, sendo seu uso promissor no tratamento de doenças cuja terapêutica atual é pouco eficaz. Além disso, na membrana amniótica humana encontram-se células-tronco mesenquimais, que apresentam plasticidade e vem sendo aplicadas para a regeneração de tecidos. Entretanto, muito pouco se sabe sobre a capacidade plástica e o uso de células-tronco de membrana amniótica de animais, já que a literatura a este respeito, não é tão ampla quanto à de humanos. Neste projeto estabelecemos a cultura de células-tronco de membrana amniótica (MA) de fetos caninos, caracterizando as células in vitro e in vivo. As células de MA foram obtidas a partir de um procedimento cirúrgico de histerectomia em cadelas prenhas, durante campanhas de castração da prefeitura da cidade de São Paulo. As células de MA foram caracterizadas in vitro, observando-se características semelhantes a outras células-tronco mesenquimais. Porém, quando foi analisado o seu comportamento in vivo, observamos a formação de um tumor de crescimento rápido, aproximadamente um mês, após o inóculo dessas células em 10 camundongos imunossuprimidos nude, sendo o tumor identificado histologicamente como um carcinoma embrionário. Diante do comportamento biológico formando um tumor in vivo, inferimos que células-tronco provenientes de membrana amniótica de cães não devem ser usadas para aplicação com objetivos terapêuticos em animais, pelo menos até que novas coletas sejam realizadas para que se possa confirmar ou não este comportamento. / The human amniotic membrane has taken an extremely important role in regenerative medicine in recent years, especially in dermatology and ophthalmology, and its promising use in treating diseases for which current therapy is ineffective. In addition, the amniotic membrane has human mesenchymal stem cells, which exhibit plasticity and have been applied to tissue regeneration. However, very little is known about the plastic capacity and the use of stem cells from amniotic membrane of animals, since the literature in this regard, it is not as broad as those of humans. In this project we established a culture of amniotic stem cells of dog, characterizing these cells in vitro and in vivo. The cells were obtained from a surgical procedure for hysterectomy in pregnant bitches, during castration\'s campaigns of the São Paulo\'s municipality. The cells were characterized in vitro, observing characteristics similar to other mesenchymal stem cells. In spite of their behavior, in vivo we observed the formation of a fast-growing tumor about a month after the inoculation of these cells in 10 immunosuppressed mice, being the tumor identified histologically as an embryonic carcinoma. Considering the biological behavior of forming a tumor in vivo, we infer that stem cells from amniotic membrane of dogs should not be used for application for therapeutic purposes in animals, at least until other collections are carried out so that it can be confirmed or not.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a membrana de celulose bacteriana associada a células mesenquimais, que foram inoculadas juntamente com derivado do ácido hialurônico, hylano G-F 20, em patelas lesadas de suínos. Foram utilizados 12 suínos (24 joelhos) submetidos à raspagem das superfícies articulares das patelas até osso esponjoso; joelhos esquerdos sem tratamento, grupo controle (GC). Joelhos direitos, grupo tratado (GT), tiveram membranas de celulose bacteriana fixadas às superfícies de suas patelas, sendo que as mesmas foram preparadas com inoculação de células mesenquimais, ósseas e cartilaginosas, provenientes das raspagens das superfícies, lavadas em solução fisiológica 0,9%, filtradas e diluídas em 5 ml de solução fisiológica à 0,9% e posteriormente acrescentados 2 ml de hylano G-F 20. Colhidos 5 ml dessa papa que teve contido o volume de 16,35 x \'10 POT.8\' células na sua totalidade, e foram infiltrados na membrana de celulose revestindo a patela, obedecendo a distribuição de 3,27 x \'10 POT.8\' por 1,2 \'CM POT.3\'. Após 2, 4 e 6 meses os animais foram sacrificados para avaliações macroscópicas e histológicas. As superfícies patelares apresentaram aspecto de neoformação de cartilagem aos dois meses; essas membranas evoluíram para tecido fibroso de altíssima resistência, com densidade de fibras conjuntivas aumentando proporcionalmente ao tempo de cirurgia, quatro ou seis meses conforme as células do infiltrado tiveram alterações morfológicas para fibroblastos Ao mesmo tempo, parte do volume dessas células sofreu processo de degeneração e morte celular, semelhante ao mecanismo de apoptose celular. Dessa forma, ofereceu substratos para as células remanescentes, colaborando para a neoformação desse tecido conjuntivo. Não ocorreram processos inflamatórios ou agressão às cartilagens em contigüidade à membrana. Pelo contrário, em relação ao grupo controle não tratado, a membrana de celulose bacteriana utilizada segundo a metodologia aplicada, atuou com uma barreira protetora para agressões maiores à cartilagem da fossa intercondilar do fêmur que manteve a integridade de seus contornos articulares. Desta forma, segundo a metodologia utilizada, concluímos que a membrana de celulose bacteriana apresentou biocompatibilidade para uso articular, hábil para agregar condrócitos e fibroblastos. / The goal of this work was to evaluate the bacterial cellulose membrane associated with mesenchymal cells, which were inoculated with hyaluronic acid derivative, G-F 20 hylano in patelas injured pigs. 12 pigs were used (24 knees) submitted to the scraping of the articular surfaces of spongy bone patelas up; knees left without treatment, group controller (GC). Knees rights, treated group (GT), bacterial cellulose membranes had fixed on their surfaces patelas, being that they were prepared with inoculation of mesenchymal cells, bone and cartilage from sweeps of surfaces, washed in 0.9% saline solution, filtered and diluted in 5 ml of saline solution to 0.9% and subsequently added 2 ml hylano G-F 20. Collected 5 ml that Pope had contained the volume 16.35 x \'10 POT.8\' cells in its entirety, and were infiltrated in the membrane of cellulose coating the patella, obeying distribution 3.27 x \'10 POT.8\' per 1.2 \'CM POT.3\'. After 2, 4 and 6 months the animals were sacrificed to macroscopic and histological evaluations. The surfaces patellar components submitted aspect of neoplasm of cartilage to two months; These membranes evolved into fibrous tissue resistance of high density fibrous tears increasing in proportion to the time of surgery, four or six months as had infiltrated cells for morphological changes while fibroblasts, part of the volume of these cells suffered process of degeneration and cell death, similar to the mechanism of cellular apoptosis. This way, offered substrates for the remaining cells, collaborating for this connective tissue neoplasm. There were no inflammatory processes or aggression on cartilage in adjacency to the membrane. On the contrary, compared to the untreated control group, the bacterial cellulose membrane used according to the methodology applied, served with a protective barrier for larger aggressions of cartilage of the femur intercondilar trench that maintained the integrity of its articular contours. This way, according to the methodology, we found that the bacterial cellulose membrane biocompatibility presented for use articulate, skilled to aggregate condrócitos and fibroblasts.

Primaquina e cloroquina são agentes antimaláricos amplamente utilizados profilática e terapeuticamente contra esta enfermidade. A interação destes fármacos com sistemas modelo podem fornecer informações úteis no entendimento dos mecanismos envolvidos em sistemas biológicos reais. Neste sentido, através das técnicas de calorimetria diferencial de varredura e ressonância paramagnética eletrônica, estudamos as interações entre os fármacos antimaláricos supracitados e modelos de membrana, no intuito de investigarmos as modificações provocadas por ambos na estrutura lipídica. Os resultados obtidos indicam que a associação da cloroquina com membranas de DMPC em pH fisiológico é limitada. Uma perturbação desta molécula na estrutura e dinâmica lipídica foi detectada apenas numa região próxima ao carbono sete das cadeias acila das fosfatidilcolinas. Os experimentos de DSC mostram que este fármaco tem efeito apenas na diminuição da cooperatividade da transição principal das membranas. Por outro lado, a redução da temperatura de transição de fase lipídica observada nos estudos calorimétricos demonstra que a primaquina promove uma desestabilização da fase gel. Os experimentos de RPE corroboram esse resultado, evidenciado pelo aumento da fluidez da membrana. Adicionalmente, o aumento do empacotamento provocado no centro da bicamada lipídica sugere penetração deste fármaco até esta região. Não foram observadas alterações da estrutura e dinâmica das cadeias lipídicas na fase fluida da membrana. Os resultados obtidos fornecem um melhor entendimento das interações fármacos-lipídios em um nível molecular, que podem ser aplicados no desenvolvimento de sistemas carreadores de ambos os fármacos. / Primaquine (PQ) and Chloroquine (CQ) are potent therapeutic agents used in the treatment of malaria. The investigation of drug-lipid interactions is pivotal for understanding their biological activity. Electron Spin Resonance (ESR) and Differential Scanning Calorimetry (DSC) were used to investigate the effects of drug binding on the lipid phase transition and acyl chain dynamics of model membranes made up of 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DMPC) phospholipids. Labels located at different positions along the lipid chain were used to monitor different membrane regions. ESR results indicated that PQ is more effective in changing the membrane structure than CQ. PQ is effective in perturbing the whole chain of DMPC vesicles, whereas the effect of CQ is more pronounced near the polar headgroup region. Furthermore, PQ causes a slight increase of the lipid packing close to the membrane center, suggesting a deeper insertion of this molecule into DMPC bilayers. DSC thermograms revealed that PQ interacts with DMPC decreasing the main transition temperature (TM) by ca. 2ºC and completely abolishing its pre-transition. On the other hand, CQ effects are mainly noticed as a decrease in the cooperativity of the main transition. Because of its lipophilic character, PQ penetrates into the bilayer hydrocarbon region causing considerable disorganization. Electrostatic interaction between CQ and the phosphatidylcholine phosphate groups is probably related with its low membrane permeability. These results shed light on the molecular mechanism of druglipid interaction, which may be useful for the development of lipid drug delivery systems of antimalarial drugs.

A Terapia Fotodinâmica (do inglês, Photodynamic Therapy - PDT) é uma técnica indicada para o tratamento local de câncer que vem tendo grandes avanços ao longo dos anos. A PDT consiste na interação entre luz e uma substância fotossensibilizadora, resultando na transformação do oxigênio molecular em oxigênio singleto, altamente reativo e tóxico para a célula, levando à destruição do tecido. Nesse contexto, o uso do modelo de Membrana Corioalantóica (CAM) é uma opção para o estudo dos efeitos vasculares envolvidos nessa terapia, além de permitir o estudo na variação de diversos parâmetros associados com a PDT e seus efeitos. Nesse estudo foram investigados um composto derivado de porfirina e um derivado de clorina. Esses fotossensibilizadores foram administrados topicamente e por via intravenosa, sendo variados diversos parâmetros. No primeiro caso, o tempo de incubação foi variado entre 20 e 80 minutos e a concentração de área da droga foi variada entre 0,1 e 100 g/cm2. Quanto à dose de luz, o intervalo foi entre 4,8 e 60 J/cm2, empregando lasers de diodo em 635 nm para Photogem&reg e 660 nm para Photodithazine&reg. Depois de estabelecido 30 J/cm² para a aplicação tópica, foi usada a aplicação intravenosa com essa dose, a fim de comparar os resultados. Após iluminação, foram feitas imagens da membrana imediatamente após a iluminação até 300 minutos pós-terapia. Com ajuda de softwares de processamento de imagem, foi feita a transformação da imagem: os pixels referentes aos vasos sanguíneos foram transformados em preto e o restante (clara, gema e embrião) em branco. Esse processo levou à obtenção de um valor relacionado à área de vasos sanguíneos em função do tempo pós-terapia, quantificando e mostrando o comportamento do efeito vascular da PDT. A comparação entre os dois fotossensibilizadores mostrou que o uso da mesma concentração (1 g/cm²) pode levar à destruição da rede vascular tratada para a porfirina e à dilatação dos vasos periféricos com destruição dos vasos mais calibrosos, para a clorina. Entretanto, variando as concentrações de ambos, obtemos respostas contrárias. A análise dos resultados obtidos, observando a diferença de ação dos fotossensibilizadores, permitiu a obtenção de uma relação quantitativa do comportamento vascular além do estudo individualizado do efeito da terapia fotodinâmica para análise do dano tecidual induzido. / Photodynamic Therapy is a local treatment of cancer that has great advances over the years. To obtain an efficient process that leads to tissue destruction, a dynamic interaction of three factors is required: photosensitizing agent, light, and molecular oxygen. When there is the appropriate illumination of tissue with photosensitizer, this molecule is excited and produces singlet oxygen. This product is reactive and cytotoxic, and it results in cell death. In this context, the CAM model allows studies with variation in many parameters linked with PDT and its effects and it is an option to study of vascular effects. A compound of porphyrin (Photogem&reg) and a compound of chlorine (Photodithazine&reg) were investigated in this study. These fotosensitizers were topically administrated and the parameters were ranged between 20-80 minutes for incubation, and 0.1-100 g/cm2 for concentration. About light dose, the range was between 4.8-60 J/cm2, with diode laser at 635 nm (Photogem&reg) and 660 nm (Photodithazine&reg). After established that light dose of 30J/cm² as ideal for topical application, intravenous application was used with that dose in order to compare the results. After illumination, the membrane images were made from zero to 300 minutes. At image processing, the pixels corresponding to vessels were defined as black and the remaining structures as white pixels. Calculating the percentage area of the black pixels as a function of the treatment time, it is possible to quantify the vascular effect of this therapy. The comparison between two fotosensitizers (1 g/cm²) can lead to vascular network destruction to porphyrin and can lead to dilation of peripheral vessels with destruction to larger vessels, for chlorine. However, increasing the porphyrin concentration and decreasing the chlorine concentration, we have opposite responses. With varying PDT parameters, it was possible to obtain the best assay for PDT. The results obtained by observing the difference of action of photosensitizers, allows obtaining a quantitative relationship of vascular behavior in addition to individual study of the effect of photodynamic therapy for analysis of tissue damage induced.

A maior parte dos insetos possui uma estrutura anatômica em forma de filme (membrana peritrófica, MP) composta de quitina e proteínas (peritrofinas), que separa o alimento do epitélio do intestino médio. A MP protege o epitélio de microorganismos e da abrasão, e possui outras funções baseadas no fato de que a MP promove a compartimentalização de enzimas, que incluem: aumento da eficiência digestiva através da diminuição da taxa de excreção das enzimas e de outros mecanismos postulados que são testados nesta tese. A síntese das peritrofinas é mais conhecida do que a da quitina componente da MP, tornando desejável um esforço no detalhamento dessa última. Foram realizadas a caracterização e expressão de genes de S. frugiperda que codificam uma peritrofina e enzimas responsáveis pela síntese e degradação de quitina (quitina sintases 1 (SfCHS1) e 2 (SfCHS2), e quitinase (SfCHI), respectivamente). As sequências dos cDNAs correspondentes foram determinadas através da amplificação de fragmentos de PCR que se sobrepõem. Os padrões de expressão dos genes envolvidos no metabolismo da quitina da MP foram analisados durante o desenvolvimento do inseto por RT-PCR. SfCHS2 é expresso no intestino médio durante os estágios de alimentação da larva, enquanto que SfCHI é expresso durante as fases de pós-alimentação, pré-pupa, e pupa. Ambos os genes são predominantemente expressos na região anterior no intestino médio com um gradiente decrescente de expressão ao longo do tubo digestivo. A citolocalização da quitina revelou que o polissacarídeo está presente somente quando SfCHS2 é expresso e não há quitina no intestino médio quando SfCHI é expresso. Esses resultados levaram a formulação da hipótese de que SfCHS2 é responsável pela síntese da quitina da MP durante o estágio larval e SfCHI degrada a quitina da MP durante a muda larva-pupa, sugerindo padrões inversos de expressão desses genes. Em Spodoptera frugiperda, Tenebrio molitor e Musca domestica é possível prever o sítio de secreção das enzimas digestivas (ventrículo anterior, médio ou posterior) a partir da distribuição antero-posterior das enzimas no espaço endoperitrófico. Também foi possível mostrar, usando vários modelos experimentais, que a separação de compartimentos luminais pela MP: a) impede a inibição de despolimerazes por remover oligômeros do espaço endoperitrófico; b) evita a inibição de oligômero hidrolases restringindo-as ao espaço ectoperitrófico e impedindo que entrem em contato com o alimento e c) anula a inibição de enzimas envolvidas na digestão terminal presentes na superfície do epitélio, impedindo que o alimento entre em contato com elas. / Most insects have a film-like anatomical structure (peritrophic membrane, PM) composed of chitin and proteins (peritrophins), which separates food from midgut tissue. It protects the epithelium against food abrasion and microrganisms and has other functions based on compartmentalization of enzymes, which include: increasing digestive efficiency by decreasing enzyme excretion and by other mechanisms that were tested in this thesis. The peritrophin synthesis is less known than PM chitin synthesis, which needs to be better understood. The characterization and expression of S. frugiperda genes encoding a peritrophin and enzymes responsible for the synthesis and degradation of chitin, chitin synthases 1(SfCHS1) and 2 (SfCHS2), and chitinase (SfCHI), respectively, were analysed. Sequences of corresponding cDNAs were determined by amplification of overlapping PCR fragments and the expression patterns of chitin metabolism genes were analyzed during insect development by RT-PCR. SfCHS2 is expressed in the midgut during the feeding stages, whereas SfCHI is expressed during the wandering and pupal stages. Both genes are predominantly expressed in the anterior portion of the midgut with a decreasing gradient of transcript levels in the medial and posterior portions. Chitin staining revealed that the polysaccharide is present in the PM only when SfCHS2 is expressed. There is little or no chitin in the midgut when SfCHI is expressed. These results support the hypothesis that SfCHS2 is responsible for PM chitin synthesis during the larval stage and SfCHI for PM chitin degradation during larval-pupal molting, suggesting inverse patterns of expression of these genes. The secretion site (anterior, middle or posterior midgut) of digestive enzymes can be predicted in Spodoptera frugiperda, Tenebrio molitor and Musca domestica based on enzyme activity distribution along the endoperitrophic space. We also have shown, using several experimental models, that the luminal compartment separation by PM: a) avoid the polimer hidrolases inhibition by removing oligomer from endoperitrophic space; b) decrease the oligomer hidrolases inhibition by restricting them to the ectoperitrophic space (by avoiding their contact with food); and c) block the inhibition of enzymes located at the cell surface involved in terminal digestion by avoiding their contact with food.

Os insetos da ordem Hemiptera apresentam membranas lipoproteicas que revestem as microvilosidades das células intestinais, como se fossem dedos de luva, e formam expansões para o lúmen do intestino que parecem terminar em fundo cego. A presença das duas membranas no ápice dos enterócitos gera questões intrigantes de como se dá a formação da membrana perimicrovilar, como ocorre a absorção de nutrientes e como se dá o encaminhamento de enzimas digestivas para o lúmen intestinal. A digestão de proteínas baseada em enzimas originalmente lisossômicas é uma característica marcante nos Hemiptera, em especial os Heteroptera que evolutivamente voltaram a uma alimentação de polímeros. O presente estudo indica que os genes das proteinases tipicamente lisossômicas sofrem uma série de duplicações, havendo a manutenção de um gene para função puramente lisossômica e a divergência funcional dos demais genes para a função de digestão extracelular. O gene que mantém a função lisossômica não é modulado pela alimentação, além de ser expresso nos mais diversos tecidos. Já os genes que se especializaram na digestão extracelular têm a expressão aumentada com a ingestão de alimento, indicando sua função. Parece não haver diferença nas características relacionadas ao encaminhamento celular das proteínas produzidas por esses genes, indicando que o direcionamento para a rota secretória é devido à superexpressão dos genes relacionados à digestão. Enzimas como alfa-glicosidases, alfa-manosidases e aminopeptidases que participam da digestão extracelular seguem a rota secretória que envolve a formação de vesículas de dupla membrana. Foi possível ampliar o modelo de digestão incluindo a participação das catepsinas D, de uma alfa-glicosidase solúvel e a possível participação de uma tiolredutase além do definir o local de atuação das lipases. Temos agora uma visão global da participação das enzimas digestivas que atuam na digestão em D. peruvianus. / The insects of the order Hemiptera have lipoprotein membranes lining the microvilli of midgut cells, like glove fingers, and form expansions into the lumen of the intestine. The presence of two membranes on the apex of enterocytes thus generates intriguing questions about the formation of perimicrovillar membrane, the absorption of nutrients, and the targeting of digestive enzymes into the intestinal lumen. The digestion of proteins based on originally lysosomal enzymes is an important feature in Hemiptera, especially in Heteroptera that evolutionary returned to feed on polymers. The genes of typical lysosomal proteinases undergo a series of duplications followed by the maintenance of a gene for purely lysosomal function and functional divergence of other genes for extracellular digestion function. The gene that maintains the lysosomal function is not modulated by feeding, in addition to being expressed in diverse tissues. By the other hand, genes specialized in extracellular digestion are up regulated by food intake, indicating its function. No difference was found in the targeting in the proteins produced by these genes, which indicates that targeting to the secretory route is due to overexpression of digestion-related genes. Enzymes involved in extracellular digestion as alpha-glucosidase, alpha-mannosidase and aminopeptidase follow the secretory route that includes the formation of double membrane vesicles. In this study we increased the digestion model adding the participation of cathepsin D, a soluble alpha-glucosidase, and the possible participation of a tiolredutase, and also to defining the place of lipases operation. We now have a global view of the participation of digestive enzymes involved in digestion D. peruvianus.

Os insetos possuem uma película que reveste o intestino médio (membrana peritrófica, MP), que é composta por quitina e proteínas (peritrofinas). Além de possuir as funções de proteção contra abrasão causada pela comida e contra microrganismos, a MP possui algumas funções específicas que dependem do fato de que essa estrutura compartimentaliza o lúmen do intestino médio em duas regiões denominadas espaço endoperitrófico e espaço ectoperitrófico. As funções específicas da MP são baseadas em evidências indiretas e incluem o impedimento da ligação não específica de comida na superfície celular, o decréscimo na excreção das enzimas digestivas através da sua reciclagem e, em insetos mais evoluídos, o impedimento de oligômero- e dímero-hidrolases de penetrarem no espaço endoperitrófico. As proteínas da membrana microvilar intestinal e uma peritrofina (proteína da membrana peritrófica) de Spodoptera frugiperda foram isoladas e utilizadas para a produção de anticorpos em coelho. Esses anticorpos, juntamente com um anticorpo anti-amilase de Tenebrio molitor (que reconhece as amilases de S. frugiperda), foram utilizados em estudos de imunocitolocalização realizados com a ajuda de anticorpos secundários acoplados a uma proteína fluorescente ou a partículas de ouro coloidal. Os resultados mostraram que a peritrofina de S. frugiperda é secretada pelas células colunares da região anterior do intestino médio através de vesículas que se destacam das microvilosidades (secreção microapócrina). As vesículas com dupla membrana (uma da própria vesícula e a outra da microvilosidade) tornam-se vesículas com membrana simples através da fusão entre membranas e, nesse processo, a peritrofina e parte da amilase e tripsina são liberadas. As membranas remanescentes das vesículas, ainda contendo proteínas microvilares, amilase e tripsina ligadas, são incorporadas a um material com consistência de gel que forma parte da MP. Larvas alimentadas com calcoflúor tiveram a sua MP desestruturada e, em razão disso, perderam o gradiente decrescente antero-posterior de tripsina e quimotripsina observado ao longo do intestino médio das larvas controle. Esse gradiente é presumivelmente formado por um contrafluxo de fluidos (no espaço entre a MP e o epitélio) que permite a reciclagem de enzimas. / Insects have a film-like anatomical structure (peritrophic membrane, PM) which lines the midgut. It is composed of chitin and proteins (peritrophins). Besides the functions of protection against food abrasion and microrganisms, PM has specific functions that depend on the fact that this structure compartimentalizes the midgut lumen into an endoperitrophic and an ectoperitrophic space. Knowledge on these specific functions are based only in indirect evidence and include: prevention of non-specific food binding onto cell surface; prevention of enzyme excretion by allowing enzyme recycling and restriction of oligomer hydrolases to ectoperitrophic space. A peritrophin from Spodoptera frugiperda PM, as well as microvillar proteins from S. frugiperda anterior midgut, were isolated and used to raise antibodies in a rabbit. These antibodies, a Tenebrio molitor anti-amylase antibody that cross-reacts with S. frugiperda amylases, and wheat-germ aglutinin were used in immunolocalization experiments performed with the aid of confocal fluorescence and immunogold techniques. The results showed that the peritrophin is secreted by anterior midgut columnar cells in vesicles that pinched-off the microvilli (microapocrine secretion). The resulting double membrane vesicles become single membrane vesicles by membrane fusion, releasing peritrophin and part of the amylase and trypsin. The remaining vesicle membranes (still containing microvillar proteins and membrane-bound amylase and trypsin) are incorpored into a jelly-like material associated with PM. Calcofluor-treated larvae lacking a PM were shown to lose the trypsin and chymotrypsin decreasing gradient observed along the midgut of control larvae. This gradient is thought to be formed by a countercurrent flux of fluid (in the space between PM and midgut cells) that powers enzyme recycling.