A rota de biossíntese de colesterol tem sido estudada pelo seu envolvimento com a secreção de hormônios. A secreção de insulina depende do colesterol e de intermediários da sua biossíntese como o geranilgeranil pirofosfato. Para compreender a contribuição destes elementos na secreção de insulina foram utilizados inibidores de diferentes pontos da rota de biossíntese do colesterol. Estudou-se a contribuição do geranilgeranil pirofosfato e do colesterol na secreção de insulina estimulada pela glicose e analisados parâmetros físicos de membrana dos quais decorrem aspectos funcionais da célula beta. Sinvastatina inibiu a secreção de insulina sem afetar o conteúdo celular de colesterol, mas inibindo a geranilgeranilação de proteínas. A diminuição do conteúdo de colesterol aumenta a fluidez de membrana desorganizando lipid rafts. A suplementação com colesterol recupera a função secretória. Por tanto, a inibição da síntese de colesterol diminui a secreção de insulina através da redução da isoprenilação de proteínas e da alteração estrutural de membranas celulares. / Cholesterol biosynthesis pathway has been studied for its involvement with the hormone secretion process. Insulin secretion depends on cholesterol and its biosynthesis intermediates such as geranylgeranyl pyrophosphate. For understand their contribution on the glucose stimulated insulin secretion, cholesterol biosynthesis pathway key steps inhibitors were used. The geranylgeranyl pyrophosphate and cholesterol contribution to the insulin secretion was studied so as physical parameters of the membrane, from where derive key functions of it. Simvastatin inhibited insulin secretion without affecting total cellular cholesterol, but inhibiting protein geranylgeranylation. The cholesterol reduction increased the membrane fluidity with consequent disorganization of membrane lipid rafts, in which secretion machinery is organized. Cholesterol supplementation recovers cellular secretory function. We conclude that cholesterol biosynthesis inhibition reduces insulin secretion through protein isoprenylation impairment and structural disarrangement of the cellular membranes.

Os princípios biológicos da regeneração óssea guiada (ROG) têm contribuído para o desenvolvimento de membranas que, em odontologia, são utilizadas em diversas situações como tratamentos com implantes dentários, aumento de rebordo alveolar e reparo de defeitos ósseos de origem traumática e patológica. Resultados de experimentos in vitro comparando a membrana obtida pela associação do polímero poli(fluoreto de vinilideno-trifluoretileno) e da cerâmica titanato de bário (P(VDFTrFE)/ BT) à membrana de politetrafluoretileno (PTFE) mostraram uma resposta favorável de osteoblastos, fibroblastos e queratinócitos à membrana de P(VDFTrFE)/ BT. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da membrana de P(VDFTrFE)/ BT sobre a formação óssea in vivo. Foram criados defeitos ósseos com 5 mm de diâmetro em calvárias de ratos machos Wistar (peso 200-250 g), distribuídos em três grupos com relação à utilização ou não de membranas nos defeitos ósseos: (1) membrana de P(VDF-TrFE)/BT; (2) membrana de PTFE; (3) nenhum tipo de membrana. Ao final de 4 e 8 semanas os animais foram eutanasiados e as amostras foram submetidas à: (1) análise por microtomografia computadorizada (micro-CT) para avaliar volume ósseo, superfície óssea, superfície óssea específica, número de trabéculas, separação trabecular e espessura trabecular, (2) análise histológica com base em cortes histológicos não descalcificados, (3) análise por reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR em tempo real) para avaliar a expressão gênica dos marcadores ósseos runt-related transcription factor 2 (RUNX2), fosfatase alcalina (ALP), sialoproteína óssea (BSP), osteocalcina (OC), osteoprotegerina (OPG) e receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL) e (4) análise da expressão de microRNAs (miRs) pela técnica de sequenciamento na plataforma Illumina. Os dados das análises morfométricas e da expressão gênica foram submetidos ao teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Fischer quando apropriado, e para a análise da expressão de miRs foi utilizado o teste de Mann-Whitney para comparar a membrana de P(VDF-TrFE)/BT à de PTFE. Para todas as comparações o nível de significância adotado foi de 0,05. Os defeitos que não receberam a membrana tiveram uma formação óssea insignificante. Ambas as membranas favoreceram a formação óssea, sendo a superfície óssea maior sobre a membrana de P(VDF-TrFE)/BT comparada à de PTFE em 4 (p=0,01) e 8 (p=0,001) semanas e a separação trabecular maior sobre a membrana de PTFE comparada à de P(VDF-TrFE)/BT em 4 (p=0,05) e 8 (p=0,001) semanas. A expressão gênica de BSP (p=0,01), OC (p=0,001) e OPG (p=0,001) foi maior e de RANKL (p=0,001) foi menor sobre a membrana de P(VDFTrFE)/ BT comparada à de PTFE em 4 semanas. A expressão gênica de RUNX2 (p=0,001) e OC (p=0,05) foi maior e de ALP (p=0,05), RANKL (p=0,01) e OPG (p=0,001) foi menor sobre a membrana de P(VDF-TrFE)/BT comparada à de PTFE em 8 semanas. Quarenta e cinco e 13 miRs foram regulados positivamente (>2 vezes) em 4 semanas e 8 semanas, respectivamente, e 11 e 39 miRs foram regulados negativamente (>2 vezes) em 4 semanas e 8 semanas, respectivamente, pela membrana de P(VDF-TrFE)/BT comparada à de PTFE. Os resultados indicam que a membrana de P(VDF-TrFE)/BT favorece a formação óssea quando comparada à membrana de PTFE e, portanto, pode ser considerada um biomaterial promissor para ser utilizado em procedimentos de ROG. / Biological principles of guided bone regeneration (GBR) have contributed to development of membranes that, in dentistry, are used in several situations such as treatment with dental implants, alveolar bone augmentation and repair of traumatic and pathological bone defects. Results of in vitro experiments comparing membrane obtained by the combination of poly(vinylidene fluoride-trifluoroethylene) and barium titanate ceramics (P(VDF-TrFE)/BT) with polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane showed a favorable response of osteoblasts, fibroblasts and keratinocytes to the P(VDF-TrFE)/BT membrane. The aim of this study was to evaluate the effect of P(VDFTrFE)/ BT membrane on in vivo bone formation. Bone defects with 5 mm in diameter were created in calvaria of male Wistar rats (weight 200-250 g), distributed into three groups regarding the use or not of membranes on defects: (1) P(VDF-TrFE)/BT membrane; (2) PTFE membrane; (3) no membrane. At the end of 4 and 8 weeks, the animals were euthanized and samples were subjected to: (1) computed microtomography analysis (micro-CT) to assess bone volume, bone surface, specific bone surface, trabecular number, trabecular thickness and trabecular separation; (2) histological analysis based on non-decalcified histological sections; (3) real time polymerase chain reaction (real time PCR) to evaluate gene expression of the bone markers runt-related transcription factor 2 (RUNX2), alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), osteocalcin (OC), osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL); (4) microRNAs (miRs) sequencing analysis at Illumina platform. Data from morphometric and gene expression analyses were submitted to the Kruskal-Wallis test followed by Fischer\'s test, when appropriate, and from miRs expression to the Mann-Whitney test to compare P(VDF-TrFE)/BT with PTFE membrane. For all comparisons, the significance level was 0.05. Defects without membrane exhibit a non significant bone formation. Both membranes favored osteogenesis with an increased bone formation on the P(VDF-TrFE)/BT membrane compared with PTFE at 4 (p=0.05) and 8 weeks (p=0.001). Trabecular separation was greater on PTFE membrane compared with the P(VDF-TrFE)/BT at 4 (p=0.05) and 8 weeks (p=0.001). At 4 weeks, the gene expression of BSP (p=0.01), OC (p=0.001) and OPG (p=0.001) were higher on P(VDF-TrFE)/BT membrane compared with PTFE, while RANKL (p=0.001) was lower. The gene expression of RUNX2 (p=0.001) and OC (p=0.05) were higher and ALP (p=0.05), RANKL (p=0.01) and OPG (p=0.001) were lower on the membrane of P(VDF- TrFE)/BT compared with PTFE at 8 weeks. Fortyfive and 13 miRs were up-regulated (> 2 fold) at 4 weeks and 8 weeks, respectively, and 11 and 39 miRs were negatively regulated (> 2 fold) at 4 weeks and 8 weeks, respectively, on the P(VDF-TrFE)/BT membrane compared with PTFE membrane. The results indicate that the P(VDF-TrFE)/BT membrane favors bone formation compared with PTFE membrane and, therefore, may be considered a promising biomaterial for using in GBR procedures.

A membrana amniótica tem se consolidado no tratamento das afecções da superfície ocular. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a viabilidade e a eficácia do implante de MA eqüina, preservada em glicerina a 98%, na reparação de ceratoplastias lamelares em cães, por meio do estudo da avaliação clínica pós-operatória dos animais, do tempo de cicatrização, da reconstrução da arquitetura da córnea, da resposta inflamatória, e da composição colágena do estroma corneal no local do implante. Foram selecionados 12 cães, sem raça definida, machos ou fêmeas, divididos em quatro grupos de três, que tiveram tempos de observação distintos: 2, 7, 21 e 40 dias. Foi realizada ceratoplastia lamelar de 5 mm de diâmetro em um dos olhos de cada animal, seguida da aplicação do implante de membrana amniótica eqüina de 6 mm. Durante o período de observação, exame clínico oftalmológico foi realizado nos cães, com intervalos de 48 horas e ao final deste período, foram submetidos á eutanásia. Os olhos em estudo foram enucleados e fixados para posterior análise. Foram utilizados três métodos de coloração para o estudo histológico do tecido implantado: hematoxilina-eosina (HE), ácido periódico de Schiff (PAS) e picrossirius. Além disso, procedeu-se a imunomarcação para colágenos tipo I, III, e V, com uso de pepsina para digestão das fibras colágenas heterotípicas exposição dos epítopos. Clinicamente os implantes foram completamente epitelizados em aproximadamente 10 dias, os neovasos apresentaram involução progressiva a partir dos 20 dias de pós-operatório, estando ausentes ao final dos 40 dias de observação, restando apenas uma nébula no local da lesão. À microscopia óptica, observou-se resposta inflamatória moderada, presença de epitélio pavimentoso estratificado aos sete dias e epitelização completa aos 21 dias. Aos 40 dias a membrana basal do epitélio apresentou-se reconstituída. O colágeno tipo I teve sua expressão no estroma intensificada aos 21 dias de pós- operatório. O colágeno tipo III está presente na membrana amniótica, sua a ausência no local do implante, aos 21 dias, mostrou remodelamento do tecido implantado. O colágeno tipo V, presente no estroma da córnea, teve sua expressão aumentada aos 7 e 21 dias, retornando à distribuição normal aos 40 dias de pós-operatório. Assim concluí-se que: a membrana amniótica eqüina é viável como implante em córnea de cão, sendo incorporada ao estroma, resultando em restabelecimento parcial da transparência no local de implante; o colágeno do tecido implantado é remodelado e substituído já aos 21 dias de pós-operatório; a pepsina foi eficiente na digestão das fibras e exposição dos epítopos dos colágenos nas fibras heterotípicas / The amniotic membrane has consecrated itself in the treatment of ocular surface diseases. The objective of this study was to evaluate the efficiency and viability of the equine amniotic membrane graft, preserved in glycerin at 98%, in the lamellar keroplasty recovery in dogs. Evaluation was based on clinical post-surgical exam, healing time, corneal architectural reconstruction, inflammatory response and collagen composition of the corneal stroma at the graft site. Twelve mixed-breed, male and female dogs were divided into four groups of three dogs. Each group was submitted to different observation periods of 2, 7, 21 and 40 days. Each dog was submitted to a 5 mm lamellar keratoplasty in one eye, followed by a 6 mm equine amniotic membrane graft. Each animal was submitted to clinical ophthalmologic exam every 48 hours. At the end of the evaluation period, the animal was euthanized and the grafted eye was removed and fixated for posterior analysis. For the histological study of the tissue graft, three methods of coloration were used: hematoxylin eosin (HE), periodic acid of Schiff (PAS) and picrosirius. Immunolocalization for the collagen types I, III and V using pepsin for fiber digestion of heterotypic fibrils and epitope exposure, was made. Clinically, the grafts were completely epithelized in approximately 10 days and neovascularization regressed progressively 20 days after surgery, being completely absent after 40 days, when only a nebula remained at the graft site. Optic microscopy revealed mild inflammatory response and presence of stratified pavement epithelium after 7 days and complete epithelization 21 days after surgery. At the end of 40 days the basal membrane was reconstituted. Type I collagen had its expression in the stroma intensified 21 days after the surgery. By day 21 the absence of collagen III in the corneal stroma showed graft remodeling, since this was formerly present in the amniotic membrane. The expression of type V fiber in the corneal stroma showed a mildly intensified expression at 7 and 21 days of observation, but returned to its normal distribution 40 days after surgery. Conclusion was that the equine amniotic membrane is a viable graft for the dog\'s cornea as it is incorporated to the stroma, resulting in partial transparency at the site of the graft. Twenty-one days after surgery, collagen from the graft is already remodeled and substituted. Pepsin is efficient for fiber digestion and collagen epitope exposure in heterotypical fibers.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Los astrocitos son el tipo celular más abundante de la glia en el Sistema Nervioso Central y cuando son expuestos a factores sanguíneos durante un daño cerebral, éstos se vuelven “reactivos”, cambiando su forma estrellada a una de tipo fibroblasto. Los astrocitos “reactivos” también proliferan y migran al sitio dañado para formar la cicatriz glial, constituyendo uno de los mayores impedimentos para que ocurra la regeneración neuronal. Se piensa que estos cambios morfológicos que sufren los astrocitos in vivo, podrían tener una relación con los gatillados in vitro por Thy-1, una glicoproteína neuronal muy abundante, que se une a la Integrina αVβ3 en la membrana de astrocitos provocando cambios dramáticos en la forma de estas células. Con estos antecedentes se planteó la hipótesis de que la estimulación sostenida de la Integrina αVβ3por Thy-1 provoca la migración y/o proliferación de astrocitos, activando vías de transducción de señales que involucran a las proteínas quinasa PI3-K y Erk, respectivamente. Para poner a prueba esta hipótesis, se utilizaron ensayos in vitro de cicatrización de herida, la cual consiste en la remoción de una porción de células desde una monocapa de astrocitos en cultivo de la línea celular de rata DI-TNC1 con punta de pipeta y el subsecuente monitoreo de la migración de éstos al área libre de células después de la estimulación con el complejo soluble de Thy-1-Fc/Proteína-A. Adicionalmente, se realizaron en paralelo, análisis de Inmunofluorescencia indirecta a diferentes tiempos para la visualización de estructuras de avance como filopodios y lamelipodios en los astrocitos del borde de la herida estimulados con el complejo soluble de Thy-1-Fc/Proteína-A. Para demostrar la participación de la enzima PI3-K, los ensayos de cicatrización de herida se realizaron en presencia de inhibidores específicos de esta quinasa como son LY294002 y Wortmanina y mediante técnica de Inmunoblot se determinaron los niveles de fosforilación de un sustrato de esta enzima, la proteína Akt, en los astrocitos estimulados con el complejo Thy-1-Fc/Proteína-A. Para determinar si el complejo Thy-1-Fc/Proteína-A inducía cambios en la proliferación y viabilidad de los astrocitos, se utilizaron técnicas de MTS y de exclusión de azul de tripán, así como también se analizó el ciclo proliferativo de éstas células por citometría de flujo. Los resultados demuestran que Thy-1: 1) Induce la migración de los astrocitos DI-TNC1 al sitio de la herida; 2) Induce una mayor formación de estructuras de avance y migración como filopodios y lamelipodios, en los astrocitos del borde de la herida; 3) No induce proliferación ni aumento de la viabilidad de los astrocitos como tampoco cambios significativos en el ciclo proliferativo de éstas células; y 4) La quinasa PI3-K está implicada en la migración de los astrocitos estimulados por Thy-1. En conjunto, estos datos sugieren que la interacción de Thy-1 con la Integrina αVβ3 en la membrana de los astrocitos estimula cambios morfológicos llevando a estas células a una mayor adhesión celular para luego inducir su migración. Cabe destacar que la secuencia de eventos observados in vitro en este trabajo es similar a lo que ocurre en el proceso de astrogliosis, en el cual luego de un daño cerebral, los astrocitos se tornan reactivos, migran al sitio dañado y producen la cicatrización de la herida / Financiamiento: FIRCA 1R03TW006024 - FONDECYT 1040390 - FONDECYT 1070699

Orientadores: Eneida de Paula, Cleyton Crepaldi Domingues / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T17:11:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Casadei_BrunaRenata_M.pdf: 5692711 bytes, checksum: 9dcfea152b622eb3bd7d81b793794e3e (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A visão atual sobre membranas biológicas abarca descrições cada vez mais complexas devido, principalmente, à descoberta de novos papéis atribuídos aos lipídios e sua heterogeneidade. Em particular a associação de esfingolipídios e colesterol, acrescida de proteínas específicas, constitui a base da formação de domínios membranares conhecidos como lipid rafts. Rafts são microdomínios funcionais de biomembranas e estão envolvidos em diversos processos biológicos como reconhecimento celular, endocitose, transdução de sinal, entre outros processos. Uma estratégia experimental para estudar esses domínios é a preparação de frações de membrana parcialmente resistentes ao tratamento com detergentes, a baixa temperatura (4°C). Neste trabalho demonstramos pela primeira vez o preparo e caracterização de frações resistentes a detergente (DRMs) extraídas de membranas de eritrócito humano, a partir do tratamento com os detergentes não iônicos polioxietileno 20-oleil éter (Brij 98) e polioxietileno 20-cetil éter (Brij 58), seguida de separação por ultracentrifugação em gradiente de sacarose. Essas DRMs foram obtidas a 4°C e 37°C, a partir de membranas intactas e com conteúdo reduzido de colesterol (após tratamento com metil-beta-ciclodextrina) e foram comparadas com DRMs de Triton X-100 (TX-100) em relação ao tamanho, conteúdo proteico e lipídico e grau de organização da bicamada. As frações de DRM de Brij mostraram-se enriquecidas em colesterol e fosfolipídios com ácidos graxos de cadeia saturada (em especial ácido lignocérico das esfingomielinas), características consistentes com lipid rafts. No entanto, DRMs de TX-100 apresentaram maior proporção de esfingomielinas/glicerofosfolipídios que as frações obtidas com Brij, além de menor proporção de fosfatidiletanolamina, um lipídio preferencial da monocamada interna da membrana de eritrócitos. Em relação à solubilização proteica, a membrana do eritrócito foi mais resistente ao tratamento com Brij 98 do que aos outros dois detergentes. Flotilina-2 e estomatina foram encontradas nas frações de DRMs de Brij 98 e Brij 58, porém a redução do conteúdo de colesterol da membrana eritrocitária resultou numa menor associação da flotilina-2 àquelas DRMs. Resultados de Ressonância Paramagnética Eletrônica, com uso de marcadores de spin do tipo doxil-estearato não acusaram variação significativa no grau de empacotamento dos lipídios nas bicamadas de DRMs de Brij 98 e Brij 58 em relação à membrana eritrocitária, diferentemente do observado em DRMs de TX-100 e do que seria esperado para domínios lipídicos na fase líquido-ordenada. Em conclusão, DRMs de eritrócitos humanos, com características compatíveis aos domínios funcionais de biomembranas (rafts), foram obtidas tanto a 4ºC quanto a 37ºC; essas frações resistentes aos Brij apresentaram tamanho, composição proteica e lipídica e grau de empacotamento da bicamada diferente das DRMs de TX-100, indicando um processo de extração diferencial dos componentes da membrana eritrocitária induzida por esses detergentes / Abstract: Depiction of biological membranes has been turning more and more complex lately due to the new roles assigned to their lipid components and their heterogeneity. The association between sphingolipids and cholesterol is the basis of lipid rafts formation. Rafts are functional microdomains of biological membranes which have been associated to different biological processes such as cellular recognition, endocytosis and signal transduction, among others. An useful experimental approach to study lipid rafts is the preparation of membrane fractions partially resistant to detergents under low temperature (4ºC). In this work we report the isolation of detergent resistant membranes (DRMs) from human erythrocytes treated with the non-ionic detergents polioxyethylene 20-oleoyl ether (Brij 98) and polioxyethylene 20-cetyl ether (Brij 58) followed by sucrose gradient ultracentrifugation. Such DRMs were obtained at 4°C and 37°C, from cholesterol-depleted (treated with methyl-beta-cyclodextrin) and intact erythrocyte membranes and they compared to DRMs obtained with Triton X-100 (TX-100) regarding the size, protein and lipid content and membrane fluidity. Brij DRMs were found to be enriched in cholesterol and phospholipids containing saturated fatty acids (especially those from sphingomyelin), features commonly associated to lipid rafts. Nevertheless, TX-100 DRMs presented higher sphingomyelin/phospholipid ratios and lower phosphatidylethanolamine content (a glycerophospholipid mainly present in the inner leaflet) than the Brij's. As for protein solubilization, erythrocyte membranes were more resistant to Brij 98 than to the other two detergents. Flotillin-2 and stomatin were found in both Brij 98 and Brij 8 DRMs. However, flotillin-2 was partially solubilized when DRMs were prepared from cholesterol-depleted erythrocyte membrane. Electron paramagnetic resonance experiments, with doxyl stearic acid spin labels incorporated in the DRMs showed no significant changes in the bilayer compactness of Brij 98 and 58 DRMs in comparison to intact membrane, a unexpected result for lipid domains existing in a liquid-ordered phase, and in contrast to results previously observed with TX-100 DRMs. Altogether, these results show the isolation of DRMs from human erythrocytes treated with Brij 98 and Brij 58 at low (4°C) and physiological temperature (37°C). These detergent-resistant membrane fractions, obtained with Brij 98 and 58 presented some lipid rafts features, although with differences in protein and lipid contents, size and membrane fluidity in comparison to TX-100 DRMs. Besides, these results suggest that TX-100, Brij 98 and Brij 58 induced a different solubilization process on the erythrocyte membrane / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El tercer párpado o membrana nictitante corresponde a un anexo ocular ubicado en el canto medial de la mayoría de las especies domésticas, entre ellas el perro. Su anatomía está compuesta por un cartílago en forma de T, una glándula en su trazo vertical y un revestimiento conjuntival. Posee funciones de tipo protectoras para el ojo y además una glándula de tipo sero-mucoide responsable en cierto porcentaje de la producción de la capa acuosa de la película lagrimal. Las patologías que suelen afectarlo parecen tener cierta predisposición racial y dentro de ellas el prolapso de la glándula es la más prevalente. La etiología de esta condición no se ha determinado en su totalidad, pero se cree que se debe a una debilidad del tejido que afirma a esta glándula en su posición normal. En los últimos años los procedimientos han evolucionado hacia el tratamiento del prolapso de la glándula, preservando la producción de lágrimas por parte de ésta. Por lo mismo, la elección de la técnica debe intentar reponer adecuadamente la glándula, no generando limitaciones en el movimiento del tercer párpado y evitando el daño o la pérdida de tejido glandular. No todos los métodos logran esto y en ciertos casos el funcionamiento puede verse afectado, llevando a complicaciones como por ejemplo la aparición de queratitis sicca, también conocida como enfermedad del ojo seco

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Química / La presente tesis es un aporte al conocimiento en el área de la Química medicinal mediante el diseño y síntesis de nuevos derivados indólicos que actúen como ligandos multifuncionales con potencial acción antidepresiva. Los estudios de afinidad se efectuaron sobre h-TSER (proteína transportadora de serotonina humana), D2s (receptor de dopamina D2 corto humano) e inhibición sobre la enzima MAO-A (monoamino oxidasa de rata). Estructuralmente las nuevas familias corresponden a indolil propilpiperazinas conectadas a: anillos benzoxazínicos (F1), derivados morfolinoetilbenzamidas fluorados (F2) y anillos aminopiridínicos (F3). Los estudios de afinidad efectuados por desplazamiento de radioligandos en las 3 familias, mostraron que 14 compuestos que exhibieron valores de Ki en el rango nanomolar (3.0-16nM) en la proteína TSER. En los estudios de afinidad por desplazamiento de radioligando para el receptor D2s, 11 compuestos exhibieron afinidades entre 330-910 nM. Finalmente, en los ensayos en MAO–A, 7 compuestos mostraron porcentajes de inhibición sobre el 50%. Solo una (familia III) exhibió un perfil de acción con acción multimodal dual Los compuestos F3F (Ki TSER = 3,13 nM; e inhibición MAO-A = 50%), F3G (Ki TSER = 13,10 nM; e inhibición MAO-A = 75%) y F3L (Ki TSER = 9,64 nM; e inhibición MAO-A = 67%). Todos los ensayos farmacológicos fueron complementados contrastados y discutidos con estudios de acoplamiento molecular inducido (docking) / The main goal of the present thesis is to contribute to the knowledge of the medicinal chemistry through the design and synthesis of novel indol derivatives functioning as multitargets agents with potential antidepressive action. Binding affinities studies were carried out in h-SERT (human serotonine transporter proteine), hD2s (human short-dopamine receptor) and rat MAO-A enzyme inhibition. Indolylpropyl piperazine moieties were connected to the following scaffolds: functionalized benzoxazine rings (F1), morpholinoethylfluorinated benzamide derivatives (F2) and functionalized aminopyridines (F3). Radioligand binding assays on SERT carried out for compounds belonging to the three families showed that 14 compounds displayed Ki values in the nanomolar range (3.0-16nM) six of them belonging to the first family. The D2s receptor study gave 11 compounds displaying affinities between 330-910 nM, the MAO-A assays revealed that 7 compounds showed enzyme inhibition values over 50%. Only Family III displayed a dual mode of biological activity. Compounds F3F (Ki SERT = 3.13 nM, MAO-A inhibition = 50%), F3G (Ki SERT = 13.10 nM, MAO-A inhibition = 75%) and F3L (Ki SERT = 9.64 nM, MAO-A inhibition = 67%). The pharmacological results were supported and discussed using induced molecular coupling studies (docking)

OBJETIVO: Se realizó un estudio analítico, longitudinal prospectivo, para realizar una evaluación anatómica, funcional e inmunohistoquímica a pacientes con membranas epirretinales (MER) maculares idiopáticas sometidos a tratamiento quirúrgico a través de vitrectomía pars plana. MÉTODO: La muestra de de 68 pacientes con MER idiopáticas diagnosticados de MER idiopática, atendidos en las consultas del servicio de oftalmología del hospital universitario San Juan de Alicante, desde enero del 2016 hasta enero de 2018, que cumplieron con los criterios de inclusión y exclusión. A los pacientes se les realizó un examen oftalmológico completo, tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) al diagnóstico, al mes y a los tres meses de la cirugía. Se empleó la vitrectomía pars (VPP) plana 23 G, con levantamiento de la MER y liberación de la membrana limitante interna como tratamiento quirúrgico. Para el análisis inmunohistóquímico se recogieron muestras de MER durante la VPP. Las principales variables estudiadas fueron MAVC, utilización de Triamcinolona intravítrea, grosor foveal central (GFC), alteración de capa de Henle y de líneas hiperreflectivas de capas externas a nivel foveal por SD-OCT, presencia de células de Müller, astrocitos, microglía residente, microglía activada y macrófagos. Se relacionó el resultado anatómico, funcional e inmunohistoquímico. RESULTADOS: Se evidenció una recuperación significativa (p<0,001) de la MAVC después de la VPP El grosor foveal central (GFC) y los quistes intraretinales no presentaron una asociación estadísticamente significativamente con la mejor agudeza visual corregida (MAVC). Se observó una recuperación significativa de las alteraciones de las cuatro líneas hiperreflectivas de capas externas y de la capa de Henle por SD-OCT después de la cirugía. El grupo celular más frecuente en las muestras de MER estudiadas fue la macroglia, observándose en todos los estadios evolutivos por SD-OCT. Se demostró la aparición, con mayor frecuencia, de la microglía residente, microglía activada y macrófagos en los pacientes que no presentaron alteraciones de líneas hipereflectivas de capas externas. Los pacientes que mostraron microglía activada y macrófagos en sus muestras de MER, tuvieron una mayor recuperación del GFC y de la MAVC. CONCLUSIONES: La mejoría de la agudeza visual de los pacientes con MER idiopáticas no depende del GFC ni de quistes intrarretinales; siendo la integridad de capas externas, en asociación con la agudeza visual, los mejores factores predictivos de recuperación visual en estos pacientes. Las alteraciones de la capa de Henle, y de las líneas hiperreflectivas de capas externas 1 y 4, fueron las variables anatómicas que presentaron una mayor asociación con la MAVC, antes y después de la cirugía. La presencia de microglía residente, microglía activada y macrófagos en la MER idiopática, podría ser un factor protector de alteraciones de líneas hiperreflectivas externas por SD-OCT.

Los ovocitos ováricos totalmente crecidos de anfibios están fisiológicamente arrestados en la profase de la primera división meiótica. La progesterona, a través de un proceso denominado maduración, induce el desarresto ovocitario que se traduce en la ruptura de la vesícula germinal (GVBD). Se acepta generalmente que la hormona desencadena la maduración por un mecanismo no genómico que involucra la inhibición de la adenilil ciclasa y la disminución del AMPc intracelular a través de la unión a un receptor ligado a la membrana plasmática. Como respuesta al estímulo hormonal se sintetiza la oncoproteína c-Mos cuya actividad biológica está mediada por la cascada de las proteínas activadas por mitógenos (MAPK). En conjunto con la activación de reguladores del ciclo celular estos caminos convergen en la activación del factor promotor de la maduración (MPF). Los rafts de membrana, en particular la estructura invaginada de las caveolae, podrían proporcionar un ambiente óptimo para la interacción entre la progesterona y el ovocito en la maduración meiótica. Sin embargo, las bases moleculares y los mecanismos de la posible participación de los microdominios caveolares en la transducción de señales de la maduración aún no han sido completamente dilucidados. En este trabajo de tesis se analizó el efecto de la maduración inducida por la progesterona sobre el contenido y la composición de los lípidos neutros y polares de las plaquetas vitelinas, organelas del ovocito de Bufo arenarum que cumplen un rol importante durante la embriogénesis. Se realizó un análisis cuantitativo de los lípidos y de las proteínas de las membranas de baja densidad aisladas de ovocitos ováricos y la identificación bioquímica y el estudio biofísico de los microdominios tipo-caveolares, como un requisito para comprender mejor sus funciones regulatorias. La metil-β-ciclodextrina (MβCD) se usó como herramienta para modular el colesterol celular con el fin de evaluar la participación de los rafts de membrana en la maduración inducida por progesterona y en la inducida por ceramida, disparador de la reiniciación de la meiosis en otras especies de anfibios. En particular, se indagó la vía de las MAPK en la señalización de la maduración meiótica. Se demostró que los lípidos de las plaquetas vitelinas están involucrados activamente en la reiniciación del ciclo meiótico lo que apoya la hipótesis de un rol dinámico de estas organelas. La maduración produjo una disminución en el contenido total de fosfolípidos fundamentalmente por la caída de fosfatidilcolina, un fosfolípido considerado esencial para que se complete la meiosis. Los principales cambios en el perfil de ácidos grasos se observaron en esfingomielina, en ácido fosfatídico y en los diacilgliceroles, lípidos bioactivos implicados en caminos de señalización celular. El tratamiento hormonal disminuyó el nivel de la esfingomielina plaquetaria lo que podría vincularse con su rol como precursor de ceramidas. Se pusieron a punto distintos métodos de aislamiento de microdominios de membrana y se logró obtener una fracción de membranas livianas en ausencia de detergentes. Se determinó que dicha fracción deriva de la membrana plasmática, está enriquecida en colesterol y en el gangliósido GM1 y presenta un nivel importante de esfingomielina. Las membranas livianas muestran un enriquecimiento en una caveolina de 21 kDa indicando la existencia de estructuras tipo-caveolares en el ovocito de Bufo arenarum. Además, están asociadas significativamente con las moléculas señales, c-Src y H-Ras. En estas membranas se encontró una banda proteica que, por espectrometría de masa, se identificó como la cadena pesada de la miosina no muscular planteando la posibilidad de una relación con el citoesqueleto. La depleción de colesterol, mediada por MβCD, afectó principalmente el nivel de colesterol de las membranas livianas alterando el orden lipídico y la localización de los marcadores moleculares de rafts, caveolina, c-Src y GM1, e inhibiendo la maduración de manera dosis-dependiente lo que sugiere que estos microdominios de membrana están involucrados en la inducción hormonal. La repleción de colesterol indicó una recuperación de la habilidad para madurar de los ovocitos tratados especialmente en la concentración de MβCD 25 mM en la cual la reversibilidad fue cercana al valor control. Se demostró que la ceramida es un inductor efectivo de la maduración que afecta la distribución de los marcadores moleculares de rafts en las fracciones de membrana. Por el contrario, la progesterona no parece afectar la integridad de los microdominios de membrana. En concordancia con la inhibición de la GVBD, el tratamiento con MβCD retardó la fosforilación en tirosinas y la activación de la p42 MAPK en la maduración inducida por progesterona. La presencia de los marcadores de rafts, caveolina, GM1, c-Src y H-Ras, y el hallazgo de moléculas señales de la cascada de las MAPK funcionalmente asociadas a las membranas livianas, sugieren que esta fracción enriquecida en microdominios tipo-caveolares puede, en parte, recrear eficazmente la señalización de la maduración. / Amphibian full-grown ovarian oocytes are physiologically arrested at the first meiotic prophase. Progesterone, through a mechanism called maturation, induces meiotic resumption represented by germinal vesicle breakdown (GVBD). It is generally accepted that progesterone hormone triggers maturation through a nongenomic mechanism that involves the inhibition of adenylyl cyclase and the reduction of intracellular cAMP by association with a plasma membrane receptor. As a response to the hormonal stimuli oncoprotein c-Mos is synthesized and its biological activity is mediated by the mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascade. Together with the activation of cell cycle regulators, both pathways converge in the activation of the M-phase promoting factor (MPF). Membrane rafts, particularly the invaginated structure of caveolae, seems to provide an optimal environment for hormone binding leading to meiotic maturation. However, the molecular bases and the mechanisms of the posible caveolar microdomain involvement in maturation signal transduction pathways have not been fully elucidated to date. In the present thesis, the effect of progesterone-induced maturation on the quantity and composition of neutral and polar lipids of yolk platelets, organelles from Bufo arenarum oocyte that play an important role during embryogenesis, were analyzed. A quantitative analysis of lipids and proteins of low-density membranes isolated from ovarian oocytes and the biochemical identification and a biophysical study of caveolae-like microdomains were performed as a requisite to further understand how these domains carry out their regulatory functions. Methyl-β-cyclodextrin (MβCD) was thus used for cellular cholesterol modulation in order to assess the membrane raft involvement in maturation induced by progesterone and by ceramide, the latter being trigger of meiosis reinitiation in other amphibian species. We demonstrated that lipids from yolk platelets are actively involved in the resumption of the meiotic cell cycle supporting the hypothesis of a dynamic role for these organelles. Phospholipid content decreased mainly as a result of a fall at the level of phosphatidylcholine, a phospholipid considered crucial for the completion of meiosis. Fatty acid composition registered significant changes in sphingomyelin, phosphatidic acid and diacylglycerols, bioactive lipids involved in cellular signaling pathways. Hormonal treatment induced a decrease at sphingomyelin level that could be related to its role as ceramide precursor. Different isolation methods were assayed to obtain membrane microdomains and a light membrane fraction was obtained in the absence of detergents. Light membranes derive from the plasma membrane, show an enrichment in cholesterol and GM1 ganglioside, and evidence an important level of sphingomyelin. The finding of a 21 kDa caveolin enriched in light membranes indicates the presence of caveolae-like structures in Bufo arenarum oocytes. In support of this finding, signaling molecules as c-Src and H-Ras are significantly associated to this fraction. A protein band was found in these membranes and it was identified as a non-muscle myosin heavy chain by mass spectrometry suggesting possible membrane-cytoskeleton interactions. Cholesterol depletion mediated by MβCD affected mainly light membranes cholesterol level disturbing lipid order and localization of rafts markers, caveolin, c-Src, and GM1 and inhibiting maturation in a dose-dependent manner, thus suggesting that these membrane microdomains are involved in hormonal induction. Cholesterol repletion showed a recovery of the ability of MβCD-treated oocytes to mature, particularly at the 25 mM concentration at which reversibility was close to control level. We also demonstrated that ceramide is an effective inducer of maturation that affects the distribution of raft markers among membrane fractions. On the contrary, progesterone seems not to affect membrane microdomain integrity. In agreement with GVBD inhibition, MβCD treatment delayed tyrosine phosphorylation and p42 MAPK activation in progesterone-induced maturation. The presence of the rafts markers, caveolin, GM1, c-Src, and H-Ras, and the finding of signaling molecules from the MAPK cascade functionally associated to light membranes suggest that this fraction enriched in caveolae-like microdomains could efficiently recreate, at least in part, maturation signaling.

O processo de Impressão à Tela foi desenvolvido neste trabalho para ser aplicável à deposição de camadas catalíticas em eletrólitos utilizados em PEMFC. Inicialmente foram construídos conjuntos eletrodos-membrana (MEAs) de 25 cm2 de área ativa e comparados com outros produzidos pelo método de Aspersão. Os dois métodos produziram MEAs que apresentaram densidades de corrente acima de 600 mA.cm-2 a 600 mV. Foi conduzido um estudo para o aumento de escala do MEA para 144 cm2 de área ativa. Para este fim, foi projetada uma célula para abrigar os MEAs destas dimensões. Neste projeto, o perfil dos canais de distribuição de gás foi desenvolvido através da ferramenta de fluido dinâmica computacional Comsol Multiphysics, sendo que, para o projeto das placas componentes da célula foi utilizado o AutoCAD. Os MEAs de 144 cm2 confeccionados por Aspersão e por Impressão à Tela foram confrontados com MEAs comerciais de iguais dimensões. Estes apresentaram melhor desempenho a 600 mV, entretanto são mais custosos que a solução desenvolvida neste estudo. O novo método apresentou-se adequado para a confecção de MEAs de baixo custo de diferentes geometrias e para a produção de lotes a serem utilizados em pequenos módulos de potência. / The Sieve Printing process was studied in this work to apply the catalyst layers onto electrolytes utilized in PEMFC. Initially, 25 cm2 active area MEAs were built for comparison with others MEAs produced by the Spray technique. The two methods produced MEAs that showed current densities higher than 600 mA.cm-2 at 600 mV. A scaling up study for 144 cm2 of active area MEAs was carried out. For this purpose, a new cell had to be projected for shelter the MEAs in such dimensions. The profile of the gas distribution channels was developed through the computational fluid dynamic tool Comsol Multiphysics. For the design of the bipolar plates of the cell the AutoCAD was used. The 144 cm2 MEAs made by Spray and by Sieve Printing methods were confronted with commercials MEAs ones of equal dimensions. These commercials MEAs presented better performance at 600 mV, however they were more costly than the solution developed in this study. The new method was showed to be adequate to fabricate low cost MEAs of different geometries and to produce any amount of MEAs for small scale stacks (up to 10 kW).