En esta memoria nos planteamos profundizar en el potencial eléctrico de disoluciones de electrolitos no en equilibrio. Los límites que imponemos son considerar al sistema en equilibrio mecánico y térmico, así como trabajar con disoluciones de electrolitos con ión común. La variable que proponemos es el potencial eléctrico medido con electrodos reversibles. El marco teórico empleado ha sido la Termodinámica de los Procesos Irreversibles. Los flujos de la formulación propuesta son las densidades de flujo de los constituyentes iónicos y la densidad de corriente eléctrica.La principal característica de la nueva formulación es que discrimina el equilibrio de distribución de los constituyentes iónicos en dos componentes:1) Equilibrio de distribución de los electrolitos.2) Equilibrio eléctrico, que preferentemente es caracterizado por valores nulos de la densidad de corriente eléctrica en todo el sistema.La formulación propuesta se ha aplicado a tres casos:1) Potencial eléctrico en la unión líquida de un sistema ternario.2) Potencial eléctrico en pilas gravitacionales o rotacionales.3) Medida de números de transporte en sistemas de membrana. El modelo desarrollado para membranas nos permite caracterizar la asimetría de las membranas mediante las diferencias del número de transporte en ambas caras de la membrana en contacto con la disolución. Las membranas utilizadas en las medidas experimentales han sido membranas asimétricas de acetato de celulosa y polisulfónicas empleadas en ósmosis inversa.

O processo de Impressão à Tela foi desenvolvido neste trabalho para ser aplicável à deposição de camadas catalíticas em eletrólitos utilizados em PEMFC. Inicialmente foram construídos conjuntos eletrodos-membrana (MEAs) de 25 cm2 de área ativa e comparados com outros produzidos pelo método de Aspersão. Os dois métodos produziram MEAs que apresentaram densidades de corrente acima de 600 mA.cm-2 a 600 mV. Foi conduzido um estudo para o aumento de escala do MEA para 144 cm2 de área ativa. Para este fim, foi projetada uma célula para abrigar os MEAs destas dimensões. Neste projeto, o perfil dos canais de distribuição de gás foi desenvolvido através da ferramenta de fluido dinâmica computacional Comsol Multiphysics, sendo que, para o projeto das placas componentes da célula foi utilizado o AutoCAD. Os MEAs de 144 cm2 confeccionados por Aspersão e por Impressão à Tela foram confrontados com MEAs comerciais de iguais dimensões. Estes apresentaram melhor desempenho a 600 mV, entretanto são mais custosos que a solução desenvolvida neste estudo. O novo método apresentou-se adequado para a confecção de MEAs de baixo custo de diferentes geometrias e para a produção de lotes a serem utilizados em pequenos módulos de potência. / The Sieve Printing process was studied in this work to apply the catalyst layers onto electrolytes utilized in PEMFC. Initially, 25 cm2 active area MEAs were built for comparison with others MEAs produced by the Spray technique. The two methods produced MEAs that showed current densities higher than 600 mA.cm-2 at 600 mV. A scaling up study for 144 cm2 of active area MEAs was carried out. For this purpose, a new cell had to be projected for shelter the MEAs in such dimensions. The profile of the gas distribution channels was developed through the computational fluid dynamic tool Comsol Multiphysics. For the design of the bipolar plates of the cell the AutoCAD was used. The 144 cm2 MEAs made by Spray and by Sieve Printing methods were confronted with commercials MEAs ones of equal dimensions. These commercials MEAs presented better performance at 600 mV, however they were more costly than the solution developed in this study. The new method was showed to be adequate to fabricate low cost MEAs of different geometries and to produce any amount of MEAs for small scale stacks (up to 10 kW).

La demanda mundial de agua ha ido aumentando y seguirá creciendo de manera significativa en los próximos años en función del aumento de la población, del desarrollo económico y los cambios en los patrones de consumo, entre otros factores. Los niveles extremadamente bajos de tratamiento de las aguas residuales en los países con ingresos medios-altos y medios-bajos, y la reducción del agua disponible muestran la imperiosa necesidad de realizar mejoras tecnológicas para contar con opciones seguras para la reutilización del agua. La composición de las aguas residuales municipales puede variar notoriamente, debido a la gran diversidad de contaminantes liberados por las distintas fuentes domésticas, industriales, comerciales e institucionales. Los hábitos de consumo de la sociedad actual generan una serie de contaminantes en el agua residual que anteriormente no eran conocidos y/o no detectados. Estos microcontaminantes (MCs) se introducen a diario en el medio ambiente en muy bajas concentraciones, principalmente a través de los efluentes de las estaciones depuradoras de aguas residuales (EDARs) actuales. El constante aumento en el uso de MCs requiere tecnologías de tratamiento más eficientes para lograr su reducción o eliminación en las aguas residuales. En las grandes y medianas aglomeraciones urbanas el procedimiento más habitual para el tratamiento de los vertidos líquidos es el de lodos activados, en sus distintas modalidades, que desde sus primeras aplicaciones a principios del siglo XX se ha convertido en el tratamiento mundialmente más extendido. No obstante, con el objetivo de mejorar la calidad del efluente obtenido en este tratamiento convencional y promover su reutilización, en los últimos años se intensificaron las investigaciones de otras posibles tecnologías para el tratamiento de las aguas residuales. La tecnología MBR (Membrane Biological Reactor o Membrane Bioreactor) es conocida por producir efluentes de elevada calidad y eliminar eficazmente una amplia gama de MCs, incluidos algunos compuestos que son resistentes al proceso de lodos activados y otros procesos convencionales. Los MBR incluyen dos procesos principales: la unidad biológica, responsable de la degradación de la materia orgánica presente en el agua residual (biodegradación), y la unidad de filtración, encargada de llevar a cabo la separación sólido-líquido del licor mezcla. En el campo de tratamiento de aguas residuales, los MBR son muy valorados por sus ventajas, aunque también presentan algunos inconvenientes. A pesar de los numerosos avances tecnológicos logrados a lo largo de los años, el ensuciamiento de la membrana sigue siendo uno de los mayores desafíos en la aplicación de esta tecnología. Esta desventaja se debe a múltiples causas, principalmente derivados de las características de las membranas, de la biomasa y del afluente, así como de las condiciones de operación. Estudios recientes reportan que para incrementar la eliminación de los contaminantes más recalcitrantes se puede combinar este proceso con otras tecnologías. Así, algunos trabajos realizados en casi su totalidad con aguas sintéticas, demuestran que la integración de procesos electroquímicos (electrocoagulación, EC) con la tecnología MBR ofrece prometedoras ventajas. La electrocoagulación es una tecnología bastante conocida y utilizada desde hace muchos años principalmente en el tratamiento de aguas residuales industriales. El proceso se lleva a cabo mediante la generación in situ de coagulantes debido a la aplicación de una corriente eléctrica que provoca la oxidación electrolítica de un material anódico apropiado, comúnmente de aluminio o de hierro. En este sentido surge un sistema innovador, el Electro-Biorreactor de Membrana (EMBR) que combina las ventajas de las tecnologías MBR (tratamiento biológico y filtración de membrana) y electrocoagulación. La aplicación de la EC puede ser capaz de reducir la adhesión de sustancias en la superficie de la membrana y mejorar la eficiencia de eliminación de diversos contaminantes. Esta investigación aborda la puesta en marcha y operación de un EMBR piloto para el tratamiento de aguas residuales reales, con el objetivo general de verificar si se reduce el ensuciamiento de la membrana, en relación con un MBR sin electrocoagulación, y si se mejora de la calidad del efluente. La planta piloto EMBR se ubicó en dos depuradoras distintas, realizándose por tanto la investigación en dos etapas, primero en la EDAR de Santomera (Murcia, España) y posteriormente en la EDAR de Monte Orgegia (Alicante, España). Se verificó de esta manera el comportamiento del EMBR con distintas características del afluente y factores estacionales. En la EDAR de Santomera, la planta piloto se alimentó con un agua residual municipal que incorpora un significativo componente industrial, mientras que en la EDAR de Monte Orgegia el agua residual urbana no tiene aporte industrial. La temperatura varió entre 12 y 30°C, el pH entre 6,7 y 8,0 y la conductividad entre 1.500 y 4.000 µS/cm. En las dos etapas de la investigación se evaluó el impacto de la densidad de corriente (DC) aplicada sobre la calidad del efluente, las propiedades del lodo y el ensuciamiento de la membrana, y los resultados fueron comparados con el sistema MBR convencional. Para analizar la calidad del efluente se verificó el grado de reducción de materia orgánica (DQO), nutrientes (nitrógeno total, amonio, fósforo total) y de un total de 22 microcontaminantes (9 fármacos, 4 parabenos, 3 hormonas, 2 surfactantes, 1 plastificante, 1 producto de higiene personal y 2 pesticidas). Respecto a las propiedades del lodo, se analizaron los parámetros biocinéticos, los bioindicadores, los sólidos suspendidos (MLSS), la viscosidad, el índice volumétrico (IVF), la morfología flocular y las sustancias poliméricas extracelulares (EPS). Para la medición del ensuciamiento de la membrana se verificó la evolución de la presión transmembrana (PTM). Los resultados obtenidos en cada fase fueron contrastados mediante análisis estadístico. En relación a la mejora de calidad del efluente, los resultados demostraron que el sistema EMBR incrementó su calidad, principalmente respecto a la eliminación de fósforo, y los contaminantes carbamazepina, claritromicina y diclofenaco. En relación a la eficiencia en la reducción del ensuciamiento de la membrana, el sistema EMBR presentó un impacto positivo en las propiedades del lodo y consecuentemente en el ensuciamiento de la membrana. El índice volumétrico de fango (IVF), la viscosidad y las fracciones de proteínas y carbohidratos de las EPS solubles presentaron reducciones significativas respecto al MBR. Por su parte, se logró disminuir la PTM hasta un 73%, con una DC de 5 A/m2 lo que nos indica que con un bajo consumo energético (0,16 kWh/m3) es posible lograr una buena sinergia entre las tecnologías MBR y la electrocoagulación.

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 josefranciscogandolfi_tese.pdf: 946147 bytes, checksum: 007d161afcdde952537f95c14f87bb0c (MD5) Previous issue date: 2006-03-06 / Introduction: Extracorporeal pulmonary assistance has been proposed as an invasive alternative to the conventional treatment when adequate oxygenation becomes impossible by mechanical ventilation. Extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) attained using assisted circulation may cause hemolysis, coagulation disorders, an inflammatory response and complications inherent to a high-risk high-cost procedure. The objective of this work was to evaluate the efficacy, both in vitro and ex vivo, of a low-resistance oxygenator in ECMO without assisted circulation. Material and Method: Initially, different prototypes of the low-resistance membrane oxygenator were developed to test the influence of the of inlet and outlet conditions of the blood, the area, the quantity and placement of the fibers in the oxygenation process and the removal of carbon dioxide gas (CO2). In the in vitro tests when bovine blood was utilized, the mean flow, volume of blood needed to fill the oxygenator and for priming, oxygen saturation, carbon dioxide gas exchange and the pressure gradient were measured. For the ex vivo experiments, five Santa Inês sheep, weighing between 5 and 33 kg, were used. In each animal, variations in respect to the oxygen saturation, the PO2 and the PCO2 were studied in the systemic blood at the outlet of the oxygenator and of the venous blood using oxygen flow rates of 0.5L/min, 1.0 L/min and 1.5 L/min. Results: The oxygenator had an excellent mechanical performance, which was seen by the PO2, PCO2 and oxygen saturation of the blood at the outlet of the oxygenator. From the clinical point of view, the improvement in the PO2 and oxygen saturation and the reduction in PCO2 of the systemic arterial blood (femoral artery of the sheep), were evident in the five sheep. A tendency of better results was seen when the weight was less than 10kg. Translating these relationships in terms of blood flow and total volume, the best results appeared when the blood flow in the oxygenator/volume proportion was 20% or greater, establishing this cutoff point as the ideal flow necessary for the best performance of the oxygenator. Conclusion: The in vitro and ex vivo performance tests achieved with the low-resistance membrane oxygenator used in arteriovenous extracorporeal circulation without the assistance of a propulsion pump, proved that this device is capable of providing oxygen and removing carbon dioxide from the blood in sufficient quantities to maintain the tested parameters at acceptable limits when ventilation is prejudiced. / Introdução: A assistência pulmonar extracorpórea tem sido proposta como uma alternativa invasiva ao tratamento convencional, quando a oxigenação adequada torna-se impossível pelo uso de ventilação mecânica. A oxigenação extracorpórea por membrana (ECMO) realizada com auxílio circulatório pode produzir hemólise, distúrbios da coagulação, resposta inflamatória e complicações inerentes a um procedimento de alto risco e elevado custo. O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia in vitro e ex vivo de um oxigenador de baixa resistência em ECMO sem auxílio circulatório. Material e Método: Inicialmente foram desenvolvidos diferentes protótipos do oxigenador de membrana de baixa resistência para testar a influência das condições de entrada e saída do sangue, área, quantidade e disposição das fibras no processo de oxigenação e remoção de gás carbônico (CO2). Nos testes in vitro, utilizando-se sangue bovino, foram avaliados fluxo médio, volume de sangue necessário para preencher o oxigenador ou priming, saturação de oxigênio e transferência de gás carbônico e o gradiente de pressão. Nos experimentos ex vivo foram utilizados cinco carneiros da raça Santa Inês, pesando entre 5 a 33 Kg. Em cada animal foram estudadas as variações com relação à saturação de O2, PO2 e PCO2, no sangue sistêmico, na saída do oxigenador e no sangue venoso com fluxos de oxigênio no oxigenador 0,5 L/min, 1,0 e 1,5 L/min. Resultados: O oxigenador demonstrou excelente desempenho mecânico, o que pode ser verificado pelos valores de PO2, PCO2 e SatO2 do sangue na saída do oxigenador. Do ponto de vista clínico, a melhora de PO2 e SO2 e a redução de PCO2 no sangue arterial sistêmico (artéria femoral do carneiro) foram evidentes nos cinco experimentos. Foi possível observar uma tendência para melhores resultados com pesos inferiores a 10,0 kg. Traduzindo-se essas relações em termos de fluxo sanguíneo e volemia total, os melhores resultados apareceram com proporção fluxo sangüíneo no oxigenador/volemia, de 20% ou maior, podendo-se estabelecer esse limite de corte, como fluxo ideal necessário para bom desempenho do oxigenador. Conclusão: Os testes de performance in vitro e desempenho ex vivo, realizados com o oxigenador de membrana de baixa resistência ao fluxo, para uso em circulação extracopórea arteriovenosa, sem o auxílio de bomba propulsora, mostraram resultados suficientes para concluir que tais dispositivos são capazes de fornecer Oxigênio e retirar gás Carbônico do sangue em quantidades suficientes para manter tais parâmetros em níveis aceitáveis, quando a ventilação está prejudicada.

O alumínio é limitante à atividade agrícola em todo o mundo. Nos solos ácidos a disponibilidade de Al aumenta. Estes solos constituem a maioria dos solos do mundo e dois terços dos solos brasileiros. O problema da acidez do solo e da toxicidade por Al é altamente significativo para as perdas na produtividade agrícola e florestal. Para se ter Al disponível, primeiramente tem que se ter condições de pH baixo. O primeiro sintoma causado pela toxicidade por Al é a inibição no alongamento do sistema radicular. Existem trabalhos vinculando a inibição a alterações nos processos de divisão e expansão celular. Embora os mecanismos de toxicidade e resistência ao Al não estejam totalmente elucidados, admite-se que em algumas plantas, a quelação do Al por ácidos orgânicos é um dos mecanismos que confere resistência das células ao Al, assim como em outras plantas a elevação do pH da rizosfera, por compostos liberados pelo sistema radicular, atua na queda da disponibilidade do Al na solução do solo. Porém, existem outras alternativas que vêm sendo propostas na literatura como possíveis mecanismos de resistência das plantas ao Al, principalmente ao nível celular e molecular. Alterações nas composições lipídica e protéica da membrana plasmática, assim como na sua estrutura física; ativação do sistema antioxidante celular; alterações na sinalização celular e de atividade dos canais de troca da membrana plasmática vêm sendo estudados como possíveis contribuintes para os mecanismos de resistência ao Al. A sensibilidade celular ao Al depende do seu estágio de desenvolvimento. As células sensíveis ao Al acumulam o metal, enquanto que as resistentes acumulam muito pouco. Foi constatado em nosso trabalho que as células sensíveis ao Al também são sensíveis ao baixo pH. As células sensíveis não conseguem recuperar seu crescimento e sua viabilidade celular após a exposição ao Al ou ao baixo pH.A sacarose ou manitol conferiram proteção às células quanto ao acúmulo de Al. Isso fez com que a viabilidade mantivesse-se em níveis próximos ao controle (pH5,6) e a cultura conseguisse recuperar seu crescimento e viabilidade após a exposição ao Al e ao baixo pH. O efeito protetor não foi devido ao caráter energético da sacarose, pois o manitol não é metabolizado pelas células BY-2 e os resultados foram semelhantes quando se usou sacarose ou manitol, nas mesmas concentrações. Sabe-se que o Al aumenta a peroxidação lipídica e a oxidação protéica da membrana plasmática, pela geração de EAO?s, desencadeando o processo de estresse oxidativo na célula. Em nosso estudo, nas células sensíveis houve peroxidação dos lipídios, ativação do sistema de enzimas antioxidantes, como SOD, GST, GR, CAT e APX, alteração nos níveis de carboidratos e alteração no perfil protéico de frações enriquecidas de membrana plasmática, obtido por eletroforese 2D. O mesmo comportamento foi verificado em células sensíveis tratadas a baixo pH. Pode-se concluir que o sistema antioxidante celular foi ativado na presença de baixo pH ou Al, pela ocorrência de peroxidação lipídica, que gera maiores concentrações de H2O2 nas células sensíveis (fase log). E que existem diferenças no perfil protéico de células tratadas com Al em relação a células mantidas sob condições de cultivo, tanto em presença de spots como em expressão diferencial. Porém estas diferenças necessitam ser melhores exploradas. A peroxidação lipídica é um bom indicador da sensibilidade celular ao Al e ao baixo pH, assim como a ativação do sistema antioxidante e a geração do peróxido de hidrogênio. Poderiam ser realizados experimentos no tempo, medindo-se o acúmulo de Al e relacionando-o aos níveis de peroxidação lipídica, atividade das enzimas antioxidantes e geração do peróxido, para que pudéssemos indicar talvez um processo que se iniciasse antes que outro, ou mesmo que decaísse antes do outro. Assim como um monitoramento das condições de oxidação protéica na presença de Al. / Aluminum limits crop production in all over the world. In acid solis the Al disponibility is larger. Acid soils compose the major part of the brazillian soils. The problem of acidity and Al toxicity results in losses of productivity in agriculture and forestry. The first symptom of Al toxicity is inhibition of root growth. There is many studies that indicate relations between the inhibition of root growth and cell division and expansion alterations. The mechanisms of Al toxicity and resistance aren?t completely understood in plants. The resistance mechanism of Al chelation by organic acid is one of the mechanisms accept, like the elevation of the rizosphere pH by substances exsudated by the root system. Other possible mechanisms that are being mentionated are the alterations in plasma membrane composition and structure, antioxidant cell system activation, alterations in cell signal and alterations in the membrane channels activity. Aluminum cell sensibility depends of the status cellular. The cells that are sensible to Al, are in the log phase of growth and accumulate the metal, whereas the resistant cells do not accumulate and were in the stationary phase of growth. In our work, we observed that the sensible cells are sensible to low pH too. The sensible cells don?t recover their growth rate and cellular viability after the treatment exposition. Sucrose or mannitol confers cellular protection against the Al. The cellular viability was high (next to the control, pH5,6) and the cell culture recovery their growth and viability after the Al or low pH exposition. The protective effect don?t occurs in response to the energetic role of sucrose, because cells treated with mannitol showed the same results and the mannitol did not metabolizated by tobacco BY-2 cells. Al induces lipid peroxidation and protein oxidation in plasma membrane, by the ROS generation promoting the oxidative stress. We found that sensible Al cells showed lipid peroxidation, H2O2 generation, antioxidant enzymes activation (SOD, le carbohydrate levels and protein profile alterations by 2D electrophoresis. The same responses were observed in the pH sensible cells, at log phase of growth. This differences should be more explored. We concluded that the lipid peroxidation is an indicator of sensitivity to Al and low pH, like the antioxidant enzymes activities and the H2O2 generation. Studies should be done with the Al accumulated in time, measuring the activities of antioxidant system and the lipid peroxidation with the objective to indicated what process could start firstly

Objetivo: Estudar e comparar a acuidade visual, metamorfopsia, espessura foveal, camada limitante externa e zona elipsoide por meio da Tomografia de Coerência Óptica (OCT), e a taxa de recorrência dos pacientes operados de remoção de membrana epirretiniana, com e sem a retirada da membrana limitante interna. Métodos: Pacientes com MER operados por um único cirurgião e randomizados, aleatoriamente, em dois grupos. Todos os pacientes tiveram a retirada da membrana epirretiniana: 35 pacientes do Grupo 01, sem a adicional retirada de membrana limitante interna, e 28 pacientes do Grupo 02, com a retirada dessa membrana. Os pacientes foram seguidos e avaliados no primeiro, terceiro e sexto mês. Resultados: Setenta pacientes operados no total, sendo sete excluídos por perda de seguimento. Os pacientes de ambos os grupos evoluíram com melhora gradativa da visão ao longo do tempo. No Grupo 01, a média de acuidade visual inicial foi 0,60 logMAR (±0,3 desvio padrão - DP), no primeiro mês foi 0,49 logMAR (±0,26 DP), no terceiro mês, 0,39 logMAR (±0,30 DP) e no sexto mês, 0,27 logMAR (±0,25 DP). No Grupo 02, a média de acuidade visual inicial foi 0,63 logMAR (±0,25 DP), no primeiro mês foi 0,44 logMAR (±0,26 DP), no terceiro mês, 0,41 logMAR (±0,35 DP), e no sexto mês, 0,43 logMAR (0,44 DP). Não houve diferença estatisticamente significante quanto à melhora da acuidade visual entre os dois grupos. Não foi encontrada diferença estatisticamente significante em relação às alterações na OCT entre os grupos. O Grupo 02 apresentou maior taxa de recidiva (17%) quando comparada com o Grupo 01 (3,6%), embora esta diferença não foi estatisticamente significante (p=0,09). Conclusão: Ambos os grupos apresentaram melhora funcional e anatômica semelhantes, mas o grupo no qual não se removeu a membrana limitante interna mostrou uma possível tendência à maior taxa de recidiva / Objective: To study and compare the visual acuity, metamorphosis, foveal thickness, the outer limiting layer and the ellipsoid zone, studied by Optic Coherence Tomography (OCT), and the recurrence rate of patients undergoing removal of epiretinal membrane with and without the removal of the internal limiting membrane. Methods: Seventy patients undergoing removal of epiretinal membrane, by a single surgeon and randomly assigned into two groups. Group 1, without additional removal of internal limiting membrane, 35 patients, and group 2 with the removal of the internal limiting membrane, 28 patients. Both groups were followed and evaluated in the first, third and sixth month. Results: Patients of both groups developed with a gradual improvement of vision over time. In group 1, the mean initial visual acuity was 0.60 logMAR (±0.3 standard deviation - SD), the average visual acuity of the first month was 0.49 logMAR (±0.26 SD), in the third month 0.39 logMAR (±0.30 DP), and in the sixth month logMAR 0.27 (±0.25 SD). In group 2, the mean initial visual acuity was 0.63 logMAR (±0.25 SD), average visual acuity of the first month was 0.44 (±0.26 DP) logMAR, in the third month 0.41 logMAR (±0.35 DP), and in the sixth month 0.43 logMAR (±0.44 DP). There was no statistical difference in improvement in visual acuity between the two groups, there was no statistically significant differences related to tomographic alterations between the groups, but the group 2 showed a higher relapse rate (17%) compared to the group 1 (3.6%). Although the difference is not statistically significant (p=0.09). Conclusion: Both groups showed similar functional and anatomical improvement, but the group which the internal limiting membrane was not removed showed a higher recurrence rate

O prion celular (PrPc) é uma glicoproteína ligada à membrana plasmática por uma âncora de GPI (glycosylphosphatidylinositol). A sua isoforma anormal (PrPsc) é uma molécula infecciosa que causa várias doenças neurodegenerativas em mamíferos. A etiologia dessas doenças está associada a uma mudança conformacional pós-traducional de PrPc que ocorre após sua internalização (Prusiner, 1998). Na tentativa de desvendar as funções fisiológicas de PrPc, nosso grupo tem identificado e caracterizado as interações celulares que PrPc participa. A primeira delas é a interação entre PrPc e STI1 (Stress Inducible Protein 1). Essa interação transduz sinalização por cAMP e PKA levando a neuroproteção contra morte celular programada (Chiarini e cols, 2002; Zanata e cols, 2002). A segunda é a interação específica que existe entre PrPc e as proteínas da matriz extracelular, laminina e vitronectina, contribuindo para os processos neuronais, tais como crescimento, manutenção (Graner e cols., 2000 a e b) e regeneração dos neuritos (Hajj e cols., submetido), além da formação de memória de curta e longa duração (Coitinho e cols., submetido). Na primeira parte deste trabalho, procuramos investigar os genes regulados pelos sinais resultantes dessas interações e também pela remoção de PrPc usando a técnica de \"differential display\'\' RT-PCR. Na segunda parte do trabalho, caracterizamos que a interação PrPc - laminina é capaz de induzir uma sinalização transitória de cálcio, a qual ocorre mesmo na ausência de cálcio do meio extracelular. PrPc é uma molécula que cicla continuamente entre a membrana plasmática e os compartimentos intracelulares. Estudos recentes têm correlacionado o processo de internalização de PrPc com alguns dos seus papeis fisiológicos, tais como, homeostase de Cu2 + (Brown, 2001 ), interação com receptor de laminina (Gauczynski e cols, 2001) e até na conversão de PrPc para PrPsc (McKinley e cols, 1991; Arnold e cols, 1995). Portanto, na terceira parte deste trabalho, caracterizamos a localização e o tráfego celular de PrPc mostrando que PrPc está localizado na membrana plasmática e em compartimentos intracelulares e que trafega pelo Golgi, membrana plasmática, endossomos iniciais e de reciclagem. Foram mapeados ainda domínios na região amino-terminal responsáveis pela internalização de PrPc e na região carboxi-terminal como participantes da via secretora. Este trabalho contribuiu para o esclarecimento de alguns eventos biológicos relacionados à sinalização e ao tráfego de PrPc. Estes achados são de grande importância para a determinação das funções celulares de PrPc e ainda dos mecanismos envolvidos com as doenças relacionadas com esta molécula. / The cellular prion protein (PrPc) is a glycoprotein anchored to the plasma membrane by GPI (Glycosyl-phosphatidylinositol). Its abnormal isoform (PrPsc) is the infectious protein responsible for several neurodegenerative diseases. The main etiology of the prion diseases is related to conformational changes in the PrPc molecule, which occur after its internalization (Prusiner, 1998). In order to elucidate the physiological functions of PrPc, our group identified and characterized interactions between PrPc and other cellular molecules. The first is the interaction between PrPc and STI 1 (Stress Inducible Protein 1). This interaction has an important role in the neuroprotection against apoptosis through cAMP and PKA signaling (Chiarini et al., 2002; Zanata et al., 2002). PrPc also interacts with proteins of the extracellular matrix such as laminin and vitronetin. These interactions contribute for neurite outgrowth, maintenance and regeneration (Graner et al., 2000 a and b; Hajj et al., submitted) and also in memory formation (Coitinho et al., submitted). In the first part of this work we have applied the differential dysplay RTPCR technique in order to identify genes that are regulated by PrPc - STI 1 interaction and also by the deletion of PrPc. In the second part we have demonstrated that PrPc-laminin interaction induces transient calcium signaling in neuronal cells, which occurs even in the absence of extracellular calcium. PrPc cycles continuously between the plasma membrane and intracellular compartments. This mechanism is associated with some of the physiological function of PrPc, such as Cu2+ homeostasis (Brown, 2001 ), interaction with laminin receptor (Gauczynski et al., 2001 ), and PrPc conversion into PrPsc (McKinley et al., 1991; Arnold et al., 1995). Thus, in the third part of this project, we have characterized the PrPc localization at the cell surface and in intracellular compartments. The protein trafficking through Golgi apparatus, plasma membrane, early and recycling endosomes was also defined. Moreover, we have determinated that N-terminus PrPc domain is responsible for its internalization while C-terminus participates in PrPc delivery. Therefore, this work has contributed to elucidate biological events related to the cell signaling and trafficking of PrPc, which are important for the characterization of PrPc physiological functions and to understand the pathological mechanisms related to this molecule.

O prion celular (PrPc) é uma glicoproteína ligada à membrana plasmática por uma âncora de GPI (glycosylphosphatidylinositol). A sua isoforma anormal (PrPsc) é uma molécula infecciosa que causa várias doenças neurodegenerativas em mamíferos. A etiologia dessas doenças está associada a uma mudança conformacional pós-traducional de PrPc que ocorre após sua internalização (Prusiner, 1998). Na tentativa de desvendar as funções fisiológicas de PrPc, nosso grupo tem identificado e caracterizado as interações celulares que PrPc participa. A primeira delas é a interação entre PrPc e STI1 (Stress Inducible Protein 1). Essa interação transduz sinalização por cAMP e PKA levando a neuroproteção contra morte celular programada (Chiarini e cols, 2002; Zanata e cols, 2002). A segunda é a interação específica que existe entre PrPc e as proteínas da matriz extracelular, laminina e vitronectina, contribuindo para os processos neuronais, tais como crescimento, manutenção (Graner e cols., 2000 a e b) e regeneração dos neuritos (Hajj e cols., submetido), além da formação de memória de curta e longa duração (Coitinho e cols., submetido). Na primeira parte deste trabalho, procuramos investigar os genes regulados pelos sinais resultantes dessas interações e também pela remoção de PrPc usando a técnica de \"differential display\'\' RT-PCR. Na segunda parte do trabalho, caracterizamos que a interação PrPc - laminina é capaz de induzir uma sinalização transitória de cálcio, a qual ocorre mesmo na ausência de cálcio do meio extracelular. PrPc é uma molécula que cicla continuamente entre a membrana plasmática e os compartimentos intracelulares. Estudos recentes têm correlacionado o processo de internalização de PrPc com alguns dos seus papeis fisiológicos, tais como, homeostase de Cu2 + (Brown, 2001 ), interação com receptor de laminina (Gauczynski e cols, 2001) e até na conversão de PrPc para PrPsc (McKinley e cols, 1991; Arnold e cols, 1995). Portanto, na terceira parte deste trabalho, caracterizamos a localização e o tráfego celular de PrPc mostrando que PrPc está localizado na membrana plasmática e em compartimentos intracelulares e que trafega pelo Golgi, membrana plasmática, endossomos iniciais e de reciclagem. Foram mapeados ainda domínios na região amino-terminal responsáveis pela internalização de PrPc e na região carboxi-terminal como participantes da via secretora. Este trabalho contribuiu para o esclarecimento de alguns eventos biológicos relacionados à sinalização e ao tráfego de PrPc. Estes achados são de grande importância para a determinação das funções celulares de PrPc e ainda dos mecanismos envolvidos com as doenças relacionadas com esta molécula. / The cellular prion protein (PrPc) is a glycoprotein anchored to the plasma membrane by GPI (Glycosyl-phosphatidylinositol). Its abnormal isoform (PrPsc) is the infectious protein responsible for several neurodegenerative diseases. The main etiology of the prion diseases is related to conformational changes in the PrPc molecule, which occur after its internalization (Prusiner, 1998). In order to elucidate the physiological functions of PrPc, our group identified and characterized interactions between PrPc and other cellular molecules. The first is the interaction between PrPc and STI 1 (Stress Inducible Protein 1). This interaction has an important role in the neuroprotection against apoptosis through cAMP and PKA signaling (Chiarini et al., 2002; Zanata et al., 2002). PrPc also interacts with proteins of the extracellular matrix such as laminin and vitronetin. These interactions contribute for neurite outgrowth, maintenance and regeneration (Graner et al., 2000 a and b; Hajj et al., submitted) and also in memory formation (Coitinho et al., submitted). In the first part of this work we have applied the differential dysplay RTPCR technique in order to identify genes that are regulated by PrPc - STI 1 interaction and also by the deletion of PrPc. In the second part we have demonstrated that PrPc-laminin interaction induces transient calcium signaling in neuronal cells, which occurs even in the absence of extracellular calcium. PrPc cycles continuously between the plasma membrane and intracellular compartments. This mechanism is associated with some of the physiological function of PrPc, such as Cu2+ homeostasis (Brown, 2001 ), interaction with laminin receptor (Gauczynski et al., 2001 ), and PrPc conversion into PrPsc (McKinley et al., 1991; Arnold et al., 1995). Thus, in the third part of this project, we have characterized the PrPc localization at the cell surface and in intracellular compartments. The protein trafficking through Golgi apparatus, plasma membrane, early and recycling endosomes was also defined. Moreover, we have determinated that N-terminus PrPc domain is responsible for its internalization while C-terminus participates in PrPc delivery. Therefore, this work has contributed to elucidate biological events related to the cell signaling and trafficking of PrPc, which are important for the characterization of PrPc physiological functions and to understand the pathological mechanisms related to this molecule.

Aquesta tesi se centra en l’estudi de les possibles glicosiltransferases de Micoplasma genitalium involucrades en la síntesi de glicolípids. Aquests compostos formen part de la membrana plasmàtica del microorganisme, únic envolcall que el protegeix del seu entorn ja que no disposa de paret cel•lular. La hipòtesi sobre la qual s’ha desenvolupat el treball és la possibilitat que aquests glicolípids i els enzims encarregats de la seva producció, les glicosiltransferases, siguin essencials per a la viabilitat del micoplasma i per tant, la seva inhibició sigui una forma d’eradicar les infeccions causades pel patògen. De les tres seqüències classificades com a glicosiltrasferases en el genoma de Mycoplasma genitalium, mg025, mg060 i mg517, s’ha determinat que mg025 és l’únic dels tres gens que no és essencial per al bacteri, tot i que s’ha observat que els tres s’expressen tant a la fase exponencial com a la fase estacionària del seu creixement. La funció de mg025 i mg060 és encara desconeguda, mentre que mg517 és la glicosiltransferasa encarregada de la síntesi dels dos principals glicolípids del micoplasma, el monoglicosildiacilglicerol (MGlcDG) i el diglicosildiacilglicerol (DGlcDG). En aquesta tesi s’ha desenvolupat un protocol d’expressió per a la glicosiltransferasa codificada per mg517, anomenada GT-MG517, el qual fa ús d’una coexpressió amb xaperones i solubilitza la proteïna amb detergents, glicerol i una elevada força iònica. Aquesta metodologia ha estat necessària ja que GT-MG517 és una proteïna associada a membrana i la seva expressió recombinant en E.coli presenta dificultats. La proteïna s’ha purificat mitjançant cromatografia d’afinitat per Ni, tot i que el grau de puresa assolit no ha estat suficient per a intentar la seva cristal•lització. Les diverses proves realitzades usant cromatografia d’exclusió molecular han permès determinar que GT-MG517 forma oligòmers d’alt pes molecular. A partir de la proteïna purificada s’ha realitzat un estudi cinètic de la seva doble activitat glicosildiacilglicerolsintasa. D’aquest estudi s’extreu que GT-MG517 pot transferir un sucre, Glc o Gal, a una molècula principalment hidrofòbica, com és el DOG, i a una molècula molt més hidrofílica, com el MGlcDG. Ambdós compostos però posseeixen un alcohol primari sobre el qual té lloc la transferència creant l’enllaç (16). Amb qualsevol dels substrats acceptors provats, l’enzim presenta activitats específiques superiors si el substrat donador és UDP-Gal. L’acceptor preferit de GT-MG517 és el lípid DOG, però la glicosiltransferasa és capaç d’elongar, ja sigui amb una Glc o amb una Gal, glicolípids com el MGlcDG i el MGDEG, preferint en aquest cas el compost amb una Gal a l’extrem no reductor. Tot i això, l’afinitat de l’enzim és superior per a donadors amb Glc (KM inferiors a les dels donadors amb Gal). D’altra banda, s’ha demostrat que el lípid aniònic DOPG es comporta com a activador de l’activitat enzimática. GT-MG517 posseeix un teòric domini d’unió d’UDP-Glc a l’extrem N-terminal. Aquesta zona presenta similitud de seqüència amb altres glicosiltransferases i permet la classificació de GT-MG517 dins de la família GT-2. En canvi, el seu extrem C-terminal presenta una seqüència particular que no s’alinea amb altres proteïnes. En aquesta tesi es formula la hipòtesi que aquesta zona podria ser d’interacció amb la membrana i, a més, que aquesta interacció podria regular l’activitat enzimàtica. Per això es preparen diverses formes truncades de GT-MG517, en les quals s’eliminen alguns aminoàcids de l’extrem C-terminal, i una forma en la qual només es conserva l’hipotètic domini d’unió d’UDP-Glc. Aquestes noves proteïnes s’expressen, solubilitzen i purifiquen aplicant el protocol establert per a la forma completa. Amb l’anàlisi dels glicolípids sintetitzats s’estableix que els deu últims aminoàcids de GT-MG517 són prescindibles per a la seva activitat, ja que les formes truncades corresponents continuen tenint la capacitat de sintetitzar glicolípids. No obstant, l’eliminació d’un nombre superior de residus, inactiva la proteïna. La purificació de l’hipotètic domini d’unió d’UDP-Glc posa de manifest que forma oligòmers, de la mateixa forma que ho fa la proteïna completa. / Esta tesis se centra en el estudio de las posibles glicosiltransferasas de Mycoplasma genitalium involucradas en la síntesis de glicolípidos. Estas moléculas constituyen parte de la membrana plasmática del miroorganismo, única estructura de protección frente al entorno ya que los micoplasmas carecen de pared celular. La hipótesis sobre la cual se ha desarrollado el trabajo es la posibilidad que los mencionados glicolípidos y las enzimas encargadas de su producción, las glicosiltransferasas, sean esenciales para la viabilidad del micoplasma y, por tanto, su inhibición sea una forma de erradicar las infecciones causadas por el patógeno. De las tres secuencias clasificadas como glicosiltransferasas en el genoma de Mycoplasma genitalium, mg025, mg060 y mg517, se determinó que mg025 es el único de los tres genes que no es esencial para la bacteria, aunque se observó que los tres se expresan tanto en la fase exponencial como en la fase estacionaria de su crecimiento. Se desconoce todavía la función de mg025 y mg060. En cambio, se conoce que mg517 es la glicosiltransferasa responsable de la síntesis de los dos principales glicolípidos del micoplasma, el monoglicosildiacilglicerol (MGlcDG) y el diglicosildiacilglicerol (DGlcDG). En esta tesis se desarrolló un protocolo de expresión para la glicosiltransferasa codificada por mg517, llamada GT-MG517, el cual emplea una coexpresión con chaperonas y solubiliza la proteína con detergentes, glicerol y una fuerza iónica elevada. Dicha metodología fue necesaria ya que GT-MG517 es una proteína asociada a membrana y su expresión recombinante en E.coli presenta dificultades. La proteína se purificó mediante cromatografía de afinidad por Ni pero el grado de pureza obtenido no fue suficiente para intentar su cristalización. Distintas pruebas realizadas usando cromatografía d’exclusión molecular permitieron determinar que GT-MG517 forma oligómeros de alto peso molecular. Con la proteína purificada se realizó un estudio cinético de su doble actividad glicosildiacilglicerolsintasa. De este estudio se extrae que GT-MG517 puede transferir un azúcar, Glc o Gal, a una molécula principalmente hidrofóbica, como es el DOG, y a una molécula mucho más hidrofílica, como el MGlcDG. Pese a su diferencia, los dos compuestos poseen un alcohol primario sobre el que tiene lugar la transferencia creándose el enlace (16). Con cualquiera de los sustratos aceptores probados, la enzima presenta actividades específicas superiores si el sustrato dador es UDP-Gal. El aceptor preferido de GT-MG517 es el lípido DOG, aunque la glicosiltransferasa es capaz de elongar, ya sea con una Glc o con una Gal, glicolípidos como el MGlcDG y el MGDEG, prefiriendo en este caso el compuesto con una Gal en el extremo no reductor. Aún así, la afinidad de la enzima es superior para dadores con Glc (KM inferiores a las de los dadores con Gal). Por otro lado, se demostró que el lípido aniónico DOPG se comporta como activador de la actividad enzimática. GT-MG517 posee un dominio teórico de unión de UDP-Glc en su extremo N-terminal. Esta zona presenta similitud de secuencia con otras glicosiltransferasas y permite la clasificación de GT-MG517 dentro de la familia GT-2. En cambio, su extremo C-terminal presenta una secuencia particular que no se alinea con otras proteínas. En esta tesis se formula la hipótesis que dicha zona podría ser de interacción con la membrana y, además, que dicha interacción podría regular la actividad enzimática. Por eso se prepararon distintas formas trucadas de GT-MG517, en las cuales se eliminaron algunos aminoácidos del extremo C-terminal, y una forma en la cual sólo se conservó el hipotético dominio de unión de UDP-Glc. Las nuevas proteínas se expresaron, solubilizaron y purificaron aplicando el protocolo establecido para la forma completa. Con el análisis de los glicolípidos sintetizados se determinó que los diez últimos aminoácidos de GT-MG517 eran prescindibles para su actividad, ya que las correspondientes formas truncadas conservaban su capacidad de sintetizar glicolípidos. No obstante, la eliminación de un número superior de residuos inactiva la proteína. La purificación del hipotético dominio de unión de UDP puso de manifiesto que forma oligómeros, de la misma forma en que lo hace la proteína completa. / This thesis is focused on the glycolipid producing glycosyltransferases from Mycoplasma genitalium. Glycolipids are part of the microorganism plasma membrane, which is the external covering of mycoplasmas since they lack a cell wall. Our working hypothesis is that glycolipids and the enzymes responsible for their production are essential to mycoplasma. Thus, glycosyltransferase inhibition could be a way to eradicate this pathogen caused infections. There are three genes described as putative glycosyltransferases in Mycoplasma genitalium genome, mg025, mg060 and mg517. We determined that mg025 is the only one essential to the bacteria, although the three of them are expressed both during the exponential and stationary growth phases. The function of mg025 and mg060 still remains unknown, whereas mg517 codifies for the glycosyltransferase responsible for monoglycosyldiacylglycerol (MGlcDG) and diglycosyldiacylglycerol (DGlcDG) synthesis, main mycoplasma glycolipids. In this work an expression protocol for mg517 codified glycosyltransferase was designed. The protocol included chaperone coexpression and protein solubilization with detergents, glycerol and high ionic strength. This methodology was necessary since GT-MG517 is a membrane associated protein and its recombinant expression in E.coli presents some difficulties. GT-MG517 was purified by Ni affinity chromatography. However, a suitable purity degree to attempt protein crystallization was not achieved. Some experiments using size exclusion chromatography revealed that GT-MG517 forms high molecular weight oligomers. A kinetic study of the protein double glycosyldiacylglycerol synthase activity was performed. From this study we learned that GT-MG517 is able to transfer a sugar moiety, Glc or Gal, both to a hydrophobic molecule such as DOG or to a more hydrophilic compound such as MGlcDG. These acceptor substrates share a primary alcohol where the sugar transfer takes place forming a (16) bond. The enzyme presents higher specific activities when UDP-Gal acts as reaction donor, regardless of the acceptor tested. DOG is the preferred acceptor although the enzyme is able to transfer Glc or Gal moieties to glycolipids such as MGlcDG and MGDEG. In this case, the reaction is faster with acceptors with Gal in the non-reducing end. As for donor substrate, enzyme’s affinity is higher for Glc containing molecules, with lower KM values than for Gal donors. In addition, our study proved the anionic lipid DOPG to act as an enzymatic activity enhancer. GT-MG517 has a putative binding domain for UDP-Glc in the N-terminal end. This sequence is similar to other glycosyltransferases and allows its classification in Cazy’s GT-2 family. On the contrary, the C-terminal end has a particular sequence which does not match up with any other protein. Our hypothesis was that this C-terminal end of GT-MG517 could contain a membrane interaction sequence, which could at the same time modulate enzymatic activity. To test this hypothesis some truncated forms of GT-MG517, where C-terminal aminoacids had been removed, were prepared. Moreover, a form where only the putative UDP-Glc binding domain was conserved was also expressed. All these proteins were expressed, solubilized and purified with the same protocol used for the full-length form of GT-MG517. Glycolipids produced by truncated forms were analysed and results implied that the last ten aminoacids were not involved in the enzyme’s activity. Elimination of a higher number of aminoacids caused protein inactivation. When the putative UDP-binding domain was purified, it showed high molecular weight oligomers such as those developed by the complete form of the protein.

Objetivo: Estudar e comparar a acuidade visual, metamorfopsia, espessura foveal, camada limitante externa e zona elipsoide por meio da Tomografia de Coerência Óptica (OCT), e a taxa de recorrência dos pacientes operados de remoção de membrana epirretiniana, com e sem a retirada da membrana limitante interna. Métodos: Pacientes com MER operados por um único cirurgião e randomizados, aleatoriamente, em dois grupos. Todos os pacientes tiveram a retirada da membrana epirretiniana: 35 pacientes do Grupo 01, sem a adicional retirada de membrana limitante interna, e 28 pacientes do Grupo 02, com a retirada dessa membrana. Os pacientes foram seguidos e avaliados no primeiro, terceiro e sexto mês. Resultados: Setenta pacientes operados no total, sendo sete excluídos por perda de seguimento. Os pacientes de ambos os grupos evoluíram com melhora gradativa da visão ao longo do tempo. No Grupo 01, a média de acuidade visual inicial foi 0,60 logMAR (±0,3 desvio padrão - DP), no primeiro mês foi 0,49 logMAR (±0,26 DP), no terceiro mês, 0,39 logMAR (±0,30 DP) e no sexto mês, 0,27 logMAR (±0,25 DP). No Grupo 02, a média de acuidade visual inicial foi 0,63 logMAR (±0,25 DP), no primeiro mês foi 0,44 logMAR (±0,26 DP), no terceiro mês, 0,41 logMAR (±0,35 DP), e no sexto mês, 0,43 logMAR (0,44 DP). Não houve diferença estatisticamente significante quanto à melhora da acuidade visual entre os dois grupos. Não foi encontrada diferença estatisticamente significante em relação às alterações na OCT entre os grupos. O Grupo 02 apresentou maior taxa de recidiva (17%) quando comparada com o Grupo 01 (3,6%), embora esta diferença não foi estatisticamente significante (p=0,09). Conclusão: Ambos os grupos apresentaram melhora funcional e anatômica semelhantes, mas o grupo no qual não se removeu a membrana limitante interna mostrou uma possível tendência à maior taxa de recidiva / Objective: To study and compare the visual acuity, metamorphosis, foveal thickness, the outer limiting layer and the ellipsoid zone, studied by Optic Coherence Tomography (OCT), and the recurrence rate of patients undergoing removal of epiretinal membrane with and without the removal of the internal limiting membrane. Methods: Seventy patients undergoing removal of epiretinal membrane, by a single surgeon and randomly assigned into two groups. Group 1, without additional removal of internal limiting membrane, 35 patients, and group 2 with the removal of the internal limiting membrane, 28 patients. Both groups were followed and evaluated in the first, third and sixth month. Results: Patients of both groups developed with a gradual improvement of vision over time. In group 1, the mean initial visual acuity was 0.60 logMAR (±0.3 standard deviation - SD), the average visual acuity of the first month was 0.49 logMAR (±0.26 SD), in the third month 0.39 logMAR (±0.30 DP), and in the sixth month logMAR 0.27 (±0.25 SD). In group 2, the mean initial visual acuity was 0.63 logMAR (±0.25 SD), average visual acuity of the first month was 0.44 (±0.26 DP) logMAR, in the third month 0.41 logMAR (±0.35 DP), and in the sixth month 0.43 logMAR (±0.44 DP). There was no statistical difference in improvement in visual acuity between the two groups, there was no statistically significant differences related to tomographic alterations between the groups, but the group 2 showed a higher relapse rate (17%) compared to the group 1 (3.6%). Although the difference is not statistically significant (p=0.09). Conclusion: Both groups showed similar functional and anatomical improvement, but the group which the internal limiting membrane was not removed showed a higher recurrence rate