Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La formation et l'étude structurale de bicouches planes formées à partir de lipides synthétiques et d'extraits lipidiques naturels sont décrites. Les bicouches ont été utilisées comme modèles membranaires pour étudier et quantifier les mécanismes d’action du médicament antifongique Amphotéricine B, principalement par réflectométrie des neutrons. Différents modèles membranaires de complexités croissantes, qui intègrent de l’ergostérol ou du cholestérol afin d’imiter respectivement des systèmes fongiques ou mammifères, ont été étudiés. L'extraction, l'analyse chimique et la préparation des mélanges de lipides hydrogénés et deutérés issus de levures sont présentés en même temps que l'optimisation du procédé de déposition sur des substrats de silicium, initialement contrôlés avec une microbalance à quartz et mesure de la dissipation, qui permet d'accéder à des modèles de membranes naturelles pertinentes pour les techniques de diffusion neutronique. Les effets de la deutération sur la composition lipidique de la levure méthylotrophe Pichia pastoris ou de la levure pathogène Candida glabrata, sont détaillés et utiles pour comprendre la modulation des lipides obtenus de ces micro-organismes. Les modèles membranaires basés sur le lipide synthétique 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine ont d'abord été caractérisés et comparés à ceux formés des phospholipides ou des lipides totaux extraits des levures, principalement par réflectométrie des neutrons, mais aussi par diffraction de membrane. Enfin, la relation entre la composition lipidique et les réponses des modèles à l'Amphotéricine B ont été étudiées et quantifiées. Bien que différents comportements soient observés pour les systèmes fongiques et mammifères, les différents degrés de complexité des modèles utilisés a montré une incidence sur les résultats et l'interprétation des mécanismes impliqués lors de l'interaction du médicament avec les membranes. Les différences observées entre les systèmes lipidiques synthétiques et naturels démontrent la pertinence des modèles membranaires nouvellement développés à partir des lipides extraits de biomasse. / The formation and structural investigation of planar bilayers from synthetic lipids and natural extracts is described. The bilayers were used as model membrane systems for the investigation and quantification of the molecular mechanisms of the membrane-binding antifungal drug Amphotericin B, primarily by neutron reflectometry. Different membrane models of increasing complexity were investigated, with ergosterol or cholesterol included to mimic fungal and mammalian cell membranes, respectively. The extraction, chemical analysis and preparation of hydrogenous and deuterated lipid mixtures from yeasts are presented together with the optimization of the deposition process of supported lipid bilayers on silicon substrates using Quartz Crystal Microbalance with Dissipation monitoring to create relevant natural model membranes for the neutron scattering experiments. The effects of deuteration on the lipid composition in two different yeasts, the methylotrophic Pichia pastoris and the pathogenic Candida glabrata are detailed and is shown to be useful for understanding the modulation of the lipids accessible from these microorganisms. Model membranes from the synthetic lipid 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine were initially characterized and compared to those formed by the phospholipids or the total lipids extracted from the yeasts, mainly using neutron reflectometry but also membrane diffraction. Finally, the relationship between the lipid composition and the response to Amphotericin B was investigated. Although different behavior of the drug is observed in fungal and mammal membrane mimics, the composition and degree of complexity of the model systems employed were shown to affect the findings and the interpretation of the mechanisms involved in the interaction of the drug with the membranes. The differences found between synthetic and natural lipid systems demonstrate the relevance of the newly developed model membranes from lipids extracted from biomass.

L’objectif de mon travail de thèse a été de caractériser l’adhésion de vésicules géantes lipidiques et de cellules vivantes. Dans le but d’obtenir des informations quantitatives sur l’adhésion, j’ai développé deux techniques de nanoscopie de fluorescence basées sur la microscopie TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). Cette technique repose sur création d’une onde évanescente à proximité d’une interface. J’ai développé pour cela un montage optique, qui permet de contrôler finement les caractéristiques de l’onde évanescente (longueur d’atténuation, état de polarisation, etc.). L’adhésion des vésicules a été étudiée par nTIRF (TIRF normalisé) : les images TIRF sont normalisées par des images en épi-fluorescence. J’ai pu ainsi caractériser l’adhésion non spécifique (interaction électrostatique) et spécifique (interaction biotine-streptavidine) de vésicules sur différentes surfaces fonctionnalisées. Pour quantifier l’adhésion des cellules, j’ai utilisé l’approche VA-TIRF (TIRF à angle variable). Cette dernière consiste à enregistrer une série d’images en régime évanescent à différents angles d’incidence. Ceci nous a permis d’établir une cartographie des distances entre la membrane ventrale d’une cellule et la surface pour différents comportements d’adhésion initiés sur divers substrats : chimiques ou protéiques. Ces deux techniques permettent de mesurer la distance membrane-surface avec une précision nanométrique, ≈20nm, ce qui est particulièrement adapté à l’étude du processus d’adhésion / The aim of my thesis was to characterize the adhesion of Giant Unilamellar Vesicles and living cells. In order to obtain a quantitative information about the state of the adhesion, I developed two fluorescence nanoscopy techniques based on microscopy TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). This technique consist of creating an evanescent wave in the vicinity of an interface. I developed the experimental setup, which allows an accurate control of characteristics of the evanescent wave (penetration depth, polarization state, etc.). The vesicles adhesion was studied by nTIRF (normalized TIRF). TIRF images are normalized by epi-fluorescence images. I was able to characterize the nonspecific adhesion (electrostatic interaction) and specific adhesion (biotin-streptavidin interaction) of vesicles on different functionalized surfaces. To quantify the adhesion of cells, I used the VA-TIRF approach (variable angle TIRF). The latter is to record a series of images at different angles of incidence in the evanescent regime. This allowed us to map the distances between the ventral membrane of a cell and the surface for different adhesion behaviors initiated on various substrates: chemical or protein. These two techniques permit to measure the membrane surface-distance with the nanometer precision ≈20nm, which is particularly suitable for the study of the adhesion process

L’objectif de mon travail de thèse a été de mettre au point une nouvelle technique de nanoscopie de fluorescence par excitation non radiative pour l’étude des interactions membrane/substrat. Cette technique repose sur la modification d’une lamelle de verre par une monocouche de boîtes quantiques (QDs). Les QDs joueront alors le rôle de donneurs lors du transfert d’énergie non radiatif. Afin d’obtenir un transfert d’énergie entre cette surface et une membrane (vésicule géante unilamellaire ou cellule vivante), cette dernière est marquée par un fluorophore amphiphile jouant le rôle d’accepteur. Notre étude s’est principalement portée sur l’étude de l’adhésion des vésicules (système modèle de cellule) sur une surface de QDs recouverte de poly-L-lysine. Une attraction électrostatique forte est alors induite, conduisant à l’adhésion des vésicules sur la surface En ajoutant un sel en solution, nous avons pu contrôler finement la force de l’interaction et donc modifier la distance d’équilibre entre la surface et la membrane. A partir de mesure quantitative du quenching des QDs et de la fluorescence émise par le transfert non radiatif, nous avons pu calculer les distances d’équilibre et obtenir une cartographie de ces distances avec une résolution optique nanométrique. Nous avons également utilisé cette technique pour étudier l’adhésion membranaire des cellules U87MG sur différentes surfaces afin d’observer leur points focaux / The objective of my thesis work was to develop a new technique of Non-radiative Excitation Fluorescence Microscopy to study the interactions membrane/substrate.This technique is achieved by coating the substrate with donor species, such as quantum dots (QDs). Thus the dyes are not excited directly by the laser source, as in common fluorescence microscopy, but through a non-radiative energy transfer.To prevent dewetting of the donor film, we have implemented a silanization process to covalently bond the QDs on the substrate. A monolayer of QDs was then deposited on only one side of the coverslips. We highlight the potential of our method through the study of Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) labeled with DiD as acceptor, in interaction with surface functionalized with poly-L-lysine. In the presence of GUVs, we observed together a quenching of QDs emission and emission of DiD located in the membrane, which clearly indicated that non-radiative energy transfer from QDs to DiD occurs. By changing salt concentration in the solution, we have been able to finely control the force of the interaction and thus modify the equilibrium distance between the surface and the membrane. From quantitative measurements of quenching of QDs and fluorescence emitted by non-radiative transfer, we calculate the equilibrium distances and obtain a mapping of these distances with a nanometric optical resolution. Based on this study, our functionalization technique is also used to observe the adhesion of living cells, U87MG on different surfaces in order to observe their focal points

La résistance aux antibiotiques est responsable de nombreuses maladies et décès depuis plusieurs décennies. L'augmentation de la résistance bactérienne a donc encouragé les chercheurs à développer de nouveaux antibiotiques, et de nouvelles stratégies pour contrer les différents mécanismes de résistance. L'un des mécanismes de résistance les plus notables est la formation de biofilms. Par conséquent, notre groupe de recherche s'est concentré sur différents types de mécanismes d'action des antibiotiques, plus particulièrement sur la perméabilisation de la membrane cellulaire. Ceci est réalisé par la formation de pores, d'agrégats, de canaux ou de micelles à travers celle-ci. En réponse à cela, nous avons synthétisé des composés antibactériens possédant deux cations benzimidazolium, deux chaînes apolaires hydrophobes et un échafaudage phényl- ou pyridyl-phényléthynylène, ayant la capacité de former des agrégats supramoléculaires via des interactions π-π et des liaisons hydrogène à travers la bicouche lipidique. Ces composés perturbateurs de la membrane agissent par un mécanisme rapide et efficace et ont montré de bons résultats contre les souches MRSA (Methicilin Resistant Staphylococcus Aureus), ce qui en fait des candidats prometteurs pour combattre les infections bactériennes et la formation des biofilms. / Antibiotic resistance has been responsible for multiple diseases and deaths for several decades. The rise of bacterial resistance has therefore encouraged researchers to develop new antibiotics, and new strategies to counter their various resistance mechanisms. One of the more notable resistance mechanics is the formation of biofilms. Consequently, our research group focused on the different types of antibiotics mechanisms of action, more particularly on the permeabilization of the cell membrane. This is achieved through the formation of pores, aggregate, channels, or micelles through it. In response to this, we have thus synthesized antibacterial compounds with a benzimidazolium cation, a hydrophobic apolar chain and a phenyl- or pyridyl-phenylethynylene scaffold with the capacity to form supramolecular aggregates via π-π interaction and hydrogen bonding through the lipid bilayer. These membrane-disrupting compounds act via a rapid and effective mechanism and have shown good results against strains of MRSA, thus making promising candidates to combat bacterial infections and biofilms formation.

La protéine Tau est impliquée dans de nombreuses maladies neurodégénératives regroupées sous le terme de Tauopathies dont la plus fréquente est la maladie d'Alzheimer (MA), qui est caractérisée, dans les phases précoces, par une augmentation du stress oxydant dans le cerveau des patients. L'accumulation d'espèces réactives de l'oxygène (ou ROS) dans les neurones mène notamment à l'apparition de dommages au niveau de leur ADN génomique. Les neurones ne se divisant pas, l'accumulation de dommages non réparés au niveau de la molécule d'ADN induit, à terme, des conséquences importantes sur leur fonctionnement. Cependant, les mécanismes impliqués dans l'accumulation de dommages à l'ADN neuronal dans la MA ne sont pas élucidés. La MA est également caractérisée par la présence de protéine Tau hyper et anormalement phosphorylée. Cette protéine Tau pathologique s'agrège et forme les " dégénérescences neurofibrillaires " (ou DNF). Les mécanismes conduisant à l'agrégation de Tau dans les cerveaux Alzheimer demeurent encore peu connus. Néanmoins, il est maintenant admis que bien plus que les agrégats insolubles, ce sont des petites formes oligomériques de Tau qui sont toxiques dans les neurones.Tau peut se localiser dans les conditions physiologiques au niveau de la membrane plasmique et au sein du noyau des neurones. Dans le laboratoire, il a été montré dans des cultures primaires de neurones murins que Tau joue un rôle essentiel dans la protection de l'ADN génomique neuronal en condition de stress. Le premier objectif de cette thèse était de savoir si in vivo Tau joue un rôle protecteur vis-à-vis de l'ADN. Nous avons donc mis au point un modèle murin de stress hyperthermique, stress induisant la formation de ROS. Nous avons ainsi validé in vivo la fonction protectrice de Tau vis-à-vis de l'ADN génomique. Nous avons également mis en évidence que l'absence de Tau altérait l'intégrité d'ARN cytoplasmiques et nucléaires en condition de stress, ce qui suggère que Tau pourrait jouer un rôle dans le contrôle qualité des ARN. Le deuxième objectif était d'évaluer l'impact de la pathologie Tau sur sa fonction protectrice de l'ADN. Notre hypothèse était que la pathologie Tau pourrait avoir un rôle délétère sur sa fonction protectrice de l'ADN génomique. L'impact de la pathologie Tau a alors été évalué in vivo dans un modèle de souris transgéniques (THY-Tau22). Nos résultats indiquent que dans les neurones hippocampiques soumis à un stress hyperthermique et possédant une pathologie de Tau précoce, il y a la perte de la fonction protectrice de Tau vis-à-vis de l'intégrité des acides nucléiques. Par ailleurs, nous avons observé qu'une augmentation de ROS jouait le rôle d'agent inducteur in vivo dans la formation de petits oligomères de Tau dans le cytoplasme et le noyau de neurones hippocampiques. De façon intéressante nous avons observé une corrélation entre les neurones possédant des dommages aux acides nucléiques et la formation de petits oligomères de Tau. Ces résultats mettent en lumière l'existence d'une fenêtre temporelle critique où une augmentation du stress oxydant induit conjointement l'oligomérisation de Tau et la formation de dommages aux acides nucléiques dans des neurones présentant une pathologie précoce. Ceci suggère que des formes oligomériques de Tau seraient impliqués dans l'altération des acides nucléiques.Les phospholipides peuvent également servir d'agent inducteur pour l'oligomérisation de Tau. Ils sont retrouvés dans les membranes. Les radeaux lipidiques sont des microdomaines de la membrane plasmique riches en sphingolipides et en cholestérol qui pourraient servir de point de nucléation pour l'oligomérisation de Tau. Avant de pouvoir répondre à cette question, le troisième objectif a été d'étudier l'état de phosphorylation de Tau associée aux radeaux lipidiques. Nos résultats indiquent que dans le cortex de patients atteints de la MA, la protéine Tau associée aux radeaux lipidiques est hyperphosphorylée et oligomérisée.

The biological membrane surrounding the living cell provides a sealed barrier that tightly regulates the interactions with the outside environment. A large number of integral membrane proteins mediate these interactions and are involved in a wide variety of biological processes. An increasing number of studies have led to the conclusion that lipids provide more than a hydrophobic solvent for membrane proteins, and that interactions between lipids and proteins are required to allow protein function. ABC transporters are one of the most important family of membrane proteins. However, the importance of their lipidic environment is largely unknown. Only a few studies showed that their activity was dependent on the lipidic composition of the surrounding bilayer. The bacterial ABC transporter HorA was used as a model to probe the influence of the lipidic environment on that class of membrane proteins.<p><p> HorA is a multidrug transporter expressed in Lactobacillus brevis, a Gram-positive beer spoilage bacterium. It turned out that phosphatidylethanolamine (PE) was indispensable to maintain both the activity and the structural integrity of HorA.<p> Surprisingly, replacement of PE by the chemically related PC (phosphatidylcholine) did not led to the suppression of HorA activity, but to an unexpected phenotype. Whereas the cytoplasmic domains of HorA were still able to hydrolyze ATP, the membrane parts of the transporter were unable to use that energy to mediate substrate transport. Using several biophysical methods particularly adapted to the study of reconstituted systems, we showed that the structure of HorA is strongly altered by this lipid replacement. In particular, the structural organization of the transmembrane domains of the protein is strongly affected.<p> / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La résistance aux antibiotiques est l'une des menaces les plus graves pour la santé mondiale de nos jours. L'émergence de bactéries multirésistantes encourage les chercheurs à développer de nouveaux antibiotiques et stratégies pour compenser leurs différents mécanismes de résistance. L'un de ces mécanismes de défense est la formation de biofilms. Sous cette forme, les bactéries développent une matrice extracellulaire protectrice les rendant plus résistantes à divers traitements antimicrobiens. Nous avons conçu et synthétisé des composés de déstabilisation des membranes avec des caractéristiques clés : un cation benzimidazolium ou imidazolium, une chaîne apolaire hydrophobe et/ou un site de reconnaissance des anions lipophiles. Ces caractéristiques leur confèrent une activité antimicrobienne accrue et une grande capacité à perturber les membranes cellulaires. Ces composés perturbateurs de la membrane agissent via un mécanisme rapide et efficace et ont montré de bons résultats contre les souches de SARM (staphylococcus aureus résistant à la méthiciline) en tant que candidats antibiofilms prometteurs. Ces nouveaux agents ont le potentiel de se disperser et d'inhiber la formation de biofilms et pourraient avoir un impact positif sur la médecine humaine à l'avenir. / Antibiotic resistance is one of the most serious threats to global health nowadays. Emergence of resistant bacteria encourages researchers to develop new antibiotics and strategies to mitigate their different resistance mechanisms. One of these defense mechanisms is the formation of biofilms. In this form, bacteria develop a protective extracellular matrix making them more resistant to various antimicrobial treatments. We have designed and synthesized membrane destabilizing compounds with three key features: a benzimidazolium or an imidazolium cation, a hydrophobic apolar chain, and a lipophilic anion recognition site. These characteristics give these compounds increased antimicrobial activity and greater ability to disrupt cell membranes. These membrane-disrupting compounds act via a fast and efficient mechanism and showed good results against MRSA (methicillin-resistant staphylococcus aureus) strains as promising antibiofilms candidates. These new agents have the potential to disperse and inhibit the formation of biofilms and could have a positive impact on human medicine in the future.

La metformine, un médicament couramment utilisé pour le traitement du diabète de type II, fut récemment identifiée comme un composé ayant des propriétés anticancéreuses très intéressantes, notamment pour le cancer du pancréas. Toutefois, malgré les nombreuses expériences in vitro et sur des modèles murins qui ont confirmé cet effet, les essais cliniques sur les humains sont restés infructueux. Un des facteurs mis en cause pour expliquer ces résultats est la grande hydrophilie de la metformine, qui diminue sa biodisponibilité et limite son transport au travers des membranes cellulaires. Nous nous sommes donc intéressés à la synthèse de sels de biguanidium amphiphiles inspirés de la metformine qui se partitionnent plus facilement dans les bicouches phospholipidiques et qui possèdent de meilleures activités anticancéreuses. Pour ce faire, nous avons tout d’abord étudié la perturbation des membranes par de simples alkylbiguanidium. Nous avons démontré que ces composés peuvent transporter des ions H+/OH- et dépolariser les membranes bactériennes, ce qui leur confère des propriétés antibactériennes et antifongiques. Afin de limiter l’hémolyse associée à ces composés, des sels de biguanidium substitués par le groupement phényléthynylbenzyle ont par la suite été synthétisés. La structure de ceux-ci leur permet de mieux se partitionner dans les membranes et s’accumuler dans les mitochondries, tout en diminuant la toxicité associée à une perturbation membranaire trop forte. Leur activité sur les cellules cancéreuses du pancréas est ainsi beaucoup plus importante que celle de la metformine, de même que leur capacité à inhiber la croissance de xénogreffes chez les souris. Ces résultats nous ont ensuite amené vers la synthèse d’une petite librairie de sels de biguanidium et l’étude de leurs activités anticancéreuses et antibactériennes. Les modifications structurales et les changements de contre-ion apportés à cette librairie ont permis d’obtenir des composés encore plus efficaces et surtout beaucoup plus sélectifs envers les cellules saines, ouvrant ainsi la porte à une nouvelle classe de médicaments anticancéreux à base de sels de biguanidium. / Metformin, a common drug used for the treatment of type II diabetes, has recently been linked to interesting anticancer properties, notably on pancreatic cancer. Although there have been many experiments in vitro and on murine models that have confirmed this effect, human clinical trials featuring metformin have been unsuccessful. One of the reasons brought forward to explain these results is the high hydrophilicity of metformin, which limits its bioavailability and transport through cellular membranes. For this reason, we have been interested in the synthesis of amphiphilic biguanidium salts inspired from metformin that can partition more easily in phospholipid membranes and thus have better anticancer properties. We first studied the membrane perturbation properties of simple alkylbiguanidium salts and showed that these compounds can transport H+/OH- ions and depolarize bacterial membranes, which in turn gives them antibacterial and antifungal properties. To limit the hemolytic activity associated with these compounds, biguanidium salts substituted by the phenylethynylbenzyl moiety were then synthesised. Their structure allows them to partition more easily in membranes and accumulate in mitochondria, while lowering the toxicity associated with high membrane perturbation. For those reasons, their activity on pancreatic cancer cells is much higher than metformin, as is their inhibition of xenograft growth in mice. These results encouraged us to synthesise a small library of biguanidium salts and study their anticancer activity. The structural modifications and counter-anion variations brought to this library have improved the efficiency of these compounds as well as their selectivity towards healthy cells, thus opening the door to a new class of anticancer drugs based on biguanidium salts.

Cette thèse porte sur les membranes biologiques, étudiées du point de vue de la physique théorique. Nous nous intéressons aux effets génériques de la présence d'une ou deux inclusions membranaires, par exemple des protéines, et à ceux d'une modification chimique locale de l'environnement de la membrane.<br /> Tout d'abord, nous étudions une interaction entre deux inclusions membranaires, qui est analogue à la force de Casimir : elle provient des contraintes que les inclusions imposent aux fluctuations thermiques de la forme de la membrane. Nous calculons les fluctuations de cette force entre deux inclusions ponctuelles. Nous clarifions la définition de la force exercée par un fluide corrélé sur une inclusion, dans un micro-état du fluide. Cette définition joue un rôle clé dans l'étude de la force de Casimir au-delà de sa valeur moyenne à l'équilibre. Nous étudions également les interactions de Casimir entre des inclusions membranaires de forme allongée.<br /> Ensuite, nous nous intéressons à l'élasticité membranaire à l'échelle nanométrique, qui est mise en jeu dans les déformations locales de l'épaisseur de la membrane à proximité de certaines protéines. Nous soulignons l'importance d'un terme énergétique qui a été négligé jusqu'à présent.<br /> Enfin, nous présentons une description théorique, développée à partir de principes fondamentaux, de la dynamique d'une membrane soumise à une perturbation chimique locale de son environnement. Nous comparons nos prévisions théoriques à de nouveaux résultats expérimentaux portant sur la déformation dynamique d'une membrane biomimétique soumise à une augmentation locale de pH.