Développer de nouvelles méthodes pour l'étude des interactions entre les membranes cellulaires et diverses molécules bioactives telles que des peptides, des protéines ou des médicaments est d’une grande importance. Ces interactions sont primordiales dans l’activité de ces composés et leur meilleure compréhension pourrait permettre, entre autres, la mise au point de nouveaux médicaments, l’amélioration de leur efficacité et la diminution de leur toxicité. La spectroscopie RMN des solides est une technique de choix pour l’étude de telles interactions. Plus spécifiquement, l’utilisation de sondes membranaires est courante et permet d’accéder à de nouvelles expériences. Le projet de thèse principal porte sur la synthèse et l’étude de phospholipides monofluorés pour leur validation comme sonde membranaire modèle en RMN des solides. Le fluor possède de nombreuses caractéristiques chimiques et spectroscopiques d’intérêt pour son utilisation pour l’étude de complexes de biomolécules en spectroscopie RMN. La présente thèse rapporte d’abord les travaux de synthèse de trois nouveaux analogues monofluorés de la dimyristoylphosphatidylcholine (F-DMPC), ayant un atome de fluor sur la chaîne acyle en position 2 du glycérol, dans le but de mimer les membranes eucaryotes. L’étude des propriétés de ces trois nouveaux F-DMPC, ainsi que de trois dérivés synthétisés antérieurement, réalisée principalement en spectroscopie infrarouge et en RMN des solides, est aussi présentée. Dans l’ensemble, les résultats ont montré que l’incorporation d’un atome de fluor à la DMPC induit des perturbations significatives, mais que des mélanges F-DMPC/DMPC composés d’au maximum 25% de phospholipides monofluorés se comportent de façon similaire aux membranes de DMPC. Afin de valider ce nouveau modèle, l’orientation de deux peptides antimicrobiens au comportement connu a été estimée dans des membranes contenant 25% de F-DMPC. Pour tous les F-DMPC, la RMN de l’azote-15 a montré que l’orientation des peptides n’était pas affectée par la présence de DMPC monofluorée. De tels mélanges pourraient ainsi être utilisés comme sonde membranaire pour l’étude d’interactions entre ces membranes et différentes molécules bioactives par RMN des solides. La thèse présente aussi le développement d’une méthodologie de synthèse flexible de phosphatidylglycérols. Puisque des chaînes acyle identiques ou différentes et de longueur variée peuvent être incorporées, cette méthodologie permettra d’accéder aux F-DMPG en vue de mimer les cellules procaryotes. Le second projet de thèse porte sur l’étude de nouveaux peptides modèles afin de mettre au point un outil pour évaluer l’épaisseur des membranes biologiques. Une série de peptides analogues au peptide antimicrobien synthétique MSI-103 ayant différentes longueurs, appelés KIAn, a d’abord été synthétisée et étudiée afin d’étudier l’importance du concept de décalage hydrophobe dans la formation de pores transmembranaires et l’activité des peptides. Cette étude a démontré que la longueur est un facteur clé dans l’activité de ces peptides : ils doivent être suffisamment longs pour traverser l’épaisseur hydrophobe des bicouches lipidiques. Toutefois, dans le design de la série KIAn, les peptides plus longs sont davantage chargés et ce facteur peut aussi affecter la tendance observée. Cette thèse rapporte donc les travaux menés afin de vérifier l’influence de la charge cationique des peptides KIAn dans leur activité. Deux nouvelles séries de peptides de longueur variable (14 à 28 acides aminés) et de charge globale constante (+7), appelées KIA(7)n et KIXAn, ont été synthétisées et analysées par différentes techniques (dichroïsme circulaire, tests biologiques, spectroscopie de fluorescence, RMN de l’azote-15). Cette étude a permis de confirmer l’importance du principe de décalage hydrophobe et l’absence d’effet dû à la charge des peptides dans leur activité. Elle a ainsi permis de valider l’utilisation de ces peptides comme règle moléculaire afin d’estimer l’épaisseur des bicouches lipidiques. / The development of new methodologies to investigate interactions between cell membranes and various bioactive molecules such as peptides, proteins or drugs is of primary importance. These interactions are essential for the activity of those compounds and a better understanding would allow, among others, the development of new drugs, the improvement of their efficiency and the reduction of their toxicity. Solid-state NMR spectroscopy is a method of choice to study membranes – molecules interactions. Specifically, using membrane probes is common and allows to access new experiments. The main project within this thesis focuses on the synthesis and study of monofluorinated phospholipids for their validation as model membranes probe in solid-state NMR. Fluorine possesses numerous chemical and spectroscopic characteristics of interest for its use to study biomolecule complexes in NMR spectroscopy. This thesis reports the synthesis of three new monofluorinated analogs of dimyristoylphosphatidylcholine (F-DMPC), having one fluorine atom located on the acyl chain at position 2 of the glycerol, with the goal of mimicking eukaryotic membranes. Property studies of these three new F-DMPCs and of three previously synthesized derivatives are also presented. Overall, the results have shown that the incorporation of a fluorine atom into DMPC perturbs significantly the membrane properties, but that F-DMPC/DMPC mixtures containing 25% F-DMPC or less behave in a similar way to DMPC membranes. To validate this new model, the orientation of two antimicrobial peptides having a known behaviour in the presence of DMPC membranes has been estimated in F-DMPC/DMPC (1/3) membranes. For all F-DMPC, 15N NMR has shown that peptide orientation is not affected by the presence of monofluorinated DMPC. Such mixtures can therefore be used as membrane probes to study interactions between them and various bioactive molecules with solid-state NMR. This thesis also presents the development of a new and flexible synthetic methodology of phosphatidylglycerols. As identical or different acyl chains with various lengths can be incorporated, this methodology will allow access to F-DMPG in order to mimic prokaryotic cell membranes. The second thesis project focuses on the study of new model peptides in order to develop a new tool to evaluate biological membrane thickness. A series of peptides analogues to the antimicrobial synthetic peptide MSI-103, having various lengths and called KIAn, have first been synthesized and studied to investigate the importance of the hydrophobic mismatch in the formation of pores and in the activity of these peptides. This study showed that peptide length is a key factor in their activity: the length must be sufficient to span the hydrophobic thickness of the lipid bilayers. However, the design of KIAn peptides implies that longer peptides are more charged and this factor can also influence the observed tendency. Therefore, this thesis reports our study aimed at verifying the influence of global cationic charge of KIAn peptides on their activity. Two new peptide series of various lengths (14 to 28 amino acids) and of constant global charge (+7), called KIA(7)n and KIXAn, have been synthesized and analyzed with several techniques (circular dichroism, biological tests, fluorescence spectroscopy and 15N NMR). This study confirmed the importance of hydrophobic mismatch and the absence of charge effect in the activity of these peptides. It also validated the use of these peptides as molecular rulers to estimate the hydrophobic thickness of lipid bilayers.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La formation et l'étude structurale de bicouches planes formées à partir de lipides synthétiques et d'extraits lipidiques naturels sont décrites. Les bicouches ont été utilisées comme modèles membranaires pour étudier et quantifier les mécanismes d’action du médicament antifongique Amphotéricine B, principalement par réflectométrie des neutrons. Différents modèles membranaires de complexités croissantes, qui intègrent de l’ergostérol ou du cholestérol afin d’imiter respectivement des systèmes fongiques ou mammifères, ont été étudiés. L'extraction, l'analyse chimique et la préparation des mélanges de lipides hydrogénés et deutérés issus de levures sont présentés en même temps que l'optimisation du procédé de déposition sur des substrats de silicium, initialement contrôlés avec une microbalance à quartz et mesure de la dissipation, qui permet d'accéder à des modèles de membranes naturelles pertinentes pour les techniques de diffusion neutronique. Les effets de la deutération sur la composition lipidique de la levure méthylotrophe Pichia pastoris ou de la levure pathogène Candida glabrata, sont détaillés et utiles pour comprendre la modulation des lipides obtenus de ces micro-organismes. Les modèles membranaires basés sur le lipide synthétique 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine ont d'abord été caractérisés et comparés à ceux formés des phospholipides ou des lipides totaux extraits des levures, principalement par réflectométrie des neutrons, mais aussi par diffraction de membrane. Enfin, la relation entre la composition lipidique et les réponses des modèles à l'Amphotéricine B ont été étudiées et quantifiées. Bien que différents comportements soient observés pour les systèmes fongiques et mammifères, les différents degrés de complexité des modèles utilisés a montré une incidence sur les résultats et l'interprétation des mécanismes impliqués lors de l'interaction du médicament avec les membranes. Les différences observées entre les systèmes lipidiques synthétiques et naturels démontrent la pertinence des modèles membranaires nouvellement développés à partir des lipides extraits de biomasse. / The formation and structural investigation of planar bilayers from synthetic lipids and natural extracts is described. The bilayers were used as model membrane systems for the investigation and quantification of the molecular mechanisms of the membrane-binding antifungal drug Amphotericin B, primarily by neutron reflectometry. Different membrane models of increasing complexity were investigated, with ergosterol or cholesterol included to mimic fungal and mammalian cell membranes, respectively. The extraction, chemical analysis and preparation of hydrogenous and deuterated lipid mixtures from yeasts are presented together with the optimization of the deposition process of supported lipid bilayers on silicon substrates using Quartz Crystal Microbalance with Dissipation monitoring to create relevant natural model membranes for the neutron scattering experiments. The effects of deuteration on the lipid composition in two different yeasts, the methylotrophic Pichia pastoris and the pathogenic Candida glabrata are detailed and is shown to be useful for understanding the modulation of the lipids accessible from these microorganisms. Model membranes from the synthetic lipid 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine were initially characterized and compared to those formed by the phospholipids or the total lipids extracted from the yeasts, mainly using neutron reflectometry but also membrane diffraction. Finally, the relationship between the lipid composition and the response to Amphotericin B was investigated. Although different behavior of the drug is observed in fungal and mammal membrane mimics, the composition and degree of complexity of the model systems employed were shown to affect the findings and the interpretation of the mechanisms involved in the interaction of the drug with the membranes. The differences found between synthetic and natural lipid systems demonstrate the relevance of the newly developed model membranes from lipids extracted from biomass.

L’objectif de mon travail de thèse a été de caractériser l’adhésion de vésicules géantes lipidiques et de cellules vivantes. Dans le but d’obtenir des informations quantitatives sur l’adhésion, j’ai développé deux techniques de nanoscopie de fluorescence basées sur la microscopie TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). Cette technique repose sur création d’une onde évanescente à proximité d’une interface. J’ai développé pour cela un montage optique, qui permet de contrôler finement les caractéristiques de l’onde évanescente (longueur d’atténuation, état de polarisation, etc.). L’adhésion des vésicules a été étudiée par nTIRF (TIRF normalisé) : les images TIRF sont normalisées par des images en épi-fluorescence. J’ai pu ainsi caractériser l’adhésion non spécifique (interaction électrostatique) et spécifique (interaction biotine-streptavidine) de vésicules sur différentes surfaces fonctionnalisées. Pour quantifier l’adhésion des cellules, j’ai utilisé l’approche VA-TIRF (TIRF à angle variable). Cette dernière consiste à enregistrer une série d’images en régime évanescent à différents angles d’incidence. Ceci nous a permis d’établir une cartographie des distances entre la membrane ventrale d’une cellule et la surface pour différents comportements d’adhésion initiés sur divers substrats : chimiques ou protéiques. Ces deux techniques permettent de mesurer la distance membrane-surface avec une précision nanométrique, ≈20nm, ce qui est particulièrement adapté à l’étude du processus d’adhésion / The aim of my thesis was to characterize the adhesion of Giant Unilamellar Vesicles and living cells. In order to obtain a quantitative information about the state of the adhesion, I developed two fluorescence nanoscopy techniques based on microscopy TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). This technique consist of creating an evanescent wave in the vicinity of an interface. I developed the experimental setup, which allows an accurate control of characteristics of the evanescent wave (penetration depth, polarization state, etc.). The vesicles adhesion was studied by nTIRF (normalized TIRF). TIRF images are normalized by epi-fluorescence images. I was able to characterize the nonspecific adhesion (electrostatic interaction) and specific adhesion (biotin-streptavidin interaction) of vesicles on different functionalized surfaces. To quantify the adhesion of cells, I used the VA-TIRF approach (variable angle TIRF). The latter is to record a series of images at different angles of incidence in the evanescent regime. This allowed us to map the distances between the ventral membrane of a cell and the surface for different adhesion behaviors initiated on various substrates: chemical or protein. These two techniques permit to measure the membrane surface-distance with the nanometer precision ≈20nm, which is particularly suitable for the study of the adhesion process

L’objectif de mon travail de thèse a été de mettre au point une nouvelle technique de nanoscopie de fluorescence par excitation non radiative pour l’étude des interactions membrane/substrat. Cette technique repose sur la modification d’une lamelle de verre par une monocouche de boîtes quantiques (QDs). Les QDs joueront alors le rôle de donneurs lors du transfert d’énergie non radiatif. Afin d’obtenir un transfert d’énergie entre cette surface et une membrane (vésicule géante unilamellaire ou cellule vivante), cette dernière est marquée par un fluorophore amphiphile jouant le rôle d’accepteur. Notre étude s’est principalement portée sur l’étude de l’adhésion des vésicules (système modèle de cellule) sur une surface de QDs recouverte de poly-L-lysine. Une attraction électrostatique forte est alors induite, conduisant à l’adhésion des vésicules sur la surface En ajoutant un sel en solution, nous avons pu contrôler finement la force de l’interaction et donc modifier la distance d’équilibre entre la surface et la membrane. A partir de mesure quantitative du quenching des QDs et de la fluorescence émise par le transfert non radiatif, nous avons pu calculer les distances d’équilibre et obtenir une cartographie de ces distances avec une résolution optique nanométrique. Nous avons également utilisé cette technique pour étudier l’adhésion membranaire des cellules U87MG sur différentes surfaces afin d’observer leur points focaux / The objective of my thesis work was to develop a new technique of Non-radiative Excitation Fluorescence Microscopy to study the interactions membrane/substrate.This technique is achieved by coating the substrate with donor species, such as quantum dots (QDs). Thus the dyes are not excited directly by the laser source, as in common fluorescence microscopy, but through a non-radiative energy transfer.To prevent dewetting of the donor film, we have implemented a silanization process to covalently bond the QDs on the substrate. A monolayer of QDs was then deposited on only one side of the coverslips. We highlight the potential of our method through the study of Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) labeled with DiD as acceptor, in interaction with surface functionalized with poly-L-lysine. In the presence of GUVs, we observed together a quenching of QDs emission and emission of DiD located in the membrane, which clearly indicated that non-radiative energy transfer from QDs to DiD occurs. By changing salt concentration in the solution, we have been able to finely control the force of the interaction and thus modify the equilibrium distance between the surface and the membrane. From quantitative measurements of quenching of QDs and fluorescence emitted by non-radiative transfer, we calculate the equilibrium distances and obtain a mapping of these distances with a nanometric optical resolution. Based on this study, our functionalization technique is also used to observe the adhesion of living cells, U87MG on different surfaces in order to observe their focal points

La résistance aux antibiotiques est responsable de nombreuses maladies et décès depuis plusieurs décennies. L'augmentation de la résistance bactérienne a donc encouragé les chercheurs à développer de nouveaux antibiotiques, et de nouvelles stratégies pour contrer les différents mécanismes de résistance. L'un des mécanismes de résistance les plus notables est la formation de biofilms. Par conséquent, notre groupe de recherche s'est concentré sur différents types de mécanismes d'action des antibiotiques, plus particulièrement sur la perméabilisation de la membrane cellulaire. Ceci est réalisé par la formation de pores, d'agrégats, de canaux ou de micelles à travers celle-ci. En réponse à cela, nous avons synthétisé des composés antibactériens possédant deux cations benzimidazolium, deux chaînes apolaires hydrophobes et un échafaudage phényl- ou pyridyl-phényléthynylène, ayant la capacité de former des agrégats supramoléculaires via des interactions π-π et des liaisons hydrogène à travers la bicouche lipidique. Ces composés perturbateurs de la membrane agissent par un mécanisme rapide et efficace et ont montré de bons résultats contre les souches MRSA (Methicilin Resistant Staphylococcus Aureus), ce qui en fait des candidats prometteurs pour combattre les infections bactériennes et la formation des biofilms. / Antibiotic resistance has been responsible for multiple diseases and deaths for several decades. The rise of bacterial resistance has therefore encouraged researchers to develop new antibiotics, and new strategies to counter their various resistance mechanisms. One of the more notable resistance mechanics is the formation of biofilms. Consequently, our research group focused on the different types of antibiotics mechanisms of action, more particularly on the permeabilization of the cell membrane. This is achieved through the formation of pores, aggregate, channels, or micelles through it. In response to this, we have thus synthesized antibacterial compounds with a benzimidazolium cation, a hydrophobic apolar chain and a phenyl- or pyridyl-phenylethynylene scaffold with the capacity to form supramolecular aggregates via π-π interaction and hydrogen bonding through the lipid bilayer. These membrane-disrupting compounds act via a rapid and effective mechanism and have shown good results against strains of MRSA, thus making promising candidates to combat bacterial infections and biofilms formation.

Depuis la vulgarisation de certains concepts comme la globalisation ou la mondialisation, le secteur agroalimentaire a connu une expansion fulgurante et un engouement incessant pour la commercialisation d’aliments entre les peuples à travers le monde. Ce phénomène, contribuant significativement à l’accroissement économique des marchés, n’est toutefois pas sans risque. Pendant ce temps, les dangers de sources microbiologiques, notamment les pathogènes, sont véhiculés par des matrices alimentaires et voyagent d’un pays à l’autre, ce qui augmente le risque de contamination pour les consommateurs. Conséquemment, on assiste à une augmentation des cas d’allergies alimentaires, d’intoxications ou de toxi-infections alimentaires dont les agents étiologiques peuvent venir des quatre coins du monde. À cet effet, les organismes réglementaires comme l’Agence canadienne d’inspection des aliments (ACIA), Santé Canada, la Food and Drug Administration (USFDA) américaine ou d’autres autorités internationales compétentes comme l’Organisation des Nations unies pour l’alimentation et l’agriculture(FAO) et l’Organisation mondiale de la santé (OMS) multiplient leurs efforts afin de mettre en place des normes et politiques réglementaires pour aider l’industrie agroalimentaire à renforcer les contrôles depuis la fabrication jusqu’à la commercialisation des aliments. Les dangers microbiologiques venant de pathogènes comme Bacillus cereus demeurent un risque de santé publique majeur qu’il faut maîtriser afin d’assurer la protection des consommateurs. Bien que de nombreuses techniques de contrôle (e.g., additifs alimentaires, haute pression hydrostatique, rayonnements ionisants, procédés thermiques, etc.) ont été développées et utilisées pour assurer la salubrité et l’innocuité des aliments, dans certains cas cela n’a pas permis de produire des aliments totalement exempts de bactéries responsables de la dégradation/altération des aliments et de pathogènes causant des intoxications alimentaires comme c’est le cas avec B. cereus. En effet, cette bactérie pathogène est ubiquitaire, aérobie et anaérobie facultative. Elle est capable de produire dans une grande variété d’aliments et d’ingrédients comme les épices des spores très résistantes ainsi que différents types de toxines pouvant causer la diarrhée, la nausée, le vomissement et même la mort. Dans cette optique, et vue la grande difficulté à maitriser la contamination des aliments causée par ce pathogène, l’objectif général de cette recherche a été d’utiliser la technologie d’électro-activation, une branche appliquée de l’électrochimie qui s’intéresse notamment à la réactivité des solutions aqueuses, comme méthode alternative et potentiellement efficace pour lutter contre B. cereus afin de produire des aliments plus sécuritaires avec une grande valeur nutritionnelle et organoleptique. Pour y parvenir, des solutions aqueuses de sels d’acides organiques de lactate de calcium, d’ascorbate de calcium et de leur mélange équimolaire ont été électro-activées dans un réacteur soumis à un courant électrique continu avec des intensités de l’ordre de 250, 500 et 750 mA pendant un maximum de temps de 30 minutes afin de produire les acides organiques conjugués respectifs; de l’acide lactique et de l’acide ascorbique. Dans la première partie de ce travail de recherche, les caractéristiques physicochimiques (e.g., pH, acidité titrable, pKa) des solutions électro-activées (SÉA) ont été étudiées et leurs profils moléculaires comparés à ceux d’acides standards respectifs en utilisant différentes techniques (e.g., FTIR, HPLC, DSC, DPPH), ce qui a permis de confirmer la production d’acides organiques conjugués respectifs des sels utilisés. Ces SÉA avaient un pH très bas, une acidité titrable élevée, notamment pour l’ascorbate de calcium et le mélange. En plus, une activité antioxydante élevée a été observée pour la solution électro-activée d’ascorbate de calcium et du mélange. Dans la deuxième partie de l’étude, les SÉA traitées à 250, 500 et 750 mA pendant 10, 20 et 30 min ont été retenues pour être mises en contact avec des cellules végétatives de Bacillus cereus ATCC 14579 en conditions modèles (contact direct) afin d’évaluer leurs effets antimicrobiens sur ce pathogène. Les cellules ont été testées en contact direct avec les SÉA pendant 5, 30 et 60 secondes. Le même traitement a été également réalisé par contact direct avec des acides organiques standards (lactique, ascorbique) pendant 5, 30, 60, et 120 secondes afin de faire des comparaisons. Les SÉA et les acides organiques standards correspondants avaient les mêmes valeurs d’acidité titrable. Par la suite, les cellules ont été observées au microscope (coloration au bleu de méthylène et fluorescence) afin d’évaluer les effets inhibiteurs/destructeurs de ces solutions. Également, les SÉA ont été diluées avec de l’eau distillée pour obtenir des solutions possédant 10 à 90% de l’acidité titrable (force) initiale pour être ensuite testées contre les cellules de B. cereus. Les résultats ont démontré que toutes les SÉA avaient une grande efficacité contre les cellules végétatives de B. cereus. Également, même à des taux de dilution représentant en moyenne 20% de la force initiale des SÉA, l’effet antimicrobien était très élevé pour les différentes solutions. L’observation de B. cereus au microscope a permis de confirmer les effets létaux des SÉA. Dans ce volet avec des cellules végétatives de B. cereus, l’efficacité des SÉA a été estimée à une réduction de 4–7 log UFC/mL. En plus, il a été démontré que le pouvoir antibactérien des SÉA était nettement plus élevé que celui des acides lactiques et ascorbiques standards (conventionnels). Dans la troisième partie de cette étude, des solutions électro-activées de lactate de calcium, d’ascorbate de calcium et de leur mélange équimolaire à 750 mA pendant 30 minutes ont été retenues et utilisées contre des spores de Bacillus cereus ATCC 14579 en conditions modèles et dans du saumon Atlantique frais. Les spores traitées ont été analysées à l’aide de microscopes électroniques à balayage et à transmission pour évaluer les effets sporicides des SÉA. Les résultats obtenus ont clairement montré un grand pouvoir sporicide des SÉA utilisées sur les spores de B. cereus avec une réduction de 7 à 9 log en utilisant une population initiale de spores de 10⁹ UFC/mL, dépendamment des conditions évaluées; à savoir : en contact direct (2–30 min), dans du saumon utilisé comme matrice alimentaire(2–7 min), ainsi qu’en combinaison avec de la chaleur modérée de 60, 70, 80 et 90 °C pendant 0.5–2 min. Également, il a été observé que la capacité sporicide des SÉA augmentait avec la température et le temps de contact. La microscopie électronique à balayage et à transmission a permis de constater que les SÉA pouvaient provoquer la destruction totale des cellules de B. cereus, et notamment la perforation de la membrane (cortex et manteau), ainsi que le reflux de différentes composantes de la structure des spores de B. cereus. Tenant compte des résultats obtenus dans cette étude, nous pouvons conclure que les solutions électro-activées à base de lactate de calcium, ascorbate de calcium et leur mélange, notamment celles électro-activées à 750 mA–30 min, pourraient être d’une grande contribution afin de renforcer la capacité de l’industrie alimentaire à lutter contre B. cereus ATCC 14579 et de produire des aliments plus sécuritaires pour le consommateur. / Since the popularization of concepts like globalization, the agri-food sector has experienced a huge expansion and a ceaseless craze for the marketing of food between the peoples worldwide. This phenomenon, contributing significantly to the economic growth of the markets, is not without risk, however. Meanwhile, microbiological hazards, including pathogens, are carried through food matrices and travel from one country to another, increasing the risk of contamination for consumers. Consequently, we are also witnessing an increase in cases of food allergies, foodborne illnesses and outbreaks, with etiological agents coming from all over the world. Thus, regulatory organisms such as Canadian Food Inspection Agency (CFIA), Health Canada, United States Food and Drug Administration (USFDA) or competent international authorities like Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO) and World Health Organization (WHO) are stepping up efforts to put in place regulatory standards and policies in order to help the food industry to strengthen controls from the processing to the marketing of foods. Microbiological hazards from pathogens like Bacillus cereus remain a major public health risk that must be controlled in order to ensure consumers protection. Although many techniques of control (e.g., food additives, high hydrostatic pressure, ionizing radiation, thermal processes, etc.) have been developed and used to ensure the safety and security of foods, in some instance this has not allowed to produce food products that are completely free of bacteria responsible for degradation/spoilage of food and pathogens causing food poisoning as is the case with B. cereus. Indeed, this pathogenic bacterium is ubiquitous, aerobic and facultative anaerobic. It is able to produce, in a wide variety of foods and ingredients such as spices, highly resistant spores as well as different types of toxins that can cause diarrhea, nausea, vomiting, and even death. In this context, and given the great difficulty in controlling the contamination of food caused by this pathogen, the general objective of this research was to use the electro-activation technology, an applied branch of electrochemistry which is particularly interested in the reactivity of aqueous solutions, as an alternative and potentially effective method to fight against B. cereus in order to produce safer foods with high nutritional and organoleptic values. To achieve this, aqueous solutions of organic acid salts of calcium lactate, calcium ascorbate and their equimolar mixture were electroactivated in a reactor subjected to a direct electric current with intensities of 250, 500 and 750 mA for a maximum time of 30 minutes in a bid to produce the respective conjugated organic acids, lactic acid and ascorbic acid. In the first part of this research work, the physicochemical characteristics (e.g.,pH, titratable acidity, pKa) of the electro-activated solutions (EAS) were studied and their molecular profiles compared to those of respective standard acids using different techniques (e.g., FTIR, HPLC, DSC, DPPH), which helped to confirm the production of conjugated organic acids from the respective salts used. These EAS had a very low pH, a high titratable acidity, particularly for the calcium ascorbate and the mixture. In addition, a high antioxidant activity was observed for the electro-activated calcium ascorbate solution and the mixture. In the second part of the study, the EAS treated at 250, 500 and 750 mA for 10,20 and 30 min were selected to be brought into contact with vegetative cells of Bacilluscereus ATCC 14579 under model conditions (direct contact) in order to evaluate their antimicrobial effects on this pathogen. The cells were tested in direct contact with the EAS for 5, 30 and 60 seconds. The same treatment was also carried out by direct contact with standard organic acids (lactic, ascorbic) for 5, 30, 60, and 120 seconds in order to make comparisons. The EAS and the corresponding standard organic acids had the same titratable acidity values. There after, the cells were observed under microscope (Methylene blue and fluorescence) to evaluate the inhibitory / destructive effects of these solutions. Also, the EAS were diluted with distilled water to obtain solutions with 10 to 90% of the initial titratable acidity (strength) to be tested against B. cereus cells. The results demonstrated that all the EAS made were highly effective against the vegetative cells of B.cereus. Also, even at dilution rates averaging 20% of the EAS initial strength, the antimicrobial effect was very high for the different solutions. In addition, the microscopic observation of B. cereus has confirmed the lethal effects of EAS. In this part with the vegetative B. cereus cells, the efficacy of the EAS was estimated to a reduction of 4–7 log CFU/mL. In addition, the antibacterial power of the EAS has been shown to be significantly higher than that of the standard (conventional) lactic and ascorbic acids. In the third part of the study, electro-activated solutions of calcium lactate, calcium ascorbate and their equimolar mixture at 750 mA for 30 min were selected and used against the spores of Bacillus cereus ATCC 14579 under model conditions and in fresh Atlantic salmon. The treated spores were analyzed using scanning and transmission electron microscopes to evaluate the sporicidal effects of EAS. The results obtained clearly showed a great sporicidal power of the EAS used on B. cereus spores with a reduction of 7 to 9 log using an initial spore population of 10⁹ CFU/mL, depending on the conditions assessed; namely: in direct contact (2–30 min), in salmon used as a food matrix (2–7 min), as well as in combination with moderate heat of 60, 70, 80 and 90 ℃ for 0.5–2 min. Also, it was observed that the sporicidal capacity of the EAS increased with temperature and contact time. Scanning and transmission electron microscopy showed that the EAS could cause the total destruction of B. cereus cells, including perforation of the membranes (cortex and coat), as well as the reflux of different components of the structure of B. cereus spores. Taking into account the results obtained in this study, we can conclude that the electro-activated solutions made with calcium lactate, calcium ascorbate and their mixture, especially those electro-activated at 750 mA–30 min, could be of a great contribution to reinforce the capacity of the food industry to control B. cereus ATCC 14579 and produces safer foods for the consumer.

La protéine Tau est impliquée dans de nombreuses maladies neurodégénératives regroupées sous le terme de Tauopathies dont la plus fréquente est la maladie d'Alzheimer (MA), qui est caractérisée, dans les phases précoces, par une augmentation du stress oxydant dans le cerveau des patients. L'accumulation d'espèces réactives de l'oxygène (ou ROS) dans les neurones mène notamment à l'apparition de dommages au niveau de leur ADN génomique. Les neurones ne se divisant pas, l'accumulation de dommages non réparés au niveau de la molécule d'ADN induit, à terme, des conséquences importantes sur leur fonctionnement. Cependant, les mécanismes impliqués dans l'accumulation de dommages à l'ADN neuronal dans la MA ne sont pas élucidés. La MA est également caractérisée par la présence de protéine Tau hyper et anormalement phosphorylée. Cette protéine Tau pathologique s'agrège et forme les " dégénérescences neurofibrillaires " (ou DNF). Les mécanismes conduisant à l'agrégation de Tau dans les cerveaux Alzheimer demeurent encore peu connus. Néanmoins, il est maintenant admis que bien plus que les agrégats insolubles, ce sont des petites formes oligomériques de Tau qui sont toxiques dans les neurones.Tau peut se localiser dans les conditions physiologiques au niveau de la membrane plasmique et au sein du noyau des neurones. Dans le laboratoire, il a été montré dans des cultures primaires de neurones murins que Tau joue un rôle essentiel dans la protection de l'ADN génomique neuronal en condition de stress. Le premier objectif de cette thèse était de savoir si in vivo Tau joue un rôle protecteur vis-à-vis de l'ADN. Nous avons donc mis au point un modèle murin de stress hyperthermique, stress induisant la formation de ROS. Nous avons ainsi validé in vivo la fonction protectrice de Tau vis-à-vis de l'ADN génomique. Nous avons également mis en évidence que l'absence de Tau altérait l'intégrité d'ARN cytoplasmiques et nucléaires en condition de stress, ce qui suggère que Tau pourrait jouer un rôle dans le contrôle qualité des ARN. Le deuxième objectif était d'évaluer l'impact de la pathologie Tau sur sa fonction protectrice de l'ADN. Notre hypothèse était que la pathologie Tau pourrait avoir un rôle délétère sur sa fonction protectrice de l'ADN génomique. L'impact de la pathologie Tau a alors été évalué in vivo dans un modèle de souris transgéniques (THY-Tau22). Nos résultats indiquent que dans les neurones hippocampiques soumis à un stress hyperthermique et possédant une pathologie de Tau précoce, il y a la perte de la fonction protectrice de Tau vis-à-vis de l'intégrité des acides nucléiques. Par ailleurs, nous avons observé qu'une augmentation de ROS jouait le rôle d'agent inducteur in vivo dans la formation de petits oligomères de Tau dans le cytoplasme et le noyau de neurones hippocampiques. De façon intéressante nous avons observé une corrélation entre les neurones possédant des dommages aux acides nucléiques et la formation de petits oligomères de Tau. Ces résultats mettent en lumière l'existence d'une fenêtre temporelle critique où une augmentation du stress oxydant induit conjointement l'oligomérisation de Tau et la formation de dommages aux acides nucléiques dans des neurones présentant une pathologie précoce. Ceci suggère que des formes oligomériques de Tau seraient impliqués dans l'altération des acides nucléiques.Les phospholipides peuvent également servir d'agent inducteur pour l'oligomérisation de Tau. Ils sont retrouvés dans les membranes. Les radeaux lipidiques sont des microdomaines de la membrane plasmique riches en sphingolipides et en cholestérol qui pourraient servir de point de nucléation pour l'oligomérisation de Tau. Avant de pouvoir répondre à cette question, le troisième objectif a été d'étudier l'état de phosphorylation de Tau associée aux radeaux lipidiques. Nos résultats indiquent que dans le cortex de patients atteints de la MA, la protéine Tau associée aux radeaux lipidiques est hyperphosphorylée et oligomérisée.

The biological membrane surrounding the living cell provides a sealed barrier that tightly regulates the interactions with the outside environment. A large number of integral membrane proteins mediate these interactions and are involved in a wide variety of biological processes. An increasing number of studies have led to the conclusion that lipids provide more than a hydrophobic solvent for membrane proteins, and that interactions between lipids and proteins are required to allow protein function. ABC transporters are one of the most important family of membrane proteins. However, the importance of their lipidic environment is largely unknown. Only a few studies showed that their activity was dependent on the lipidic composition of the surrounding bilayer. The bacterial ABC transporter HorA was used as a model to probe the influence of the lipidic environment on that class of membrane proteins.<p><p> HorA is a multidrug transporter expressed in Lactobacillus brevis, a Gram-positive beer spoilage bacterium. It turned out that phosphatidylethanolamine (PE) was indispensable to maintain both the activity and the structural integrity of HorA.<p> Surprisingly, replacement of PE by the chemically related PC (phosphatidylcholine) did not led to the suppression of HorA activity, but to an unexpected phenotype. Whereas the cytoplasmic domains of HorA were still able to hydrolyze ATP, the membrane parts of the transporter were unable to use that energy to mediate substrate transport. Using several biophysical methods particularly adapted to the study of reconstituted systems, we showed that the structure of HorA is strongly altered by this lipid replacement. In particular, the structural organization of the transmembrane domains of the protein is strongly affected.<p> / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La résistance aux antibiotiques est l'une des menaces les plus graves pour la santé mondiale de nos jours. L'émergence de bactéries multirésistantes encourage les chercheurs à développer de nouveaux antibiotiques et stratégies pour compenser leurs différents mécanismes de résistance. L'un de ces mécanismes de défense est la formation de biofilms. Sous cette forme, les bactéries développent une matrice extracellulaire protectrice les rendant plus résistantes à divers traitements antimicrobiens. Nous avons conçu et synthétisé des composés de déstabilisation des membranes avec des caractéristiques clés : un cation benzimidazolium ou imidazolium, une chaîne apolaire hydrophobe et/ou un site de reconnaissance des anions lipophiles. Ces caractéristiques leur confèrent une activité antimicrobienne accrue et une grande capacité à perturber les membranes cellulaires. Ces composés perturbateurs de la membrane agissent via un mécanisme rapide et efficace et ont montré de bons résultats contre les souches de SARM (staphylococcus aureus résistant à la méthiciline) en tant que candidats antibiofilms prometteurs. Ces nouveaux agents ont le potentiel de se disperser et d'inhiber la formation de biofilms et pourraient avoir un impact positif sur la médecine humaine à l'avenir. / Antibiotic resistance is one of the most serious threats to global health nowadays. Emergence of resistant bacteria encourages researchers to develop new antibiotics and strategies to mitigate their different resistance mechanisms. One of these defense mechanisms is the formation of biofilms. In this form, bacteria develop a protective extracellular matrix making them more resistant to various antimicrobial treatments. We have designed and synthesized membrane destabilizing compounds with three key features: a benzimidazolium or an imidazolium cation, a hydrophobic apolar chain, and a lipophilic anion recognition site. These characteristics give these compounds increased antimicrobial activity and greater ability to disrupt cell membranes. These membrane-disrupting compounds act via a fast and efficient mechanism and showed good results against MRSA (methicillin-resistant staphylococcus aureus) strains as promising antibiofilms candidates. These new agents have the potential to disperse and inhibit the formation of biofilms and could have a positive impact on human medicine in the future.