Une étude a été effectuée a la jonction neuro- musculaire de grenouille pour vérifier l'existence du phénomène d'exocytose, c'est-à-dire la fusion des membranes vésiculaires avec la membrane plasmique lors de la libération de neurotransmetteur. Certaines jonctions neuromusculaires intactes, préalablement incubées avec des collagénases, sont incubées avec du Black Widow Spider Venom (BWSV) afin de provoquer une libération massive de neurotransmetteur et une exocytose des vésicules. Les jonctions sont immédiatement fixées après ce traitement. D'autres jonctions ne sont pas incubées avec le BWSV et servent de contrôle. La présence des membranes vésiculaires dans la membrane plasmique est révélée a l'aide d'un sérum antivésiculaire. La membrane plasmique intacte de la jonction empêche la diffusion des immunoglobulines a l'intérieur de celle-ci. La seule possibilité d'obtenir du marquage sur ces jonctions est donc d'incorporer les membranes vésiculaires a la membrane plasmique pour qu'elles soient exposées à l'extérieur de la terminaison. La position des anticorps est révélée à l'aide de la réaction peroxydase-DAB. Les observations sont effectuées a l'aide d'un microscope avec optique de Nomarski. Les tissus sont ensuite préparés pour les observations en microscopie électronique. Les observations en microscopie optique montrent que la plupart des jonctions marquées se retrouvent sur les muscles incubés avec le BWSV et le sérum antivésiculaire sauf quelques unes qui sont présentes sur les muscles non- incubés avec le BWSV mais incubés avec le sérum antivésiculaire. Aucune jonction marquée n'est observée sur les muscles non-incubés avec le sérum antivésiculaire. Les observations en microscopie électronique révélent du marquage sur la membrane présynaptique des profils de jonctions incubées avec le BWSV et le sérum antivésiculaire. Au contraire, la membrane présynaptique des jonctions non-incubées avec le BWSV est rarement marquée. On observe également sur des coupes transverses de jonctions neuromusculaires (l'intérieur accessible aux immunoglobulines) que le sérum antivésiculaire marque les différents organites impliqués par Heuser et Reese (1973) dans un recyclage local des membranes vésiculaires. Cette étude nous permet de conclure qu'il y a incorporation d'antigènes vésiculaires dans la membrane plasmique lors de l'exocytose massive de neurotransmetteur produite par le BWSV. Cette étude permet également de conclure que l'endocytose est spécifique aux membranes vésiculaires et que ces membranes semblent se disperser dans la membrane plasmique lors de l'exocytose massive produite par le BWSV. / Montréal Trigonix inc. 2018

La déformation en trois dimensions est calculée pour des globules rouges prisonniers à l'aide de trappes optiques dans le cadre de théories analytique et numérique d'élasticité membranaire. Comme la distribution de stress radiale à la membrane est couplée à la déformation de celle-ci, nous calculons cette distribution de stress sur le globule déformé et obtenons les déformations subséquentes itérativement en utilisant une méthode d'élément fini numérique. Ce principe doit s'appliquer jusqu'à ce que l'équilibre final soit atteint entre la distribution de stress et la déformation de la membrane. L'expérience est produite avec des globules rouges soumis à une pression osmotique pour qu'ils prennent une forme sphérique et en suspension dans le médium. L'élasticité de la membrane est obtenue en comparant les résultats expérimentaux avec les prédictions théoriques. Cette approche a la particularité de pouvoir être appliquée à de larges déformations et étendue à d'autres particules soumises à des trappes optiques.

Le syndrome du QT long (SQTL) est une anomalie du coeur caractérisée par une prolongation de l'intervalle de repolarisation entre les ondes Q et T sur l'électrocardiogramme. Ce syndrome pouvant provoquer de l'arythmie et même la mort peut être causé par des mutations génétiques, ou par la prise de certains médicaments. Plusieurs médicaments vendus sous ordonnance qui induisaient le syndrome du QT long ont été retirés du marché au cours de la dernière décennie et plusieurs autres ont échoué les tests de contrôle avant même leur sortie en pharmacie. La plupart de ces médicaments provoquent le SQTL à des doses thérapeutiques et dans pratiquement tous les cas, le syndrome est causé par une interaction du médicament avec le canal potassique transmembranaire du human ether-à-go-go-related-gene (hERG). Selon plusieurs études, la majorité des molécules qui bloquent le canal hERG se lieraient à des sites localisés dans la partie intracellulaire de la région du pore (hélice transmembranaire S5 et/ou S6) ou dans la région extracellulaire qui connecte S5 et S6. Dans la présente recherche, le rôle du segment extracellulaire (lIe583 -Tyr597 ) dans le fonctionnement du canal hERG et dans le mécanisme du SQTL fut étudié. Pour ce faire, l'interaction de ce segment avec quatre médicaments cardiotoxiques (bépridil, cétirizine, diphenhydramine, pentamidine) fut analysée en plus de vérifier l'interaction de ce segment et des médicaments avec des membranes modèles. Une approche combinant la RMN de l'état liquide et de l'état solide jumelée avec des analyses de dichroïsme circulaire a permis d'obtenir les conclusions suivantes. Tout d'abord, les résultats des interactions peptide-médicaments étudiées par RMN de l'état liquide du ¹H par des mesures de diffusion à l'aide de gradients de champ pulsés suggèrent une faible interaction du peptide avec chacun des médicaments dans un environnement aqueux. Cependant, une très forte interaction des médicaments et du peptide avec la membrane a été observée, suggérant un rôle potentiel de cette dernière dans la cardiotoxicité des médicaments provoquant le SQTL. Ensuite, les résultats des interactions médicaments-membranes et peptide-membrane étudiées par RMN de l'état solide du ²H et du ³¹P suggèrent une importante perturbation de la membrane (tant au niveau des têtes polaires que des chaînes acyle) par le segment extracellulaire lIe583 -Tyr597 . Finalement, les analyses de dichroïsme circulaire ont permis de démontrer que ce segment n'adopte pas une structure secondaire bien définie malgré sa forte interaction avec la membrane. Cependant, la conformation de ce segment varie en fonction de la nature et de la charge de la membrane modèle, ce qui prouve sa grande flexibilité structurale. Ces résultats suggèrent que la membrane joue un rôle important dans le fonctionnement du canal hERG, probablement en stabilisant des conformations transitoires durant les processus d'ouverture et de fermeture contrôlés par voltage. En terminant, les expériences biochimiques réalisées ont permis d'exprimer avec succès le segment S5. Des expériences sont toujours en cours pour purifier ce segment. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Syndrome du QT long, hERG, Médicaments cardiotoxiques, Membrane modèle, RMN de l'état liquide, RMN de l'état solide, Interaction médicaments-membranes, Interaction peptide-membranes.

Le phénomène de résistance aux antibiotiques stimule le développement de nouveaux médicaments. Ceux ayant un mécanisme d'action basé sur la perturbation des membranes bactériennes sont de bons candidats puisque les pathogènes y développent plus lentement une résistance. La RMN-ÉS in vivo de membranes naturelles marquées au deutérium (2H) devraient permettre des études plus représentatives des interactions entre les membranes et des agents antimicrobiens ce qui poussera le développement de nouveaux antibiotiques moins susceptibles aux phénomènes de résistance. Le but de ce projet est donc de préparer des bactéries Escherichia coli ayant les lipides membranaires deutérés par incorporation d'acides gras exogènes deutérés pour permettre des études in vivo par 2H RMN-ÉS. Le projet a également pour but d'extraire et purifier des pigments de type marennine pour évaluer leur activité biologique et leurs effets sur les membranes d'E. coli. Nos résultats démontrent qu'une souche sauvage d'E. coli incorpore l'acide palmitique deutéré dans les phospholipides membranaires à un taux de 76% (m/m d'acide gras totaux) permettant un bon rapport signal sur bruit sur les spectres 2H RMN-ÉS. Trois agents antimicrobiens avec des mécanismes d'action différents ont été testés afin de vérifier la réponse des membranes deutérée d'E. coli. Les effets de l'antibiotique polymyxine B étaient cohérents avec la rigidification des membranes, tandis que l'exposition aux nanoparticules de fullerénol a restreint légèrement la dynamique des phospholipides. Le spectre du chlorure de cétyltriméthylammonium révèle la formation d'une phase gel de la membrane. Les interactions entre le modèle développé et les agents antimicrobiens sont en accord avec les mécanismes d'action connus ce qui souligne la justesse de l'analyse in vivo 2H RMN-ÉS d'une souche sauvage d'E. coli pour étudier les mécanismes d'action des agents antimicrobiens et les biomembranes. Le modèle développé a été exposé à l'agent antimicrobien marennine pour vérifier si ce pigment algal extrait de diatomées perturbait les membranes d'E. coli. Les travaux ont permis d'optimiser la croissance des diatomées H. provincialis et d'H. karadagensis en réduisant l'intensité lumineuse, ce qui a assuré la qualité et la quantité du pigment marennine. L'analyse 2H RMN-ÉS indique que la forme externe du pigment extrait d'H. provincialis rigidifie les membranes d'E. coli tandis que la forme interne les fluidifie légèrement ce qui est en accord avec leur propriétés antimicrobiennes respectives connues. Les interactions entre les pigments et les membranes bactériennes sont possiblement la cause de leur action antibiotique. Les formes externes d'H. ostrearia et d'H. karadagensis ont été testées sur les cellules Vero pour déterminer leur cytotoxicité et leur effet antiviral sur le virus HSV-1. Le pigment d'H. karadagensis est moins toxique et a un effet antiviral plus important que le pigment d'H ostrearia ce qui oriente la recherche de nouveaux agents antiviraux sur les pigments d'H karadagensis. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Bactérie Gram négatif, interactions membranaires, polymyxine B, fullerène polyhydroxylé, chlorure de cétyltriméthylammonium, pigment de type marennine.

Les fullerènes natifs sont reconnus pour leur faible solubilité dans l'eau et par conséquent pour former des agrégats insolubles (nano-C60) dans les fluides biologiques. Au contraire, les hydroxyfullerènes (C60(OH)n) sont très solubles dans les milieux aqueux. Ils sont biocompatibles et démontrent une toxicité in vivo très faible sur les lignées cellulaires humaines. Les mécanismes d'interaction entre ces nanoparticules solubles dans l'eau et les membranes biologiques ne sont pas très connus et pourraient constituer un nouveau mode d'action pour lutter contre les bactéries résistantes aux médicaments et permettre le développement de nouveaux agents antibiotiques plus efficaces. Les buts principaux de cette recherche sont de vérifier l'effet des fullerénols, C60(OH)24, sur les membranes cellulaires modèles à l'aide de la spectroscopie de RMN-ÉS et d'IRTF et de synthétiser des nanoparticules (NPs) à base de fullerène au pouvoir potentiellement antibiotique. Les membranes cellulaires sont composées majoritairement de phospholipides, et des mélanges de dipalmitoyl-phosphatidylcholine et –phosphatidylglycérol (DPPC/DPPG) et de DPPC/Cholestérol sont utilisés pour imiter respectivement les membranes de bactéries et d'eucaryotes. Les résultats de spectroscopie de RMN (31P et 2H) de l'état solide et d'IRTF présentés dans ce travail démontrent une affinité spécifique des fullerénols pour les membranes bactériennes composées du phospholipide anionique DPPG. Selon nos observations, les fullerénols sont solubles dans l'eau et interagiraient sélectivement avec les têtes polaires de la DPPG à l'interface eau/bicouche via des ponts-H. Aucun effet similaire n'a été observé pour les membranes modèles de type eucaryotes composées de DPPC/Cholestérol. Dans une autre section, une méthodologie de synthèse permettant d'introduire en une étape des unités propargyle ou azoture en périphérie du fullerène est détaillée, ainsi que la méthode pour en évaluer le nombre à l'aide de la TGA, de la RMN et de I'ATR. Ensuite, à l'aide de la méthode de réduction de Staudinger sur un précurseur polyazidofullerène, le composé polycationique C60(OH)n(OCH2CH2NH3+CI-)10 est synthétisé. Aussi, l'exploration de la "Click chemistry" nous permet de synthétiser un fulléroglyco "cluster" D-mannosylé contenant sept unités de carbohydrates en périphérie du fullerène. La haute solubilité de ces composés dans les milieux aqueux est démontrée. En conclusion, à l'aide de la spectroscopie de RMN-ÉS et d'IRTF, nous avons démontré l'effet spécifique des fullerénols sur les membranes modèles de bactéries. Aussi en deuxième partie, nous avons synthétisé des molécules nouvelles à base de fullerène contenant des fonctions ammonium ou des sucres en périphérie du C60. Ces molécules sont fortement solubles dans l'eau. L'ensemble de nos travaux suggère une piste intéressante dans le développement de nouveaux antibiotiques à base de fullerène ayant une spécificité pour les membranes bactériennes de type E. coli. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Fullerénol, interactions membrane/nanoparticule, DPPC, DPPG, cholestérol, RMN de l'état solide, phosphore, deutérium, IRTF, bactérie, eucaryote, ponts-H, fulléroglyco "cluster", polyazidofullerène, fullerène polycationique, TGA, ATR.

Les phospholipides sont des constituants importants de la membrane cellulaire. Ce sont des lipides qui regroupent deux acides gras, du glycérol et du phosphate, liés de façon covalente. Ce projet de recherche vise à synthétiser de nouveaux composés phospholipides avec deux appendices greffés sur la tête phosphate : un groupe ferrocène (sonde électrochimique) ainsi qu'un groupe dansyle (unité fluorescente). Ces biomolécules modifiées pourraient être incorporées dans des liposomes et des membranes biologiques, permettant d'étudier ces superstructures par microscopie de fluorescence et électrochimique, cette dernière utilisant des ultra-microélectrodes. Le microscope pourrait servir à la détection des cellules particulières sécrétant des espèces électroactives à un potentiel donné. Donc, ces molécules ont un intérêt tant en électrochimie, en biochimie qu'en chimie organique. Le défi dans cette recherche est qu'il n'y a aucun phospholipide dans la littérature comportant à la fois les deux fonctions de visualisation : fluorescence et potentiel redox. La première étape du projet, qui consiste en la production du composé 1,2-dioléoylglycérol, a bien été réalisée en trois étapes seulement et avec un rendement global de 34 % via une mono-protection du glycérol. Le choix de la sonde fluorescente a été porté sur le groupe dansyle pour des raisons de stabilité, de facilité de couplage et de disponibilité. Le chlorure de dansyle a réagi avec l'éthanolamine pour fabriquer l'alcool à coupler, soit le N-dansyl-2-aminoéthanol, le phospholipide marqué avec le dansyle a été préparé avec succès avec un bon rendement de 85 %. Pour le dernier groupe, soit la sonde électrochimique de cette synthèse, le ferrocène a été choisi selon les prérogatives des collègues électrochimistes, pour son potentiel redox compatible avec les milieux biologiques. Le composé ferrocèneéthanol, préparé par le groupe de Prof. Mauzeroll, a été utilisé comme alcool de couplage. Ensuite, en vue d'obtenir un phospholipide fluorescent et électroactif, deux types de structures ont été visées. Le premier type est un phosphate trisubstitué combinant le 1,2-dioléoylglycérol et les deux alcools sondes, soit le N-dansyl-2-aminoéthanol et le ferrocèneéthanol. Malheureusement cette synthèse, tentée via divers protocoles connus, n'a pas fonctionné, particulièrement lors du couplage du partenaire ferrocène. Un deuxième type de composé comprend un phosphate dialkylé cette fois, combinant toujours le 1,2-dioléoylglycérol avec un autre alcool comportant à la fois le groupe dansyle et le ferrocène, en l'occurrence le (N-dansyl, N-ferrocényléthyl)-2-aminoéthanol. Malheureusement encore, cet alcool bifonctionnalisé n'a pas pu être obtenu par des méthodes usuelles. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Phospholipides, sonde électrochimique, unité fluorescente, ultra-microélectrodes, 1,2-dioléoylglycérol, ferrocèneéthanol, dansyle.

Thèse doctorat : Sciences : Strasbourg 1 : 2006. / Thèse soutenue sur un ensemble de travaux. Titre provenant de l'écran-titre. Notes bibliogr.

Reproduction de : Thèse d'exercice : MEDECINE : Nancy 1 : 2000. / 2000NAN11107. Titre provenant de l'écran-titre.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr.: f. 67-75. Publ. aussi en version électronique.

La protéine Tau est impliquée dans de nombreuses maladies neurodégénératives regroupées sous le terme de Tauopathies dont la plus fréquente est la maladie d’Alzheimer (MA), qui est caractérisée, dans les phases précoces, par une augmentation du stress oxydant dans le cerveau des patients. L’accumulation d’espèces réactives de l’oxygène (ou ROS) dans les neurones mène notamment à l’apparition de dommages au niveau de leur ADN génomique. Les neurones ne se divisant pas, l’accumulation de dommages non réparés au niveau de la molécule d’ADN induit, à terme, des conséquences importantes sur leur fonctionnement. Cependant, les mécanismes impliqués dans l’accumulation de dommages à l’ADN neuronal dans la MA ne sont pas élucidés. La MA est également caractérisée par la présence de protéine Tau hyper et anormalement phosphorylée. Cette protéine Tau pathologique s’agrège et forme les « dégénérescences neurofibrillaires » (ou DNF). Les mécanismes conduisant à l’agrégation de Tau dans les cerveaux Alzheimer demeurent encore peu connus. Néanmoins, il est maintenant admis que bien plus que les agrégats insolubles, ce sont des petites formes oligomériques de Tau qui sont toxiques dans les neurones.Tau peut se localiser dans les conditions physiologiques au niveau de la membrane plasmique et au sein du noyau des neurones. Dans le laboratoire, il a été montré dans des cultures primaires de neurones murins que Tau joue un rôle essentiel dans la protection de l’ADN génomique neuronal en condition de stress. Le premier objectif de cette thèse était de savoir si in vivo Tau joue un rôle protecteur vis-à-vis de l’ADN. Nous avons donc mis au point un modèle murin de stress hyperthermique, stress induisant la formation de ROS. Nous avons ainsi validé in vivo la fonction protectrice de Tau vis-à-vis de l’ADN génomique. Nous avons également mis en évidence que l’absence de Tau altérait l’intégrité d’ARN cytoplasmiques et nucléaires en condition de stress, ce qui suggère que Tau pourrait jouer un rôle dans le contrôle qualité des ARN. Le deuxième objectif était d’évaluer l’impact de la pathologie Tau sur sa fonction protectrice de l’ADN. Notre hypothèse était que la pathologie Tau pourrait avoir un rôle délétère sur sa fonction protectrice de l’ADN génomique. L’impact de la pathologie Tau a alors été évalué in vivo dans un modèle de souris transgéniques (THY-Tau22). Nos résultats indiquent que dans les neurones hippocampiques soumis à un stress hyperthermique et possédant une pathologie de Tau précoce, il y a la perte de la fonction protectrice de Tau vis-à-vis de l’intégrité des acides nucléiques. Par ailleurs, nous avons observé qu’une augmentation de ROS jouait le rôle d’agent inducteur in vivo dans la formation de petits oligomères de Tau dans le cytoplasme et le noyau de neurones hippocampiques. De façon intéressante nous avons observé une corrélation entre les neurones possédant des dommages aux acides nucléiques et la formation de petits oligomères de Tau. Ces résultats mettent en lumière l’existence d’une fenêtre temporelle critique où une augmentation du stress oxydant induit conjointement l’oligomérisation de Tau et la formation de dommages aux acides nucléiques dans des neurones présentant une pathologie précoce. Ceci suggère que des formes oligomériques de Tau seraient impliqués dans l’altération des acides nucléiques.Les phospholipides peuvent également servir d’agent inducteur pour l’oligomérisation de Tau. Ils sont retrouvés dans les membranes. Les radeaux lipidiques sont des microdomaines de la membrane plasmique riches en sphingolipides et en cholestérol qui pourraient servir de point de nucléation pour l’oligomérisation de Tau. Avant de pouvoir répondre à cette question, le troisième objectif a été d’étudier l’état de phosphorylation de Tau associée aux radeaux lipidiques. Nos résultats indiquent que dans le cortex de patients atteints de la MA, la protéine Tau associée aux radeaux lipidiques est hyperphosphorylée et oligomérisée. / Tau protein is involved in neurodegenerative diseases called tauopathies. The most frequent tauopathies is Alzheimer's disease (AD). This dementia is characterized, in the early phases, by an increase of oxidative stress in the brain of patients. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in neurons leads to the appearance of damage to genomic DNA. Neurons do not divide, so unrepaired DNA damage will have important consequences on neuronal functioning. However, mechanisms involved in DNA damage accumulation in AD have not been deciphered.AD is also characterized by the presence of hyper and abnormally phosphorylation of Tau protein. Pathological Tau forms aggregates and leads to the formation of neurofibrillary tangles. However, mechanisms involved in the intracellular aggregation of Tau in AD brains remain unknown. Nevertheless, it is now admitted that, much more than insoluble aggregates of Tau, small oligomers are the toxic form of Tau.Tau protein is mainly known for its MAP (Microtubule Associated Protein) function. However, in physiological condition, it can also be located at the plasmic membrane level and in neurons nucleus and therefore may have others functions. A new function of Tau was revealed in the laboratory. It was shown that Tau plays an essential role in neuronal genomic DNA protection in stress condition. This study was performed in primary neuronal cultures of embryonic mice neurons. The first objective of this thesis was to challenge the DNA protective function of Tau in vivo. To answer this question, we designed a murine model of hyperthermic stress which leads to the formation of ROS. Using this model, we showed that Tau is able to protect in vivo the genomic DNA of hippocampal neurons of mice submitted to hyperthermic stress. We also highlighted the fact that Tau deficiency alters the integrity of cytoplasmic and nuclear ARN suggesting that Tau could play a role in quality control of RNA. Our second objective was to study if Tau pathology has a deleterious impact on its DNA protective function. The impact of Tau pathology has been analyzed in the transgenic mouse model THY-Tau 22 mice. Our results indicate that an increase of ROS induces the loss of the nucleic acid protective function of Tau selectively in early stages of Tau pathology. We also observed that hyperthermic stress plays an inducing role in vivo in the formation of small Tau oligomers in the nuclei and the cytoplasm of hippocampal neurons. Interestingly, we observed a correlation between nucleic acid damage and the formation of Tau oligomers suggesting that oligomers would be the toxic forms of Tau involved in the alteration of nucleic acid integrity. These results bring to light the existence of a critical time window where an increase of ROS induces both Tau oligomerization and nucleic acid damage in neurons displaying early Tau pathology.Phospholipids, which are principally found in membranes, can be an inducing agent for Tau oligomerization. Lipid rafts are microdomains of the plasmic membrane, which are rich in sphingolipids, and cholesterol. A hypothesis is that lipid rafts could be a nucleation point for Tau oligomerisation. Before being able to answer this question, the third objectif was to study the phosphorylation and conformational state of Tau associated with rafts in physiological and pathological conditions. Our results indicate that in the cortex of AD patients, Tau associated to lipid rafts is hyperphosphorylated, abnormally conformed and oligomerized.