Orientador: Rui Seabra Ferreira Junior / Resumo: Atualmente são muitos casos de pacientes que perdem estrutura óssea em acidentes ou reabsorção patológica. A bioengenharia óssea é um tratamento promissor que visa reconstruir estas estruturas sem a morbidade do enxerto autógeno. O tecido ósseo é um conjuntivo especializado com a função principal de proteção e sustentação dos tecidos moles, mas também é responsável pela produção de tipos celulares e homeostase de minerais. Sua reparação é complexa com diferentes tipos celulares e agentes quimiotáticos que funcionam de forma orquestrada até a reparação. As terapias celulares vêm sendo estudadas para promover a reparação de defeitos que o organismo por si não consegue resolver. Células menos especializadas como as células-tronco embrionárias (ESCs) possuem grande potencial terapêutico, mas são complicadas eticamente. Já as células-tronco mesenquimais (MSC) podem ser autólogas, o que minimiza o risco de imunogenicidade mas necessitam área doadora do paciente. Atualmente ainda não há consenso quanto ao uso de células tronco na terapia regenerativa pois há grandes variáveis como a melhor forma de aplicação, a quantidade correta e o melhor tipo celular para a regeneração óssea. As células produzem mediadores químicos no local enxertado, que segundo pesquisas recentes é o principal mecanismo de reparação tecidual. Estes mediadores são depositados em abundância no meio de cultura durante a cultura celular e usados na bioengenharia com a ajuda de scaffolds. Os biopolímeros de fibrina ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Chapter I present a review about bone repair and its biological events, bioengineering, cells, fibrin biopolymer as scaffold and the secretoma derived from cell culture. Many patients nowadays lose bone structure in accidents or pathological reabsorption. Bone bioengineering is a promising treatment that aims to reconstruct these structures without autogenous graft morbidity. Bone tissue is a specialized connective tissue specialized in protecting and supporting soft tissues, but it is also responsible for the production of cell types and mineral homeostasis. The bone healing is a complex process where different cell types and chemotactic agents work in an orchestrated way. The cell therapies can promote the repair of defects that the body cannot solve. Less specialized cells like embryonic stem cells (ESCs) have great therapeutic potential, but are ethically complicated. In contrast, mesenchymal stem cells (MSCs) may be autologous, which minimizes the risk of immunogenicity but requires a patient's donor area. Currently there is still no consensus regarding the use of stem cells in regenerative therapy, studies uses different methods, cells and biomaterials for bone regeneration. Recent researches advocate that paracrine secretions by cells are main mechanism of tissue repair. These mediators are deposited in abundance in the culture medium during cell culture. Fibrin biopolymers (BF) are natural biomaterials to the body and can function as drug delivery of growth factors, c... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Rogerio Martins Amorim / Resumo: Estudos com células estromais mesenquimais multipotentes (MSCs) estão em crescente progresso devido às suas propriedades imunomoduladoras, antiinflamatórias, antiapoptóticas e de regeneração tecidual, tornando essa modalidade de terapia celular promissora no tratamento de diversas doenças. Devido à limitada capacidade regenerativa do sistema nervoso central (CNS), causando sequelas funcionais, as MSCs estão sendo investigadas como uma alternativa terapêutica para condições neurológicas inflamatórias, vasculares, traumáticas e degenerativas em diversas espécies animais. A Mieloencefalite protozoária equina (EPM) causada por ambos os protozoários do filo Apicomplexa, Sarcocystis neurona e Neospora hughesi, permanece como uma importante doença neurológica dos equinos nas Américas, embora a maioria dos casos seja devida à infecção por S. neurona. A aplicação da proteômica com sua gama de ferramentas na clínica de equinos pode contribuir significativamente para o entendimento de processos patológicos e facilitar a descoberta de novos alvos terapêuticos ou marcadores diagnósticos. Neste contexto, os objetivos deste estudo foram avaliar o perfil proteômico do líquido cefalorraquidiano (CSF) antes e após múltiplos transplantes intratecal de MSCs em equinos hígidos e o perfil proteômico do CSF de equinos cronicamente afetados pela EPM. Doze cavalos adultos clinicamente saudáveis foram divididos aleatoriamente em três grupos experimentais: grupo DPBS (DPBS ou control; n = 4) onde a sol... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Multipotent mesenchymal stromal cell (MSCs) studies are under increasing progress because of their immunomodulatory, anti-inflammatory, antiapoptotic and tissue regeneration properties, making this modality of cell therapy promising in the treatment of various diseases. Due to the limited regenerative capacity of the central nervous system (CNS), causing functional sequelae, MSCs are being investigated as a therapeutic alternative for inflammatory, vascular, traumatic and degenerative neurological conditions in various animal species. Equine protozoal myeloencephalitis (EPM) caused by both protozoa of the Apicomplexa phylum, Sarcocystis neurona and Neospora hughesi, remains an important neurological disease in horses in the Americas, although most cases are due to S. neurona infection. The application of proteomics with its range of tools in the equine clinic can contribute significantly to the understanding of pathological processes and facilitate the discovery of new therapeutic targets or diagnostic markers. In this context, the objectives of this study were to evaluate the proteomic profiling of cerebrospinal fluid (CSF) before and after multiple intrathecal transplantations of MSCs in healthy horses and the CSF proteomic profiling of horses chronically affected by EPM. Twelve clinically healthy adult horses were randomly divided into three experimental groups: DPBS (DPBS or control; n = 4), in which intrathecal "transplants" with Dulbecco's phosphate buffered saline (DPB... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Benedito Barraviera / Resumo: O reparo do tecido ósseo é um desafio antigo da ciência mundial. A partir das décadas de 70-80, os biomateriais passaram a ser explorados e hoje desempenham importante papel na engenharia tecidual. Estes, quando aplicados na enxertia óssea, devem ser bioativos, biocompatíveis e reabsorvíveis. A integração entre os diversos materiais de origem sintética e os arcabouços biológicos possui amplo espectro de uso. Dentre os arcabouços destacam-se os compostos à base de fibrina por suas propriedades hemostáticas, estabilidade e morfologia favorável à proliferação celular. A presente revisão abordou a estrutura e constituição do tecido ósseo e suas limitações no processo de reparo, a relevância da engenharia tecidual aplicada à esta finalidade e os biomateriais utilizados para otimizar tal processo, com ênfase especial aos materiais compostos por fosfatos de cálcio, células tronco mesenquimais e sua aplicação junto ao arcabouço biológico selante de fibrina, com destaque para o selante heterólogo de fibrina, agora denominado biopolímero de fibrina, um produto único e em fase de testes em experimentação animal e estudos clínicos. Propõe-se, ao final desta, uma nova abordagem para a regeneração de defeitos ósseos de ratos baseada na associação entre o selante heterólogo de fibrina, o fosfato de cálcio bifásico e células tronco mesenquimais. / Abstract: Bone tissue repair is an ancient challenge of world science. From the 70s and 80s, biomaterials began to be explored and nowadays play an important role in tissue engineering. These, when applied in bone grafting, have to be bioactive, biocompatible and resorbable. The integration between the various materials of synthetic origin and biological scaffolds has a wide spectrum of use. Among these scaffolds, fibrin-based compounds are distinguished by their hemostatic properties, stability and morphology favorable to cell proliferation. The present review addressed the structure and constitution of bone tissue and its limitations in the repair process, the relevance of tissue engineering approaches applied to this purpose and the biomaterials used to optimize this process, with special emphasis on materials composed of calcium phosphates, mesenchymal stem cells and its application with the biological sealant fibrin scaffold, highlighting the heterologous fibrin sealant, now named as fibrin biopolymer, a unique product testing in animal experimentation and clinical studies. At the end of this, a new approach is proposed for the regeneration of rat bone defects based on the association between heterologous fibrin sealant, biphasic calcium phosphate and mesenchymal stem cells. / Mestre

Orientador: Rogerio Martins Amorim / Resumo: As lesões de nervos periféricos por neurotmese apresentam resultados paradoxais na recuperação pela ausência na regeneração. Assim, manter o ambiente permissivo de crescimento no coto distal após a lesão é essencial, sendo as células de Schwann chaves neste processo. A terapia celular apresenta potencial para a regeneração nervosa, baseado na substituição celular e promoção do crescimento axonal. As células tronco mesenquimais multipotentes de tecido adiposo (CTMM-TA) são uma fonte promissora pela fácil obtenção, expansão in vitro e por apresentarem propriedades imunomoduladoras e antinflamatórias. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi comparar os efeitos do transplante de CTMM caninas e murinas em combinação com a técnica de tubulação com veia descelularizada, na regerenaração do nervo ciático em modelo experimental de neurotmese em ratos. Ratos Wistar submetidos a neurotmese do nervo ciático foram divididos em 5 grupos: Grupo controle (GC), Grupo denervado (GD), Grupo Transplante de Veia descelularizada (GV), Grupo Veia + células tronco mesenquimais multipotentes caninas (GCTMMc), Grupo Veia + células tronco mesenquimais multipotentes murinas (GCTMMm). Após a marcação com nanocristais fluorescentes e viabilidade celular, 1 x 106 CTMM caninas e murinas foram injetadas depois da realização da lesão experimental por neurotmese com 10mm por tubulação com veia descelularizada nos grupos GCTMMc e GCTMMm, e solução tampão salina de Hank's (HBSS) no grupo veia (GV). Durante o ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The peripheral nerves injury by neurotmesis presents confusing results in the recovery by the lack of regeneration. Thus, it is essential to maintain a growth permissive microenvironment in the distal stump following injury for Schwann cells. The cell therapy has therapeutic potential for nerve regenertion, based on cell replacement and promotion of axonal growth. Adipose-derived multipotent mesenchymal stem cells (AdMSC) are a promising source for easy retrieval and expansion in vitro and have immunomodulatory and anti-inflammatory properties. The objective of this study was to compare the effects of canine and murine MSC transplantation in combination with the tubulization of decellularized vein in sciatic nerve regeneration. Wistar rats were divided into 5 groups: control group (CG), denervated group (DG), decellularized vein transplantation group (VG), vein + canine MSC group (cMSC) and vein + murine MSC group (mMSC). After labeling with fluorescent nanocrystals and cell viability, 1 x 106 canine and murine MSC were injected after experimental injury for neurotmesis with 10mm and tubulization with decellularized vein in the cMSC and mMSC groups. During a period of 35 days the sciatic nerve functional index (SFI) and electroneuromyography (EMG) were performed to access functional recovery. Histological analysis and immunohistochemistry were performed to evaluate myelination, neurotrophic factor production and persistence of MSC. It was observed functional postive results a... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Resumo: As células-tronco mesenquimais (MSCs) exercem seus efeitos terapêuticos predominantemente pela sua atividade parácrina. Como o secretoma desempenha um papel direto nas atividades biológicas das MSCs, a análise de seus componentes proteicos é um passo fundamental para identificar os principais responsáveis no controle e regulação dos muitos processos biológicos desenvolvidos por essas células. O secretoma de MSCs pode ser modificado e melhorado de forma in vitro para estimular efeitos celulares específicos desejados para aplicações terapêuticas, e uma maneira de modificá-lo é por meio de modificações nas condições de cultura. No presente estudo, objetivou-se descrever o secretoma de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo (AD-MSCs) de gatos e cães submetidos a diferentes condições de cultivo, identificamos e comparamos os efeitos exercidos por diferentes modificações de cultivo. Para a produção de meio condicionado, as células foram descongeladas e cultivadas com meio DMEM/F12 com 20% de FBS, suplementado com antibióticos e antimicóticos em uma incubadora com umidade controlada a 37,5 °C, e 5% de CO2. Após atingir pelo menos 70% de confluência, as garrafas foram lavadas três vezes com solução salina balanceada Hanks (HBSS) e foram cultivadas em quatro condicionamentos distintos. O meio condicionado foi colhido após 4 dias, centrifugado por 10 min/300 g, filtrado em um filtro 0,22 μm e congelado a -80 °C. Foram realizadas a extração e concentração proteica de to... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: It is now known that mesenchymal stem cells (MSCs) exert their therapeutic effects predominantly through their paracrine activity. Since the secretome plays a direct role in the biological activities of MSCs, the analysis of their protein components is a fundamental step in identifying the main responsible for the control and regulation of the many biological processes developed by these cells. The MSCs secretome can be modified and improved in vitro to stimulate specific cellular effects desired for therapeutic applications, and one way of modifying it is through modifications in the culture conditions. In the present study, in addition to describing for the first time the secretome of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (AD-MSCs) in feline species, we identified and compared the effects exerted by different culture modifications, such as the use of serum-free medium and hypoxia in the protein production by AD-MSCs in canines and felines. For the conditioned media production, the cells were thawed and cultured with DMEM/F12 medium with 20% fetal bovine serum (FBS), supplemented with antibiotics and antimycotics in controlled incubator ay 37.5 °C with 5% CO2. After reaching at least 70% confluency, the flasks were washed three times with Hanks balanced salt solution (HBSS) and were grown in four different conditions. Conditioned media were collected after 4 days, centrifuged for 10 min/300 g, filtered on a 0.22 μm filter and frozen at -80 °C. Protein extraction... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Neste trabalho tentamos traçar quais seriam os efeitos funcionais e de expressão gênica de mutações patogênicas no gene TCOF1 em células não embrionárias. A partir do estabelecimento de culturas celulares oriundas de periósteo facial de quatro pacientes portadores da síndrome de Treacher Collins (STC), obtivemos populações celulares com mais de 95% de marcação positiva para antígenos que caracterizam células de origem mesenquimal. Demonstramos que as células-tronco mesenquimais e fibroblastos provenientes de pacientes com STC apresentaram redução da expressão de TCOF1 de aproximadamente 31% quando comparados aos controles. Tal redução se mostrou compatível com a diminuição da expressão dos transcritos portadores de mutação patogênica observada no seqüenciamento do cDNA dos pacientes. Portanto, estes resultados sugerem que há degradação do transcrito mutado, que muito possivelmente deve ser regulada pelo mecanismo de non-sense mediated mRNA decay (NMD) e corroboram o modelo de haploinsuficiência da Treacle. Como o pico de expressão do gene Tcof1 é detectado durante o estágio embrionário de formação das células da crista neural e embriões de camundongos Tcof1+/- apresentam redução da proliferação das células neuroepiteliais, testamos se haveria alteração da capacidade proliferativa de células mesenquimais adultas com mutações no TCOF1. A análise das taxas de crescimento das culturas celulares provenientes de pacientes com STC se mostrou semelhante aos controles normais, indicando que menores níveis de transcritos do gene não interferem na capacidade proliferativa celular. Além disso, avaliamos o potencial de diferenciação óssea in vitro, mostrando que menores níveis de TCOF1 também não parecem influenciar a capacidade de diferenciação celular. Apesar de ainda não termos identificado um fenótipo celular, a deficiência de TCOF1 em células não embrionárias resulta na alteração da expressão gênica, já que a análise da expressão genômica das culturas celulares identificou uma série de genes diferencialmente expressos. Ademais, genes de parada do ciclo celular e apoptose com expressão aumentada em células embrionárias de camundongo Tcof1+/- não apresentaram expressão aumentada nas células humanas com mutações patogênicas no TCOF1, sugerindo que a via da p53 não está ativa nestas células não embrionárias. Dentre os genes diferencialmente expressos encontrados, o aumento dos transcritos de DAXX nas células-tronco mesenquimais com mutações patogênicas no TCOF1 poderia modular as funções da p53 nessas células, constituindo um bom alvo de investigações futuras para a elucidação da função do TCOF1 em células não embrionárias. Os resultados obtidos sugerem que deficiência de TCOF1 em células mesenquimais leva à ativação de outras vias de sinalização, cujo efeito funcional é ainda desconhecido. Quais seriam as funções e em quais vias celulares o TCOF1 agiria, são questões a serem elucidadas a respeito do papel do gene na fase adulta. / In this work we tried to outline the effects of functional and gene expression of pathogenic mutations in the gene TCOF1 in non-embryonic cells. From the establishment of facial periosteum derived cell culture of four patients with Treacher Collins syndrome (TCS), we obtained cell populations that are more than 95% positive for mesenchymal origin characteristic antigens. We demonstrated that mesenchymal stem cells and fibroblasts from patients with TCS showed reduction of approximately 31% in the TCOF1 expression when compared to controls. This reduction was consistent with the decrease in the expression of transcripts carrying the pathogenic mutations observed when sequencing the cDNA of the patients. Therefore, these results suggest that degradation of the mutated transcript occurs and it may possibly be governed by the mechanism of non-sense mediated mRNA decay (NMD), thus corroborating the Treacle haploinsufficiency model. As the peak of TCOF1 gene expression is detected during the embryonic stage of the formation of neural crest cells and Tcof1+/- mice embryos had shown reduction of neuroepithelium cells proliferation rate, we tested if there is a change in proliferative capacity of adult mesenchymal cells with mutations in TCOF1. The analysis of the growth rate of TCS patients cells was similar to normal controls, indicating that lower levels of transcripts of the gene does not interfere with cellular proliferative capacity. Furthermore, we evaluated the bone differentiation potential of these cells in vitro, showing that lower levels of TCOF1 also seem does not influence cell differentiation ability. Although a cellular phenotype has not yet been identified, deficiency of TCOF1 in non-embryonic cells results in gene expression change, since genomic analysis of the expression of cell cultures identified a number of differentially expressed genes. Furthermore, arresting cell cycle and apoptosis related genes with increased expression in embryonic cells of Tcof1+/- mice showed no increased expression in human cells with pathogenic mutations in TCOF1 suggesting that the p53 pathway is not active in these non-embryonic cells. Among the differentially expressed genes found, the increase of DAXX transcripts in mesenchymal stem cells with pathogenic mutations in TCOF1 could modulate the function of p53 in these cells, providing a good target for future investigations to elucidate the function of TCOF1 in non-embryonic cells. The results suggest that deficiency of TCOF1 in mesenchymal cells leads to activation of other signaling pathways, whose functional effects are still unknown. The functions and cellular pathways in which the TCOF1 act, are issues yet to be elucidated concerning the role of the gene during adulthood.

Células-tronco mesenquimais (CTM) apresentam tropismo a tumores, sendo importantes componentes do estroma tumoral. No cérebro, o nicho perivascular é uma importante fonte de CTM, as quais podem contribuir direta e/ou indiretamente para o desenvolvimento de tumores, embora os mecanismos envolvidos sejam pouco conhecidos. No presente trabalho, investigou-se a influência de CTM sobre a proliferação, capacidade invasiva e tumorigenicidade de células de Glioblastoma (GBM) humano. Sabe-se que CTM produzem TGFB1, uma citocina multifuncional envolvida em imunomodulação, proliferação, migração e transição epitelial-mesenquimal de células tumorais. Experimentos in vitro, realizados com meios condicionados de CTM de cordão umbilical humano com silenciamento permanente do gene TGFB1, demonstraram que o TGFB1 secretado por CTM é capaz de aumentar significativamente a proliferação e viabilidade de células de GBM humano da linhagem U87FP635. Esses resultados revelam uma importante ação parácrina dessa citocina regulatória, quando produzida por outros tipos celulares contidos no microambiente tumoral. Entretanto, sob condições experimentais que melhor mimetizam o microambiente tumoral, detectou-se que CTM também afetam o comportamento de células tumorais por um mecanismo alternativo, dependente de contato celular, mas independente dos níveis de TGFB1 secretados pelas CTM. Sob condições de cocultivo celular, envolvendo contato físico entre CTM e células de GBM U87FP635, detectou-se um aumento significativo na quantidade de células tumorais viáveis. Quando cultivadas na forma de esferoides tumorais, o contato com CTM aumentou a capacidade invasiva das células U87FP635. Finalmente, em modelo in vivo ectópico de GBM, células U87FP635 geraram tumores mais desenvolvidos quando coinjetadas com CTM. Esses efeitos pró-tumorigênicos foram observados tanto em contato com CTM controles, quanto com CTM contendo o gene TGFB1 permanentemente silenciado. Assim, esses achados indicam que CTM podem exercer efeitos pró-tumorigênicos por dois mecanismos alternativos e independentes: ação parácrina de TGFB1 secretado por CTM e ação mediada por contato célula-célula. Nas condições experimentais testadas, o mecanismo dependente de contato célula-célula demonstrou ser predominante. O estudo proteômico do secretoma dessas células identificou 126 proteínas diferencialmente expressas além de 10 proteínas exclusivamente detectadas em meios condicionados de cocultivos de CTM com células de GBM U87FP635. Cerca de 80% dessas proteínas exclusivamente secretadas pelo contato célula-célula são componentes de exossomos e estão envolvidas em proliferação celular e desenvolvimento tecidual. Esses resultados apontam uma interação dinâmica de comunicação entre CTM e células tumorais, e revelam algumas proteínas interessantes potencialmente envolvidas em uma ação pró-tumorigênica de CTM mediada por contato celular / Mesenchymal stem cells (MSC) display tropism to tumors, being recruited to its microenvironment where they comprise the tumor stroma. In brain, perivascular niche is a substantial source of MSC. Although mechanisms involved are poorly understood, MSC may directly and/or indirectly contribute to tumor development. Herein, the influence of MSC on the proliferation, invasiveness and tumorigenicity of human glioblastoma cells (GBM) was investigated. Moreover, since MSC releases TGFB1, a multifunctional cytokine with roles in immunomodulation, proliferation, migration and epithelial-mesenchymal transition of tumor cells, we analyzed if MSC-secreted TGFB1 affects GBM behavior. In vitro studies performed in the presence of conditioned media from human umbilical cord MSC with a stable TGFB1 gene expression knockdown showed that MSC-secreted TGFB1 is able to significantly increase the proliferation and viability of a GBM cell line (U87FP635). These results revealed an important paracrine effect of this regulatory cytokine when secreted by other cell types in tumor microenvironment. However, under experimental conditions that better mimic the tumor microenvironment, it was found that MSC also affect tumor cell behavior by an alternative mechanism dependent on cell-cell contact, but independent of TGFB1 levels secreted by MSC. The cell-cell contact between MSC and GBM U87FP635 significantly enhaced tumor viable cells. Additionally, the spheroid tumor cell culture with MSC cell contact increased the invasiveness of U87FP635 cells. Finally, in vivo ectopic implantation model showed more developed tumors when GBM U87FP635 cells were coinjected with MSC. These pro-tumorigenic effects were found both in cell-cell contact with control MSC, as with MSC containing TGFB1 gene expression knockdown. Thus, these findings indicate that MSC can exert pro-tumorigenic effects by two alternative and independent mechanisms: paracrine action of TGFB1 secreted by MSC and action mediated by cell-cell contact. In the present experimental conditions, the cell-cell contact-dependent mechanism was predominant. The secretome proteomic study of those cells identified 126 differentially expressed proteins as well as 10 proteins exclusively detected in conditioned media from GBM U87FP635 cell cocultures with MSC. About 80% of proteins uniquely secreted by cell-cell contact are exosomes components and are involved in cell proliferation and tissue development. These results indicate a dynamic interaction of communication between MSC and tumor cells and reveal some interesting proteins potentially involved in a MSC pro-tumorigenic action mediated by cell contact

Células multipotentes mesenquimais estromais (CTM) são células adultas multipotentes que podem ser isoladas a partir de diferentes tecidos e são capazes de atingir sítios danificados, exercer papéis na regeneração tecidual e modular a resposta imune. Estas células demonstraram resultados discrepantes em estudos in vivo dependentes de sua fonte de obtenção. Há na literatura hipóteses de que o mecanismo predominante pelo qual as CTMs atuam no reparo tecidual estaria relacionado à sua atividade parácrina, criando um microambiente com sinais tróficos. Nesse sentido, a avaliação do conteúdo do secretoma destas células é de grande interesse. Portanto, este projeto teve como objetivo analisar o meio condicionado de CTMs obtidas de diferentes fontes (tecido adiposo, músculo esquelético e tubas uterinas) de mesmos indivíduos. A abordagem experimental consistiu em proteômica shotgun (nanocromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas em tandem) com o intuito de identificar alvos diferentemente expressos entre as culturas que possam sugerir funções específicas de cada linhagem celular. Os dados espectrais foram obtidos pelo modo de aquisição dependente de dados (Top15). Os dados adquiridos foram processados pelas plataformas MaxQuant e TPP (Trans-Proteomic Pipeline). Foi realizada análise qualitativa de vias enriquecidas por meio do programa Ingenuity utilizando as proteínas em comum nos secretoma de todas as CTMs analisadas. Essa análise permitiu observar vias enriquecidas de proliferação celular, migração celular e desenvolvimento do sistema cardiovascular, demonstrando que as proteínas secretadas por quaisquer das CTMs analisadas podem ser relacionadas a resultados encontrados na literatura utilizando estas células para terapias para patologias. As análises estatísticas para determinar se haveria dependência da composição do secretoma em função do indivíduo doador ou tecido fonte das CTMs revelaram proteínas diferencialmente expressas entre todos os grupos. Estas proteínas diferencialmente expressas são relacionadas à proliferação, sinalização e interação celular, além de modulação do sistema imune e da angiogênese. Neste contexto, podemos concluir que o secretoma das CTMs é muito semelhante, que as CTMs isoladas de quaisquer tecidos ou indivíduos são capazes de secretar moléculas que possivelmente exercem benefícios em determinado tratamento. Entretanto, estes benefícios podem ser exacerbados ou suprimidos pelas moléculas diferencialmente expressas, as quais são dependentes tanto dos tecidos quanto dos indivíduos dos quais as CTMs foram obtidas / Multipotent Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are multipotent adult cells that can be isolated from different tissues and are able to reach damaged sites, play a role in tissue regeneration and modulate immune response. These cells showed conflicting results in studies in vivo depending on their tissue origin. It is hypothesised that the predominant mechanism by which MSCs function could be related to its paracrine activity, creating a microenvironment with trophic signals. Accordingly, the evaluation of the content of the secretome of these cells is of great interest. Towards this end, this project analyzed the proteins of conditioned medium of MSCs obtained from different sources from the same donors (adipose tissue, uterine tubes and skeletal muscle). The MSCs were characterized by flow cytometry for the presence of membrane markers and by differentiation in vitro into adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts. The conditioned media were obtained and the protein profile was analysed by liquid nanochromatography coupled to tandem mass spectrometry. Spectral data were obtained by full-acquisition mode MS / dd-MS2 (Top15). The acquired data were processed by MaxQuant software and TPP (Trans-Proteomic Pipeline). Qualitative analysis of enriched pathways through the Ingenuity program using the shared proteins between the cell lineages was performed.It showed enriched pathways related to cell proliferation, cell migration and development of the cardiovascular system. This allows considering that the secreted proteins from the analyzed MSCs might be related to findings in the literature using these cells for therapies. After this, the proteins were analyzed for differential expression by comparing the MSCs into groups of different sources or different donors. In which were observed differentially expressed proteins related to proliferation, cell signaling and interaction, modulation of the immune system and angiogenesis. In this context, we can conclude that MSC\'s secretome is very similar in the analyzed lineages, and that any MSCs are able to secrete molecules which potentially exert for certain treatment benefits. However, these benefits can be exacerbated or annulled by differentially expressed molecules, which are dependent both as the individual and tissues from which MSCs were obtained

A fissura lábio-palatina não-sindrômica (FLP NS) é uma doença multifatorial, determinada pela interação entre fatores genéticos e ambientais e sua incidência é estimada entre 0,34 e 2,29 a cada 1000 nascimentos. Trata-se de uma embriopatia causada por erros durante a morfogênese orofacial, a qual depende de uma fina regulação de mecanismos como proliferação celular, remodelagem de matriz extracelular, e transição epitélio-mesenquimal. Apesar de intensos esforços para se determinar fatores genéticos e ambientais de susceptibilidade, a etiologia desta malformação permanece pouco compreendida. Vários loci associados às FLP NS vêm sendo identificados por meio de estudos de mapeamento gênico convencionais, entretanto, a grande maioria dos resultados não se replica em diferentes estudos, e não há clareza acerca do efeito funcional das variantes detectadas. Neste contexto, uma abordagem interessante para investigar a etiologia da doença é a análise de expressão gênica, que pode ser utilizada para identificar alterações de vias biológicas que convergem na manifestação do quadro clínico. Em vista disso, neste trabalho nós utilizamos a análise do transcriptoma de células-tronco de polpa dental de pacientes portadores de FLP NS, com o intuito de identificar padrões de expressão relacionados a mecanismos biológicos relevantes para a embriopatogênese da doença. Obtivemos padrões de expressão que sugerem desregulação de mecanismos associados à remodelagem de matriz extracelular e à transição epitélio-mesenquimal. Além disso, ao utilizarmos diferentes condições de cultura celular, verificamos em uma nova amostra de pacientes a desregulação de vias biológicas relacionadas ao reparo de DNA e checkpoint do ciclo celular. Nossos dados revelam a aplicabilidade das células-tronco de polpa dental para este tipo de abordagem, e indicam que tais perfis de expressão podem levar ao acometimento da morfogênese lábio-palatina. Além disso, mostramos pela primeira vez uma conexão entre desregulação de expressão gênica e a documentada maior incidência de formas esporádicas de câncer em famílias segregando a FLP NS. Nossos resultados abrem novas possibilidades para a investigação da etiologia das FLP NS, e ajudarão na compreensão dos eventos embrionários que predispõem a essa malformação. / Non-syndromic cleft lip and palate (NSCL/P) is a multifactorial disease determined by the interplay between genetic and environmental factors, with a variable incidence of 0.34-2.29:1000 births. This malformation arises from errors during lip and palate morphogenesis, which requires tight regulation of biological mechanisms such as cellular proliferation, extracellular matrix remodelling, and epithelial-mesenchymal transition. Albeit much effort has been put into determining the genetic and environmental factors underlying disease susceptibility, the aetiology of NSCL/P remains obscure. Many candidate loci have been identified through conventional gene mapping strategies, however, there is a general lack of reproducibility across studies, and there is no consensus with regard to the functional implications of the identified genetic variants. In this context, an alternative approach resides in assessing differential expression patterns to identify alterations in biological networks that could lead to phenotype manifestation. Here, we analysed the transcriptome of dental pulp stem cells from NSCL/P patients in order to pinpoint dysregulated pathways involved in the embryopathogenesis of the disease. We encountered expression patterns related to dysregulation of extracellular matrix remodelling and epithelial mesenchymal transition. Moreover, by subjecting a novel NSCL/P sample to differential cell culture conditions, we observed abnormal transcription of genes partaking in DNA repair and cell cycle checkpoint pathways. Our results show the applicability of dental pulp stem cells to this strategy and suggest that the observed expression patterns could lead to impairment of lip and palate morphogenesis. Moreover, we described for the first time a connection between abnormal gene expression in these individuals and the elevated occurrence of sporadic cancer types in NSCL/P families. Our results open new possibilities to investigate the aetiology of NSCL/P and provide further insight into the ontogenetic events underlying disease predisposition.

As células de pluripotência induzida (iPS) foram reportadas pela primeira vez em 2006 por Takahashi e Yamanaka e desde então vem sendo extensivamente estudadas. Por meio da técnica, células somáticas adultas adquirem comportamento muito semelhante às células tronco embrionárias, reduzindo as questões éticas relacionadas ao uso destas em pesquisas. Entretanto, os mecanismos biológicos das células iPS ainda não estão completamente elucidados. Ainda são necessárias pesquisas mais aprofundadas para garantir a segurança e eficácia de sua possível utilização em futuras terapias. Os coelhos, como modelos experimentais, são vantajosos tanto pelo seu tamanho ideal para procedimentos cirúrgicos quanto por sua manutenção fácil e econômica. As células tronco derivadas do tecido adiposo (ADSC) consistem em um tipo de célula tronco mesenquimal multipotente que se destaca pela facilidade, rapidez e segurança de coleta e processamento. As ADSC foram coletadas e caracterizadas por meio de análises de curva de crescimento celular, doubling time, viabilidade após criopreservação, capacidade de formação de colônias fibroblastoides, diferenciação osteogênica, condrogênica e adipogênica, imunocitoquímica e citometria de fluxo. Elas demonstraram possuir as características básicas de células tronco mesenquimais, destacando-se por uma alta e rápida capacidade proliferativa. A indução de pluripotência foi realizada nas ADSC de coelhos pela introdução de quatro fatores de transcrição (OCT4, SOX2, cMYC, e KLF4), pelo vetor lentiviral STEMCCA (Milipore). Cinco protocolos de indução foram testados. Células resultantes da indução foram caracterizadas quanto à atividade da fosfatase alcalina e perfil fenotípico por citometria de fluxo. A proliferação acentuada das ADSC parece ser um fator limitante para a eficácia da reprogramação. A partir destes dados, espera-se contribuir para o desenvolvimento de uma tecnologia brasileira ainda inédita em coelhos e adicionar informações importantes à literatura, acerca das propriedades das células iPS, visando sua utilização como modelo experimental para futuras terapias. / Induced Pluripotent Stem (iPS) cells were first reported in 2006 by Takahashi e Yamanaka and has been intensively studied since then. Through the technique, adult somatic cells acquire behavior very similar to embryonic stem cells, reducing the ethical issues related to the use of such research. However, biological mechanisms of iPS cells are not yet fully elucidated. Thus, further research is needed to ensure the safety and efficacy for their possible use in future therapies. Rabbits, as experimental models, are advantageous by their ideal size for surgical procedures and easy and economic maintenance. Adipose Derived Stem Cells (ADSC) consists of multipotent mesenchymal stem cells that stand for ease, speed and safety of collection and processing. The ADSC were collected and characterized by analysis of cell growth curve, doubling time, viability after cryopreservation, ability of fibroblast colony formation, osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation, immunocytochemistry and flow cytometry. They showed to have the basic characteristics of mesenchymal stem cells, standing out by a high and fast proliferative capacity. Induction of pluripotency was performed in rabbits ADSC by the introduction of four transcription factors (OCT4, SOX2, cMYC, and KLF4) by lentiviral vector STEMCCA (Millipore). Five protocols were tested and analyzed. The resulting cells after induction were characterized by alkaline phosphatase activity and phenotypic profile by flow cytometry. The great proliferation of ADSC seems to be detrimental for the reprogramming efficiency. From these data, it is expected to contribute to the development of a Brazilian technology still unpublished in rabbits, and to add important information to the literature about the properties of iPS cells, aiming their use as an experimental model for future therapies.