Made available in DSpace on 2015-04-14T13:29:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 413419.pdf: 7548238 bytes, checksum: fb7df37e9d8df24acf3390709418323f (MD5) Previous issue date: 2009-03-31 / A engenharia tecidual tem se mostrado um campo promissor para a reabilita??o de pacientes com traumas ou deformidades faciais que necessitem de ?reas extensas de enxerto ?sseo. Seu princ?pio b?sico envolve a associa??o de um tipo apropriado de c?lula e de um arcabou?o biocompat?vel e bioabsorv?vel que mimetize funcional e estruturalmente determinado tipo de tecido. O Cimento de Fosfato de C?lcio (CFC) aparece como uma alternativa vi?vel de biomaterial a ser utilizado com esta finalidade em virtude de suas caracter?sticas como biocompatibilidade, bioatividade e osteocondutividade. Assim, o objetivo da presente pesquisa foi avaliar a capacidade de suportes tridimensionais macroporosos de CFC, confeccionados com mat?rias-primas brasileiras, de permitir a ades?o, prolifera??o e diferencia??o de c?lulas-tronco mesenquimais derivadas da medula ?ssea humana. Para isso, c?lulas obtidas da crista il?aca de um doador humano adulto foram rotineiramente processadas at? as condi??es experimentais e, a seguir, cultivadas sobre suportes de CFC, macroporosos, que tiveram como corpo gerador de poros, microesferas de parafina, com tamanho entre 100 e 250μm. Para indu??o das c?lulas em linhagem osteog?nica foi acrescentada Prote?na Morfog?nica ?ssea (BMP4) ao meio de cultura. Os per?odos de cultura estabelecidos foram de cinco, dez e 15 dias. Ap?s estes per?odos, o comportamento e a morfologia das c?lulas junto ao biomaterial foram avaliados por meio de Microscopia Eletr?nica de Varredura. Os n?veis de express?o dos genes BGLA e SSP1, que codificam as prote?nas osteocalcina (OC) e osteopontina (OP) respectivamente, bem como a atividade da Fosfatase Alcalina (ALP), outro marcador osteobl?stico importante, foram quantificados pela t?cnica de PCR em Tempo Real (QT-PCR) utilizando o fluor?foro SYBR Green?. O QT-PCR detectou a express?o dos genes BGLA e SSP1 e a atividade da fosfatase alcalina nos per?odos de 10 e 15 dias de cultura, o que nos permitiu constatar que houve prolifera??o celular e diferencia??o destas em c?lulas osteog?nicas. No per?odo de cinco dias, n?o foi observada a express?o de nenhum dos genes investigados. A partir destes resultados conclu?mos que o CFC, macroporoso, com tamanho de poros entre 100 e 250μm, criados por meio da utiliza??o de microesferas de parafina, permite a ades?o, prolifera??o e diferencia??o de c?lulas-tronco mesenquimais em c?lulas osteog?nicas, podendo ser utilizado como arcabou?o para engenharia de tecido ?sseo.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:29:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 417772.pdf: 8647052 bytes, checksum: ff0995a277ba9d1db6d58798d55822b1 (MD5) Previous issue date: 2009-08-13 / As c?lulas tronco mesenquimais origin?rias do estroma da medula ?ssea humana possuem grande capacidade de diferencia??o em diversos tecidos, inclusive osso. Culturas de c?lulas tronco mesenquimais in vitro podem sofrer osteoindu??o e produzir c?lulas dos diferentes est?gios da linhagem osteobl?stica. A busca de um arcabou?o adequado quanto a sua capacidade osteocondutora e osteoindutora vem sendo um dos grandes desafios da engenharia tecidual ?ssea. Neste estudo verificou-se o papel de um arcabou?o al?geno fresco congelado e do meio de cultura (DAG) sobre a osteog?nese de c?lulas tronco adultas. Os aspectos morfol?gicos das c?lulas osteog?nicas e do arcabou?o, al?m da express?o das prote?nas osteopontina, osteocalcina e fosfatase alcalina ?sseas foram analisadas em sete, quatorze e vinte e um dias de cultura, sem e com meio osteog?nico (DAG). Os resultados obtidos do s?timo dia at? o vig?simo primeiro dia da pesquisa demonstraram a presen?a de aumento na ades?o, migra??o, crescimento e diferencia??o celular ?ssea. O meio DAG foi um acelerador da osteog?nese, verificado principalmente, nas primeiras duas semanas. O arcabou?o de osso al?geno, in vitro, apresentou a capacidade de suportar a ostegen?se at? a mineraliza??o em todas as culturas. Assim, concluiu-se que as c?lulas derivadas da medula ?ssea humana podem: aderir, migrar, crescer, proliferar e se diferenciar sobre um arcabou?o de osso al?geno fresco congelado. O meio osteog?nico acelera a ades?o, migra??o, crescimento, prolifera??o e diferencia??o das c?lulas tronco adultas em osteoblastos principalmente nos primeiros quatorze dias de cultura. Os osteoblastos foram obtidos a partir de c?lulas de medula ?ssea humana sobre um arcabou?o de osso al?geno fresco congelado, mesmo sem adi??o de fatores osteoindutores. Finalmente, o arcabou?o de osso al?geno fresco congelado ? osteocondutor e osteoindutor quando associado com c?lulas tronco adultas.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:35:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 425136.pdf: 6824100 bytes, checksum: a0f00fc5697ef7ef0055b9577b7dbbbe (MD5) Previous issue date: 2010-06-29 / O diabetes mellitus tipo 1 (DM1) ? uma s?ndrome auto-imune ?rg?o-espec?fica caracterizada pela destrui??o seletiva de c?lulas β produtoras de insulina nas ilhotas pancre?ticas. A busca por alternativas terap?uticas para o DM1, voltadas ? preserva??o e/ou regenera??o da massa de c?lulas β e, consequentemente, ? reconstitui??o do padr?o fisiol?gico de secre??o de insulina, tem sido exaustivamente realizada. Dentre as estrat?gias de tratamento estudadas, destaca-se a terapia celular baseada na utiliza??o de c?lulas-tronco mesenquimais. Na busca por um produto que mimetize qualitativamente e quantitativamente as caracter?sticas das c?lulas β pancre?ticas, protocolos devem ser aperfei?oados e a capacidade de (trans)diferencia??o de novas fontes celulares tecido-espec?ficas devem ser exploradas. Assim, o objetivo deste trabalho foi comparar a capacidade de expans?o e diferencia??o in vitro de c?lulas-tronco mesenquimais murinas, isoladas do rim, p?ncreas e medula ?ssea, avaliando sua capacidade de diferencia??o em c?lulas produtoras de insulina. Evidenciou-se que estas popula??es celulares s?o capazes de se (trans) diferenciar em c?lulas com fen?tipo pancre?tico end?crino, quando cultivadas em meio rico em indutores, incluindo morfologia esf?rica, forma??o de clusters, secre??o de insulina (com a conseq?ente colora??o positiva para ditizona) e express?o in vitro do gene e da prote?na da insulina-1. Al?m disso, c?lulas produtoras de insulina (CPIs) derivadas de c?lulas-tronco mesenquimais pancre?ticas reverteram o estado hiperglic?mico quando transplantadas em c?psula renal de camundongos diab?ticos, indicando que s?o capazes de diferenciarem-se in vitro em CPIs funcionais e de manterem esta funcionalidade in vivo.

As células tronco mesenquimais de tecido adiposo (MSCs-TA) são células progenitoras que residem entre adipócitos e contribuem para o turnover do tecido adiposo. Gangliosídios são glicoensfigolipídios localizados na membrana das células, envolvidos na regulação do crescimento celular, interação de superfície, sinalização transmembrana e diferenciação celular. O gangliosídio neural GD2 foi relatado como um marcador de superfície de células tronco mesenquimais de medula óssea e cordão umbilical, mas existem poucos dados sobre a expressão do GD2 em MSCs-TA indiferenciadas e nas diferenciadas para adipócito ou osteoblasto. Nosso principal objetivo foi estudar a expressão de gangliosídios nas MSCs-TA, em especial o GD2, durante a diferenciação adipogênica e osteogênica. Para isso, as MSCs-TA foram isoladas de lipoaspirado humano, cultivadas e induzidas para diferenciação adipogênica e osteogênica. As análises foram feitas por HPTLC, microscopia confocal, citometria de fluxo e PCR em tempo real. Por HPTLC, as MSCs-TA indiferenciadas e MSCs-TA diferenciadas para adipócitos e osteoblasto mostraram aumento do perfil de gangliosídios complexos. A microscopia confocal evidenciou os gangliosídios GM3, GM1 e GD2 na superfície das células e, por citometria de fluxo, identificamos uma subpopulação de células GD2 positivas nas MSCs-TA e MSCs-TA diferenciadas para adipócito ou osteoblasto. Entretanto, o percentual de células GD2 positivas decresceu com a diferenciação. A expressão do mRNA da GD2 sintase aumentou na diferenciação adipogênica e diminui na diferenciação osteogênica. O GD2 é um substrato para a biosíntese de gangliosídios complexos e o aumento da expressão da GD2 sintase pode estar relacionado com o aumento de gangliosídios complexos que ocorre durante a diferenciação adipogênica. / Mesenchymal Stem Cells from Adipose Tissue (MSCs-TA) are progenitor cells that reside between adipocytes, and contribute to the turnover of adipose tissue. Gangliosides are glycosphingolipids localized in cell membrane, involved in cell growth regulation, surface interaction, transmembrane signaling and differentiation. The neural ganglioside GD2 has been reported as surface marker for MSCs from bone marrow and umbilical cord, but sparse data exist about the expression of GD2 in MSCs-TA and during the differentiation to adipocytes and osteoblast. Our aim was to study the expression of glangliosides, in special of GD2 in MSCs-TA and during the adipogenic and osteogenic differentiation. Thus MSCs-TA were isolated from lipoaspirate, cultured and induced to adipogenic and osteogenic differentiation. Then, we examined the gangliosides expression by HPTLC, confocal microscopy, flow citometry and real-time PCR. By HPTLC, the MSCs-TA and MSCs-TA differentiated into adipocytes and osteoblast demonstrate an increased complex gangliosides profile. The confocal microscopy showed the presence of GM3, GM1, and GD2 on the cell surface. By the flow cytometry, we identified a GD2 positive subpopulation in MSCs-TA and in MSCs-TA differentiated to adipocytes and osteoblast. However, the percentage of GD2 positive cells decreased with the differentiation. The expression of GD2 synthase mRNA increased during the adipogenic differentiation and decreased in osteogenic differentiation. GD2 is a substrate for the complex gangliosides biosynthesis, and the increase in GD2 synthase expression could be related with the increase in complex gangliosides that occurs during the adipogenic differentiation.

As células mesenquimais estromais multipotentes (CMM) são na atualidade uma fonte atrativa para aplicações na engenharia de tecidos e na terapia celular. Devido à baixa disponibilidade nos tecidos (0,01%-0,0005%) e às elevadas doses necessárias para uma infusão (aproximadamente 106 células/Kg paciente) tornou-se necessário o desenvolvimento de tecnologias de expansão in vitro, eficientes e de custo reduzido, que permitam a obtenção de CMM com manutenção das características funcionais (diferenciação e inibição da proliferação de linfócitos), imunofenotípicas e citogenéticas. As CMM são células aderentes, ou seja, necessitam de um substrato sólido para se aderir e proliferar. O procedimento convencional de expansão em garrafas estáticas, geralmente envolve um processo laborioso em que não há correto controle e monitoramento dos parâmetros de cultivo e possui uma maior susceptibilidade à contaminação devido à excessiva manipulação para atingir o número ideal de células. Além disso, este tipo de cultivo não permite uma produção em larga escala. Em função disso, o presente trabalho foi proposto com o objetivo de desenvolver um bioprocesso escalonável, economicamente viável e eficiente para expansão de CMM derivadas da medula óssea em microcarregadores. Para isso, as células foram cultivadas em microcarregador Cyotdex 3, em frasco spinner com o meio -MEM suplementado com 15% de SFB. Foram avaliadas neste trabalho, a adesão celular aos microcarregadores, crescimento, metabolismo, recuperação celular final e avaliação das propriedades funcionais e imunofenotípicas pré e pós cultivo, comparando ao cultivo já estabelecido em garrafas estáticas. De maneira geral, os resultados obtidos mostraram que foi possível expandir CMM utilizando a tecnologia de microcarregadores. A análise do metabolismo celular mostrou que não houve exaustão de nutrientes importantes como glicose e glutamina durante o cultivo, tampouco formação dos subprodutos lactato e amônia em concentrações inibitórias. As células recuperadas após a expansão mantiveram as características imunofenotípicas e funcionais. A produção média (n=10) foi de aproximadamente 4,9x105 cel/mL. Como o sistema utilizado permite o escalonamento, se utilizássemos um biorreator de 1L, seria possível a produção de aproximadamente 5x108 células que seriam suficientes para tratar mais de 3 pacientes de até 70Kg na dose de 2x106 células/Kg. Para expansão da mesma quantidade de células na forma tradicional seriam necessárias 135 garrafas de 175 cm2 com um custo total de expansão duas vezes superior à estimativa do custo de expansão utilizando microcarregadores. / Multipotent mesenchymal stromal cells are currently an attractive source for applications in tissue engineering and cell therapy. Due to the low availability in tissues (0,01%-0,0005%) and the high doses necessary for an infusion (about 106 cells/Kg patient), it has become necessary the development of effective and low cost technologies for in vitro expansion that enable to obtain MSC with maintenance of functional (differentiation and inhibition of lymphocytes proliferation), immunophenotypic and cytogenetics characteristics. MSC are adherent cells, i.e., they need a solid substrate to adhere and proliferate. The conventional procedure for expansion in static flasks normally involves a laborious process in which there is no suitable control and monitoring of the cultivation parameters besides presenting a higher susceptibility to contamination due to excessive manipulation to reach the ideal amount of cells. Moreover, this kind of cultivation does not allow a large scale production. For this reason, this work was proposed with the objective to develop a low cost, effective and scalable bioprocess for expansion of bone marrow-derived MSC in microcarriers. Cells grew on microcarriers Cyotdex 3, in spinner flasks with the -MEM medium supplemented with 15% FBS. We evaluated the cell adhesion to microcarriers, growth, metabolism, final cell recovery, and the functional and immunophenotypic properties before and after cultivation, comparing them with the cultivation already established in static flasks. In general, the results obtained showed that it was possible to expand MSC using microcarriers technology. The analysis of the cell metabolism showed that there was no depletion of important nutrients such as glucose and glutamine during cultivation, neither formation of lactate and ammonia subproducts in inhibitory concentrations. The cells recovered after the expansion kept the immunophenotypic and functional characteristics. The mean production (n=10) was about 4,9x105 cel/mL. As the system used allows the scale-up, if we had used a bioreactor of 1L it would had been possible to produce approximately 5x108 cells that would be enough to treat more than three patients of up to 70kg with a dose of 2x106 cells/kg. For the expansion of the same amount of cells in the traditional way, it would be necessary 135 T-flasks of 175 cm2 with total cost twice higher than the estimate cost of expansion using microcarriers.

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A esclerose múltipla é uma doença inflamatória crônica desencadeada por células T autorreativas contra antígenos proteicos da mielina. A encefalomielite experimental autoimune é o modelo murino mais utilizado para o estudo da EM. As tubas uterinas e o útero de camundongos fêmeas são órgãos ricos em células mesenquimais que são pouco utilizadas em estudos. Dessa forma, no presente projeto, caracterizamos a obtenção dessa população e avaliamos sua capacidade imunossupressora utilizando o modelo de EAE. Observamos que o tratamento é capaz de modular o perfil de linfócitos T CD4+ durante sua ativação nos linfonodos, induzindo o direcionamento para a subpopulação Tr1 e atenuando as Th1 e Th17. Assim, houve uma diminuição do número de células infiltrantes no SNC associado a uma menor ativação de células da microglia. Em conjunto, demostraramos que as meMSC utilizadas como tratamento são capazes de atrasar o desenvolvimento da EAE e, portanto, evidenciando o caráter imunomodulador das MSCs derivadas do endométrio, chamando a atenção para seu potencial terapêutico. / Multiple sclerosis is a chronic inflammatory disease triggered by autoreactive T cells against myelin protein. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis is the most commonly used murine model for the study of MS. The uterine tubes and uterus of female mice are organs rich in mesenchymal cells which are rarely used. Thus, in the present work, we characterized the extraction of this population and evaluated its immunosuppressive capacity using the EAE model. We observed that the meMSC treatment is capable of modulating the CD4 T lymphocyte profile during its activation in the lymph nodes, inducing the expansion of the Tr1 subpopulation and attenuating Th1 and Th17. Consequently, there was a decrease in the number of infiltrating cells in the CNS associated with a reduction of microglial activation. Taken together, our results demonstrated that the meMSCs used as treatment are capable of delaying the development of EAE, therefore, evidencing its immunomodulatory features drawing attention to its therapeutic potential.

As distrofias musculares progressivas (DMP) são um grupo de doenças genéticas hereditárias caracterizadas pela degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é a forma mais comum e mais grave de DMP, com prevalência de 1 a cada 3500 a 5000 meninos. Em geral, a perda da ambulação ocorre entre 9 a 12 anos e complicações respiratórias e cardíacas podem levar ao óbito a partir da segunda década. A pesquisa em terapia celular iniciou-se com o objetivo de reverter ou diminuir a progressão do processo distrófico através do repovoamento do músculo com células normais. Atualmente, acredita-se em um benefício terapêutico com base nas propriedades anti-inflamatórias, anti-fibróticas e imunomodulatórias das células tronco adultas (CTA). As CTAs mesenquimais são bastante heterogêneas quanto à sua composição celular o que ocasiona inconsistência de resultados. Por isso, a caracterização e separação de sub-populações através de marcadores específicos e o enriquecimento de culturas de CTA com um subtipo celular de interesse pode aumentar a robustez e o efeito das terapias. Uma dessas subpopulações é o pericito que, ao contrário das CTAs mesenquimais, foi bem descrito quanto à sua localização e função in vivo. Além disso, pericitos derivados de tecido adiposo humano aumentaram a sobrevida de camundongos duplo mutantes para distrofina e utrofina (dko). Dessa forma, este trabalho pretendeu comparar o potencial terapêutico de CTAs mesenquimais e pericitos de um mesmo tecido adiposo em camundongos dko. Conseguimos confirmar o resultado anterior, mostrando que os pericitos tendem a melhorar a sobrevida de animais tratados, sendo ainda melhores do que células mesenquimais, mas a melhora perdura somente durante o tratamento. A sobrevida é maior no começo do tratamento, sugerindo que o quanto antes o tratamento for iniciado, com animais mais jovens e sintomas mais leves, melhor poderá ser o resultado. Outras perguntas a serem pesquisadas na tentativa de melhorar o efeito terapêutico da terapia celular com pericitos são: número de injeções, quantidade de células a serem injetadas, tempo de tratamento e idade das células \"doadoras\" / Progressive muscular dystrophies (PMD) are inherited genetic diseases characterized by progressive muscle loss and weakness. Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the most common and aggressive form of PMD, with incidence of 1 in every 3500-5000 boys. In general, patients with DMD are confined to wheelchairs around 9-12 years of age and death occurs due to respiratory and heart dysfunction after the second decade. Cell therapy research at first aimed to recover or slow down the dystrophic process by repopulating the patient\'s muscle with normal cells. However, nowadays it is believed also that therapeutic benefits occur by the anti-inflammatory, anti-fibrotic and immunomodulation properties of mesenchymal stem cells (MSC). MSC are constituted by an heterogeneous cell population and therefore, cell sorting of the subpopulation cell of interest is being done routinely. By doing this enrichment, the effect can be more robust and powerful. One of the cell populations of interest for research is pericyte, which are cells well defined regarding their in vivo function and location, as opposed to MSC. Besides that, pericytes derived from adipose tissue were successful in increasing survival of double knockout mice for dystrophin and utrophin (dko). The present work aimed to compare the therapeutic potential of MSC and pericytes derived from the same adipose tissue sample in the dko mouse model. We confirmed our previous results, showing that pericytes tend to improve the survival of treated mice, and are even better than MSC from the same source but the trend was statistically significant only during the treatment period. Additionally, we also observed that the survival was better in the beginning of treatment, suggesting that earlier treatment may lead to a better therapeutic effect. In an attempt to increase the therapeutic effect of these procedure other questions to be asked are: the number of injections and number of cells per injection, the duration of the treatment and the \"age\" of the donor cells

Tese de Doutoramento. Engenharia Biomédica. Área de Especialização de Biomateriais. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2012

Orientador: Ana Liz Garcia Alves / Resumo: As terapias regenerativas com a utilização de células tronco mesenquimais (CTMs) têm sido amplamente empregadas com a finalidade de modificar a progressão de enfermidades locomotoras em animais de grande porte. Estudos sobre o comportamento das células tronco, portanto, mostram-se de extrema importância para que, cada vez mais, elucidar sua ação, efeito e eficácia nos tratamentos propostos. A inserção das CTMs derivadas do tecido adiposo de muares em microcápsulas de hidrogel gera expectativas promissoras para a proteção da célula contra anticorpos do receptor, bem como processos inflamatórios exacerbados, distribuição de agentes terapêuticos e supressão de processos inflamatórios. O presente trabalho teve por objetivo verificar o comportamento das CTMs após o encapsulamento em hidrogel, quanto a sua viabilidade, migração, além da avaliação morfológica e imuno-histoquímica. Avaliação da morfologia da cápsula, dos poros, a rugosidade por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e observação das células encapsuladas pela microscopia confocal de varredura a laser. A porcentagem de células viáveis manteve-se ao longo dos momentos em uma média de 93%, então o biomaterial permitiu a difusão de nutrientes e oxigênio adequadamente. A diminuição da quantidade de células no interior das cápsulas é justificada pela possível migração das mesmas através dos microporos das microcápsulas permitindo a aderência à placa de cultivo. Na avaliação morfológica foi possível identificar as células... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Regenerative therapies using mesenchymal stem cells (MSCs) have been widely widespread to treat locomotor diseases in large animals. Studies on the behavior of stem cells are extremely important to increase our knowledge regarding their action, effect and effectiveness in the proposed treatments. The insertion of muar adipose-derived MSCs into hydrogel microcapsules yields promising expectations for cell protection against immune response, as well as exacerbated inflammatory processes, delivery of therapeutic agents, and suppression of inflammatory processes. The present research aimed to verify the behavior of MSCs after hydrogel encapsulation, including cell viability, migration, morphological and immunohistochemical pattern. Evaluation of capsule morphology, pore size, roughness by scanning electron microscopy (SEM) and observation of encapsulated cells by confocal laser scanning microscopy. The percentage of viable cells remained throughout the moments at an average of 93%, so the biomaterial allowed the diffusion of nutrients and oxygen properly. A decreased amount of cells number inside the capsules is justified by the possible migration of them through the microcapsule micropores allowing adherence to the culture plate. The cells showed positive CD44 staining, absence in MHC II. The capsules were evaluated with SEM for their morphology, the area of circular and irregular pores and the size of the cells. It was possible to confirm the presence of stem cells in the micro... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor