Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-03-13T12:28:29Z No. of bitstreams: 1 Jamilly Lopes de Macedo.pdf: 2811894 bytes, checksum: 04624f3f27eca1f1b30e84a908c08df6 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-13T12:28:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jamilly Lopes de Macedo.pdf: 2811894 bytes, checksum: 04624f3f27eca1f1b30e84a908c08df6 (MD5) Previous issue date: 2017-09-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Synthetic mesoionic compounds, belonging to the 1,3-thiazolium-5-thiolate group, have an excellent ability to cross cell membranes and interact with several biological molecules with distinct affinities. The present work aimed to evaluate the antineoplastic potential of new mesoionic compounds of the 1,3-thiazolium-5-thiolate group, with or zinc enrichment, and their possible mechanisms of action. For this, the compounds were initially subjected to chemical characterization by obtaining the calibration curve, ultraviolet and visible spectrophotometry (UV-vis), optical emission spectrometry (ICP-OS), photoluminescence spectroscopy, nuclear magnetic resonance, infrared spectroscopy (FT-IR), X-ray and thermogravimetric analysis (TGA). In vitro experimental studies using cervical carcinoma (HEp-2) cell lines, human rectal colon carcinoma (HT-29), human acute promyelocytic leukemia (HL-60), human mammary adenocarcinoma (MCF7), carcinoma human breast cancer (T-47D), rat breast cancer (4T1) and a lineage of healthy transformed cells of murine peritoneal macrophages (RAW 264.7). For the staining with propidium iodide, in flow cytometry, the cell viability in the HL-60 strain was evaluated. For the mitochondrial depolarization test, rhodamine 123 was used and for the evaluation of the cell death pattern, Annexin V was used. Cell cycle analysis and DNA fragmentation were performed with the Guava® cell cycle kit. Subsequently, RNA extraction with Trizol was obtained, cDNA was obtained with ImProm-II ™ Reverse Transcription System (PROMEGA) and expression analysis of BAX, BCL2, CASPASE 3, CASPASE 9 and GAPDH genes as reference control. The results showed that, considering the time of exposure of the cells to the compounds, the lowest IC50 concentration and the best selectivity index (IS), the mesoionic compounds MIH 2.4Bl [3.5 μg / mL (3.0-4.0)] and MIH 2.4Zn [5.0 μg / mL (4.5-5.5)] showed better activity in the HL-60 cell line, in 48 h time, promoting inhibition of the growth of cancer cells with lower toxicity in healthy cells (RAW 264.7). The compounds promoted mitochondrial depolarization in the tested lineage (HL-60), cell death by apoptosis and cell cycle arrest in G2 phase. However, the tested concentrations of the compounds did not promote DNA fragmentation. Regarding the analysis of gene expression, it was observed that the BAX gene presented significant difference only when compared to the expression in the sample BLC1 (MIH 2.4Bl; 3.5 μg / mL) vs. BLC2 (MIH 2.4Bl; 7.0 μg / mL) (p <0.05) and when comparing the expression of the gene in the sample BLC1 vs. ZNC1 (MIH 2.4Zn; 5.0 μg / mL) (p <0.05). For the BCL2 gene, there was a significant difference when compared to the BLC2 sample. ZNC2 (MIH 2.4Zn; 10.0 μg / mL) (p <0.01) and the ZNC1 sample. ZnC2 (p <0.05). Regarding the expression of CASPASE 3, a significant difference was observed when comparing BLC2 vs. BLC1 (p <0.05). And for CASPASE 9 there was a significant difference when compared to the following samples: BLC1 vs. BLC2 (p <0.001); BLC1 vs. ZNC1, BLC1 vs. ZNC2, BLC1 vs. doxorubicin and BLC1 vs. negative control (p <0.01). The synthetic mesoionic compounds analyzed have a potential antitumor effect as candidates for antineoplastic treatment, allowing the continuity of in vitro and in vivo studies for future preclinical analysis. / Os compostos mesoiônicos sintéticos, que pertencem ao grupo 1,3-tiazólio-5-tiolato, possuem capacidade de atravessar membranas celulares e interagir com diversas moléculas biológicas com afinidades distintas. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o potencial antineoplásico de novos compostos mesoiônicos do grupo 1,3-tiazólio-5-tiolato, com ou sem enriquecimento por zinco, e seus possíveis mecanismos de ação. Para tal, os compostos foram inicialmente submetidos à caracterização química através da obtenção da curva de calibração, espectrofotometria de ultravioleta e visível (UV-vis), espectrometria de emissão óptica (ICP-OS), espectroscopia de fotoluminescência, ressonância magnética nuclear (RMN), espectroscopia de infravermelho (FT-IR), raios X e análise termogravimétrica (TGA). Foram desenvolvidos estudos experimentais in vitro, utilizando linhagens celulares de carcinoma de colo de útero (HEp-2), carcinoma de cólon retal humano (HT-29), leucemia promielocítica aguda humana (HL-60), adenocarcinoma mamário humano (MCF7), carcinoma ductal de mama humano (T-47D), câncer de mama de rato (4T1) e uma linhagem de células transformadas de macrófagos murinos peritoneais (RAW 264.7). Pelo ensaio de coloração com o iodeto de propídeo, em citometria de fluxo, avaliou-se a viabilidade celular na linhagem HL-60. Para o teste de despolarização mitocondrial foi utilizada a rodamina 123 e para a avaliação do padrão de morte celular foi utilizada a Anexina V. A análise do ciclo celular e fragmentação do DNA foi realizada com o kit cell cycle Guava®. Posteriormente, foi realizada extração do RNA com Trizol, obtenção do cDNA com o kit ImProm-II™ Reverse Transcription System (PROMEGA) e análise da expressão dos genes BAX, BCL2, CASPASE 3, CASPASE 9 e GAPDH como controle de referência. Os resultados demonstraram que, considerando o tempo de exposição das células aos compostos, a menor concentração obtida da CI50 e o melhor índice de seletividade (IS), os compostos mesoiônicos MIH 2.4Bl [3,5 μg/mL (3,0 – 4,0)] e MIH 2.4Zn [5,0 μg/mL (4,5 – 5,5)] apresentaram melhor atividade na linhagem celular HL-60, no tempo de 48h, promovendo inibição do crescimento de células cancerígenas com menor toxicidade em células saudáveis (RAW 264.7). Os compostos promoveram a despolarização mitocondrial na linhagem testada (HL-60), a morte celular por apoptose e parada do ciclo celular na fase G2. Contudo, as concentrações testadas dos compostos não promoveram fragmentação do DNA. Com relação à análise da expressão dos genes, observou-se que o gene BAX apresentou diferença significativa somente quando comparados a expressão na amostra BLC1 (MIH 2.4Bl; 3,5 μg/mL) vs. BLC2 (MIH 2.4Bl; 7,0 μg/mL) (p<0,05) e quando comparados a expressão do gene na amostra BLC1 vs. ZNC1 (MIH 2.4Zn; 5,0 μg/mL) (p<0,05). Para o gene BCL2, houve diferença significativa quando comparados a amostra BLC2 vs. ZNC2 (MIH 2.4Zn; 10,0 μg/mL) (p<0,01) e a amostra ZNC1 vs. ZNC2 (p<0,05). Em relação à expressão da CASPASE 3, observou-se diferença significativa ao comparar as amostras BLC2 vs. BLC1 (p<0,05). E para a CASPASE 9 houve diferença significativa quando comparadas as seguintes amostras: BLC1 vs. BLC2 (p<0,001); BLC1 vs. ZNC1, BLC1 vs. ZNC2, BLC1 vs. doxorrubicina e BLC1 vs. controle negativo (p<0,01). Os compostos mesoiônicos sintéticos analisados apresentam potencial efeito antitumoral como candidatos ao tratamento antineoplásico, permitindo a continuidade dos estudos in vitro e in vivo para futura análise pré-clínica.

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:21:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ArquivoTotalLucinez.pdf: 2070839 bytes, checksum: 3d56c7860a648e855f328fcab8ae6afb (MD5) Previous issue date: 2013-05-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The mesoionic compounds can not be represented by a purely ionic or covalent structure. Are neutral compounds that have well-separated regions of positive and negative charges, leading to a high dipole moment. They show wide range of applications, through biology and medicinal chemistry, as well in the obtaining products of technological interest. In this study, the stability and diradicalar character of four mesoionic rings were investigated: 1,3-oxazol-5- one, 1,3-oxazol-5-thione, 1,3-thiazol-5-one and 1,3-thiazol-5-thione. Many criteria to quantify the diradicalar character were used: (I) HOMO-LUMO energy difference (EHL, inversely proportional to the diradicalar character; EHL = 0 corresponding to a pure diradical), (ii) determination of the energy difference due to the broken symmetry in the unrestricted formalism (ESS), (iii) determination of the energy difference between the singlet and triplet wave functions (EST); and (iv) diradicalar character (Y0, calculated from the occupation numbers n of HOMO and LUMO natural orbitals, in the unrestricted formalism). Various methods of electronic structure (DFT/B3LYP, MP2, CCSD and QCISD) with different basis sets (6-311+ G* and aug-cc-pVDZ) were employed. It was observed that: (i) a suitable choice of the substituent at R position (the outer ring) is important for the structural stability; (ii) substitution of oxygen by sulfur in the R and R positions (into the ring) do a little contribution for the diradicalar character (Y0 < 1% in all cases, indicating pronounced mesoionic character in the investigated structures); and (iii) the use of an electron donating group at R position and an electron withdrawing group at R position contribute to maximize the mesoionic character. Thus, it was possible to describe the dependencies of the molecular structure on the electronic properties, and the effect of substitutions, which is of great importance for the control of mesoionic character. / Os compostos mesoiônicos não podem ser representados por uma estrutura totalmente covalente ou puramente iônica. São compostos neutros que possuem regiões bem separadas de cargas positiva e negativa, conferindo-lhes elevado momento de dipolo. Apresentam faixa ampla de aplicações, passando pela biologia e a química medicinal, bem como na obtenção de produtos de interesse tecnológico. Neste trabalho, investigou-se o caráter dirradicalar de quatro anéis mesoiônicos: 1,3-oxazol-5-ona, 1,3- oxazol-5-tiona, 1,3-tiazol-5-ona e 1,3-tiazol-5-tiona, procurando a melhor representação eletrônica, e como a reatividade influencia no tipo de reação em que participam. Foram utilizados diferentes critérios para a quantificação do caráter dirradicalar: (i) diferença de energia HOMO-LUMO (EHL, inversamente proporcional ao caráter dirradicalar; EHL = 0 correspondendo a um dirradical puro); (ii) determinação da diferença de energia devida à quebra de simetria no formalismo irrestrito (ESS); (iii) determinação da diferença de energia entre as funções de onda singleto e tripleto (EST); e (iv) caráter dirradicalar (Y0, calculado a partir dos números de ocupação n dos orbitais naturais HOMO e LUMO, determinados no formalismo irrestrito). Foram empregados diversos métodos de estrutura eletrônica (DFT/B3LYP, MP2, CCSD e QCISD) com diferentes conjuntos de bases (6-311+G* e aug-cc-pVDZ). Observou-se que: (i) a escolha adequada do substituinte na posição R (externa ao anel) é importante para a estabilidade estrutural; (ii) a substituição do oxigênio por enxofre nas posições R e R (no anel) pouco contribui para o caráter dirradicalar (Y0 < 1% em todos os casos, indicando caráter mesoiônico pronunciado nas estruturas investigadas); e (iii) a utilização de um grupo doador de elétrons na posição R e retirador na R contribui para maximizar o caráter mesoiônico. Dessa forma, foi possível descrever as dependências da estrutura molecular sobre as propriedades eletrônicas, e o efeito das substituições, que é relevante para o controle do caráter mesoiônico.

Submitted by Maria Medeiros (maria.dilva1@ufcg.edu.br) on 2018-09-27T14:29:18Z No. of bitstreams: 1 RAILDA SHELSEA TAVEIRA ROCHA DO NASCIMENTO - TESE (PPGEP) 2008.pdf: 2253809 bytes, checksum: ec04359cafb5760ae50bf56746b420d4 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-27T14:29:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RAILDA SHELSEA TAVEIRA ROCHA DO NASCIMENTO - TESE (PPGEP) 2008.pdf: 2253809 bytes, checksum: ec04359cafb5760ae50bf56746b420d4 (MD5) Previous issue date: 2008-11-17 / Sólidos obtidos em escala nanométrica têm demandado um grande interesse científico e tecnológico, dadas às significativas alterações nas propriedades físicas e químicas observadas em materiais com estas características, potencializando assim as aplicações tecnológicas. Neste trabalho foram sintetizados quatro nanocomplexos do tipo Ln(MI)3.3H2O onde, Ln = Er ou Eu e MI = 5(4-clorofenil)-3-fenil-1,3,4-tiodiazólio-2-tiolato (MI-1) ou 5(4-clorofenil)-3-metil-4-fenil-1,3-tioazólio-2-tiolato (MI-2). Estes complexos foram caracterizados através de técnicas físico-químicas, espectroscópicas, térmicas e estrutural. A metodologia utilizada para a síntese dos complexos partiu de uma solução etanólica de LnCl3 adicionando-se o mesoiônico, sob agitação e temperatura constante de 65oC, mantendo em refluxo por quatro horas. O resultado da análise elementar de C, H e N dos complexos Er(MI-1)3.3H2O, Eu(MI-1)3.3H2O, Er(MI-2)3.3H2O e Eu(MI-2)3.3H2O mostraram uma boa concordância entre os valores experimentais e os calculados. Os espectros de infravermelho indicam que a coordenação dos compostos mesoiônicos com os cátions Eu+3 e Er+3 acontece possivelmente através do átomo de enxofre exocíclico onde, pode-se perceber um deslocamento considerável na ligação carbono-enxofre (C-S-). Os espectros de RMN 1H dos complexos revelaram a presença de todos os sinais dos hidrogênios aromáticos, evidenciados nos compostos mesoiônicos. Através dos espectros de RMN 13C (APT), foi possível reconhecer o padrão de hidrogenação correspondente a cada átomo de carbono, possibilitando atribuir com segurança o deslocamento químico dos carbonos (C-2) e (C-5) do anel mesoiônico. Nos espectros de absorção na região do UV-visível as bandas dos complexos se deslocam quando comparadas às bandas dos compostos mesoiônicos, sendo possível atribuir a inserção dos cátions de lantanídeos à modificação das bandas de absorção, visto que os complexos apresentaram energias em comprimento inferior. Os espectros de emissão dos compostos MI-1 e MI-2 assim como os dos complexos Eu(MI-1)3.3H2O e Er(MI-2)3.3H2O apresentaram comportamento semelhante com uma banda larga de emissão entre 560 e 720 nm, não sendo possível a observação das bandas de emissão dos íons lantanídeo. As curvas TG/DTG indicaram que os compostos mesoiônicos se decompuseram em cinco etapas, diferentemente da decomposição dos complexos Er(MI-1)3.3H2O, Eu(MI-1)3.3H2O, Er(MI-2)3.3H2O e Eu(MI-2)3.3H2O que ocorreu em 5, 4, 7 e 6 etapas, respectivamente. Os complexos sintetizados com Eu apresentaram maior estabilidade térmica em detrimento dos complexos de Er, independente do mesoiônico utilizado. As curvas DSC, mostraram que os complexos estudados neste trabalho iniciam a reação de decomposição térmica ainda em estado sólido, antes da fusão. Os difratogramas de raios-x dos compostos mesoiônicos e dos complexos, apresentaram mais de uma fase, com características cristalinas, e cristalito inferior a 60nm. / The solids obtained in nanometric scale has been attracted the technological and scientific interest due to the significant modifications observed on their physical and chemical properties which increases the technological applications. In this work, four nanocomplex materials were synthesized: Ln(MI)3.3H2O where, Ln = Er or Eu and MI = 5(4-chlorophenyl)-3-phenyl-1,3,4-thiodiazole-2-tiolat (MI-1) or 5(4-chlorophenyl)-3-methyl-4-phenyl-1,3-thioazole-2-thiolate (MI-2). These complexes were characterized using physico-chemical, spectroscopic, thermal and structural techniques. To synthesize the complexes, it was used a LnCl3 ethanolic solution mixed with the mesoionic, maintained under agitation and at a constant temperature at 65oC and refluxed for a period of four hours. It was observed a good agreement between the experimental and calculated results of the C, H and N elemental analysis of Er(MI-1)3.3H2O, Eu(MI-1)3.3H2O, Er(MI-2)3.3H2O and Eu(MI-2)3.3H2O. The IR spectra indicates that the coordination of the mesoionic compounds with cations Eu+3 and Er+3, must happen probably because of the exocyclic sulfur atom and it can be perceived a considerable displacement in the carbon-sulfur (C-S-) ligation. The RMN 1H spectra suggested the presence of aromatic hydrogen evidenced in the mesoionic compounds. Through the RMN 13C (APT), it was possible to recognize the hydrogenation standard corresponding to each carbon atom. It can be safely attributed the carbon chemical displacement (C-2) and (C-5) of the mesoionic ring. In the UV-visible absorption spectra of the UV the complexes bands are displaced comparing to the mesoionic compound bands. It can be possible to attribute the insertion of the lanthanide cations to the modification of the absorption bands, once the complexes presented energies at inferior length. The MI-1 and MI-2 compounds emission spectra and the complexes Eu(MI-1)3.3H2O and Er(MI-2)3.3H2O presented a behavior similar to a large emission band between 560 and 720 nm. It was not possible to observe the emission bands of the lanthanide ions. The TG/DTG curves indicate that the mesoionic compounds were decomposed in five levels, with a different behavior of the Er(MI-1)3.3H2O, Eu(MI-1)3.3H2O, Er(MI-2)3.3H2O and Eu(MI-2)3.3H2O, which decomposition occurred in 5,4,7 and 6 steps, respectively. The complexes synthesized with Eu presented a higher thermal stability than the ones that used Er, independently of the kind of mesoionic compound that was used. The DSC curves showed that the studied complexes begin the thermal decomposition reaction before the fusion, in the solid state. The x-ray diffractograms of the complexes and mesoionic compounds present more than a level, with crystalline characteristics and crystallite size inferior to 60nm.

Submitted by Emanuel Varela Cardoso (emanuel.varela@ufcg.edu.br) on 2018-05-24T18:03:23Z No. of bitstreams: 2 GABRIELA BRASILEIRO CAMPOS MOTA – TESE (PPGEP) 2014.pdf: 2208551 bytes, checksum: aefc619e6f9a0e4440ee264fa9431b59 (MD5) Ficha Catalográfica - GABRIELA BRASILEIRO CAMPOS MOTA – TESE (PPGEP) 2014.pdf: 54437 bytes, checksum: c9ec775e575ff1f890b9adb61626fef7 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-24T18:03:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 GABRIELA BRASILEIRO CAMPOS MOTA – TESE (PPGEP) 2014.pdf: 2208551 bytes, checksum: aefc619e6f9a0e4440ee264fa9431b59 (MD5) Ficha Catalográfica - GABRIELA BRASILEIRO CAMPOS MOTA – TESE (PPGEP) 2014.pdf: 54437 bytes, checksum: c9ec775e575ff1f890b9adb61626fef7 (MD5) Previous issue date: 2014 / O estudo de nanomateriais tornou-se uma linha muito importante de pesquisa em áreas como a física do estado sólido, química de estado sólido, engenharia de materiais, ciências médicas e biotecnologia. As pesquisas envolvendo a coordenação de íons lantanídicos ganham cada vez mais destaque na área científica, devido suas propriedades luminescentes. Concomitantemente, destacam-se os estudos científicos de compostos orgânicos que apresentam propriedades biológicas, entre os quais se distinguem os compostos mesoiônicos, que apresentam características estruturais, que despertaram um interesse considerável dos investigadores envolvidos na área da Química Medicinal. Neste sentido, a possibilidade de coordenar e associar as propriedades de íons lantanídeos com compostos mesoiônicos, a fim de preservar as características estruturais destes, têm atraído a atenção de pesquisadores. Nesta perspectiva, o presente trabalho teve como objetivo sintetizar pós cristalinos da coordenação do íon európio lantanídeos com mesoiônico do grupo 1,3-tiazolio-5-tiolato e bipiridina, além de caracterizar o complexo Eu(MESO1)3 bipy e Eu(MESO2)3bipy, 2-(4-clorofenil)-3-metil-4-(4-metilfenil)-1,3-tiazólio-5-tiolato (MESO1) e 2-(4-clorofenil)-3-metil-4-fenil-1,3-tiazólio-5-tiolato (MESO2) e a 2,2-bipiridina (bipy). Partindo da reação entre os cloreto de európio,com os ligantes orgânicos, sob refluxo de aproximadamente seis horas os mesoiônicos como segundo ligante, sob agitação magnética e temperatura de 60ºC, foi obtido um pó cristalino de coloração avermelhada. Os resultados das temperaturas de fusão/decomposição dos ligantes quando comparadas aos complexos mostraram-se bastante diferentes, o que indica a formação de novas substâncias. O nanocomplexos de íons lantadínicos apresentaram resultados da análise elementar satisfatórios, comprovando a estequiometria (1:3:1). Os espectros de absorção na regiao do UV-visível apresentaram deslocamento e surgimento de novas bandas, o que confirma a coordenação. A coordenação dos ligantes com o íons landanídicos ocorreu através dos átomos de enxofre exocíclico (C-S-) dos mesoiônicos e dos átomos de nitrogênio (C-N) da bipiridina, observados nos espectros de infravermelho. Os espectros de emissão dos complexos mostram que a emissão não foi potencializada pelo cátion. Os resultados dos difratogramas de raios-x dos complexos apresentam o desaparecimento e surgimento de novos picos, bem como, a variação de intensidade. As micrografias dos complexos confirmaram a formação de aglomerados e evidenciaram a cristalinidade dos compostos. Com base nas curvas termogravimétricas, as temperaturas de decomposição, dentre os complexos sintetizados, o Eu(MESO2)3 bipy apresentou maior estabilidade térmica. As curvas DSC dos complexos mostram um deslocamento dos picos sugestivo da formação de novas espécies. / The study of nanomaterials has become a very important line of research in areas such as solid state physics, solid state chemistry, materials engineering, medical sciences and biotechnology. Research involving the coordination of lanthanide ions are gaining more prominence in science, because their luminescent properties. Conco mitantly, we highlight the scientific study of organic compounds that exhibit biological properties, among which we distinguish the mesoionic compounds that have structural features that have attracted considerable interest from researchers involved in the field of Medicinal Chemistry. In this sense, the ability to coordinate and link the properties of lanthanide ions with mesoionic compounds, in order to preserve the structural characteristics of these have attracted the attention of researchers. In this perspective, the present study aimed to synthesize crystalline powders of europium lanthanide ion coordination with the group mesoionic 1,3-thiazolium -5-thiolate and bipyridine, besides characterizing the complex I (MESO1) 3bipy and I (MESO2) 3bipy 2 - (4-chlorophenyl)-3-methyl-4-(4-methylphenyl) -1,3-thiazolium -5-thiolate (MESO1) and 2 - (4-chlorophenyl)-3-methyl-4-phenyl- 1,3-thiazolium -5-thiolate (MESO2) and 2,2-bipyridine (bipy). Leaving the reaction between europium chloride with organic ligands under reflux for about six hours as the mesoionics second linker, under magnetic stirring and temperature of 60 º C, was obtained a crystalline powder reddish. The results of melting / decomposition of binders compared to the complexes were quite different, indicating the formation of new substances. The nanocomplexos of lantadínicos ions showed satisfactory results of elemental analysis, confirming the stoichiometry (1:3:1). The absorption spectra in the UVvisible region showed displacement and the appearance of new bands, confirming coordination. The coordination of the ligands with landanídicos ions occurred through the exocyclic sulfur atoms (CS-) of mesoionics and nitrogen atoms (CN) of bipyridine observed in the infrared spectra. Emission spectra of the complexes show that the issue was not potentiated by cation. The results of x-ray diffraction patterns of the complexes show the disappearance and appearance of new peaks and the intensity variation. The micrographs confirmed the formation of the complexes and clusters showed the crystallinity of the compounds. Based on the thermogravimetric curves, the decomposition temperatures, among the synthesized complexes, I (MeSO2) 3bipy showed higher thermal stability. The DSC curves of the complexes show a shift of the peaks suggestive of the formation of new species.