pH is a key parameter in the optimization of animal cell processes, and has be linked to specific patterns of consumption and production of extracellular metabolites. However, the effect of extracellular pH on intracellular metabolism has not been fully elucidated. Metabolic flux analysis is a mathematical method that can be used to generate the intracellular flux distributions in cells, e.g. as a function of some environmental parameter. In this work, the overall objective was to develop a culture system and experimental protocol for cultivation of CHO cells, which can be used to generate data for analysis of the relationship between extracellular pH and intracellular fluxes in CHO cells by metabolic flux analysis. First, shake-flask culture of an IgG-producing cell line was performed to select an academic and chemically-defined medium with known composition. This was followed by subsequent adaptation of the cells. It was found that the originally selected medium had to be supplemented with a commercial medium to produce acceptable growth and viability. Shake-flask culture was also performed to evaluate the effect of the biological buffer HEPES on cell growth and viability, and the pH-stability during culture. HEPES-concentrations in the investigated range (7.5-45 mM) did not show an apparent effect on cell growth or viability. The higher concentrations gave slightly better buffering capacity at inoculation, however were not sufficient to keep pH stable during culture. As a result, the idea of using shake flask culture and similar techniques for cultivation of cells at various pH set-points was dismissed. Instead, a culture system and protocol based on a 100 mL Spinner flask with pH-regulation was custom-designed for the project. Features of the final design included continuous monitoring of pH and DO, stable temperature at 37 °C, adjustable agitation rate, as well as the option to incorporate inflow of air, O2 and CO2. In addition, the possibility to disconnect the flask unit to perform medium exchange and sample collection away from the reactor site (i.e. in a laminar flow workbench) was integrated into the design and protocol. The system was demonstrated for pseudo-perfusion culture with the adapted IgG-producing cell line at pH 7.0 during 24 days. Optimized regulation settings were identified. It was shown that the system could support viable cell densities of up to 11 MVC/mL and high viability (> 90 %). During the final phase of culture, stable growth, at specific growth rates of approximately 0.7 Day-1, was achieved. The specific rates of consumption and production of the key metabolites glucose, glutamine, lactate and NH4+, as well as 20 amino acids were analyzed. A majority of the rates were in accordance with CHO cell metabolism. The expected consumption of a majority of the essential amino acids and main carbon sources glucose and glutamine were confirmed, as well as the associated production of by-products lactate and NH4+. The system and protocol developed in this work can be used in future experiments to generate data describing metabolic profiles as a function of various pH-set points. This data may then be used in metabolic flux analysis to further elucidate the metabolism behind pH effects in CHO cells. / pH är en viktig parameter i optimeringen av animalcellsprocesser och har sammankopplats med specifika konsumtions- och produktionsmönster rörande extracellulära metaboliter. Det extracellulära pH-värdets effekt på den intracellulära metabolismen är dock inte fullt klarlagd. Metabolisk flux analys är en matematisk metod som kan användas för att generera intracellulära fluxfördelningar i celler, exempelvis som en funktion av någon yttre parameter. Det övergripande målet i detta arbete var att utveckla ett odlingssystem och experimentellt protokoll för odling av CHO-celler som kan användas för att generera data för metabolisk flux analys där målet är att studera effekten av pH på den intracellulära cellmetabolismen. En IgG-producerande CHO-cellslinje odlades först i skakkolv för att välja ut ett akademiskt kemiskt definierat medium med känd sammansättning. Därefter följde försök att anpassa cellerna till det valda mediet. Det visade sig att ett kommersiellt medium behövde tillsättas för att ge godtagbar tillväxt och viabilitet. Effekten av den biologiska bufferten HEPES på cellernas tillväxt och viabilitet, samt pH-stabiliteten under odling, undersöktes också genom odling i skakkolv. HEPES-koncentrationer i det undersökta intervallet (7.5 – 45 mM) hade ingen större effekt på tillväxt och viabilitet. För de högre koncentrationerna var buffertkapaciteten något bättre precis vid inokulering. Dessa koncentrationer var dock ej tillräckliga för att ge stabilt pH under odlingen. Baserat på dessa resultat övergavs tanken på att använda skakkolvsodling för att odla celler vid olika pH-värden. Ett odlingssystem och ett protokoll baserat på en 100 mL Spinnerflaska med pH-reglering specialdesignades istället för projektet. I det färdiga systemet fanns lösningar för kontinuerlig övervakning av pH och DO, stabil temperatur vid 37 °C, justerbar omrörningshastighet, samt valmöjligheten att flöda in luft, O2 och CO2. Dessutom infördes möjligheten att koppla loss flaskenheten från reglersystemet för byte av medium och provtagning. För att demonstrera systemet genomfördes en odling med den anpassade IgG-producerande cellinjen enligt principen för pseudo-perfusion vid pH 7.0. Odlingen pågick under 24 dagar och optimerade reglerinställningar identifierades. Det visades att systemet kunde understödja cellkoncentrationer upp till 11 miljoner celler per milliliter, samt hög viabilitet (> 90 %). Under den senare delen av odlingen uppnåddes stabil tillväxt, vid specifika tillväxthastigheter omkring 0.7 per dygn. Den specifika konsumtions- och produktionshastigheten för metaboliterna glukos, glutamin, laktat och NH4+, samt 20 aminosyror analyserades. Majoriteten av hastigheterna stämde överens med typisk CHO-cellsmetabolism. Den förväntade konsumtionen av majoriteten av de essentiella aminosyrorna och huvudsakliga kolkällorna glukos och glutamin konfirmerades, såväl som den associerade produktionen av bi-produkterna laktat och NH4+. Odlingssystemet och det experimentella protokollet som utvecklades i detta arbete kan användas i framtida experiment för att generera data som beskriver metaboliska profiler som funktion av extracellulärt pH. Dessa data kan sedan användas i metabolisk flux analys för att dra slutsatser om pH-effekter i CHO-celler.

Salmonid fish such as brown trout (Salmo trutta) are known to adapt to local environments in large water systems such as in Lake Vänern. Since brown trout returns to spawn at the location of birth, they become reproductively isolated from populations spawning elsewhere. Thus, genetically-based physiological and ecological differences may develop between them. There is evidence that two of the stocks of Lake Vänern brown trout, Gullspångälven brown trout (G-trout) and Klarälven brown trout (K-trout) differ, with G-trout growing faster and becoming bigger than K-trout, but there is no study identifying why this is the case. The purpose of this study was therefore to investigate whether there were differences in three variables: metabolic rate (gill-beat frequency, referred to as ventilation rate), foraging rate (number of captured prey per unit time) and aggressive behavior (number of displays) between the two stocks of brown trout. By conducting laboratory experiments on G-trout and K-trout in artificial streams with a constant supply of food through drift, behavioral observations were made to quantify these variables. The results showed that G-trout had significantly higher gill-beat frequency and foraging rate than did K-trout. In terms of aggression there was no significant difference observed between the two stocks, though there was a trend for G-trout to show more display behavior. The differences in metabolic rate and foraging rate are consistent with the different growth rates reported for the two stocks. The differences between the stocks suggest that they have developed local adaptations and have maintained these after a number of years of being raised in hatcheries. The observed differences should be taken into account when it comes to management and restoration of populations adapted to local environments. / Laxfisk som till exempel öringen (Salmo trutta) är kända att anpassa sig till lokala miljöer i stora vattensystem, såsom i sjön Vänern. Eftersom öringen återvänder och leker där de är födda blir de reproduktivt isolerade från populationer som leker på annan plats. Därmed kan ärftliga fysiologiska och ekologiska skillnader utvecklas dem emellan. Där finns bevis på att Gullspångsöringen tillväxer snabbare och blir större än Klarälvsöringen men det finns ingen riktig vetskap om varför. Syftet med denna studie var därmed att undersöka om där fanns skillnader i tre variabler: metabolisk hastighet (gälslagsfrekvens), furagering (antal tagna byten) och aggressivt beteende (antal display uppvisanden) mellan öringstammarna. Med separata försök av G-öring och K-öring i ett försöksakvarium med en konstgjord vattenström och konstant tillförsel av mat genom drift, gjordes beteendeobservervationer av dessa variabler. Resultaten visade på att G-öring hade en signifikant högre gälslagsfrekvens och furageringshastighet än K-öring. Vad gällde displaybeteende fanns ingen signifikantskillnad mellan stammarna, dock observerades en trend att G-öringen uppvisade mer display. Dessa resultat tyder på att metabolisk hastighet och furagering kan ha en roll i tillväxttakten. Skillnaderna mellan stammarna kan tyda på att de har utvecklat lokala anpassningar och har kvar dessa efter ett antal års fiskodling. De observerade skillnaderna är viktiga att ta med i beräkning när det kommer till förvaltning och restauration av populationer anpassade till lokala miljöer.

In recent years, streams draining agricultural land has been suggested to exhibit high carbon dioxide (CO2) concentrations when compared to streams draining other land-types. The transport of carbon from land to ocean is mainly occurring through the chain of inland waters, and with agricultural land today representing 40% of all continental area many of these inland waters are influenced by agricultural land. The aim of this study was to improve the understanding of CO2 dynamics and its control in agricultural streams. Continuous data was collected from two catchments of different scales, near the city of Uppsala, Sweden. Both catchments are typical low-land catchments largely dominated by agricultural land. The measured CO2 concentrations were analyzed to find temporal variations and differences in dynamics between the catchments. The interplay between CO2 and parameters such as dissolved oxygen, discharge and conductivity were analyzed to determine the main drivers for CO2 dynamics. The findings show supersaturation of CO2 concentration during the full length of the measurement periods, with mean CO2 concentrations higher than what have been observed in streams draining other land-type catchments. Diel CO2 cycles were found throughout most of the measurement periods, where manual measurements were conducted to confirm these findings. The diel CO2 patterns were suggested to be heavily dependent on in-situ metabolic control while hydrological factors, such as sufficient discharge, seemed to be needed to produce a good diel CO2 signal. CO2 build-up is suggested to occur in the catchment soil and, when flushed out after rain events, result in an increasing CO2 concentration. This might be one important driver for the high levels in CO2 concentration found in the streams during summer and autumn. Analysis of the catchment areas suggest the percentage of agricultural land and the size of the catchment areas had an impact on hydrology, both for sufficient water flow to exist but also for the CO2 response after rain events. More research is encouraged, where more parameters should be investigated, such as groundwater inputs and carbonate precipitation. / Bäckar som dränerar åkermark har under de senaste åren blivit mer uppmärksammade på grund av nya studier som visat att dessa bäckar tenderar att ha högre CO2-koncentration än bäckar som dränerar andra marktyper. Idag utgör cirka 40% av all kontinentalyta åkermark, då den huvudsakliga transporten av kol från land till hav sker genom sammankopplade vattendrag är därav en förståelse av åkermarkers dränering till bäckar av stor betydelse. Syftet med studien var att förbättra förståelsen av CO2-dynamiken och dess påverkan på bäckar i jordbruksdominerade avrinningsområden. Kontinuerlig data samlades in, samt erhölls från tidigare mätningar, från två avrinningsområden med olika storlekar och markfördelningar nära Uppsala. Båda avrinningsområdena var typiska låglands- avrinningsområden som dominerades av åkermark. Data för CO2-koncentration analyserades för att hitta kort- och långsiktiga variationer i CO2-dynamiken samt undersöka hur denna dynamik skiljer sig mellan avrinningsområden med olika storlek och markfördelning. Samspelet mellan CO2 och parametrar såsom vattenlösligt syre, vattenföring och konduktivitet analyserades för att hitta drivkrafter bakom CO2-dynamiken. Resultatet visar att de undersökta bäckarna var övermättade med CO2 under hela mätperioden, samt att medelkoncentrationerna som uppmättes var högre än vad som observerats i bäckar som dränerar andra landtyper. En dygnsvariation av CO2 observerades under större delar av mätperioderna, manuella prover utfördes för att stärka denna data. Den observerade dygnscykeln av CO2-koncentrationen konstaterades korrelera med den in-situ metaboliska kontrollen medan hydrologiska faktorer, såsom ett tillräckligt högt vattenflöde, visade sig var viktigt för att en CO2-dygnscykel ska existera. De mycket höga toppar av CO2-koncentration som observerats under mätningarna tros bero på ackumulering av CO2 i avrinningsområdenas marker, vilket under nederbörd utarmas och transporteras till bäcken. Vid jämförelse av de två avrinningsområdena föreslogs den procentuella andelen åkermark och storleken av avrinningsområdet ha en stor påverkan på hydrologin, både för att ett tillräckligt vattenflöde ska existera men också för CO2-responsen vid större nederbördsmängder. Mer forskning behövs där fler parametrar börs ta i beaktning, till exempel in-situ karbonutfällning och inflöde av CO2 via grundvatten, för att få en bättre bild över åkermarkens påverkan på CO2-dynamik i bäckar.

Cyanobakterier är intressanta mikroorganismer för produktion av biobränslen från solljus, vatten och atmosfärisk koldioxid och anses därför vara potentiella mikrobiella cellfabriker. Men på grund av långsam tillväxt och låg produktion är genteknologi processen intensiv och tidskrävande för cyanobakterier. En alternativ metod till prototypteknik för metabola vägar är att använda cellfri metabolisk teknik där cellysat av överuttryckta enzymer används. I detta projekt försökte vi utveckla en metod för cellfri metabolisk ingenjörsteknik för cyanobakterien Synechocystis PCC 6803 med hjälp av den övre mevalonatvägen som exempelreaktionsväg. Vi började med att utveckla tre fluorescensbaserade metoder för att detektera proteinöveruttryck med hjälp av de tre enzymerna från mevalonatreaktionsvägen. Dessa metoder använde fusering av YFP-proteinet till målproteinet, en delad GFP-reporterprotein eller translationskoppling. Ett av de överuttryckta enzymerna verkade vara giftigt för Synechocystis-celler så flera inducerbara promotorer användes för att försöka uttrycka enzymet. Den högst uttryckande konstruktionen för varje gen valdes ut och proteiner extraherades och blandades i en cellfri metabolisk ingenjörsreaktion. Även om inget mevalonat kunde detekteras med hjälp av gaskromatografi i detta projekt, berodde detta sannolikt på otillräckligt högt proteinöveruttryck av mevalonatgenerna. / Cyanobacteria are desirable microorganisms for the production of biofuels from sunlight, water and atmospheric carbon dioxide, and are therefore considered potential microbial cell factories. But due to slow growth rate and low production rates, the engineering processes for bioproduction is labour intensive and time consuming. An alternative method to prototype metabolic pathway engineering is to use cell-free metabolic engineering, where cell lysates of enriched enzymes are used. In this project, we attempted to develop a method for cell-free metabolic engineering for the cyanobacterium Synechocystis PCC 6803 using the upper mevalonate pathway as an example pathway. We started by developing three fluorescence-based methods for detecting protein overexpression using the three enzymes from the mevalonate pathway. These methods used YFP fusion to target proteins, a split GFP reporter tag or translation coupling. One of the overexpressed enzymes appeared to be toxic to Synechocystis cells so several inducible promoters were used to try and express the enzyme. The highest expressing construct for each gene was selected and proteins were extracted and mixed in a cell free metabolic engineering reaction. Although no mevalonate could be detected using gas chromatography in this project, this was likely due to insufficiently high protein overexpression of the mevalonate pathway genes.

Aim The aim for this present study was to investigate the acute metabolic response from intermittent resistance exercise during hypoxia, with the following research questions: (1) Are blood levels of lactate and glucose different between hypoxia and normoxia? (2) Does hypoxia induce higher lactate accumulation and pH reduction in the human skeletal muscle? (3) Is there a relationship between plasma-, blood- and muscle lactate? Method Eight healthy males (30 ± 2 years) performed 6 sets of unilateral leg extension on each leg (75% of 1RM) with randomized normoxic (20,9% inspired 𝑂2) and normobaric hypoxic (12% inspired 𝑂2) conditions. A total of 5 muscle biopsies was extracted from m. Vastus Lateralis (pre-, post exercise, 90-, 180min and 24h post exercise) during both normoxia and hypoxia trials, separated by one week for all participants. Blood samples were repeatedly taken with 20 min intervals. Heart Rate (HR) and saturation (𝑆𝑝𝑂2) were measured by a pulsoximeter during resistance exercise. Results No significant main effect was observed for blood lactate and glucose levels as well as the muscle lactate accumulation and pH between normoxia and hypoxia. However, pH in muscle showed a trend between the conditions post exercise where hypoxia reached lower levels in total (P=0.08). Significant correlations were observed for blood- and plasma lactate, where hypoxia showed a stronger relationship than normoxia (r=0.98 compared to r=0.87). Equal findings for the correlation of muscle- and plasma lactate showed an even greater coefficient value for hypoxia compared to normoxia (r=0.860 compared to r=0.59). Conclusion Summarized data indicated that no significant difference between hypoxia and normoxia was evident. Nonetheless, tendencies illustrate that hypoxia may alter the metabolic response slightly. However, further research is needed to draw a conclusion between the conditions. / Syftet med denna studie är att undersöka kroppens akuta metabola svar från intermittent styrketräning under hypoxi, med följande frågeställningar: (1) Skiljer sig nivåerna av laktat och glukos i blodet mellan hypoxi och normoxi? (2) Skapar hypoxi större laktatansamling och pH reduktion i människoskelettmuskeln? (3) Finns det en relation mellan plasma-, blod- och muskellaktat? Metod Åtta friska män (30 ± 2 år) deltog där deltagarna utförde 6 set unilateral benextension för varje ben (75% 1RM). Intermittent styrketräning randomiserades med hypoxi som utfördes med 12% syrgas och normoxi som bibehöll normal syrgasnivå (20,9% syrgas). Under två testdagar togs 5 muskelbiopsier från m. Vastus Lateralis (före-, efter träning, 90-, 180min och 24h efter träning) på vartannat ben per testdag. Hjärtfrekvensen och 𝑆𝑝𝑂2 mättes via pulsoximeter under träningen. Resultat Ingen signifikant huvudeffekt påvisades mellan hypoxi och normoxi för blodlaktat samt glukos, såväl som laktatackumulationen och pH värdet i muskeln. Muskel pH visade en trend där hypoxi efter styrketräning nådde lägre totalnivå än normoxi (P=0,08). Vidare observerades hypoxi att ha starka relationer mellan blod- och plasmalaktat jämfört med normoxi (r=0,98 vs. r=0,87). Större skillnad framgick för korrelationen mellan muskel- och plasmalaktat där hypoxi-försöket utgav starkare koefficient jämfört med normoxi (r=0,86 vs. r=0,59). Konklusion Sammanfattad data visar att hypoxi inte skapar större metabolisk respons vid intermittent styrketräning. Trots detta framkom tendenser som illustrerar att hypoxi kan påverka den metabola stressen under styrketräning. Däremot krävs vidare forskning för att kunna säkerställa effekten av hypoxi på kroppens metabola svar. / Ingår i Marcus Mobergs projekt: ”Resistance exercise under hypoxia and the acute molecular effects in human skeletal muscle