Height is a complex physical trait that displays strong heritability. Adult height is related to length of the long bones, which is determined by growth at the epiphyseal growth plate. Longitudinal bone growth occurs via the process of endochondral ossification, where bone forms over the differentiating cartilage template at the growth plate. Estrogen plays a major role in regulating longitudinal bone growth and is responsible for inducing the pubertal growth spurt and fusion of the epiphyseal growth plate. However, the mechanism by which estrogen promotes epiphyseal fusion is poorly understood. It has been hypothesised that estrogen functions to regulate growth plate fusion by stimulating chondrocyte apoptosis, angiogenesis and bone cell invasion in the growth plate. Another theory has suggested that estrogen exposure exhausts the proliferative capacity of growth plate chondrocytes, which accelerates the process of chondrocyte senescence, leading to growth plate fusion. The overall objective of this study was to gain a greater understanding of the molecular mechanisms behind estrogen-mediated growth and height attainment by examining gene regulation in chondrocytes and the role of some of these genes in normal height inheritance. With the heritability of height so well established, the initial hypothesis was that genetic variation in candidate genes associated with longitudinal bone growth would be involved in normal adult height variation. The height-related genes FGFR3, CBFA1, ER and CBFA1 were screened for novel polymorphisms using denaturing HPLC and RFLP analysis. In total, 24 polymorphisms were identified. Two SNPs in ER (rs3757323 C>T and rs1801132 G>C) were strongly associated with adult male height and displayed an 8 cm and 9 cm height difference between homozygous genotypes, respectively. The TC haplotype of these SNPs was associated with a 6 cm decrease in height and remarkably, no homozygous carriers of the TC haplotype were identified in tall subjects. No significant associations with height were found for polymorphisms in the FGFR3, CBFA1 or VDR genes. In the epiphyseal growth plate, chondrocyte proliferation, matrix synthesis and chondrocyte hypertrophy are all major contributors to long bone growth. As estrogen plays such a significant role in both growth and final height attainment, another hypothesis of this study was that estrogen exerted its effects in the growth plate by influencing chondrocyte proliferation and mediating the expression of chondrocyte marker genes. The examination of genes regulated by estrogen in chondrocyte-like cells aimed to identify potential regulators of growth plate fusion, which may further elucidate mechanisms involved in the cessation of linear growth. While estrogen did not dramatically alter the proliferation of the SW1353 cell line, gene expression experiments identified several estrogen regulated genes. Sixteen chondrocyte marker genes were examined in response to estrogen concentrations ranging from 10-12 M to 10-8 M over varying time points. Of the genes analysed, IHH, FGFR3, collagen II and collagen X were not readily detectable and PTHrP, GHR, ER, BMP6, SOX9 and TGF1 mRNAs showed no significant response to estrogen treatments. However, the expression of MMP13, CBFA1, BCL-2 and BAX genes were significantly decreased. Interestingly, the majority of estrogen regulated genes in SW1353 cells are expressed in the hypertrophic zone of the growth plate. Estrogen is also known to regulate systemic GH secretion and local GH action. At the molecular level, estrogen functions to inhibit GH action by negatively regulating GH signalling. GH treated SW1353 cells displayed increases in MMP9 mRNA expression (4.4-fold) and MMP13 mRNA expression (64-fold) in SW1353 cells. Increases were also detected in their respective proteins. Treatment with AG490, an established JAK2 inhibitor, blocked the GH mediated stimulation of both MMP9 and MMP13 mRNA expression. The application of estrogen and GH to SW1353 cells attenuated GH-stimulated MMP13 levels, but did not affect MMP9 levels. Investigation of GH signalling revealed that SW1353 cells have high levels of activated JAK2 and exposure to GH, estrogen, AG490 and other signalling inhibitors did not affect JAK2 phosphorylation. Interestingly, AG490 treatment dramatically decreased ERK2 signalling, although GH did stimulate ERK2 phosphorylation above control levels. AG490 also decreased CBFA1 expression, a transcription factor known to activate MMP9 and MMP13. Finally, GH and estrogen treatment increased expression of SOCS3 mRNA, suggesting that SOCS3 may regulate JAK/STAT signalling in SW1353 cells. The modulation of GH-mediated MMP expression by estrogen in SW1353 cells represents a potentially novel mechanism by which estrogen may regulate longitudinal bone growth. However, further investigation is required in order to elucidate the precise mechanisms behind estrogen and GH regulation of MMP13 expression in SW1353 cells. This study has provided additional evidence that estrogen and the ER gene are major factors in the regulation of growth and the determination of adult height. Newly identified polymorphisms in the ER gene not only contribute to our understanding of the genetic basis of human height, but may also be useful in association studies examining other complex traits. This study also identified several estrogen regulated genes and indicated that estrogen modifies the expression of genes which are primarily expressed in the hypertrophic region of the epiphyseal growth plate. Furthermore, synergistic studies incorporating GH and estrogen have revealed the ability of estrogen to attenuate the effects of GH on MMP13 expression, revealing potential pathways by which estrogen may modulate growth plate fusion, longitudinal bone growth and even arthritis.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2006. / Härtill 4 uppsatser.

Thesis (Ph. D.)--University of Alabama at Birmingham, 2007. / Title from first page of PDF file (viewed Feb 17, 2009). Includes bibliographical references.

O tratamento radioterápico para pacientes com neoplasias de cabeça e pescoço pode trazer consequências secundárias graves como alterações da estrutura dental, com conseguinte prejuízo da função oral, a qual influencia negativamente a qualidade de vida. Recentemente trabalhos de pesquisa tem demonstrado que a radiação induz a expressão e ativação das metaloproteinases da matriz (MMPs), consideradas as principais enzimas responsáveis pela remodelação da matriz orgânica, incluindo os componentes e estruturas da junção amelodentinária (JAD). Questiona-se então se as alterações dentais observadas em pacientes pós-radioterapia poderiam ser causadas também pela ativação das MMPs que se encontram na JAD. O presente estudo apresentou três avaliações: a ativação e expressão das MMPs, a implementação de inibidores de proteases como método de inibição das MMPs e a ativação das MMPs devido a um desafio ácido. Para as medições foram utilizados 178 fragmentos dentais de molares, divididos aleatoriamente em 2 grupos (decíduos e permanentes) / 4 subgrupos experimentais (irradiados e não-irradiados). Os fragmentos foram expostos à radiacao com Co-60, com fracao de dose de 2 Gy, 5 dias consecutivos, ate atingirem a dose total de 60 Gy, com um total de 30 ciclos, durante 6 semanas. Com o objetivo de determinar a expressão e atividade das MMPs, foram realizados os ensaios de imunofluorescência e zimografia in situ, nos fragmentos dentais de 0,6mm, analisando os tecidos duros do esmalte, dentina e JAD. Para avaliar se produtos odontológicos inativam as MMPs, os dentes foram imersos em 0,5ml de digluconato de clorexidina a 0,12%, fluoreto de sódio a 0,05%, polifenol epigalocatequina 3-galato 400μM e água destilada (grupo controle), por 1 hora. Assim também com objetivo de avaliar se em um ambiente ácido, as MMPs apresentariam maior atividade, os dentes foram colocados em contato com 20μl de solucao desmineralizadora com pH de 4,8, por um minuto, e posteriormente lavados com 20μl de água deionizada, por um minuto. De maneira geral pudemos observar que a irradiação ativa as MMPs na JAD e estes efeitos foram mais evidentes nos dentes permanentes que nos decíduos. Com relação à expressão das diferentes MMPs, foi observada uma maior expressão das MMPs-9 e -20 para dentes decíduos, e para dentes permanentes as MMPs-2, -9 e -20 apresentaram expressão semelhante. Tendo em vista que a irradiação foi capaz de ativar as MMPs expressas na JAD de dentes permanentes, e em busca de soluções capazes de inibi-las, observamos que o Digluconato de Clorexidina, o Fluoreto de Sódio e o Polifenol Epigalocatequina 3-galato inibiram a atividade das MMPs na JAD em dentes permanentes. Por último ao investigar o efeito de um desafio ácido, na atividade das MMPs, observamos que a desmineralização não aumentou a atividade das MMPs em dentes não irradiados, porém aumentou a atividade das MMPs em dentes irradiados. Comparando dentes irradiados submetidos ou não à desmineralização, observou-se que a desmineralização incrementou a atividade das MMPs, já induzida pela irradiação. / Radiotherapy for patients with head and neck cancer can have serious secondary consequences such as changes in tooth structure, with consequent loss of oral function which negatively influences an individual\'s quality of life. Recently research work has shown that radiation induces the expression and activation of matrix metalloproteinases (MMPs) which are considered the major enzymes responsible for the remodeling of the organic matrix, including the components and structures of the dentinoenamel junction (DEJ). It is questionable if the dental changes observed in post-radiotherapy patients could also be caused by the activation of MMPs that are in the DEJ. The present study has three assessments: the activation and expression of MMPs, the implementation of protease inhibitors such as method of inactivating MMPs and the activation of MMPs due to an acid challenge. The measurements that were used were 178 molar dental fragments randomly divided into 2 groups (deciduous and permanent) / 4 experimental subgroups (irradiated and non-irradiated). The samples were exposed to radiation using Co-60 at a cumulative dose of 2 Gy fraction, 5 consecutive days, until they reached a total dose of 60 Gy, with a total of 30 cycles for 6 weeks. In order to determine the expression and activity of MMPs immunofluorescence assays were performed and in situ zymography, the dental fragments of 0.6mm, analyzing the DEJ in three areas of the tooth (cervical, cuspal and groove of pit). To assess whether MMPs inactivate dental products, the teeth were immersed in 0.5 ml of chlorhexidine digluconate at 0.12%, sodium fluoride 0.05%, polyphenol epigallocatechin-3 gallate 400μM and distilled water (control group) for 1 hour. To evaluate effects in an acidic environment, MMPs have higher activity, the teeth were put in contact with 20μl of demineralizing solution with pH 4.8, for a minute, and then washed with 20μl of deionized water, one minute. In general we observed that the radiation active MMPs in DEJ and these effects were more evident in the permanent teeth than in the primary teeth. Regarding the expression of different MMPs, showed the greatest expression of MMP-9 and -20 for deciduous teeth, and permanent teeth MMPs-2, -9 and -20 showed similar expression. Given that the irradiation was able to activate MMPs expressed in the DEJ permanent teeth, and looking for solutions that inactive them, we observed that the digluconate Chlorhexidine, the Sodium Fluoride and Polyphenol Epigallocatechin-3-gallate inhibited activity of MMPs in the DEJ in permanent teeth. Finally, to investigate the effect of an acid challenge, in the activity of MMPs, we observed that the demineralization did not increase the activity of MMPs in non-irradiated teeth but increased the activity of MMPs in irradiated teeth. Comparing irradiated whether subjected to demineralization teeth or not, it was found that demineralization increased activity of MMPs, induced by the radiation.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-11-24. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:29Z : No. of bitstreams: 1 Publico-393.pdf: 1637068 bytes, checksum: 4fe3757007f6a049eac930eb08b63c88 (MD5) / O melanoma é o tipo de câncer de pele menos frequente, mas que tem um grande poder de letalidade devido ao seu potencial de formar metástases. Para as células adquirirem a capacidade de formar metástases, estas precisam ter a característica de sobreviver independente de interações com a matriz extracelular e consequentemente apresentar resistência ao anoikis. Por isso, a importância de se estudar as alterações que ocorrem com células tumorais que adquirem essa capacidade. Em nosso laboratório foi desenvolvido um modelo que nos permite estudar diferentes etapas da gênese do melanoma. Melanócitos murinos melan-a que sobreviveram depois de 1, 2, 3 e 4 ciclos de impedimento de ancoragem por 96 horas apresentaram modificações na morfologia e crescimento independente de PMA, e foram denominadas 1C, 2C, 3C e 4C, respectivamente. Diferentes linhagens de melanoma (4C11-, 4C11+, Tm1, Tm5, etc) foram estabelecidas após submeter os esferóides sobreviventes da 4C à diluição limitante. Dados prévios de nosso laboratório mostraram aumento da expressão de Timp1 ao longo da transformação maligna de melanócitos e aumento da resistência ao anoikis. Melanócitos melan-a superexpressando o gene Timp1 adquirem fenótipo de resistência ao anoikis. No entanto, o mecanismo pelo qual Timp1 medeia essa sinalização de sobrevivência não é conhecido. Dados da literatura mostram interação entre CD63, Timp1 e 1-integrinas em células epiteliais de mama humana e que essa interação regula processos fisiológicos como apoptose. Além disso, a glicosilação aberrante em moléculas de adesão celular, como integrinas, pode conferir às células capacidade de sobreviver em condições independentes de ancoragem. O objetivo do presente estudo foi analisar a possível interação entre CD63, Timp1 e 1-integrinas ao longo da transformação maligna de melanócitos, a presença de N-glicosilação aberrante em β1-integrinas e o impacto da N-glicosilação aberrante na resistência ao anoikis. Observou-se interação entre CD63 e Timp1 e CD63 e 1-integrinas nas linhagens 4C, 4C11- e 4C11+, estabelecidas após ciclos de impedimento de ancoragem, já a interação entre Timp1 e 1-integrinas foi observada somente nas linhagens de melanoma 4C11- e 4C11+. A expressão de 1-integrinas na superfície celular está aumentada na linhagem de melanoma agressivo 4C11+, assim como a expressão de Mgat-V e N-glicosilação aberrante. Além disso, o perfil eletroforético da 1-integrina sugere que a mesma apresenta aumento de N-glicosilação aberrante na linhagem de melanoma metastático 4C11+. O tratamento de células de melanoma 4C11+ com o inibidor de N-glicosilação swainsonine resulta em menor capacidade destas células em resistir ao anoikis. Este parece ser o primeiro estudo descrevendo a interação entre Timp1, CD63 e 1-integrinas em células tumorais. Assim, o presente trabalho favorece o entendimento de como Timp1 regula resistência ao anoikis ao longo da transformação maligna de melanócitos. / Although malignant melanoma is the less frequently diagnosed skin cancer, it shows a poor prognosis due its chemoresistance and metastasis development. One of the adquired abilities of transformed cells is anoikis resistance and this property is closely related to metastasis formation. In our laboratory, we developed a model that allows us to study different steps of melanocyte malignant transformation. Melan-a melanocytes surviving after 1, 2, 3 and 4 deadhesion cycles showed modified morphology and independent PMA growth and have been named, 1C, 2C, 3C and 4C cells, respectively. Different melanoma cell lines were established after submitting 4C spheroids to limiting dilution. Previous results of our group showed increased expression of Timp1 along melanoma genesis and its correlation with anoikis resistance. However, the mechanism involved in this signaling is unknown. Published data demonstrated interaction between CD63, Timp1 and 1-integrins in human breast epithelial cells and its role in apoptosis. Furthermore, aberrant glycosylation in cell adhesion molecules such as integrins provides to cells the ability to survive under anchorage-independent conditions. The aim of this work was analyze the possible interaction among CD63, Timp1 and 1-integrins along melanocyte malignant transformation, possible aberrant N-glycosylation patterns of β1-integrins and their impact in anoikis resistance. Aberrant N-glycosylation patterns were observed in tumorigenic cells. We observed interaction between CD63 and Timp1 and between CD63 and 1-integrins in the melan-a-derived cells 4C, 4C11, and 4C11 +, and interaction between Timp1 and 1-integrins only in melanoma cell lines 4C11 - and 4C11 +. The presence of Timp1 in supernatant from 4C11+ conferred to melan-a cells anoikis resistance. The expression of 1-integrins in our study model is increased in aggressive melanoma lineage, 4C11+, as well as the expression of Mgat-V and aberrant N-glycosylation on cell surface. Moreover, the electrophoretic profile of  1-integrin suggests that melanoma metastatic 4C11+. Lineage present increased aberrant N-glycosylation in this molecule. Treatment of melanoma cells 4C11 + with the N-glycosylation inhibitor, swainsonine, resulted in reduced capacity of these cells to resist to anoikis. This seems to be the first study describing the interaction between Timp1, CD63 and 1-integrin in tumor cells and may contribute to a better understanding of how Timp1 regulates resistance to anoikis during the melanocyte malignant transformation. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Daniele Amaral (daniee_ni@hotmail.com) on 2016-10-10T20:10:53Z No. of bitstreams: 1 TeseMVCS.pdf: 1443535 bytes, checksum: 00790f3f7d8d3a096d595944eba6c76d (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-21T13:44:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseMVCS.pdf: 1443535 bytes, checksum: 00790f3f7d8d3a096d595944eba6c76d (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-21T13:45:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseMVCS.pdf: 1443535 bytes, checksum: 00790f3f7d8d3a096d595944eba6c76d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-21T13:45:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseMVCS.pdf: 1443535 bytes, checksum: 00790f3f7d8d3a096d595944eba6c76d (MD5) Previous issue date: 2016-09-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Purpose: The aim of the present study was to investigate the influence of resistance training (RT) and hormone replacement (HR) on MMP-2 activity, biomechanical and physical properties bone of ovariectomized (OVX) rats. Methods: Sprague-Dawley female rats were grouped into six experimental groups (n = 11 per group): shamoperated sedentary (SHAM Sed), ovariectomized sedentary (OVX Sed), sham-operated resistance training (SHAM RT), ovariectomized resistance training (OVX RT),(OVX Sed-HR), and OVX RT-HR. HR groups received implanted silastic capsules with a 5% solution of 17β-estradiol (50 mg 17β-estradiol/ml of sunflower oil). In a 12-week RT period (27 sessions; 4–9 climbs) the animals climbed a 1.1 m vertical ladder with weights attached to their tails. Biomechanical and physical bone analyses were performed using a universal testing machine, and MMP-2 activity analysis was done by zymography. Results: Bone density and bone mineral content was higher in the RT and HR groups. The MMP-2 activity was higher in the RT and HR groups. The biomechanical analysis (stiffness, fracture load and maximum load) demonstrated better bone tissue quality in the RT associated with HR. Conclusion: The RT alone as well as when it is associated with HR was efficient in increasing MMP-2 activity, biomechanical and biophysical properties bone of ovariectomized rats. / Objetivo: o objetivo do presente estudo foi investigar a influência do treinamento resistido (TR) e reposição hormonal (RH) na atividade das metalloproteinases 2 (MMP- 2), nas propriedades biomecânicas e biofísicas do osso de ratas ovariectomizadas (OVX). Métodos: fêmeas albinas foram agrupadas em seis grupos (11 animais por grupo): Sham Sedentário (SHAM Sed); Ovariectomizado Sedentário (OVX Sed); Sham Operado Treinamento Resistido (SHAM TR); Ovariectomizado Treinamento Resistido (OVX TR); Ovariectomizado Sedentário com Reposição Hormonal (OVX Sed-RH) e Ovariectomizado Treinamento Resistido com Reposição Hormonal (OVX TR-RH). Os animais dos grupos que receberam RH tiveram capsulas de silastic implantadas com uma solução de óleo de girassol com 180μg de 17β-estradiol/mL. Os animais foram submetidos ao TR por 12 semanas (3 vezes por semana, onde realizavam de 4-9 escaladas), o treinamento acontecia em uma escada vertical de 1,1m com os pesos fixados em sua cauda. As análises biomecânicas e biofísicas foram realizadas utilizando a máquina de teste universal e a atividade da MMP-2 por zimografia. Resultados: a densidade óssea e o conteúdo mineral ósseo foram maior nos grupos TR e RH. A atividade da MMP-2 também foi maior nos grupos que foram submetidos ao TR e RH. A análise biomecânica (rigidez, carga no ponto de fratura e carga máxima) utilizada para demonstrar a qualidade do osso foi maios no grupo TR com associação do RH. Conclusão: nossos resultados indicam que o TR e RH foram eficientes em aumentar a atividade da MMP-2, as propriedades biomecânicas e biofísicas dos ossos de ratas ovariectomizadas.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Proteases are enzymes widely found in all five life being kingdoms. These proteolytic enzymes have been studied and can be used as therapeutic tools due to their actions on physiopathologic events. Metalloproteinase are hydrolytic zinc-binding dependent enzymes which interfere in physiological processes. Snake venom metalloproteinase are widely studied animal toxins. They are divided into classes (PI, PII and PIII) and PI metalloproteinase are composed of a pro-domain and a catalytic domain in its structure. In the present work, we demonstrated the biochemical and functional characteristics of a PI- metalloproteinase (BpMP-II) isolated from B. pauloensis venom. BpMP-II was purified in three chromatography steps on cation exchange resin CM-Sepharose Fast flow, filtration Sephacryl S-300 and anion exchange Capto-Q. The isolated enzyme was homogeneous on SDS-PAGE under reduction and non-reduction conditions, with a molecular weight of 23kDa determined by MALDI-TOF mass spectrometry. The isoeletric focalization demonstrated a slight acid pI (6,1) of BpMP-II. The partial sequence of protein was determined by MS/MS (MALDI-TOF/TOF) and showed high structural similarity with others SVMPs as well as a significant score match. BpMP-II showed high proteolytic activity upon azocasein and bovine fibrinogen and was inhibited by EDTA, 1,10 phenantroline and β-mercaptoethanol. Moreover, this enzyme showed stability at neutral and alkaline pH and it was inactivated at temperatures higher than 60oC. Concentrations higher than 20μg of BpMP-II was able to decrease tEnd cells viability. A slight increase in creatine kinase (CK) levels was noticed when BpMP-II was administrated an intramuscular route on mice. Therefore, the present work permitted the identification and characterization of a molecule with great therapeutic potential. / Proteases são enzimas abundantemente encontradas em todos os cinco grandes reinos de seres vivos. Essas enzimas proteolíticas provenientes da natureza têm sido alvos de estudos com a finalidade de buscar ferramentas de uso terapêutico por atuarem em diversos processos fisiopatológicos. Metaloproteases são enzimas proteolíticas da classe das hidrolases que dependem da ligação de um metal em seu sítio ativo (geralmente o zinco) para exercer suas atividades. Essas enzimas participam de diversos eventos fisiológicos e patológicos. As metaloproteases de peçonha de serpentes (SVMPs) estão entre as toxinas animais mais estudadas. Elas são divididas em classes (PI, PII e PIII) de acordo com a composição estrutural e a presença de domínios. As metaloproteases da classe PI contêm um pró-domínio e o domínio catalítico em sua estrutura. No presente trabalho, nós descrevemos as características bioquímicas e funcionais de uma metaloprotease da classe PI denominada Bothrops pauloensis Metalloproteinase-II (BpMP-II), isolada da peçonha da serpente Bothrops pauloensis. BpMP-II foi purificada utilizando-se três passos cromatográficos em resinas de troca catiônica CM-Sepharose Fast Flow, coluna de gel filtração Sephacryl S-300 e resina de troca aniônica HisTrap Capto-Q. A enzima isolada apresentou-se homogênea em eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12,5% sob condições redutoras e não-redutoras, com uma massa molecular de 23kDa determinada por espectrometria de massas MALDI-TOF. O ensaio de focalização isoelétrica resultou em um pI levemente ácido de 6,1 para a BpMP-II. A sequência parcial da proteína determinada por MS/MS (MALDI TOF/TOF) apresentou alta similaridade estrutural com outras SVMPs com score bastante significativo. BpMP-II mostrou alta atividade proteolítica sobre azocaseína sob diferentes condições experimentais e sobre o fibrinogênio bovino com variação de dose, pH. BpMP-II foi inibida por EDTA, 1,10 fenantrolina (agentes quelantes) e β-mercaptoetanol (agente redutor ligação S-S). Além disso, esta protease apresentou estabilidade em pH neutro ou alcalino e foi inativada em temperaturas elevadas (60ºC). BpMP-II mostrou ser citotóxica para células tEnd em concentrações acima de 20μg/μL. Um leve aumento nos níveis de creatina quinase (CK) foi observado quando injetada intramuscularmente em camundongos. Assim, o presente trabalho permitiu identificar e caracterizar uma molécula com grande potencial de aplicação terapêutica. / Mestre em Genética e Bioquímica

O conceito de campo de cancerização, em dermatologia, sugere que a pele fotodanificada tem maior potencial para o desenvolvimento de neoplasias cutâneas. A terapia fotodinâmica (TFD) é um método não invasivo para o tratamento de queratoses actínicas (QA) múltiplas, possibilitando a abordagem de todo o campo. Vinte e seis pacientes com múltiplas QAs na face foram submetidos a três sessões de TFD com metilaminolevulinato 16% (MAL) e luz vermelha, com intervalo de um mês. Biópsias foram realizadas antes e após três meses da última sessão e o material corado para hematoxilina-eosina e Weigert. O estudo imunohistoquímico foi feito para os marcadores: TP-53, pró-colageno I, Metaloproteinase-1 e Tenascina-C. A avaliação do fotoenvelhecimento global melhorou consideravelmente (p < 0,001) e a cura clínica das QAs foi de 89,5% ao final do estudo. Duas sessões mostraram ser equivalentes a três sessões de TFD. Diminuição significante do grau e extensão da atipia celular (p < 0,001), aumento das fibras colágenas (p = 0,001) e melhora do grau de elastose (p = 0,002) foram observadas. O estudo imunohistoquímico mostrou diminuição da expressão da TP-53 (p = 0,580), aumento de pró-colágeno I (p = 0,477) e de MMP-1 (p = 0,08), embora não houvesse diferença estatisticamente significante. Aumento significativo foi observado para Tenascina-C (p = 0,024). Múltiplas sessões de TFD com MAL induziram melhora clínica e histológica do campo de cancerização. A diminuição da severidade e extensão da atipia celular associada à menor expressão de TP-53 sugerem redução do potencial carcinogênico do campo / The field cancerization concept suggests that photodamaged skin has an increased risk for the development of malignant lesions. Topical photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive therapeutic method for multiple actinic keratosis (AK), allowing the possibility of treating the entire surface. Twenty-six patients with photodamaged skin and multiple AKs on the face were submitted to three consecutive sessions of PDT with mehtylaminolevulinate 16% (MAL) and red light, one month apart. Biopsies were performed before and three months after the last treatment session, and stained for hematoxilin-eosin and Weigert. Immunohistochemestry study was performed for TP-53, pro-collagen I, Metalloproteinase-1 and Tenascin-C. The global score for photodamage improved considerably in all patients (p < 0.001). The AK clearance rate was 89.5% at the end of the study. Two treatments were similar to three MAL-PDT sessions. A significant decrease in keratinocytes atypia grade and amount was observed (p < 0.001). A significant increase in collagen deposition (p = 0.001) and improvement of solar elastosis (p = 0.002) were noticed. Immunohistochemical study showed decreased TP-53 expression although not statistically significant (p = 0.580), increased pro-collagen I and MMP-1 expressions (p = 0.477 and p = 0.08) again not statistically significant and a increased expression of Tenascin-C (p = 0.024), which was statistically significant. In conclusion, multiple sessions of MAL-PDT induced clinical and histological improvement of field cancerization. The decrease in severity and extension of keratinocytes atypia associated with a decreased expression of TP-53 suggest a reduced carcinogenic potential of the altered field

Orientadores: Ubirajara Ferreira, Valeria H. A. Cagnon Quitete / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T17:35:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Reis_LeonardoOliveira_M.pdf: 4339458 bytes, checksum: 1e103884dabb1194ecfd6161caeed83d (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A destruição do complexo da distroglicana dependente da metaloproteinase da matriz pode ter papel importante no desenvolvimento e progressão do tumor urotelial. O carcinoma urotelial humano é frequente na bexiga e menos comum no trato urinário superior. Não há um modelo experimental animal bem definido e reprodutível de carcinoma urotelial do trato superior. Objetivos: Propor um novo modelo experimental de carcinoma urotelial que resulta de refluxo vesicoureteral em animais submetidos a tratamento com associação entre n-metil-n-nitrosourea e citrato de sódio intravesicais. Caracterizar a imunolocalização dos receptores de ?-distroglicana e metaloproteinase 9 na bexiga urinária, ureter e pelve renal deste modelo, assim como descrever aspectos morfológicos, imunohistoquímicos e proliferativos nestes órgãos. Metodologia: Cinqüenta ratas Fisher 344 foram divididas em dois grupos: Controle - recebeu 0,30ml de solução salina 0,9% intravesical; MNU-citrato - recebeu 0,15ml de MNU e 0,15ml de citrato de sódio intravesical, ambos em semanas alternadas, nas semanas 0, 2, 4 e 6, totalizando quatro doses. Após 15 semanas de tratamento, a bexiga, os ureteres, e as pelves renais foram coletados para análises morfológicas e imunohistoquímicas. Resultados: O grupo MNU-Citrato apresentou imunoreatividade reduzida de ?-DG e aumentada de MMP-9 e Ki-67. O tratamento associado de MNU e citrato de sódio levou ao desenvolvimento de carcinoma urotelial na bexiga e no trato urinário superior de todos os animais. Conclusões: O modelo proposto induziu lesão maligna de diversos graus em 100 % dos animais, sem comprometimento muscular. A imunolocalização da ?-DG foi muito diminuída em contraposição ao aumento da imunolocalização da MMP-9 nos diferentes órgãos estudados neste modelo e os aspectos morfológicos, imunohistoquímicos e proliferativos ao longo do urotélio (bexiga urinária, ureter e pelve renal) foram muito semelhantes, sendo que ocorreu aumento de apoptose e proliferação celular com expressivo predomínio deste último. Palavras chave: Distroglicana; Metaloproteinase de matriz; Carcinoma urotelial; Modelo animal experimental; Trato urinário superior / Abstract: The dystroglican complex destruction is done by matrix metalloproteinase and plays a critical role in the urothelial carcinoma development and progression. The human urothelial carcinoma is frequent on the bladder and less common on the upper urinary tract. There is no reproducible and well described experimental upper urothelial carcinoma model on this issue. Purposes: Describe a novel experimental upper urothelial carcinoma animal model which results in vesicoureteral reflux in animals submitted to associate treatment with the carcinogen n-methyl-n-nitrosourea and sodium citrate intravesically. Characterize the ?-DG and the MMP-9 immunolocalization in the bladder as well as in the upper urinary tract, and describe morphological, immunohistochemistry and proliferative aspects utilizing a novel experimental model. Materials and Methods: Fifty female Fischer 344 rats were divided into two groups: the control group received a 0.30ml dose of 0.9% physiological saline intravesically every other week for a total of 4 doses; the MNU-citrate group received 0.15 ml of MNU and 0.15ml of sodium citrate intravesically every other week for a total of 4 doses. After 15 weeks of treatment, bladder, ureters and renal pelvis were collected for morphological and immunohistochemistry analyses. Results: The MNU-Citrate group showed reduced ?-DG and increased MMP-9 and Ki-67 immunoreactivities. Associated treatment with MNU and sodium citrate was able to lead to both urinary bladder and upper urinary tract tumors in all animals. Conclusions: The proposed model showed cancer in several grades in 100 % of animals, with no muscular invasion. The immunolocalization was decreased for ?-DG and increased for MMP-9 in the analyzed tissues and the morphological, immunohistochemical and proliferative aspects of the urothelium (bladder, ureter e renal pelvis) were similar. Apoptosis and proliferation were increased, being the last one more intense / Mestrado / Cirurgia / Mestre em Cirurgia

Introdução: A dermatite atópica (DA) é uma doença cutânea inflamatória de caráter crônico, recidivante, em que o prurido intenso e a xerose cutânea são frequentes. A etiopatogenia da DA é multifatorial, envolvendo fatores genéticos, ambientais e imunológicos. Eosinófilos são leucócitos polimorfonucleares multifuncionais que estão implicados na patogênese de diversos processos inflamatórios, incluindo a DA. Além da produção e secreção de diversas proteínas presentes nos grânulos citoplasmáticos, os eosinófilos também apresentam potencial para secretar metaloproteinases, enzimas proteolíticas que degradam vários componentes da matriz extracelular, e estão presentes em diversos processos fisiológicos e patológicos. Objetivo: Avaliar: 1) o perfil fenotípico dos eosinófilos na dermatite atópica do adulto, através da expressão das moléculas CCR3, CD23, CD38, CD69 e CD62L; 2) o perfil funcional, a partir da secreção de metaloproteinases, inibidores teciduais de metaloproteinases e RANTES por eosinófilos purificados. Métodos: Foram incluídos 41 adultos diagnosticados com DA, de acordo com os critérios de Hanifin & Rajka e 45 controles adultos sadios. A gravidade da doença foi mensurada através do escore de gravidade EASI (Eczema Area and Severity Index). Eosinófilos (LIN 1- CCR3+) do sangue periférico foram analisados para os marcadores CCR3, CD38, CD69, CD23 e CD62L através da citometria de fluxo (LSRFortessa, BD Biosciences) a análise foi realizada com o FlowJo 7.5.6 software. Eosinófilos purificados de indivíduos com DA e indivíduos controles foram estimulados com enterotoxina de Staphylococcus aureus B (SEB) e FSL-1 (agonista de receptores Toll-like 2 e 6), e os sobrenadantes foram coletados para dosagem de metaloproteinases (MMPs), inibidores teciduais de metaloproteinases 1 e 2 (TIMP-1 e TIMP-2) e RANTES por ELISA e por Cytometric bead array. Resultados: Indivíduos com DA apresentaram maior frequência de eosinófilos (LIN1- CCR3+), relacionada à gravidade da doença. Observou-se também, que a frequência de CD62L (L-selectina) e de CD23 (receptor de baixa afinidade para IgE) em eosinófilos (LIN1- CCR3+) diminui em pacientes com DA. Os receptores de ativação precoce (CD69) e tardio (CD38) não mostraram diferença estatística entre os grupos analisados. Os níveis séricos de MMPs e de TIMPs foram similares entre os controles e pacientes. Ao analisarmos a secreção de MMPs e de (TIMPs), a partir de eosinófilos purificados de pacientes com dermatite atópica, observamos diminuição dos níveis basais de TIMP-1 e TIMP-2 e de RANTES. Conclusões: Na DA do adulto, o perfil fenotípico e funcional dos eosinófilos mostrou: perfil de ativação da fase aguda, com expressão aumentada de CCR3; potencial de migração elevado, em decorrência da diminuição da expressão de CD62L; falhas no processo de ativação dos eosinófilos via CD23, bem como, no remodelamento tecidual mediado por TIMP-1 e TIMP-2 e na quimotaxia mediada por RANTES / Introduction: Atopic dermatitis (AD) is an inflammatory, chronic and recurrent skin disease characterized by intense pruritus and xerosis. AD has a complex etiopathogenesis, which involves the influence of genetics, environment, and immunological disorders, among others. Eosinophils are multifunctional polymorphonuclear leukocytes that contribute to the pathogenesis of several inflammatory processes, such as AD. In addition to the production and secretion of diverse proteins of the cytoplasmic granules, eosinophils have also the potential to secrete metalloproteinases (MMPs), proteolytic enzymes with a primary role for degrading several extracellular matrix components, present in distinct physiological and pathological processes. Objective: To evaluate:1) the phenotypic profile of eosinophils in adults with atopic dermatitis through the expression of CCR3, CD23, CD38, CD69 and CD62L molecules; 2) the functional profile through secretion of MMPs, tissue inhibitors of metalloproteinases 1 and 2 ( TIMP-1 and TIMP-2) and RANTES by purified eosinophils. Methods: This work enrolled 41 patients with AD, diagnosed according to Hanifin & Rajka\'s criteria) and 45 healthy controls. Severity of the disease was established utilizing EASI (Eczema Area and Severity Index). Eosinophils (Lineage cocktail 1- CCR3+) from peripheral blood were analyzed for CCR3, CD38, CD69, CD23 and CD62L by flow cytometry (LSRFortessa, BD Biosciences), and analysis was performed using the FlowJo 7.5.6 software. Purified eosinophils were stimulated with Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB) FSL-1 (Toll-like receptor 2/6 agonist), and supernatants were collected for MMPs, TIMPs and RANTES secretion, evaluated by ELISA and cytometric bead array (CBA). Results: Patients with AD have a higher frequency of eosinophils (LIN1- CCR3+), related to disease severity. Moreover, the frequency of CD62L (L-selectin) and CD23 (low-affinity receptor for IgE) in (LIN1- CCR3+) eosinophils was reduced in individuals with AD. CD69 and CD38 (early and late activation receptors) did not show significant difference in the studied groups. Serum levels of MMPs and of TIMP-1 and TIMP-2 were similar in healthy controls and AD patients. When analyzing secretion of MMPs and TIMPs by purified eosinophils from AD individuals, we detected a decrease in baseline levels of TIMP-1, TIMP-2, and reduced RANTES-mediated chemotaxis. Conclusions: Eosinophils in AD exhibit an activation profile of acute phase, with enhanced CCR3 expression, high potential for migration due to reduced expression of CD62, defective activation mechanisms via CD23, altered tissue remodeling process mediated by TIMP-1 and TIMP-2 and reduced RANTES-mediated chemotaxis