As células-tronco mesenquimais (MSCs) são células multipotentes que tem o potencial de se diferenciarem em várias linhagens celulares in vitro e in vivo. Estas são encontradas em nichos específicos em muitos órgãos e tecidos adultos, tais como medula óssea, tecido adiposo, músculo, dente, cordão umbilical, pele, cartilagem articular, sendo facilmente isoladas, expandidas e com alta capacidade proliferativa in vitro. Assim, estas características têm despertado grande interesse na sua utilização como uma potencial fonte de células para o reparo e regeneração tecidual de diversos órgãos e tecidos. Pouco se conhece sobre as moléculas que são secretadas pelas MSCs para a matriz extracelular (MEC) e que estão na interface célula-matriz e estão presentes em vias de transdução de sinais intracelulares. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil de expressão gênica de enzimas que remodelam a MEC (metaloproteinases de matriz MMPs: 15 membros) e seus inibidores (inibidores teciduais das metaloproteinases de matriz TIMPs: 4 membros e RECK) e proteína da membrana plasmática (Caveolina-1) durante a diferenciação osteogenica in vitro a partir de células-tronco mesenquimais da polpa dentária humana (DPSCs). Para tanto, utilizamos polpas dentárias humanas provenientes de terceiros molares de indivíduos adultos (18-32 anos n=3) e as DPSCs isoladas foram imunofenotipadas por citometria de fluxo, avaliada a taxa de proliferação, induzidas as diferenciações osteogênica (1, 7, 14, 21 e 28 dias) e adipogênica (28 dias) e os transcritos avaliados por PCR em tempo real. Estas células foram positivas para o marcadores CD29, CD105, STRO-1, CD44, CD90 negativas os marcadores para CD31, CD45, CD34 e CD14 e são capazes de se diferenciarem em osteoblastos e adipócitos. Verificamos que as MMP-2, MMP-3, MMP-13, MMP-14, MMP-25, TIMP-3, TIMP-4 e Caveolina-1 foram diferencialmente expressas durante a diferenciação osteogênica, sendo reguladas positivamente apenas no período de 28 dias pós indução e a TIMP-1 regulada positivamente desde o primeiro dia de indução. A MMP-11 e MMP-16 não foram detectadas nas DPSCs e nem durante a diferenciação osteogênica. Desta forma, concluímos que MMPs encontradas bem como a Caveolina-1 e as TIMP-3 e TIMP-4 podem estar participando dos dos eventos de diferenciação óssea em DPSCs, a TIMP-1 pode estar participando de eventos biológicos relacionados as propriedades do estado indiferenciado das DPSCs e da diferenciação óssea e que as MMP-11 e MMP-16 não são expressas pelas DPSCs e também não estão envolvidas na diferenciação osteogênica. / Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent cells that have the potential to differentiate into various cell lineages in vitro and in vivo. These are found in specific niches in many adult organs and tissues, such as bone marrow, adipose tissue, muscle, tooth, umbilical cord, skin, cartilage, being easily isolated, expanded and high proliferative capacity in vitro. Thereby, these features have attracted great interest in its use as a potential source of cells for tissue repair and regeneration of various organs and tissues. Little is known about the molecules secreted by MSCs into the extracellular matrix (ECM), present at cell-matrix interface and present on intracellular signal transduction. Thus, the aim of this study was to evaluate gene expression profile of ECM remodeling enzymes (matrix metalloproteinases MMPs: 15 members) and their inhibitors (tissue inhibitors of matrix metalloproteinases TIMPs: 4 members and RECK) and plasma membrane proteins (Caveolin-1) that participate in signaling pathways during osteogenic differentiation in vitro from human dental pulp stem cells (DPSCs). Normal human impacted third molars were collected from adults (18-32 years-old n=3) and DPSCs isolated were immunophenotyping by flow cytometry, evaluated the proliferation ratio, induced to osteogenic (1, 7, 14, 21 and 28-days) and adipogenic differentiation (28-days) and the transcript levels evaluated by Real Time PCR. These cells are positive for CD29, CD105, STRO -1, CD44, and CD90 markers and negative for CD31, CD45, CD34, and CD14 markers and are capable of differentiating into osteoblasts and adipocytes. We found that MMP- 2, MMP -3, MMP -13, MMP -14, MMP -25, TIMP-3, TIMP-4 and Caveolin-1 were differentially expressed during osteogenic differentiation, being upregulated only at 28 days post-induction and TIMP-1 upregulated from the first day of induction. MMP-11 and MMP-16 were not detected in DPSCs neither during differentiation. Thus, we conclude that MMPs, Caveolin-1 found as well as TIMP-3 and TIMP-4 may be participating in the event of bone differentiation in DPSCs, TIMP-1 may participate in biological events related to the properties of the undifferentiated state DPSCs and osteogenic differentiation, MMP-11 and MMP-16 are not also expressed by DPSCs and are not involved in osteogenic differentiation.

Perdas ósseas são um problema de saúde pública em todo o mundo e não existem substitutos ósseos ideais. A bioengenharia óssea vem como uma nova alternativa terapêutica e é baseada em células, biomateriais e moléculas sinalizadoras. As células-tronco mesenquimais tornaram-se muito atraentes devido ao seu potencial osteogênico. Assim, é necessário o conhecimento do perfil das moléculas secretadas e dos mecanismos que as controlam tanto no estado indiferenciado como durante a osteogênese. Desta forma, nosso objetivo foi avaliar o perfil de expressão das metaloproteinases de matriz (MMPs) e seus inibidores (TIMPs e RECK) bem como sua função durante a indução da osteogênese in vitro a partir de células-tronco da polpa dentária humana (DPSCs). Algumas MMPs, principalmente, MMP-2 e MT-MMPs bem como seus inibidores, são expressos em DPSCs indiferenciadas. Durante a osteogênese, os níveis de transcritos foram modulados positivamente em relação as DPSCs indiferenciadas e os níveis protéicos das MMPs -2 e -14 estão mais elevados e relacionados a fase de mineralização. Desta forma, sugerimos que as MMPs/TIMPs/RECK desempenham funções na manutenção do estado indiferenciado das DPSCs e podem ser importantes para a osteogênese bem como a mineralização in vitro. / Bone loss is a major public health problem throughout the world and are not ideal bone substitute. Bone bioengineering comes as a new therapeutic approach and is based on cells, biomaterials and signaling molecules. Mesenchymal stem cells have become very attractive due to their osteogenic potential. Thus, knowledge of the profile of secreted molecules and mechanisms that control both undifferentiated state and during osteogenesis is required. Thus, our objective was to evaluate the expression profile of matrix metalloproteinases (MMPs) and their inhibitors (TIMPs and RECK) and its function during induction of osteogenesis in vitro from human dental pulp stem cells (DPSCs). Some MMPs, especially MMP-2 and MT-MMPs and their inhibitors, are expressed in undifferentiated DPSCs. During osteogenesis, the levels of transcripts were positively modulated in relation undifferentiated DPSCs and protein levels of MMP -2 and -14 are higher and related to mineralization phase. Therefore, we suggest that MMPs/TIMPs/RECK may play role in the maintenance of the undifferentiated state of DPSCs and may be important for osteogenesis and mineralization in vitro.

As células-tronco mesenquimais (MSCs) são células multipotentes que tem o potencial de se diferenciarem em várias linhagens celulares in vitro e in vivo. Estas são encontradas em nichos específicos em muitos órgãos e tecidos adultos, tais como medula óssea, tecido adiposo, músculo, dente, cordão umbilical, pele, cartilagem articular, sendo facilmente isoladas, expandidas e com alta capacidade proliferativa in vitro. Assim, estas características têm despertado grande interesse na sua utilização como uma potencial fonte de células para o reparo e regeneração tecidual de diversos órgãos e tecidos. Pouco se conhece sobre as moléculas que são secretadas pelas MSCs para a matriz extracelular (MEC) e que estão na interface célula-matriz e estão presentes em vias de transdução de sinais intracelulares. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil de expressão gênica de enzimas que remodelam a MEC (metaloproteinases de matriz MMPs: 15 membros) e seus inibidores (inibidores teciduais das metaloproteinases de matriz TIMPs: 4 membros e RECK) e proteína da membrana plasmática (Caveolina-1) durante a diferenciação osteogenica in vitro a partir de células-tronco mesenquimais da polpa dentária humana (DPSCs). Para tanto, utilizamos polpas dentárias humanas provenientes de terceiros molares de indivíduos adultos (18-32 anos n=3) e as DPSCs isoladas foram imunofenotipadas por citometria de fluxo, avaliada a taxa de proliferação, induzidas as diferenciações osteogênica (1, 7, 14, 21 e 28 dias) e adipogênica (28 dias) e os transcritos avaliados por PCR em tempo real. Estas células foram positivas para o marcadores CD29, CD105, STRO-1, CD44, CD90 negativas os marcadores para CD31, CD45, CD34 e CD14 e são capazes de se diferenciarem em osteoblastos e adipócitos. Verificamos que as MMP-2, MMP-3, MMP-13, MMP-14, MMP-25, TIMP-3, TIMP-4 e Caveolina-1 foram diferencialmente expressas durante a diferenciação osteogênica, sendo reguladas positivamente apenas no período de 28 dias pós indução e a TIMP-1 regulada positivamente desde o primeiro dia de indução. A MMP-11 e MMP-16 não foram detectadas nas DPSCs e nem durante a diferenciação osteogênica. Desta forma, concluímos que MMPs encontradas bem como a Caveolina-1 e as TIMP-3 e TIMP-4 podem estar participando dos dos eventos de diferenciação óssea em DPSCs, a TIMP-1 pode estar participando de eventos biológicos relacionados as propriedades do estado indiferenciado das DPSCs e da diferenciação óssea e que as MMP-11 e MMP-16 não são expressas pelas DPSCs e também não estão envolvidas na diferenciação osteogênica. / Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent cells that have the potential to differentiate into various cell lineages in vitro and in vivo. These are found in specific niches in many adult organs and tissues, such as bone marrow, adipose tissue, muscle, tooth, umbilical cord, skin, cartilage, being easily isolated, expanded and high proliferative capacity in vitro. Thereby, these features have attracted great interest in its use as a potential source of cells for tissue repair and regeneration of various organs and tissues. Little is known about the molecules secreted by MSCs into the extracellular matrix (ECM), present at cell-matrix interface and present on intracellular signal transduction. Thus, the aim of this study was to evaluate gene expression profile of ECM remodeling enzymes (matrix metalloproteinases MMPs: 15 members) and their inhibitors (tissue inhibitors of matrix metalloproteinases TIMPs: 4 members and RECK) and plasma membrane proteins (Caveolin-1) that participate in signaling pathways during osteogenic differentiation in vitro from human dental pulp stem cells (DPSCs). Normal human impacted third molars were collected from adults (18-32 years-old n=3) and DPSCs isolated were immunophenotyping by flow cytometry, evaluated the proliferation ratio, induced to osteogenic (1, 7, 14, 21 and 28-days) and adipogenic differentiation (28-days) and the transcript levels evaluated by Real Time PCR. These cells are positive for CD29, CD105, STRO -1, CD44, and CD90 markers and negative for CD31, CD45, CD34, and CD14 markers and are capable of differentiating into osteoblasts and adipocytes. We found that MMP- 2, MMP -3, MMP -13, MMP -14, MMP -25, TIMP-3, TIMP-4 and Caveolin-1 were differentially expressed during osteogenic differentiation, being upregulated only at 28 days post-induction and TIMP-1 upregulated from the first day of induction. MMP-11 and MMP-16 were not detected in DPSCs neither during differentiation. Thus, we conclude that MMPs, Caveolin-1 found as well as TIMP-3 and TIMP-4 may be participating in the event of bone differentiation in DPSCs, TIMP-1 may participate in biological events related to the properties of the undifferentiated state DPSCs and osteogenic differentiation, MMP-11 and MMP-16 are not also expressed by DPSCs and are not involved in osteogenic differentiation.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:32:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ValeriaSF_TESE.pdf: 1554906 bytes, checksum: 59273626aa3c7c32d790e22ae6dd68d4 (MD5) Previous issue date: 2011-02-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / The balance between the expression of matrix metalloproteinases (MMPs) and their tissue inhibitors (TIMPs) has been related to various physiological and pathological processes, including salivary gland morphogenesis and tumor invasion and metastasis processes. Pleomorphic adenoma (PA) and adenoid cystic carcinoma (ACC) respectively represent benign and malignant neoplasias of salivary glands. Although they share the same cell origin, they present distinct biological behavior. The aim of this study was to compare the immunohistochemical expression of MMPs -2, -7, -9 and -26, and of TIMPs -1 and -2, in cases of PA and ACC of minor salivary glands. Twenty cases of PA and twenty cases of ACC were assessed according to the presence, intensity and location of MMPs and TIMPs in the tumor parenchyma. Most of the PAs and ACCs presented a high expression of MMP -2, -7, -9 and -26 and of TIMP -1 and -2, predominantly located in tumor cells. There was no significant difference in the expression of MMPs -2 (p=0.359), -7 (p=0.081) and -26 (p=0.553), as well as of TIMPs -1 (p=0.657) and -2 (p=0.248), between the parenchyma of PAs and ACCs. However, MMP-9 showed a significant difference of expression between the two tumors, with the ACC showing more intense marking for this gelatinase (p=0.041). The strong expression of MMP-9 observed in the parenchyma suggests that this gelatinase may play an important role in the biological behavior of these tumors. On the other hand, although there was no significant difference between the marking of MMP -2, 7 and 26 in the studied tumors, the data, when analyzed as a whole, suggest that these proteases may take part in the process of tissue remodeling in both tumors, but do not present a direct relation with the pattern of aggressiveness of ACC. Nonetheless, matrilisins may indirectly influence the behavior of this tumor due to their capacity of activating MMP-9, strongly expressed in the parenchyma of ACC / O balan?o entre a express?o das metaloproteinases da matriz (MMPs) e seus inibidores teciduais (TIMPs) tem sido relacionado a v?rios processos fisiol?gicos e patol?gicos, incluindo a morfog?nese de gl?ndulas salivares e os processos de invas?o e met?stase tumoral. O adenoma pleom?rfico (AP) e o carcinoma aden?ide c?stico (CAC) representam, respectivamente, neoplasias benignas e malignas de gl?ndulas salivares que, embora compartilhem a mesma origem celular, apresentam comportamentos biol?gicos distintos. O prop?sito deste estudo foi comparar a express?o imuno-histoqu?mica das MMPs -2, -7, -9 e - 26 e dos TIMPs -1 e -2 em casos de AP e CAC de gl?ndulas salivares menores. Vinte casos de AP e vinte casos de CAC foram avaliados quanto ? presen?a, intensidade e localiza??o das MMPs e TIMPs no par?nquima tumoral. A maioria dos APs e CACs apresentaram alta express?o das MMPs e dos TIMPs, predominantemente localizada nas c?lulas tumorais. N?o houve diferen?a estatisticamente significativa na express?o das MMPs -2 (p=0,359), -7 (p=0,081) e -26 (p=0,553), bem como dos TIMPs -1 (p=0,657) e -2 (p=0,248), entre o par?nquima dos APs e CACs. A MMP-9 demonstrou uma diferen?a significativa de express?o entre os dois tumores, apresentando o CAC uma marca??o mais intensa para esta gelatinase (p=0,041). A forte express?o da MMP-9 observada no par?nquima dos CACs sugere que esta gelatinase possa desempenhar um papel importante no comportamento biol?gico destes tumores. Por outro lado, apesar de n?o ocorrer uma diferen?a significativa entre as m?dias das MMPs -2, 7 e 26 nos tumores estudados, os dados quando analisados em conjunto sugerem que estas proteases podem estar participando de processos de remodela??o tecidual em ambos os tumores, mas n?o apresentam uma rela??o direta com o padr?o de agressividade do CAC. Entretanto, as matrilisinas poderiam influenciar indiretamente o comportamento deste tumor devido a sua capacidade de ativar a MMP-9, fortemente expressa no par?nquima destes tumores

Matrix remodeling could be an important mode of action of multipotent mesenchymal stromal cells (MSC) in extracellular matrix (ECM) disease, but knowledge is limited in this respect. As MSC are well-known to adapt their behavior to their environment, we aimed to investigate if their mode of action would change in response to healthy versus pathologically altered ECM. Human MSC-derived ECM was produced under different culture conditions, including standard culture, culture on Matrigel-coated dishes, and stimulation with the pro-fibrotic transforming growth factor-1 (TGF1). The MSC-ECM was decellularized, characterized by histochemistry, and used as MSC culture substrate reflecting different ECM conditions. MSC were cultured on the different ECM substrates or in control conditions for 2 days. Culture on ECM increased the presence of surface molecules with ECM receptor function in the MSC, demonstrating an interaction between MSC and ECM. In MSC cultured on Matrigel-ECM and TGF1-ECM, which displayed a fibrosis-like morphology, gene expression of collagens and decorin, as well as total matrix metalloproteinase (MMP) activity in the supernatant were decreased as compared with control conditions. These results demonstrated that MSC adapt to their ECM environment, which may include pathological adaptations that could compromise therapeutic efficacy.

A radioterapia é um dos principais tratamentos para pacientes com câncer de cabeça e pescoço e a cárie relacionada à radioterapia é um de seus efeitos colaterais, apresentando-se com alta taxa de ocorrência. Além disso, falhas precoces em restaurações realizadas em dentes de pacientes irradiados em cabeça e pescoço também são observadas. Como a degradação enzimática do colágeno ocorre principalmente através da atividade das metaloproteinases de matriz e das cisteínacatepsinas, o objetivo deste estudo foi avaliar a atividade enzimática da dentina hígida e restaurada de dentes submetidos à radioterapia in vivo e in vitro. Os dentes irradiados in vivo foram extraídos de pacientes submetidos à radioterapia com uma dose cumulativa que variou de 40 a 70 Gy. As extrações foram feitas de 3 a 12 meses após a RT devido a doenças periodontais. Para os dentes irradiados in vitro, as amostras foram submersas em água destilada com uma irradiação total e única de 70 Gy. O estudo foi dividido em 2 fases independentes: Fase 1: Dentina Não-Restaurada (avaliação de amostras não irradiadas, dentes submetidos à radioterapia in vitro e in situ). Fase 2: Dentina Restaurada (avaliação de amostras não irradiadas e dentes submetidos à radioterapia in vitro) com 3 adesivos. Para o ensaio de zimografia (fase 1), os grupos irradiados in vitro, in vivo e não irradiados foram divididos em dois subgrupos: 1) mineralizado; 2) desmineralizado com ácido fosfórico10%. As proteínas dentinárias foram extraídas e submetidas à análise zimográfica de acordo com Mazzoni et al., 2007. Para a zimografia in situ (fase 2), os espécimes foram divididos em 6 grupos, de acordo com a forma de irradiação (não irradiada e irradiada in vitro) e o sistema adesivo testado (Adper Single Bond, 3M ESPE, ClearFil SE Bond, Kuraray ou Scotchbond Universal, 3M ESPE). Uma gelatina conjugada com fluoresceína autoextinguível foi usada como substrato para as proteases endógenas. A atividade enzimática gelatinolítica foi observada em microscópio confocal (Zeiss LSM 780-NLO, Carl Zeiss Microscopy GmbH). Para a análise da microscopia eletrônica de varredura, amostras restauradas e hígidas foram submetidas a técnica de pré-imunomarcação usando anticorpo monoclonal primário anti-CT-K e anti-CT-B, e anticorpo secundário conjugado com nano-partículas de ouro de 15nm. Um aumento na atividade gelatinolítica pós radioterapia para ambos os substratos (dentina restaurada e hígida) pôde ser observada. Houve uma maior expressão das formas ativas das MMP-2 e MMP-9 pós radioterapia para ambas as formas de radioterapia em dentina não restaurada. Nenhuma diferença na imuno-marcação para CT-K e CT-B entre os grupos irradiados e não irradiados foi observada. Adesivos autocondicionantes apresentaram uma imuno-marcação mais fraca para CT-K quando comparado ao adesivo de condicionamento total. Com isso, pode-se concluir que a radiação ionizante foi capaz de influenciar a atividade enzimática das proteínas endógenas da dentina restaurada e não restaurada. Palavras-chave: Radioterapia, metaloproteinases de matriz, MMP, cisteinocatepsinas, CT, Cárie relacionada à radiação. / Radiotherapy is one of the main treatments for head and neck cancer patients. Radiation-related caries and early restorations failures are side-effects with high rate of recurrence. As enzymatic degradation of collagen occurs mainly through the activity of matrix metalloproteinases (MMPs) and cysteine-cathepsins (CTs), the objective of this study was to evaluate the influence of in vivo and in vitro radiotherapy on endogenous proteases of the restored and non-restored dentin. In vivo irradiated teeth were extracted from patients who underwent clinical radiation protocols with a cumulative dose of radiation that ranged from 40 to 70 Gy. Extractions were performed 3 to 12 months after radiotherapy conclusion due to periodontal reasons. For the in vitro irradiated teeth, samples were submerged in distilled water with a total and single irradiation dose of 70 Gy. For gelatin zymography assay, irradiated in vivo, in vitro and non-irradiated groups were divided in two subgroups: 1) mineralized or 2) demineralized with 10% phosphoric acid. Dentin proteins were extracted and submitted to zymographic analysis in accordance to Mazzoni et al., 2007. For in situ zymography, specimens were divided into 6 groups, according to its irradiation form (non-irradiated and irradiated in vitro) and the adhesive system tested (Adper Single Bond, 3M ESPE, ClearFil SE Bond, Kuraray or Scotchbond Universal, 3M ESPE) using a self-quenched fluorescein-conjugated gelatin as the endogenous proteases substrate. The endogenous gelatinolytic enzyme activity was assessed by confocal laser-scanning microscope (Zeiss LSM 780-NLO, Carl Zeiss Microscopy GmbH). For SEM analysis of the HL, restored specimens were submitted to a pre-embedding immunolabeling technique using primary monoclonal antibody anti-CT-K and anti-CTB and a secondary antibody conjugated with 15nm gold nanoparticles. Radiotherapy groups presented increased gelatinolytic activity on both restored and non-restored dentin. MMP-2 and MMP-9 active form presented higher expression on both irradiated groups for non-restored dentin. Labeling for CT-K and CT-B did not differ from irradiated to non-irradiated groups. SE adhesives presenter weaker labeling for CT-K when compared to the E&R adhesive. Herewith, ionizing radiation may be able to influence the enzymatic activity of the endogenous proteins of restored and unrestored dentin

A periodontite apical é um processo inflamatório que ocorre na região do periápice, em decorrência de contaminação microbiana do sistema de canais que se origina a partir da necrose pulpar ou canais radiculares tratados inadequadamente. Estudos recentes avaliando os fatores genéticos envolvidos no desenvolvimento da periodontite apical crônica (PAC) relatam forte relação com uma predisposição genética do indivíduo e determinam que variantes polimórficas em certos genes envolvidos na remodelação da matriz óssea poderiam contribuir na persistência desta. As metaloproteinases da matriz (MMPs) são enzimas que estão fortemente associadas com os níveis de inflamação e desempenham um papel importante na remodelação e reabsorção óssea, e níveis elevados de MMPs têm relação com a deficiência de reparo da lesão induzindo a PAC. Além disso, as MMPs também participam do complexo desenvolvimento raniofacial o que faz com que também sejam consideradas para a ocorrência de malformações faciais. O objetivo deste trabalho foi determinar se variantes polimórficas nos genes MMP-2 e MMP-3, envolvidos na resposta inflamatória estão associados a permanência de periodontite apical persistente após o tratamento endodôntico em indivíduos com fissura labiopalatina. Foram selecionados para este estudo 180 indivíduos divididos em 3 grupos: GI: 34 indivíduos com fissura labiopalatina, não sindrômicos, com história de PAC relacionada ao tratamento endodôntico; GII: 45 indivíduos sem fissura labiopalatina, não sindrômicos com história de PAC e GIII: grupo controle composto por 101 indivíduos sem fissura e sem relato de PAC. Como critério de inclusão para o diagnóstico de PAC foram considerados os escores 4 e 5 do índice PAI (PeriApical Index) analisado em radiografias periapicais de controle de um ano ou mais após o tratamento dos dentes envolvidos. Foram selecionadas para a genotipagem 3 variantes polimórficas no gene MMP-2 (rs243865, rs2285053 e rs2287074) e 2 no gene MMP-3 (rs679620 e rs522616). Os resultados foram analisados usando o software SDS 1.7 (Applied Biosystems) e os dados foram tabulados no programa Excel 8.0. As comparações entre as frequências dos genótipos e alelos foram realizadas através do teste do qui-quadrado (2) e Odds Ratio com intervalo de confiança de 95% (IC). Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Das variantes polimórficas pesquisadas neste grupo populacional brasileiro, foi encontrada associação positiva do rs679620 no gene MMP-3 com a fissura labiopalatina e PAC somente quando comparado com o grupo com PAC e sem fissura. Sendo encontrada associação positiva também do rs522616 no gene MMP-3 com PAC e sem fissura, somente no comparativo com o grupo controle. Não foi encontrada nenhuma associação positiva das variantes no gene MMP-2 (rs243865, rs2285053 e rs2287074) nem com PAC nem com fissura labiopalatina. Dessa forma, são necessários estudos semelhantes analisando outras variantes polimórficas em outros genes envolvidos na cascata de sinalização da inflamação e na embriologia craniofacial, com amostras maiores, para esclarecer o papel do fator genético tanto para a periodontite apical crônica quanto para a fissura / Apical Periodontitis is an inflammatory process on periapical tissues, due to a microbial contamination of the canals system, arising from pulp necrosis or failed root canal treatment. Recent studies evaluating genetic factors involved on chronic apical periodontitis (CAP) show real relation with a genetic predisposition in individuals and determine whether polymorphic variability in some genes involved on bone matrix remodeling could contribute on the disease persistence. Matrix metalloproteinases (MMPs) are enzymes really associated with inflammation levels and take an important part of bone remodeling and resorption and high levels of MMPs have a relation with the lesion repair deficiency inducing CAP. Besides that, MMPs also participate on craniofacial development; being considered to the occurrence of some facial anomalies. The aim of this study was to determine whether polymorphic variability on genes MMP-2 e MMP-3 involved on inflammatory response is associated with the permanency of persistant apical periodontitis after endodontic therapy on individuals with cleft lip and/or palate. One hundred and eighty individuals were selected to this study, which was divided in 3 groups: GI: 34 individuals with cleft lip and/or palate, nonsyndromic, with CAP related to endodontic treatment; GII: 45 individuals without cleft lip and/or palate, nonsyndromic, with CAP, GIII: control group composed by 101 individuals without cleft and without report of chronic apical periodontitis. As inclusion criteria to CAP diagnosis were considered 4 and 5 of PAI score (PeriApical Index) analyzed on control periapical radiographies after one year or more after treatment of the teeth involved. Were selected for genotyping 3 polymorphic variabilities on gene MMP-2 (rs243865, rs2285053 e rs2287074) and 2 on gene MMP-3 (rs679620 e rs522616) were selected to genotyping. Results were analyzed by software SDS 1.7 (Applied Biosystems) and data were tabulated on 8.0 Excel program. Comparison among genotype frequencies and alleles were performed through qui square test (2) and Odds Ratio with 95% confidence. Values of p<0,05 were considered statistically significant. From polymorphic variability evaluated on this Brazilian group, it was only observed a positive association between rs679620 on MMP-3 gene with cleft lip and palate and chronic apical periodontitis only when compared with chronic apical periodontitis group and without cleft lip and palate. A positive association was also found on rs522616 gene MMP-3 with chronic apical periodontitis and without cleft lip and palate, only when compared to control group. It was not found any positive association of the variability of MMP-2 (rs243865, rs2285053 e rs2287074) gene neither with chronic apical periodontitis nor with cleft lip and palate. Therefore, other studies are required to analyze other polymorphic variability on other genes involved on inflammation cascade of signaling and craniofacial embryology with more samples, to a better understanding of genetic influence not only on chronic apical periodontitis but also on cleft lip and/or palate

ROCHA, MG. Mediadores inflamatórios na dor pélvica crônica Identificação de possíveis marcadores séricos da doença. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2010. Introdução: Dor pélvica crônica é uma doença de elevada prevalência e fisiopatologia complexa. Os métodos diagnósticos muitas vezes são insuficientes e, em decorrência, o tratamento e seguimento das mulheres é difícil. Inúmeras doenças que se apresentam com dor crônica tem um perfil inflamatório, que ainda não foi investigado para o tema em questão. Objetivos: Quantificar os níveis de óxido nítrico (NO) e das metaloproteinases 2 (MMP-2) e 9 (MMP-9) no plasma de mulheres com dor pélvica crônica. Pacientes e métodos: Foram incluídas 64 mulheres, subdivididas em 02 grupos: dor pélvica crônica e grupo controle, com 37 pacientes no primeiro grupo e 27 pacientes no segundo grupo. As pacientes do grupo de estudo eram seguidas no Ambulatório de Dor Pélvica e Endoscopia e as pacientes do grupo controle eram seguidas no Ambulatório de Anticoncepção do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto USP. Foi realizada a mensuração clínica da dor através de uma escala unidimensional (VAS) e uma escala multidimensional (McGill). Também foram preenchidas as escalas de ansiedade e depressão (HAD). Indivíduos com qualquer evidência de processos inflamatórios, hipertensão, tabagismo ou uso de contraceptivos hormonais foram excluídos. Indivíduos tomando medicação para a dor, como analgésicos ou antiinflamatórios foram solicitados a pará-los 72 horas antes de participar do estudo. Foi coletada uma amostra sanguínea de 10 ml, no ato da consulta. Esse material foi armazenado em frasco próprio com anti-coagulante, processado imediatamente no local para separação do plasma e armazenado em freezer, a -70C para mensuração subseqüente. As concentrações de espécies relacionadas ao NO (nitrato) em líquidos foram medidas, sempre em triplicata, pelo método da quimioluminescência, que é um dos métodos mais simples, sensíveis e precisos disponíveis para medir NO. Foi utilizado um analisador de NO (Sievers Model 280 NO Analyzer - Boulder, CO, EUA), o qual permite medir NO em quantidades tão pequenas quanto 1 pmol. A atividade das MMP-2 e MMP-9 no plasma serão determinadas pelo método da zimografia, que consiste em uma eletroforese das amostras em um sistema SDS/PAGE que inclui o substrato da enzima (gelatina) no gel de separação, de modo a permitir a evidenciação e quantificação da atividade da enzima. Resultados: Os níveis plasmáticos de NO foram maiores nas pacientes com DPC quando comparadas às pacientes do grupo controle (16.8 ± 7.9 versus 12.2 ± 2.4, respectivamente (P = 0.0016). Especificamente, os níveis plasmáticos de NO foram maiores nas pacientes com DPC de origem visceral quando comparadas às pacientes com dor exclusivamente somática ou aos controles saudáveis (19.2 ± 8.9 versus 12.4 ± 1.8 versus 12.2 ± 2.4, respectivamente) (P=0.0001). Não observamos uma correlação entre os níveis plasmáticos de NO e a duração dos sintomas (em meses) (Spearman r = 0.04, 95%CI:-0.34 to 0.40, P = 0.84) ou com a intensidade dos sintomas dolorosos: EAV (Spearman r =:-0.18, 95%CI:-0.52 to 0.20, P=0.34), ou McGill (Spearman r = -0.06, 95%CI:-0.41 to 0.30, P =0.72). Com relação às MMP´s, não houve diferença estatística entre os dois grupos. Conclusões: Os níveis plasmáticos de NO encontram-se elevados em mulheres com DPC, especialmente naquelas com dor de origem visceral. Este fato pode ser considerado uma possibilidade no seguimento de pacientes com DPC, visto que pode ser usado como um marcador sérico para a doença. Já a dosagem das MMP-s não se mostrou útil como marcador plasmático para mulheres com DPC. / Background: Chronic pelvic pain is a disease of high prevalence and a complex pathophysiology. The diagnostic methods are often inadequate and, consequently, treatment and follow-up of women is quite difficult. Several diseases that present with chronic pain has an inflammatory profile, which has not yet been investigated for the topic. Aim: to quantify levels of nitric oxide (NO) and metalloproteinases 2 (MMP-2) and 9 (MMP-9) in plasma of women with chronic pelvic pain. Methods: 64 women were included in the sudy and divided into 02 groups: chronic pelvic pain and control group with 37 patients in the first group and 27 patients in the second group. Patients in the study group were followed at the Endoscopy and Pelvic Pain Unit and the control group patients were followed in the Contraception Unit of the Hospital of the Medical School of Ribeirão Preto University of São Paulo. We performed the measurement of clinical pain by a unidimensional scale (VAS) and a multidimensional scale (McGill). Anxiety and depression scales were also filled. Individuals with any evidence of inflammation, hypertension, smoking or use of hormonal contraceptives were excluded. Individuals taking medication for pain, such as painkillers or antiinflammatory drugs were asked to stop them 72 hours before entering the study. A blood sample was collected from 10 ml during the appointment. This material was stored in bottle itself with anti-coagulant (EDTA and / or heparin), processed immediately on site for plasma separation and stored in a -70 ºC freezer. The concentrations of species related to NO were measured in liquid, always in triplicate by the method of chemiluminescence, which is one of the most simple, sensitive and accurate available to measure NO. We used a NO analyzer (Sievers Model 280 NO Analyzer - Boulder, CO, USA), which allows the measurement of NO in quantities as small as 1 pmol. The activity of MMP-2 and MMP-9 in plasma was determined by the zymography method, which consists of an electrophoresis of the samples in an SDS / PAGE system, which includes the enzyme substrate (gelatin) in the gel separation, allowing the disclosure and quantification of enzyme activity. Results: Plasma NO levels were higher in CPP women than in controls (16.8 ± 7.9 versus 12.2 ± 2.4, respectively) (P=0.0016). Furthermore, plasma nitrate levels were higher in CPP women with evidence of pain of visceral origin than in CPP women with evidence of an exclusive somatic component or controls (19.2 ± 8.9 versus 12.4 ± 1.8 versus 12.2 ± 2.4, respectively) (P=0.0001). No correlation was detected between NO levels and duration of symptoms or intensity of pain. Regarding the MMP\'s, there was no statistical difference between the two groups. Conclusion: Plasma levels of NO are elevated in women with CPP, especially those with visceral pain. This fact can be considered an option in treating patients with CPP as it can be used as a serum marker for the disease. On the other hand, MMP´s did not turn out to be a good serum marker for women with CPP.

As neoplasias mieloproliferativas (NMPs) BCR-ABL1 negativas compreendem a mielofibrose primária (PMF), trombocitemia essencial (TE) e a policitemia vera (PV). A patogênese e progressão dessas NMPs não estão completamente elucidadas. As metaloproteinases de matriz (MMPs) degradam a matriz extracelular, ativando citocinas e fatores de crescimento que, por sua vez, participam da tumorigênese e angiogênese. O objetivo deste estudo foi avaliar a relação da expressão gênica das MMPs, TIMPs, HIF1-&#945; e SPARC com os marcadores angiogênicos bFGF e VEGFA em pacientes com MF e TE, considerando o status mutacional; bem como avaliar a regulação desses genes em camundongos submetidos à hipóxia, e em modelos HIF1-&#945;(-/-) e VHL(-/-). Foram incluídos 21 pacientes com MF, 21 com MF pós-TE, 6 com MF pós-PV, 23 com TE e 78 indivíduos controle. As análises realizadas foram: dosagem sérica e expressão de RNAm de MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP2 e SPARC, hemograma, determinação da proteína C reativa ultrassensível, determinação das concentrações de VEGFA e bFGF e avaliação das mutações nos genes JAK2, cMPL e CALR. A avaliação da densidade microvascular da medula óssea foi feita em 30 dos pacientes incluídos. Os pacientes com MFP, MFPTE e TE apresentaram maior expressão de MMP2, SPARC, TIMP1, TIMP2 e bFGF quando comparados aos seus controles (P<0,05), enquanto MMP9 foi mais expressa nos pacientes com MFPTE e TE (P= 0,011 e P=0,047, respectivamente). Os pacientes com TE apresentaram maior expressão de HIF1-&#945; e VEGFA em relação ao grupo controle (P<0,05). Pacientes com MF JAK2V617F positivos apresentaram maiores concentrações de MMP9, TIMP2, bFGF e VEGFA quando comparados aos pacientes portadores de mutações na CALR (P<0,05). Os pacientes com TE JAK2V617F positivos apresentaram maiores concentrações de MMP2 e TIMP2 (P=0,049 e P=0,020, respectivamente). As concentrações das proteínas estudadas não apresentaram correlação com a carga alélica de JAK2V617F e nem com a densidade microvascular da medula óssea. Células de medula óssea de camundongos submetidos à hipóxia apresentaram maior expressão de MMP2 e TIMP1 comparados aos camundongos em normóxia. Camundongos VHL(-/-) apresentaram aumento na expressão dos genes MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP2 e VEGFA. Diferentemente, embriões HIF1-&#945;(-/-) não foram considerados um bom modelo para este estudo devido ao envolvimento das MMPs na embriogênese/organogênese. Frente aos resultados encontrados, pode-se sugerir que a maior expressão de MMP2, SPARC e de bFGF estão associadas às NMPs. A mutação JAK2V617F foi associada a maiores concentrações de MMPs, TIMP2 VEGFA e bFGF. HIF1-&#945; foi mais expresso na PV e na TE, sugerindo uma possível regulação da expressão das MMPs e TIMPs nessas doenças. / Myeloproliferative neoplasms (MPNs) BCR-ABL1-negative include primary myelofibrosis (PMF), essential thrombocythemia (ET) and polycythemia vera (PV). The mechanisms underlying the pathology and disease progression in MPN are not completely elucidated. The matrix metalloproteinases (MMPs) cleave extracellular matrix, activating cytokines and growth factors that, in turn, regulate tumorigenesis and angiogenesis. The aim of this study was to evaluate the relationship of MMPs, TIMPs, HIF1-&#945 and SPARC gene expression with angiogenic markers bFGF and VEGFA in patients with MPN considering their mutational status; as well as to assess the regulation of these genes in animal models HIF1-&#945 and VHL knockouts. Twenty-one MF, 21 MF post-ET, 6 MF post-PV, 23 ET patients and 78 controls were enrolled. The analysis performed in peripheral blood were: serum and mRNA expression of MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP2 and SPARC, blood count, high-sensitivity C-reactive protein determination and VEGFA and bFGF measurements in plasma. We also evaluate mutations in JAK2, MPL and CALR. The assessment of microvascular density (MVD) in bone marrow was performed in 30 patients. Patients with MFP, MFPET and ET presented higher expression of MMP2, SPARC, TIMP1, TIMP2 and bFGF compared to their controls (P <0.05), while MMP9 expression was higher in patients with MFPET and ET (P=0.011 and P=0.047, respectively). Higher expression of HIF1-&#945; and VEGFA was found in ET patients compared to the controls (P <0.05). PMF JAK2V617F patients had higher concentrations of MMP9, TIMP2, bFGF and VEGFA compared to CALR mutated ones (P <0.05). ET patients JAK2V617F positive had higher levels of MMP2 and TIMP2 (P=0.049 and P=0.020, respectively). The JAK2V617F allele burden was not associated with MVD in the bone marrow. Bone marrow cells from mice in hypoxia condition showed higher MMP2 and TIMP1 expression compared to the control. VHL(-/-) mice exhibited increased expression of MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP2 and VEGFA. In contrast, the HIF1-&#945;(-/-) embryos were not considered an applicable model for this study due to MMPs role in embryogenesis/organogenesis. In view of these findings, we can conclude that increased expression of MMP2, SPARC and bFGF are associated with MPN. The JAK2V617F mutation was associated with higher concentrations of MMPs, TIMP2 VEGFA and bFGF. HIF1-&#945; is upregulated in PV and ET and perhaps regulate the MMPs and TIMPs expression in these diseases.

A dor é um importante sintoma que sinaliza danos teciduais ou agentes potencialmente prejudiciais ao organismo, evocando respostas sensoriais e motoras de proteção. A dor orofacial apresenta alta prevalência na sociedade atual, sendo esta condição associada a tecidos duros e moles da cabeça, face, pescoço e a estruturas intraorais. Considerando as dores orofaciais de origem músculo-esquelética, destacam-se àquelas causadas pela Disfunção Temporomandibular (DTM). A DTM apresenta etiologia multifatorial, caracterizada por quadros crônicos envolvendo a região cervical, a musculatura mastigatória e a articulação temporomandibular (ATM). Desde que a inflamação das ATMs é considerada a principal causa da dor em pacientes portadores de DTM, a busca por novas opções terapêuticas para esta disfunção envolve estudos desta articulação, abrangendo aspectos fisiológicos, morfológicos e moleculares. Considerando o processo inflamatório e os aspectos moleculares envolvidos no desenvolvimento desta condição, é possível que as enzimas proteolíticas extracelulares, destacando-se as Metaloproteinases da Matriz (MMPs), as quais estão envolvidas na reabsorção de colágeno e de outras macromoléculas, tenham participação ativa neste processo. Em particular, estudos demonstraram que as MMPs estão envolvidas na modulação da dor neuropática, bem como estão presentes no líquido sinovial de portadores de inflamação da ATM. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da administração do Adjuvant de Freund (CFA) intraarticular, bilateralmente nas ATMs de ratos, na sensibilidade mecânica e nociceptiva, bem como avaliar a expressão das MMPs, em particular da MMP-2 e MMP-9, no gânglio trigeminal, nas diferentes fases de desenvolvimento da inflamação. Os resultados mostraram que a inflamação das ATMs promoveu alodinia mecânica e hiperalgesia orofacial. Em adição, a administração de doxiciclina (inibidor inespecífico das MMPs) reduziu as alterações na sensibilidade mecânica e nociceptiva. A quantificação das MMPs no gânglio trigeminal demonstrou que o início da inflamação promove aumento da MMP-9 (1 e 3 dias), enquanto que nas fases tardias do processo inflamatório acompanha-se o aumento da expressão da MMP-2 (3, 7 e 10 dias). / Pain is an important symptom that signals tissue damage or potentially harmful agents to the body and evokes sensory and motor protection. The orofacial pain is a type of symptoms that appears in high prevalence in modern society. This painful condition is associated with hard and soft tissues of the head, face, neck and intraoral structures. Considering the pain of musculoskeletal origin, we can highlight those caused by temporomandibular dysfunction (TMD). The TMD has a multifactorial etiology, characterized primarily by chronic conditions involving the neck, the chewing muscles and temporomandibular joint (TMJ). Inflammation of the TMJ is considered the main cause of pain in patients with TMD. Thus, the search for new therapeutic options for this disorder involves studies in the TMJ region encompassing physiological, morphological and molecular aspects. Considering the inflammatory process as the main cause of pain present in TMD, it is extremely important to understand the molecular aspects involved in developing this condition. In this context, extracellular proteolytic enzymes, highlighting the metaloproteniases matrix metalloproteinases (MMPs) play major role in the resorption of collagen and other macromolecules. The proteolytic activity of these MMPs is controlled by tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs), which contribute to the maintenance of metabolic balance and structure of the extracellular matrix. Therefore, the objective of this study was to assess whether the type MMP gelatinases (MMP-2 and MMP-9) of the trigeminal ganglion participate in the development of mechanical allodynia and hyperalgesia in rats orofacial chronic inflammation bilateral TMJ. Our results demonstrated the presence of orofacial hyperalgesia, as well as mechanical allodynia in animals with temporomandibular inflammation induced by CFA and an increase in the expression and activity of gelatinases in the trigeminal ganglion of these animals. Still, there was a decrease in nociceptive orofacial hipersensitivity in animals that received a non-specific inhibitor for MMPs (doxycycline, 30mg/kg/day) for 10 days.