Spelling suggestions: "subject:"microbial transglutaminase"" "subject:"microbial transglutaminases""
11 |
Improvement of heat-induced gel properties of porcine plasmaFort Fort, Nuri 07 April 2010 (has links)
L'objectiu és millorar els gels de plasma porcí induïts per calor a pH àcid utilitzant transglutaminasa microbiana (MTGasa). El tractament millora textura i CRA dels gels a pH 5,5, però les millores no són suficients per recuperar les pèrdues degut a l'acidificació. L'estructura globular de les proteïnes dificulta l'atac enzimàtic. La reactivitat de l'enzim no millora amb l'addició de cisteïna a plasma amb MTGasa. El tractament del plasma amb MTGasa sota alta pressió (HP) millora la duresa dels gels. No obstant, la CRA només millora lleugerament. La duresa es pot incrementar mantenint les solucions de plasma pressuritzat sota refrigeració, encara que no millora la CRA. Es pot concloure que les pèrdues en la textura dels gels de plasma induïts per calor a pH àcid es poden recuperar parcialment tractant amb MTGasa, especialment afegint cisteïna o sota HP. Encara que la CRA només es veu lleugerament millorada en el segon cas. / The objective of the thesis is to improve the heat-induced gel properties of porcine blood plasma at acid pH using microbial transglutaminase (MTGase). The enzymatic treatment enhances texture and WHC of plasma gels at pH 5.5, although increases are not enough to overcome loses on gelling properties. The globular structure of proteins can make the enzymatic attack difficult. The enzyme reactivity is not enhanced when cysteine is added to plasma treated with MTGase. Treating plasma with MTGase under HP increases hardness. However, WHC is only slightly modified. These achievements on hardness can be enhanced by holding pressurised-plasma solutions at refrigeration conditions. In contrast, it has no effects on WHC. Overall, losses in texture of heat-induced plasma gels at acid pH are recovered to an important degree by treating plasma with MTGase, especially with added cysteine or under HP conditions. However, their WHC is only slightly enhanced for the later.
|
12 |
New insights into the substrate specificities of microbial transglutaminase: a biocatalytic perspectiveGundersen, Maria 12 1900 (has links)
La transglutaminase microbienne (Microbial transglutaminase : MTG) est fortement exploitée dans l’industrie textile et alimentaire afin de modifier l’apparence et la texture de divers produits. Elle catalyse la formation de liaisons iso-peptidiques entre des protéines par l’entremise d’une réaction de transfert d’acyle entre le groupement γ-carboxamide d’une glutamine provenant d’un substrat donneur d’acyle, et le groupement ε-amino d’une lysine provenant d’un substrat accepteur d’acyle. La MTG est tolérante à un large éventail de conditions réactionnelles, ce qui rend propice le développement de cette enzyme en tant que biocatalyseur. Ayant pour but le développement de la MTG en tant qu’alternative plus soutenable à la synthèse d’amides, nous avons étudié la réactivité d’une gamme de substrats donneurs et accepteurs non-naturels.
Des composés chimiquement diversifiés, de faible masse moléculaire, ont été testés en tant que substrats accepteurs alternatifs. Il fut démontré que la MTG accepte une large gamme de composés à cet effet. Nous avons démontré, pour la première fois, que des acides aminés non-ramifiés et courts, tels la glycine, peuvent servir de substrat accepteur. Les α-acides aminés estérifiés Thr, Ser, Cys et Trp, mais pas Ile, sont également réactifs. En étendant la recherche à des composés non-naturels, il fut observé qu’un cycle aromatique est bénéfique pour la réactivité, bien que les substituants réduisent l’activité. Fait notable, des amines de faible masse moléculaire, portant les groupements de forte densité électronique azidure ou alcyne, sont très réactives. La MTG catalyse donc efficacement la modification de peptides qui pourront ensuite être modifiés ou marqués par la chimie ‘click’. Ainsi, la MTG accepte une variété de substrats accepteurs naturels et non-naturels, élargissant la portée de modification des peptides contenant la glutamine.
Afin de sonder le potentiel biocatalytique de la MTG par rapport aux substrats donneurs, des analogues plus petits du peptide modèle Z-Gln-Gly furent testés; aucun n’a réagi. Nous avons toutefois démontré, pour la première fois, la faible réactivité d’esters en tant que substrats donneurs de la MTG. L’éventuelle amélioration de cette réactivité permettrait de faire de la MTG un biocatalyseur plus général pour la synthèse d’amides.
Mots clés:
Lien amide, biocatalyse, biotransformation, transglutaminase, arrimage moléculaire, criblage de substrats, ingénierie de substrats. / Microbial transglutaminase (MTG) is used extensively in the food and textile industry to alter the appearance and texture of products. MTG catalyses the formation of isopeptide linkages between proteins by an acyl transfer reaction between the γ-carboxamide group of a glutamine ‘acyl-donor’ substrate, and the ε-amino group of a lysine ‘acyl-acceptor’ substrate. MTG is tolerant to a broad range of reaction conditions and is therefore suitable for further development as a biocatalyst. Toward developing MTG as a “green” alternative for amide synthesis, we have investigated a range of non-native donor and acceptor substrates to probe the scope of MTG reactivity.
Small, chemically varied compounds were tested as alternative acyl-acceptor substrates. We observed a broad acceptor specificity. We show, for the first time, that very short-chain alkyl-based amino acids such as glycine can serve as acceptor substrates. The esterified α-amino acids Thr, Ser, Cys and Trp – but not Ile – also show reactivity. Extending the search to non-natural compounds, an aromatic ring was observed to be beneficial for reactivity, although ring substituents reduced reactivity. Overall, bonding of the amine to a less hindered carbon increases reactivity. Importantly, very small amines carrying either the electron-rich azide or the alkyne groups required for click chemistry were highly reactive as acceptor substrates, providing a ready route to minimally modified, ‘clickable’ peptides. These results demonstrate that MTG is tolerant to a variety of chemically varied natural and non-natural acceptor substrates, which broadens the scope for modification of glutamine-containing peptides.
To further probe the biocatalytic potential of MTG in terms of the donor substrate, smaller analogues of the model substrate Z-Gln-Gly were tested. We did not find product formation with substrates smaller than the model substrate. We observed, for the first time, trace esterase activity with MTG. Future improvement of this activity would render MTG a more attractive, general biocatalyst for amide bond formation.
|
13 |
Enzymatische Oligomerisierung von Lebensmittelproteinen unter Hochdruck: Reaktionsorte und funktionelle KonsequenzenSchuh, Susanne 14 May 2013 (has links) (PDF)
Untersuchungen zur Reaktion von Proteinen während einer Hochdruckbehandlung (HD) ermöglichen ein besseres Verständnis der Reaktivität und Struktur auf molekularer Ebene. In der vorliegenden Arbeit wurde die enzymatische Oligomerisierung von Hühnereiweißlysozym (HEWL) mithilfe der druckstabilen mikrobiellen Transglutaminase (mTGase) unter HD untersucht. Die resultierenden Oligomere wurden anschließend hinsichtlich ihrer strukturellen und funktionellen Eigenschaften charakterisiert. Vergleichende Untersuchungen wurden mit dem evolutionsbiologisch verwandten Protein, dem α-Lactalbumin durchgeführt. Abschließend erfolgten orientierende Studien zur nicht-enzymatischen Vernetzung von HEWL und ausgewählten Milchproteinen, bei welchen eine kovalente Verknüpfung über vergleichbare Isopeptide nachgewiesen werden konnte.
Kompakte, globuläre Proteine, wie das untersuchte HEWL stellten unter Normaldruck keine Substrate für die mTGase dar. Auch war eine enzymatische Vernetzung nach erfolgter Hochdruckbehandlung aufgrund der Reversibilität der druckinduzierten Auffaltung nicht möglich. So wurde HEWL nur bei simultaner Behandlung mit mTGase und hohem hydrostatischem Druck zu Homooligomeren vernetzt. Neben einem geeigneten Puffersystem wurden der pH-Wert, die Inkubationszeit, die Temperatur, der hydrostatische Druck, die Enzymaktivität der mTGase und die Proteinkonzentration des Lysozyms verändert. Abhängig von den Reaktionsbedingungen wurden Produkte mit stark variierenden Vernetzungsgraden erhalten, wobei eine maximale Oligomerisierung von zirka 75% aus einer 3%igen HEWL-Probe in Tris-HCl-Puffer bei pH 7,5 mit 160 U mTGase/g Protein über 30 min, 600 MPa und 40°C erreicht wurde. Zudem erfolgte eine Kategorisierung aller resultierenden Proben anhand ihres mittels Gelelektrophorese bestimmten Vernetzungsgrades in drei Untergruppen: LMW (niedrig vernetzt, 0 - 30%), MMW (mittel vernetzt, 30 - 60%) und HMW (hoch vernetzt, 60 - 100%).
In den so vernetzten Proben wurden das reaktionsspezifisch gebildete Isopeptid N ε (γ L Glutamyl)-L-Lysin (Glu_Lys) nachgewiesen und die beteiligten reaktiven Aminosäuren identifiziert. Die Bestimmung von Glu_Lys, welches für die kovalenten Verknüpfungen verantwortlich ist, erfolgte nach enzymatischer Hydrolyse am Aminosäureanalysator mit Ninhydrin-Nachsäulen-Derivatisierung. Eine erste Abschätzung des Isopeptid¬gehaltes zeigte zudem, dass es bei der Oligomerisierung sowohl zu inter- als auch intra¬molekularer Vernetzung kam. Der minimal notwendige Gehalt an Cross-Link-Aminosäuren, [CLAA]min lag zum Teil um den Faktor zwei unter dem Gehalt des quantifizierten Glu_Lys.
Anschließend konnte nach tryptischem Verdau über die RP-HPLC/ESI-TOF-MS für die gering vernetzten Proben (LMW) genau eine definierte kovalente Verknüpfungsstelle ermittelt werden. Für die MMW- und HMW-Proben wurden fünf bzw. sechs Peptidfragmente detektiert. Bei den LMW-Proben wurde Lys1 mit Gln121 vernetzt. Den höher oligomerisierten Proben konnten die Lysinreste Lys1, Lys13, Lys116 und die Glutaminreste Gln41, Gln57, Gln121 zugeordnet werden. Somit gelang eine erste strukturelle Aufklärung der Vernetzungsprodukte. Der Aufbau der Oligomere läuft demnach zuerst gerichtet und linear ab. Insbesondere bei höheren Temperaturen und Enzymaktivitäten werden jedoch ungeordnete Strukturen gebildet. Die einzelnen Vernetzungsprodukte scheinen aufgrund der Lage der reaktiven Aminosäuren im HEWL-Molekül über mehrere intermolekulare Bindungen eine variierende Struktur auszubilden. Eine Quantifizierung der einzelnen Isopeptide erfolgte nicht, orientierende MS-Untersuchungen lassen aber vermuten, dass auch hier bevorzugte Reaktionsorte existieren.
Die vernetzten Proben wurden nachfolgend über Ammoniumsulfatfällung konzentriert und mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) fraktioniert. Die Ausbeuten der GPC waren sehr gering. Eine Fraktionierung in einzelne, selektiv verknüpfte Oligomere wurde nicht erreicht. Die enzymatisch oligomerisierten Proben sowie ausgewählte GPC-Fraktionen mit höheren Oligomeren wurden hinsichtlich funktioneller und struktureller Konsequenzen untersucht. Begonnen wurde dabei mit der lytischen Enzymaktivität des HEWL gegen Zellwände des Micrococcus lysodeikticus. Eine abnehmende bzw. verbleibende Lyseaktivität korrelierte mit einer zunehmenden Oberflächen¬hydrophobität der Oligomerengemische. Beide Größen verhielten sich indirekt proportional zueinander. Während der hydrophobe Kern des Moleküls mit steigender Oligomerisierungsrate freigelegt wurde, senkte sich die Lyseaktivität bis auf null ab. Eine räumliche Deformation oder Barriere entstand mutmaßlich im oder in der Nähe des reaktiven Zentrums (Glu35 und Asp52) des Lysozyms, so dass der Enzym-Substrat-Komplex nicht mehr ausgebildet werden konnte.
Die Untersuchung der Veränderung sekundärer und tertiärer Strukturbestandteilte erfolgte mithilfe der Zirkular-Dichroismus-Spektroskopie. Gleichwohl für die Tertiärstruktur keine großen Veränderungen aufgezeigt wurden, ist für die Sekundärstruktur mit zunehmendem Vernetzungsgrad eine Abnahme der α-Helices und eine Zunahme von ungeordneten und β Faltblatt-Bereichen detektiert worden. Es konnte daher die unter Hochdruck bekannte Auffaltung des HEWL über die enzymatische Vernetzung derart stabilisiert werden, dass eine vollständige Rückfaltung nicht mehr gegeben war.
Das Fibrillierungsverhalten der oligomerisierten Proben im Sauren im Vergleich zum unbehandelten HEWL stellte eine weitere Charakterisierungsmöglichkeit dar. Die Analyse der inkubierten Proben erfolgte mithilfe dreier photometrischer Methoden (Umsetzung mit den Reagenzien 8-Anilino-1-naphtalinsulfonsäure, Kongorot oder Thioflavin T). Die fibrillierten Proben wurden zudem transmissionselektronenmikroskopisch (TEM) untersucht. Mit zunehmender Vernetzung war dabei eine abnehmende Fibrillierungsneigung zu beobachten, welche gut strukturell zu erklären ist, da die zusätzlichen, kovalenten Isopeptidbindungen die Proteinmoleküle gegen eine saure Auffaltung stabilisieren. Eine Auffaltung ist jedoch die Grundvoraussetzung für eine Assoziation und Bildung in-vitro-induzierter, amyloider Strukturen.
Ferner wurde das antimikrobielle Verhalten der Präparate gegen grampositive und -negative Mikroorganismen getestet. Unbehandeltes Lysozym zeigt grundsätzlich gegenüber grampositiven Mikroorganismen eine gute antimikrobielle Aktivität. Eingesetzt wurden der Agardiffusions- und der bakterielle Hemmtest (Trübungsassay). Hierbei zeigten alle geprüften Proben keine Wirkung gegenüber gramnegativen Bakterien. Die antimikrobielle Wirkung gegenüber den grampositiven Mikroorganismen variierte stark. Das Phänomen der erhöhten Sensibilität gegenüber ausgewählten Bakterienstämmen im niederkonzentrierten Bereich wurde für Bacillus subtilis (grampositiv) und die mittel- bzw. hochvernetzten Proben im Vergleich zu unbehandelten HEWL (je 0,00625% Probe, w/v) reproduzierbar nachgewiesen.
Auf die umfassende Charakterisierung der enzymatisch vernetzten HEWL-Proben folgten orientierende Vergleichsstudien mit dem evolutionsbiologisch verwandten α Lactalbumin (α-LA). Die enzymatische Oligomerisierung konnte für das Molkenprotein dabei im Gegensatz zum HEWL bereits unter Atmosphärendruck erzielt werden. Die Vernetzungsraten betrugen, unabhängig von den untersuchten Rahmenparametern aber abhängig vom Calciumgehalt, zirka 35% (mit Ca) bis 72% (ohne Ca). Das α-LA als Calcium-bindendes Protein wurde somit durch die Abwesenheit des Metallions derart destabilisiert, dass es für die mTGase besser umsetzbar wurde. Die im Vergleich zum Lysozym vermehrt enthaltenen potentiell reaktiven Aminosäuren (doppelt so viel Lys und Gln) trugen ebenfalls zu einer stärkeren Oligomerisierung bei.
Abschließend erfolgten Studien zu nicht-enzymatischen, vakuuminduzierten Kondensations-reaktionen. Dabei wurde trockenes HEWL im Vakuum thermisch induziert vernetzt. Die Methode ist in der Literatur als Zero-Length-Cross-Linking (ZLCL) beschrieben. Die Untersuchung der Parameter Vakuum, Temperatur, pH-Wert und Zyklenzahl erfolgte an dem globulären Protein. Dieses konnte unter nicht denaturierenden Bedingungen bis zum Di- und Trimer vernetzt werden. Weitere Milchproteinproben (ein Molkenproteinisolat und β-Casein) wurden nur exemplarisch unter Standardbedingungen untersucht. Hierbei wurde das Molkenproteinisolat deutlich besser als HEWL und das β-Casein bei 85°C über je 24 h und Einsatz von Vakuum am stärksten oligomerisiert. Die gute Umsetzung des β-Caseins ist dabei auf die fehlende Tertiär- und Sekundärstruktur zurückzuführen. Zum Teil entstanden auch Casein-Polymere, welche nicht mehr elektrophoresegängig waren. Die beteiligten Isopeptide wurden analog zu den enzymatisch vernetzten Proben über die Aminosäureanalytik nachgewiesen. Es konnte das Isopeptid N-ε-(β-Aspartyl-)Lysin (Asp_Lys) neben Lysinoalanin (LAL), aber kein Glu_Lys in HEWL nachgewiesen werden. Beide Isopeptide (Asp_Lys und Glu_Lys) sowie LAL sind dagegen im β Casein gebildet worden. Der Einfluss struktureller Gegebenheiten auf die Reaktionsfähigkeit der Proteine konnte folglich eindeutig belegt werden.
|
14 |
Enzymatische Oligomerisierung von Lebensmittelproteinen unter Hochdruck: Reaktionsorte und funktionelle KonsequenzenSchuh, Susanne 25 April 2013 (has links)
Untersuchungen zur Reaktion von Proteinen während einer Hochdruckbehandlung (HD) ermöglichen ein besseres Verständnis der Reaktivität und Struktur auf molekularer Ebene. In der vorliegenden Arbeit wurde die enzymatische Oligomerisierung von Hühnereiweißlysozym (HEWL) mithilfe der druckstabilen mikrobiellen Transglutaminase (mTGase) unter HD untersucht. Die resultierenden Oligomere wurden anschließend hinsichtlich ihrer strukturellen und funktionellen Eigenschaften charakterisiert. Vergleichende Untersuchungen wurden mit dem evolutionsbiologisch verwandten Protein, dem α-Lactalbumin durchgeführt. Abschließend erfolgten orientierende Studien zur nicht-enzymatischen Vernetzung von HEWL und ausgewählten Milchproteinen, bei welchen eine kovalente Verknüpfung über vergleichbare Isopeptide nachgewiesen werden konnte.
Kompakte, globuläre Proteine, wie das untersuchte HEWL stellten unter Normaldruck keine Substrate für die mTGase dar. Auch war eine enzymatische Vernetzung nach erfolgter Hochdruckbehandlung aufgrund der Reversibilität der druckinduzierten Auffaltung nicht möglich. So wurde HEWL nur bei simultaner Behandlung mit mTGase und hohem hydrostatischem Druck zu Homooligomeren vernetzt. Neben einem geeigneten Puffersystem wurden der pH-Wert, die Inkubationszeit, die Temperatur, der hydrostatische Druck, die Enzymaktivität der mTGase und die Proteinkonzentration des Lysozyms verändert. Abhängig von den Reaktionsbedingungen wurden Produkte mit stark variierenden Vernetzungsgraden erhalten, wobei eine maximale Oligomerisierung von zirka 75% aus einer 3%igen HEWL-Probe in Tris-HCl-Puffer bei pH 7,5 mit 160 U mTGase/g Protein über 30 min, 600 MPa und 40°C erreicht wurde. Zudem erfolgte eine Kategorisierung aller resultierenden Proben anhand ihres mittels Gelelektrophorese bestimmten Vernetzungsgrades in drei Untergruppen: LMW (niedrig vernetzt, 0 - 30%), MMW (mittel vernetzt, 30 - 60%) und HMW (hoch vernetzt, 60 - 100%).
In den so vernetzten Proben wurden das reaktionsspezifisch gebildete Isopeptid N ε (γ L Glutamyl)-L-Lysin (Glu_Lys) nachgewiesen und die beteiligten reaktiven Aminosäuren identifiziert. Die Bestimmung von Glu_Lys, welches für die kovalenten Verknüpfungen verantwortlich ist, erfolgte nach enzymatischer Hydrolyse am Aminosäureanalysator mit Ninhydrin-Nachsäulen-Derivatisierung. Eine erste Abschätzung des Isopeptid¬gehaltes zeigte zudem, dass es bei der Oligomerisierung sowohl zu inter- als auch intra¬molekularer Vernetzung kam. Der minimal notwendige Gehalt an Cross-Link-Aminosäuren, [CLAA]min lag zum Teil um den Faktor zwei unter dem Gehalt des quantifizierten Glu_Lys.
Anschließend konnte nach tryptischem Verdau über die RP-HPLC/ESI-TOF-MS für die gering vernetzten Proben (LMW) genau eine definierte kovalente Verknüpfungsstelle ermittelt werden. Für die MMW- und HMW-Proben wurden fünf bzw. sechs Peptidfragmente detektiert. Bei den LMW-Proben wurde Lys1 mit Gln121 vernetzt. Den höher oligomerisierten Proben konnten die Lysinreste Lys1, Lys13, Lys116 und die Glutaminreste Gln41, Gln57, Gln121 zugeordnet werden. Somit gelang eine erste strukturelle Aufklärung der Vernetzungsprodukte. Der Aufbau der Oligomere läuft demnach zuerst gerichtet und linear ab. Insbesondere bei höheren Temperaturen und Enzymaktivitäten werden jedoch ungeordnete Strukturen gebildet. Die einzelnen Vernetzungsprodukte scheinen aufgrund der Lage der reaktiven Aminosäuren im HEWL-Molekül über mehrere intermolekulare Bindungen eine variierende Struktur auszubilden. Eine Quantifizierung der einzelnen Isopeptide erfolgte nicht, orientierende MS-Untersuchungen lassen aber vermuten, dass auch hier bevorzugte Reaktionsorte existieren.
Die vernetzten Proben wurden nachfolgend über Ammoniumsulfatfällung konzentriert und mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) fraktioniert. Die Ausbeuten der GPC waren sehr gering. Eine Fraktionierung in einzelne, selektiv verknüpfte Oligomere wurde nicht erreicht. Die enzymatisch oligomerisierten Proben sowie ausgewählte GPC-Fraktionen mit höheren Oligomeren wurden hinsichtlich funktioneller und struktureller Konsequenzen untersucht. Begonnen wurde dabei mit der lytischen Enzymaktivität des HEWL gegen Zellwände des Micrococcus lysodeikticus. Eine abnehmende bzw. verbleibende Lyseaktivität korrelierte mit einer zunehmenden Oberflächen¬hydrophobität der Oligomerengemische. Beide Größen verhielten sich indirekt proportional zueinander. Während der hydrophobe Kern des Moleküls mit steigender Oligomerisierungsrate freigelegt wurde, senkte sich die Lyseaktivität bis auf null ab. Eine räumliche Deformation oder Barriere entstand mutmaßlich im oder in der Nähe des reaktiven Zentrums (Glu35 und Asp52) des Lysozyms, so dass der Enzym-Substrat-Komplex nicht mehr ausgebildet werden konnte.
Die Untersuchung der Veränderung sekundärer und tertiärer Strukturbestandteilte erfolgte mithilfe der Zirkular-Dichroismus-Spektroskopie. Gleichwohl für die Tertiärstruktur keine großen Veränderungen aufgezeigt wurden, ist für die Sekundärstruktur mit zunehmendem Vernetzungsgrad eine Abnahme der α-Helices und eine Zunahme von ungeordneten und β Faltblatt-Bereichen detektiert worden. Es konnte daher die unter Hochdruck bekannte Auffaltung des HEWL über die enzymatische Vernetzung derart stabilisiert werden, dass eine vollständige Rückfaltung nicht mehr gegeben war.
Das Fibrillierungsverhalten der oligomerisierten Proben im Sauren im Vergleich zum unbehandelten HEWL stellte eine weitere Charakterisierungsmöglichkeit dar. Die Analyse der inkubierten Proben erfolgte mithilfe dreier photometrischer Methoden (Umsetzung mit den Reagenzien 8-Anilino-1-naphtalinsulfonsäure, Kongorot oder Thioflavin T). Die fibrillierten Proben wurden zudem transmissionselektronenmikroskopisch (TEM) untersucht. Mit zunehmender Vernetzung war dabei eine abnehmende Fibrillierungsneigung zu beobachten, welche gut strukturell zu erklären ist, da die zusätzlichen, kovalenten Isopeptidbindungen die Proteinmoleküle gegen eine saure Auffaltung stabilisieren. Eine Auffaltung ist jedoch die Grundvoraussetzung für eine Assoziation und Bildung in-vitro-induzierter, amyloider Strukturen.
Ferner wurde das antimikrobielle Verhalten der Präparate gegen grampositive und -negative Mikroorganismen getestet. Unbehandeltes Lysozym zeigt grundsätzlich gegenüber grampositiven Mikroorganismen eine gute antimikrobielle Aktivität. Eingesetzt wurden der Agardiffusions- und der bakterielle Hemmtest (Trübungsassay). Hierbei zeigten alle geprüften Proben keine Wirkung gegenüber gramnegativen Bakterien. Die antimikrobielle Wirkung gegenüber den grampositiven Mikroorganismen variierte stark. Das Phänomen der erhöhten Sensibilität gegenüber ausgewählten Bakterienstämmen im niederkonzentrierten Bereich wurde für Bacillus subtilis (grampositiv) und die mittel- bzw. hochvernetzten Proben im Vergleich zu unbehandelten HEWL (je 0,00625% Probe, w/v) reproduzierbar nachgewiesen.
Auf die umfassende Charakterisierung der enzymatisch vernetzten HEWL-Proben folgten orientierende Vergleichsstudien mit dem evolutionsbiologisch verwandten α Lactalbumin (α-LA). Die enzymatische Oligomerisierung konnte für das Molkenprotein dabei im Gegensatz zum HEWL bereits unter Atmosphärendruck erzielt werden. Die Vernetzungsraten betrugen, unabhängig von den untersuchten Rahmenparametern aber abhängig vom Calciumgehalt, zirka 35% (mit Ca) bis 72% (ohne Ca). Das α-LA als Calcium-bindendes Protein wurde somit durch die Abwesenheit des Metallions derart destabilisiert, dass es für die mTGase besser umsetzbar wurde. Die im Vergleich zum Lysozym vermehrt enthaltenen potentiell reaktiven Aminosäuren (doppelt so viel Lys und Gln) trugen ebenfalls zu einer stärkeren Oligomerisierung bei.
Abschließend erfolgten Studien zu nicht-enzymatischen, vakuuminduzierten Kondensations-reaktionen. Dabei wurde trockenes HEWL im Vakuum thermisch induziert vernetzt. Die Methode ist in der Literatur als Zero-Length-Cross-Linking (ZLCL) beschrieben. Die Untersuchung der Parameter Vakuum, Temperatur, pH-Wert und Zyklenzahl erfolgte an dem globulären Protein. Dieses konnte unter nicht denaturierenden Bedingungen bis zum Di- und Trimer vernetzt werden. Weitere Milchproteinproben (ein Molkenproteinisolat und β-Casein) wurden nur exemplarisch unter Standardbedingungen untersucht. Hierbei wurde das Molkenproteinisolat deutlich besser als HEWL und das β-Casein bei 85°C über je 24 h und Einsatz von Vakuum am stärksten oligomerisiert. Die gute Umsetzung des β-Caseins ist dabei auf die fehlende Tertiär- und Sekundärstruktur zurückzuführen. Zum Teil entstanden auch Casein-Polymere, welche nicht mehr elektrophoresegängig waren. Die beteiligten Isopeptide wurden analog zu den enzymatisch vernetzten Proben über die Aminosäureanalytik nachgewiesen. Es konnte das Isopeptid N-ε-(β-Aspartyl-)Lysin (Asp_Lys) neben Lysinoalanin (LAL), aber kein Glu_Lys in HEWL nachgewiesen werden. Beide Isopeptide (Asp_Lys und Glu_Lys) sowie LAL sind dagegen im β Casein gebildet worden. Der Einfluss struktureller Gegebenheiten auf die Reaktionsfähigkeit der Proteine konnte folglich eindeutig belegt werden.:Abbildungsverzeichnis V
Tabellenverzeichnis VIII
Abkürzungsverzeichnis XI
1 Einleitung und Zielstellung 1
2 Theoretische Grundlagen 3
2.1 Lysozym 3
2.1.1 Wirkmechanismen des Lysozyms 4
2.1.2 Anwendungsmöglichkeiten von Lysozym 7
2.1.3 Modifizierung des Lysozyms 8
2.1.3.1 Fibrillen und amyloide Strukturen von HEWL 9
2.1.3.2 Neue biologische Funktionen durch Konformationsänderung 13
2.1.4 Evolutionäre Entwicklung und Verwandtschaft zu α-Lactalbumin 14
2.2 Die enzymatische Vernetzung 15
2.2.1 Mikrobielle Transglutaminase 15
2.2.1.1 TGase katalysierte Reaktionen und Reaktionsmechanismus 17
2.2.1.2 Analytische Aspekte 19
2.2.1.3 Einsatz in der Lebensmittelindustrie 19
2.3 Nicht-enzymatische Vernetzung 21
2.3.1 Thermisch induzierte Vernetzung 21
2.3.2 In-Vacuo Zero-Length Cross-Linking 23
2.3.3 Anwendungsmöglichkeiten nicht-enzymatisch vernetzter Proteine 23
2.4 Wirkung hoher hydrostatischer Drücke auf Proteine 24
2.4.1 Wirkung von Hochdruck auf Hühnereiweiß-Lysozym 26
2.4.2 Wirkung von Hochdruck auf die mikrobielle Transglutaminase 27
3 Experimenteller Teil 29
3.1 Chemikalien, Materialien, Geräte und Software 29
3.1.1 Chemikalien 29
3.1.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien 31
3.1.3 Untersuchungsmaterialien 33
3.1.4 Software 33
3.2 Erzeugung modifizierter Proteine 34
3.2.1 Enzymatische Vernetzung von Proteinen 34
3.2.1.1 Erzeugung von Protein-Oligomeren unter Hochdruck 34
3.2.1.2 Reinigung mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) 35
3.2.1.3 Konzentrierung durch Ammoniumsulfatfällung 35
3.2.2 Thermisches und Vakuum-induziertes Zero-length Cross-linking 36
3.3 Erzeugung von HEWL-Fibrillen 38
3.4 Isolierung von α-Lactalbumin 38
3.5 Dialyse der Proteinlösungen 39
3.6 Aktivität der Transglutaminase 39
3.7 Analytische Verfahren zur Strukturuntersuchung und Charakterisierung der Proteinproben 41
3.7.1 Restwasserbestimmung mittels Karl-Fischer-Titration 41
3.7.2 Proteinbestimmung mittels Lowry 42
3.7.3 Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 44
3.7.4 Aminosäureanalytik (ASA) 47
3.7.4.1 Saure Hydrolyse 49
3.7.4.2 Enzymatische Hydrolyse 49
3.7.5 Hochdruckflüssigchromatographie mit anschließender Massenspektroskopie (RP-HPLC/ESI-TOF-MS) 51
3.7.5.1 Probenvorbereitung - Tryptischer Verdau 51
3.7.5.2 RP-HPLC/ESI-TOF-MS-Messung 51
3.7.6 Aktivitätsbestimmung für HEWL und HEWL-haltige Proben 52
3.7.6.1 Klassische Methode - Trübungsassay 52
3.7.6.2 Modifizierte Methode der Aktivitätsermittlung mit Blue-ML 53
3.7.7 Methode zur Oberflächenhydrophobitätsermittlung 54
3.7.8 Bestimmung der Sekundär- und Tertiärstruktur mittels Zirkulardichroismus Spektroskopie (CD-Spektroskopie) 56
3.7.9 Charakterisierung der HEWL-Fibrillen 57
3.7.9.1 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure-Assay (ANS-Assay) 57
3.7.9.2 Kongorot-Assay 58
3.7.9.3 Thioflavin-T-Assay 59
3.7.9.4 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 61
3.7.10 Bestimmung der antimikrobiellen Wirksamkeit 62
3.7.10.1 Agardiffusionstest 62
3.7.10.2 Bakterieller Hemmtest 63
4 Ergebnisse und Diskussion 64
4.1 Enzymatische Vernetzung von HEWL mittels mTGase und Einfluss verschiedener Reaktionsparameter 64
4.1.1 Geeignete Puffersysteme und pH-Werte 67
4.1.2 Einfluss variierender Inkubationsdauer und unterschiedlicher Drücke 68
4.1.3 Einfluss der Lysozymkonzentration 70
4.1.4 Einfluss der mTGase-Aktivität 71
4.1.5 Temperatur 73
4.1.6 Optimierte Parameter für den höchstmöglichen Vernetzungsgrad 74
4.2 Analytik der Isopeptide 76
4.2.1 Identifizierung des N-ε-(γ-L-Glutamyl)-L-Lysin-Isopeptids (Glu_Lys) 76
4.2.2 Beurteilung einer intra- und intermolekularen Vernetzung 79
4.2.3 Lokalisierung der reaktiven Lysin- und Glutaminreste mittels HPLC/MS 80
4.2.4 Strukturvorschlag 88
4.3 Isolierung und Konzentrierung enzymatisch vernetzter Lysozym-Oligomere 89
4.3.1 Ammoniumsulfatfällung 89
4.3.2 Ergebnisse der Gelpermeationschromatographie 91
4.4 Funktionelle Charakterisierung der LMW-, MMW- und HMW-Proben des HEWL 96
4.4.1 Vergleichende Untersuchungen der verbleibenden Enzymaktivität 97
4.4.2 Beurteilung der Oberflächenhydrophobität 100
4.4.3 Veränderung der Sekundär- und Tertiärstruktur 104
4.4.4 Fibrillbildung und -eigenschaften von HEWL 109
4.4.4.1 Etablierung der Charakterisierungmethoden für HEWL-Fibrillen 110
4.4.4.2 Fibrillinduktion an HEWL-Präparaten ausgewählter Vernetzungsgrade 118
4.4.5 Antimikrobielle Wirksamkeit gegenüber grampositiven und gramnegativen Mikroorganismen 126
4.5 Vergleichende Untersuchungen an dem strukturanalogen Protein α-Lactalbumin 137
4.6 Orientierende Untersuchungen zur nicht-enzymatischen In-Vakuo-Thermo-Vernetzung von HEWL und ausgesuchten Proteinen 142
4.6.1 Einfluss verschiedener Reaktionsparameter auf die Vernetzung von HEWL 143
4.6.2 Identifizierung der gebildeten Isopeptide 145
4.6.3 Vergleich der nicht-enzymatischen und enzymatischen Vernetzung von HEWL 146
4.6.4 Vergleich der In-Vakuo-Thermo-Vernetzung an HEWL mit β-Casein und erste Untersuchungen an einem Molkenproteinisolat 149
4.7 Fazit der Untersuchungen zur enzymatischen und der nicht-enzymatischen Vernetzung verschiedener Proteine 152
5 Zusammenfassung 154
6 Literaturverzeichnis 157
Veröffentlichungen 172
Danksagung 173
Versicherung 174
|
15 |
Identification of the initial reactive sites of micellar and non‑micellar casein exposed to microbial transglutaminaseDuerasch, Anja, Konieczny, Maja, Henle, Thomas 20 March 2024 (has links)
To investigate the influence of the internal micellar structure on the course of enzymatic cross-linking especially in the initial phase of the reaction, casein micelles isolated from raw milk via ultracentrifugation were incubated with microbial transglutaminase (mTG) in comparison with non-micellar sodium caseinate. Reactive lysine and glutamine residues were identified using a label-free approach, based on the identification of isopeptides within tryptic hydrolysates by targeted HRMS as well as manual monitoring of fragmentation spectra. Identified reactive sites were furthermore weighted by tracking the formation of isopeptides over an incubation time of 15, 30, 45 and 60 min, respectively. Fifteen isopeptides formed in the early stage of mTG cross-linking of caseins were identified and further specified concerning the position of lysine and glutamine residues involved in the reaction. The results revealed lysine K176 and glutamine Q175 of β-casein as the most reactive residues, which might be located in a highly flexible region of the molecule based on different possible reaction partners identified in this study. Except for the isopeptide αₛ₁ K34–αₛ₂ Q101 in sodium caseinate (SC), all reactive sites were detected in micellar and in non-micellar casein, indicating that the initial phase of enzymatic cross-linking is not affected by micellar aggregation of caseins.
|
16 |
Enzymatisch vernetzte Milchproteine: Reaktionsorte und funktionelle KonsequenzenPartschefeld, Claudia 21 February 2012 (has links) (PDF)
In der Lebensmittelindustrie steht die Entwicklung neuer innovativer Produkte im Vordergrund. Insbesondere die Modifizierung von Proteinen durch den Einsatz des Enzyms mikrobielle Transglutaminase (mTG) bietet hier neue Ansatzpunkte. Das Enzym verknüpft die γ-Carboxamidgruppe proteingebundenen Glutamins mit der ε-Aminogruppe von Lysin unter Bildung sogenannter Isopeptidbindungen. Durch diese Reaktion erreicht man eine gezielte Veränderung funktioneller Eigenschaften der Proteine wie z.B. Gelbildung, Löslichkeit, Wasserbindevermögen, Emulgier- und Schäumungsverhalten. Im Rahmen der Arbeit wurden grundlegende Forschungen zur Aufklärung des Mechanismus der mTG-katalysierten Proteinquervernetzungsreaktion im Hinblick auf das Lebensmittel Milch durchgeführt.
Der erste Teil der Arbeit beschäftigte sich mit dem Ablauf der mTG-katalysierten Reaktion innerhalb der Caseinmicellen und dessen Effekt auf die Micellstruktur. Es zeigte sich, dass durch mTG die Caseine in der micellaren Struktur fixiert werden und der extramicellare Caseinanteil abnimmt. Hierbei wird β-Casein stärker vernetzt als αs-Casein. Infolge dieser intramicellaren Caseinquervernetzung wird die Stabilität der micellaren Struktur sowohl gegenüber destabilisierenden Reagenzien (EDTA, Ethanol, GDL), mechanischen Parametern (Hochdruck) sowie einer enzymatischen Proteolyse (Chymotrypsin, Pepsin) signifikant verbessert. Vermutlich werden die Isopeptide hierfür netzartig vorwiegend zwischen den β-Caseinen in der äußeren Micellschicht ausgebildet.
Im zweiten Teil der Arbeit stand die Identifizierung der Reaktionsorte, d.h. die an der enzymatischen Vernetzung beteiligten Gln- und Lys-Reste, im Vordergrund, um den Einfluss der Proteinstruktur auf die Spezifität der mTG zu erfassen. Bei der Bestimmung der Reaktionsorte für β-Casein konnten 5 der 21 Gln-Reste und 3 der 11 Lys-Reste als zugänglich für mTG eingestuft werden. Für β-Lactoglobulin konnten unter Normaldruck 3 der 15 Lys-Reste aber keine Gln-Reste durch das Enzym markiert werden. Unter Hochdruck bei 400 MPa wurden 4 der 9 Gln-Reste sowie zwei weitere Lys-Reste als mTG-reaktiv nachgewiesen. Die Lage dieser Reaktionsorte im Protein zeigte, dass Gln-Reste bevorzugt durch mTG modifiziert werden, welche in hydrophoben Proteinabschnitten lokalisiert sind und große hydrophobe Aminosäuren N-seitig sowie positiv geladene Aminosäuren C-seitig aufweisen. Die Lys-Reste werden nur durch mTG angegriffen, wenn diese neben Aminosäuren mit ungeladenen bzw. positiv geladenen Seitenketten lokalisiert sind, während die Nachbarschaft zu negativ geladenen Aminosäuren sowie zu Aminosäuren mit ungeladenen polaren (hydrophilen) Seitenketten die Angreifbarkeit verhindert. Weiterhin zeigte eine Bestimmung der reaktiven Gln- und Lys-Reste im β-Casein innerhalb der Caseinmicelle, dass die Zugänglichkeit für mTG durch die Micellstruktur deutlich vermindert ist. Es wird vermutet, dass in der Caseinmicelle eine Art Vorstrukturierung der β-Caseine existiert.
Abschließend wurden die Ergebnisse für einen Vorschlag eines Micellmodells herangezogen. Das im Rahmen der Arbeit vorgeschlagene Micellmodell beruht auf dem Internal Structure Modell, im speziellen auf dem „dual bonding model“ nach Horne, welches weiter charakterisiert werden konnte. So wird vermutet, dass β-Casein hauptsächlich im äußeren Micellbereich lokalisiert ist, während sich die αs-Caseine eher im Micellinneren befinden. β-Casein ist hierbei in laminaren Schichten angeordnet, wobei die hydrophilen Köpfe den größtmöglichen Abstand zueinander haben und hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den hydrophoben Schwänzen ausgebildet werden können. Wird die Micelle nun mit mTG behandelt, so kann ausgehend von diesem Modell die quervernetzte Caseinmicelle als „GiOTTO® -Modell“ dargestellt werden. Dieses ist aus einem „festen äußeren Mantel“ aus quervernetzten β-Caseinen (Isopeptidnetzwerk) und einem „weichen Kern“ aus nur gering vernetzten αs-Caseinen zusammengesetzt.
|
17 |
Stability of microbial transglutaminase and its reactions with individual caseins under atmospheric and high pressure / Stabilität der mikrobiellen Transglutaminase und ihre Reaktionen mit Caseinen unter atmosphärischem Druck und unter HochdruckMenéndez Aguirre, Orquídea de María Pastora 03 November 2006 (has links) (PDF)
Kinetic inactivation of factor XIIIa and MTG were performed in a pressure range from 0.1 to 400 MPa at 40°C within a time from 0 to 60 min in a TRIS-acetate buffer at pH 6.0. The inactivation of both enzymes at these conditions followed a first order reaction model. The high inactivation rate constant of 26.6 x10-3/min-1 for factor XIIIa at low pressure (50 MP) indicated that this enzyme is much easier to inactivate than MTG, which achieved an inactivation rate constant value of 9.7 x10-3/min at higher pressure (200 MPa). An inactivation volume of –10.17±0.5 cm3/mol confirmed that MTG is very stable under high pressure. The stability of MTG under high pressure and thermal treatment was related to its conformational changes. Enzyme inactivation was accompanied by secondary and tertiary structure changes until an irreversible protein precipitation is achieved. The tertiary structure, represented by circular dichroism spectra in the aromatic region showed differences among native and MTG samples treated under high pressure, as well as at elevated temperature. Tyrosine bands, indicating protein unfolding, increased proportionally with increasing pressure treatment above 400 MPa. Nevertheless, compared to pressure, a maximal enhancement could be observed after thermal treatment at 0.1 MPa at 80°C. That demonstrated the exposure of hydrophobic groups to the protein surface with a concomitant protein unfolding. The spectra in the far ultraviolet region showed that increasing high pressure and high temperature lead to alterations in the secondary structure. The mathematical algorithms CONTIN used to calculate secondary structures stated that the 24.5% of alpha-helix of native MTG decreased to 17.2% after a treatment at 400 MPa at 40°C for 60 min and to 6.5% after a treatment at 0.1 MPa at 80°C for 2 min. However, beta-strand structures remained relatively stable after these several treatments. MTG is arranged in a way that the active site is located between beta-strand domains that are surrounded by alpha-helices, the results of this investigation suggested that MTG activity is related with the relative stability of alpha-helix and the outstanding stability of the central beta-strand structure. The irreversible precipitated protein observed at 600 MPa at 40°C for 60 min and 0.1 MPa at 80°C for 2 min was caused principally by the formation of disulfides bonds, because high pressure and high thermal treatment lead to the exposition of the Cys64 residue towards the solvent with the subsequent ability to react with neighbouring cysteine residues. Furthermore, the reaction between protein and reducing sugars resulted in the formation of Maillard products. Furosine, as an indicator of the early stages of Maillard reaction was measured. Concentration values of 261.0 mg/g protein from samples treated at 600 MPa and 40°C and 238.5 mg/g protein from samples treated at and 0.1 MPa and 80°C for 2 min were obtained. Pentosidine a subsequent product observed in the advanced Maillard reaction was also present. Concentrations of 13.7 and 6.7 mg/g protein were obtained in the samples treated at 600 MPa and 40°C for 60 min and 0.1 MPa and 80°C for 2 min, respectively. Kinetic inactivation studies of MTG in a pressure range from 0.1 to 600 MPa at 10, 30, 40, and 50°C within a long time range from 0 to 140 h were performed in order to study MTG stability under the simultaneous effect of pressure and temperature. The inactivation kinetic showed a first and very fast step and a second very slow step suggesting irreversible inactivation behaviour. Activation energy and entropy difference decreased with increasing pressure. Thereby, the inactivation rate constants of enzyme were less temperature dependent at high pressure. The effect of pressure and temperature on MTG inactivation had a synergistic behaviour. At temperatures of 10, 30, and 40°C, increasing pressure leads to increasing inactivation rate constants. However at 50°C a tendency change occurred. Negative activation volumes of –16.2±0.5, -13.6±0.1, -11.2±0.3 cm3/mol were obtained for 10, 30 and 40°C respectively and for treatment at 50°C a positive value of about +3.0±2.0 cm3/mol in a pressure range from 0.1 to 300 and a negative volume of –11.0±0.4 cm3/mol MPa from 300 to 600 MPa were calculated. A pressure/temperature diagram from inactivation rate constants was performed to represent MTG stability. The diagram shows that in a pressure and temperature range from 0.1 to 550 MPa and 10 to 40°C, pressure induces MTG stabilization against heat denaturation. At 50°C in range from 0.1 to 300 MPa, pressure induces also enzyme stabilization again heat denaturation, but at the same temperature and above 300 MPa the enzyme was inactivated. After MTG stability analysis, reaction kinetics from MTG with individual caseins in a TRIS-acetate buffer pH 6.0 were performed under atmospheric pressure (0.1 MPa) and high pressure (400 MPa) at 40°C. The reaction was monitored by gel permeation chromatography under in three assumptions: 1) The initial velocity kinetics was obtained from a non-progressive enzymatic reactions with the products. 2) The substrate concentration exceeded enzyme concentration. 3) The sum of the individual catalytic constants of the reactive glutamine residues inside caseins are represented by a single MTG-monomeric casein complex. Enzyme reaction kinetics of MTG with the individual caseins carried out at 0.1 MPa at 40°C showed Michaelis-Menten-Henri behaviour with maximal velocities of 2.7 x 10-3, 0.8 x 10-3, and 1.3 x 10-3 mmol/L∙min and Km values of 59 x 10-3, 64 x 10-3 and 50 x 10-3 mmol/L of beta-, alpha-s1-, and whole-casein, respectively. This suggested that MTG achieved a maximal velocity with ß-casein, but had the best affinity with acid casein followed by beta- casein and finally alpha-s1-casein. Enzyme reaction kinetics of beta-casein carried out at 400 MPa and 40°C also showed a Michaelis-Menten-Henri behaviour with a similar maximal velocity of 2.6 x 10-3 mmol/L×min, but the Km value of 144 x 10-3 mmol/L showing kinetical similarity to a non-competitive inhibition. The reaction of MTG with alpha-s1-casein under high pressure did not fit in to Henri-Michaelis-Menten kinetics. Kinetic parameters showed that the affinity of MTG to beta- and alpha-s1-casein under atmospheric pressure is higher than the affinity of MTG to these caseins under high pressure. This loss of affinity can be explained by a constant number of reactive glutamine residues of casein, although the protein is unfolding at high pressure, a decrease of enzyme activity of MTG to 74% after treatment at 400 MPa at 40°C for 15 min and self association of casein under thermal and high pressure treatment. Fur technological application, the formation of acid milk gels was studied under the influence of MTG within its range of pH stability. Simultaneous addition of MTG and different concentrations of glucono-delta-lactone (Gdl) to casein solutions (5% w/v) at 40°C was analysed. Gels firmness was accessed by oscillation rheometry and gel permeation chromatography. Oscillation rheometry data showed that the time of gelation decreased with an increasing Gdl concentration added to the system, however higher concentrations of Gdl caused the formation of weaker gels. Addition of 1 g Gdl/g protein without MTG caused gelation within 5 min and a storage module value G´ of 48.9 Pa. With the simultaneous addition of 1 g Gdl/g protein and 6 U MTG/ g protein the gelation time was 4 min and the reached storage modulus was 63.7 Pa. However, the addition of 0.21 g Gdl/g protein and 6 U/g protein MTG increase the gelation time to about 69 min, but, a higher module value G´ of 111.0 Pa was achieved. Addition of high Gdl concentration caused a rapid drop of pH below 5 leading to a fast enzyme inactivation. However addition of very low Gdl concentrations was also not optimal. The simultaneous influence of MTG and Gdl concentration on the gelation time and elastic properties was evaluated by a central composite rotatable design (CCRD). The resulting quadratic storage modulus model showed that, MTG concentration had a significant influence on storage modulus G´ and, that the firmness of the gels increase in direct proportion with MTG activity with the existence of a optimum Gdl concentration, whereas the resulting linear model of the gelation time stated that Gdl concentration has a significant influence on the gelation time, while it is independent of the MTG activity. A maximal firmness of 136 ± 2 Pa was reached between a range of 0.24 - 0.27 g Gdl/g protein and 5.8 U MTG/g within a time from 49 to 59 min. Gel permeation chromatography analysis demonstrated that acid gels induced by Gdl were formed by reversible cross-linking like electrostatic interactions and hydrogen bonds as well as disulfide bonds caused by temperature treatment. Whereas, the addition of MTG proved the formation of non-reversible cross-linking like oligomers based on Ne-(g-glutamyl)- lysine, which gave more firmness and stabilization on the casein gel network.
|
18 |
Stability of microbial transglutaminase and its reactions with individual caseins under atmospheric and high pressureMenéndez Aguirre, Orquídea de María Pastora 14 September 2006 (has links)
Kinetic inactivation of factor XIIIa and MTG were performed in a pressure range from 0.1 to 400 MPa at 40°C within a time from 0 to 60 min in a TRIS-acetate buffer at pH 6.0. The inactivation of both enzymes at these conditions followed a first order reaction model. The high inactivation rate constant of 26.6 x10-3/min-1 for factor XIIIa at low pressure (50 MP) indicated that this enzyme is much easier to inactivate than MTG, which achieved an inactivation rate constant value of 9.7 x10-3/min at higher pressure (200 MPa). An inactivation volume of –10.17±0.5 cm3/mol confirmed that MTG is very stable under high pressure. The stability of MTG under high pressure and thermal treatment was related to its conformational changes. Enzyme inactivation was accompanied by secondary and tertiary structure changes until an irreversible protein precipitation is achieved. The tertiary structure, represented by circular dichroism spectra in the aromatic region showed differences among native and MTG samples treated under high pressure, as well as at elevated temperature. Tyrosine bands, indicating protein unfolding, increased proportionally with increasing pressure treatment above 400 MPa. Nevertheless, compared to pressure, a maximal enhancement could be observed after thermal treatment at 0.1 MPa at 80°C. That demonstrated the exposure of hydrophobic groups to the protein surface with a concomitant protein unfolding. The spectra in the far ultraviolet region showed that increasing high pressure and high temperature lead to alterations in the secondary structure. The mathematical algorithms CONTIN used to calculate secondary structures stated that the 24.5% of alpha-helix of native MTG decreased to 17.2% after a treatment at 400 MPa at 40°C for 60 min and to 6.5% after a treatment at 0.1 MPa at 80°C for 2 min. However, beta-strand structures remained relatively stable after these several treatments. MTG is arranged in a way that the active site is located between beta-strand domains that are surrounded by alpha-helices, the results of this investigation suggested that MTG activity is related with the relative stability of alpha-helix and the outstanding stability of the central beta-strand structure. The irreversible precipitated protein observed at 600 MPa at 40°C for 60 min and 0.1 MPa at 80°C for 2 min was caused principally by the formation of disulfides bonds, because high pressure and high thermal treatment lead to the exposition of the Cys64 residue towards the solvent with the subsequent ability to react with neighbouring cysteine residues. Furthermore, the reaction between protein and reducing sugars resulted in the formation of Maillard products. Furosine, as an indicator of the early stages of Maillard reaction was measured. Concentration values of 261.0 mg/g protein from samples treated at 600 MPa and 40°C and 238.5 mg/g protein from samples treated at and 0.1 MPa and 80°C for 2 min were obtained. Pentosidine a subsequent product observed in the advanced Maillard reaction was also present. Concentrations of 13.7 and 6.7 mg/g protein were obtained in the samples treated at 600 MPa and 40°C for 60 min and 0.1 MPa and 80°C for 2 min, respectively. Kinetic inactivation studies of MTG in a pressure range from 0.1 to 600 MPa at 10, 30, 40, and 50°C within a long time range from 0 to 140 h were performed in order to study MTG stability under the simultaneous effect of pressure and temperature. The inactivation kinetic showed a first and very fast step and a second very slow step suggesting irreversible inactivation behaviour. Activation energy and entropy difference decreased with increasing pressure. Thereby, the inactivation rate constants of enzyme were less temperature dependent at high pressure. The effect of pressure and temperature on MTG inactivation had a synergistic behaviour. At temperatures of 10, 30, and 40°C, increasing pressure leads to increasing inactivation rate constants. However at 50°C a tendency change occurred. Negative activation volumes of –16.2±0.5, -13.6±0.1, -11.2±0.3 cm3/mol were obtained for 10, 30 and 40°C respectively and for treatment at 50°C a positive value of about +3.0±2.0 cm3/mol in a pressure range from 0.1 to 300 and a negative volume of –11.0±0.4 cm3/mol MPa from 300 to 600 MPa were calculated. A pressure/temperature diagram from inactivation rate constants was performed to represent MTG stability. The diagram shows that in a pressure and temperature range from 0.1 to 550 MPa and 10 to 40°C, pressure induces MTG stabilization against heat denaturation. At 50°C in range from 0.1 to 300 MPa, pressure induces also enzyme stabilization again heat denaturation, but at the same temperature and above 300 MPa the enzyme was inactivated. After MTG stability analysis, reaction kinetics from MTG with individual caseins in a TRIS-acetate buffer pH 6.0 were performed under atmospheric pressure (0.1 MPa) and high pressure (400 MPa) at 40°C. The reaction was monitored by gel permeation chromatography under in three assumptions: 1) The initial velocity kinetics was obtained from a non-progressive enzymatic reactions with the products. 2) The substrate concentration exceeded enzyme concentration. 3) The sum of the individual catalytic constants of the reactive glutamine residues inside caseins are represented by a single MTG-monomeric casein complex. Enzyme reaction kinetics of MTG with the individual caseins carried out at 0.1 MPa at 40°C showed Michaelis-Menten-Henri behaviour with maximal velocities of 2.7 x 10-3, 0.8 x 10-3, and 1.3 x 10-3 mmol/L∙min and Km values of 59 x 10-3, 64 x 10-3 and 50 x 10-3 mmol/L of beta-, alpha-s1-, and whole-casein, respectively. This suggested that MTG achieved a maximal velocity with ß-casein, but had the best affinity with acid casein followed by beta- casein and finally alpha-s1-casein. Enzyme reaction kinetics of beta-casein carried out at 400 MPa and 40°C also showed a Michaelis-Menten-Henri behaviour with a similar maximal velocity of 2.6 x 10-3 mmol/L×min, but the Km value of 144 x 10-3 mmol/L showing kinetical similarity to a non-competitive inhibition. The reaction of MTG with alpha-s1-casein under high pressure did not fit in to Henri-Michaelis-Menten kinetics. Kinetic parameters showed that the affinity of MTG to beta- and alpha-s1-casein under atmospheric pressure is higher than the affinity of MTG to these caseins under high pressure. This loss of affinity can be explained by a constant number of reactive glutamine residues of casein, although the protein is unfolding at high pressure, a decrease of enzyme activity of MTG to 74% after treatment at 400 MPa at 40°C for 15 min and self association of casein under thermal and high pressure treatment. Fur technological application, the formation of acid milk gels was studied under the influence of MTG within its range of pH stability. Simultaneous addition of MTG and different concentrations of glucono-delta-lactone (Gdl) to casein solutions (5% w/v) at 40°C was analysed. Gels firmness was accessed by oscillation rheometry and gel permeation chromatography. Oscillation rheometry data showed that the time of gelation decreased with an increasing Gdl concentration added to the system, however higher concentrations of Gdl caused the formation of weaker gels. Addition of 1 g Gdl/g protein without MTG caused gelation within 5 min and a storage module value G´ of 48.9 Pa. With the simultaneous addition of 1 g Gdl/g protein and 6 U MTG/ g protein the gelation time was 4 min and the reached storage modulus was 63.7 Pa. However, the addition of 0.21 g Gdl/g protein and 6 U/g protein MTG increase the gelation time to about 69 min, but, a higher module value G´ of 111.0 Pa was achieved. Addition of high Gdl concentration caused a rapid drop of pH below 5 leading to a fast enzyme inactivation. However addition of very low Gdl concentrations was also not optimal. The simultaneous influence of MTG and Gdl concentration on the gelation time and elastic properties was evaluated by a central composite rotatable design (CCRD). The resulting quadratic storage modulus model showed that, MTG concentration had a significant influence on storage modulus G´ and, that the firmness of the gels increase in direct proportion with MTG activity with the existence of a optimum Gdl concentration, whereas the resulting linear model of the gelation time stated that Gdl concentration has a significant influence on the gelation time, while it is independent of the MTG activity. A maximal firmness of 136 ± 2 Pa was reached between a range of 0.24 - 0.27 g Gdl/g protein and 5.8 U MTG/g within a time from 49 to 59 min. Gel permeation chromatography analysis demonstrated that acid gels induced by Gdl were formed by reversible cross-linking like electrostatic interactions and hydrogen bonds as well as disulfide bonds caused by temperature treatment. Whereas, the addition of MTG proved the formation of non-reversible cross-linking like oligomers based on Ne-(g-glutamyl)- lysine, which gave more firmness and stabilization on the casein gel network.
|
19 |
Enzymatisch vernetzte Milchproteine: Reaktionsorte und funktionelle KonsequenzenPartschefeld, Claudia 01 November 2011 (has links)
In der Lebensmittelindustrie steht die Entwicklung neuer innovativer Produkte im Vordergrund. Insbesondere die Modifizierung von Proteinen durch den Einsatz des Enzyms mikrobielle Transglutaminase (mTG) bietet hier neue Ansatzpunkte. Das Enzym verknüpft die γ-Carboxamidgruppe proteingebundenen Glutamins mit der ε-Aminogruppe von Lysin unter Bildung sogenannter Isopeptidbindungen. Durch diese Reaktion erreicht man eine gezielte Veränderung funktioneller Eigenschaften der Proteine wie z.B. Gelbildung, Löslichkeit, Wasserbindevermögen, Emulgier- und Schäumungsverhalten. Im Rahmen der Arbeit wurden grundlegende Forschungen zur Aufklärung des Mechanismus der mTG-katalysierten Proteinquervernetzungsreaktion im Hinblick auf das Lebensmittel Milch durchgeführt.
Der erste Teil der Arbeit beschäftigte sich mit dem Ablauf der mTG-katalysierten Reaktion innerhalb der Caseinmicellen und dessen Effekt auf die Micellstruktur. Es zeigte sich, dass durch mTG die Caseine in der micellaren Struktur fixiert werden und der extramicellare Caseinanteil abnimmt. Hierbei wird β-Casein stärker vernetzt als αs-Casein. Infolge dieser intramicellaren Caseinquervernetzung wird die Stabilität der micellaren Struktur sowohl gegenüber destabilisierenden Reagenzien (EDTA, Ethanol, GDL), mechanischen Parametern (Hochdruck) sowie einer enzymatischen Proteolyse (Chymotrypsin, Pepsin) signifikant verbessert. Vermutlich werden die Isopeptide hierfür netzartig vorwiegend zwischen den β-Caseinen in der äußeren Micellschicht ausgebildet.
Im zweiten Teil der Arbeit stand die Identifizierung der Reaktionsorte, d.h. die an der enzymatischen Vernetzung beteiligten Gln- und Lys-Reste, im Vordergrund, um den Einfluss der Proteinstruktur auf die Spezifität der mTG zu erfassen. Bei der Bestimmung der Reaktionsorte für β-Casein konnten 5 der 21 Gln-Reste und 3 der 11 Lys-Reste als zugänglich für mTG eingestuft werden. Für β-Lactoglobulin konnten unter Normaldruck 3 der 15 Lys-Reste aber keine Gln-Reste durch das Enzym markiert werden. Unter Hochdruck bei 400 MPa wurden 4 der 9 Gln-Reste sowie zwei weitere Lys-Reste als mTG-reaktiv nachgewiesen. Die Lage dieser Reaktionsorte im Protein zeigte, dass Gln-Reste bevorzugt durch mTG modifiziert werden, welche in hydrophoben Proteinabschnitten lokalisiert sind und große hydrophobe Aminosäuren N-seitig sowie positiv geladene Aminosäuren C-seitig aufweisen. Die Lys-Reste werden nur durch mTG angegriffen, wenn diese neben Aminosäuren mit ungeladenen bzw. positiv geladenen Seitenketten lokalisiert sind, während die Nachbarschaft zu negativ geladenen Aminosäuren sowie zu Aminosäuren mit ungeladenen polaren (hydrophilen) Seitenketten die Angreifbarkeit verhindert. Weiterhin zeigte eine Bestimmung der reaktiven Gln- und Lys-Reste im β-Casein innerhalb der Caseinmicelle, dass die Zugänglichkeit für mTG durch die Micellstruktur deutlich vermindert ist. Es wird vermutet, dass in der Caseinmicelle eine Art Vorstrukturierung der β-Caseine existiert.
Abschließend wurden die Ergebnisse für einen Vorschlag eines Micellmodells herangezogen. Das im Rahmen der Arbeit vorgeschlagene Micellmodell beruht auf dem Internal Structure Modell, im speziellen auf dem „dual bonding model“ nach Horne, welches weiter charakterisiert werden konnte. So wird vermutet, dass β-Casein hauptsächlich im äußeren Micellbereich lokalisiert ist, während sich die αs-Caseine eher im Micellinneren befinden. β-Casein ist hierbei in laminaren Schichten angeordnet, wobei die hydrophilen Köpfe den größtmöglichen Abstand zueinander haben und hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den hydrophoben Schwänzen ausgebildet werden können. Wird die Micelle nun mit mTG behandelt, so kann ausgehend von diesem Modell die quervernetzte Caseinmicelle als „GiOTTO® -Modell“ dargestellt werden. Dieses ist aus einem „festen äußeren Mantel“ aus quervernetzten β-Caseinen (Isopeptidnetzwerk) und einem „weichen Kern“ aus nur gering vernetzten αs-Caseinen zusammengesetzt.
|
Page generated in 0.0589 seconds