Orientador: Carlos Raimundo Ferreira Grosso / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-25T11:21:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AnayaFernandez_SilviaCristina_M.pdf: 2061655 bytes, checksum: 298bb14374c8c4e430d6af745191e686 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Apesar da facilidade da produção e da possibilidade de fabricação em escala industrial, as micropartículas lipídicas apresentam desvantagens como a baixa capacidade de encapsula-ção e a possibilidade de expulsão do material de recheio durante o armazenamento. Foram propostas micropartículas lipídicas contendo lipídios sólidos e líquidos como mate-riais de parede com o objetivo de minimizar a expulsão do material de recheio. Desta forma o presente trabalho teve como finalidade estudar a formação de microcápsulas lipídicas produzidas pelo processo Spray Cooling, compostas por misturas, em diferentes proporções de ácido oleico, linolênico e cera de carnaúba como matriz, lecitina de soja como surfactante e solução de glicose e glicose sólida como materiais de recheio. O objetivo foi aumentar a eficiência de encapsulação, avaliando e verificando o efeito da composição e estrutura da matriz lipídica, testando o comportamento da partícula com a inclusão de um novo compo-nente na matriz lipídica como é a cera de carnaúba. Nas micropartículas foram avaliadas a morfologia de superfície e microestrutura por microscopia eletrônica de varredura, tamanho e distribuição de partícula, quantidade de glicose superficial (não encapsulada), eficiência de encapsulação e comportamento de liberação do recheio em solução aquosa. As micro-partículas apresentaram formas esféricas com paredes rugosas, os diâmetros médios situa-ram-se numa faixa de 36 e 58 µm. Os resultados de eficiência de encapsulação nas misturas com a glicose em solução encontraram-se numa faixa de 52 a 62%, e nas misturas contendo o recheio sólido os valores de eficiência de encapsulação situaram-se numa faixa de 54 a 66%. As maiores quantidades de glicose superficial foram encontradas nas formulações nas quais foram adicionadas quantidades de recheio sólido. A liberação do recheio foi avaliada a cada 30 minutos durante 2 horas, observando-se que nos primeiros 30 minutos, as formu-lações que continham a glicose sólida apresentaram valores acima de 86% (efeito burst), enquanto que a liberação do recheio nas misturas contendo a glicose em solução apresentou valores de 22 a 72%. Ao término desse período, nestas misturas foi observado que a libera-ção de recheio ocorreu progressivamente. A utilização da matriz lipídica nas formulações parece responsável pelos resultados, considerando que a adição do lipídio liquido à cera de carnaúba foi um fator determinante na modificação da cristalização da mistura lipídica pro-porcionando uma melhoria na eficiência de encapsulação destas partículas / Abstract: The manufacturing and large scale production of micro particles is easy; however these products show some disadvantages such as poor encapsulation and deficient core material expulsion during storage. To avoid this problem the use of nanostructured lipids have been proposed with the purpose of minimizing the expulsion of core material. This work was conducted to study the formation of lipid microcapsules, produced during spray cooling, from mixtures which contained different proportions of: oleic acid and carnauba wax as matrices, soybean lecithin as a surfactant and glucose solution and solid glucose as core materials. The objective of this study was to increase the efficiency of encapsulation by assessing and verifying the effect of composition and structure of the lipid matrix. The per-formance was evaluated with the addition of a new compound, carnauba wax, in the lipid matrix. In the micro particles the following variables were assessed: superficial morphology and microstructure by electron microscopy, size and particle distribution, amount of super-ficial glucose (not encapsulated), efficiency of encapsulation and performance of releasing core material in an aqueous solution. The micro particles showed spherical shapes with rough walls, the average diameters varied from 36 and 58 µm. Results of encapsulation efficiency were from 52 - 62% for mixtures of glucose solution and from 54 - 66% for mix-tures with solid core. More superficial glucose quantities were found in formulations in which solid cores were added. Core releasing was assessed every 30 minutes during 2 hours; during the first 30 minutes, the formulations containing solid glucose showed values > 86% (burst effect) while the releasing of core material from mixtures containing glucose solution varied from 22-72% where the release increased progressively during this time. The use of a lipid matrix in the formulations may be responsible for these results because the addition of a liquid lipid (AO) to carnauba wax was a crucial factor in the crystallization modification of the lipid mixture providing reasonable encapsulation efficiency / Mestrado / Consumo e Qualidade de Alimentos / Mestra em Alimentos e Nutrição

Ce travail de thèse est une contribution au projet national AMOCOPS, financé par l’ANR. Le thème central du projet est la diffusion de lumière par des particules de formes complexes et de grandes tailles (plusieurs dizaines de µm au moins), domaine où les méthodes de simulation numérique existantes trouvent leurs limites d’applicabilité. Nous abordons le problème par le biais des effets mécaniques de la lumière, autrement dit les forces et couples créés par la pression de radiation. Etant la conséquence du transfert d’impulsion entre l’onde et la matière, ces effets sont directement liés à la diffusion de lumière. La thèse comprend une partie expérimentale –majoritaire- concernant les réponses mécaniques de particules de polystyrène de forme ellipsoïdale et d’allongement variable sous illumination par un ou deux faisceaux laser. Les cas de faisceaux faiblement focalisés (lévitation optique) et d’un faisceau très fortement focalisé (pincette optique) sont examinés successivement. Nous caractérisons différents types d’équilibre statique, certains d’entre eux non décrits auparavant, obtenus dans les deux géométries. Par ailleurs nous confirmons l’existence de réponses purement dynamiques, où la particule oscille en permanence. Trois nouveaux modes sont observés, deux dans la géométrie lévitation optique et un autre sous pincette optique. Cette étude nous permet de distinguer les oscillations dites de Simpson-Hanna dans le régime linéaire de celles non linéaires mises en évidence avant nous par Mihiretie et al..Les résultats de nos expériences sont comparés à ceux obtenus par les simulations de J.C. Loudet, sur la base de la simple optique géométrique (OG) et limitées à 2 dimensions (2d). Nous montrons que ces simulations permettent de reproduire qualitativement et comprendre physiquement la plupart des comportements observés dans nos expériences. La principale limitation de ces calculs tient à ce que l’OG ignore le caractère ondulatoire de la lumière. Pour faire mieux et aller vers des simulations fiables quantitativement, il faut développer un modèle alliant optique géométrique et optique ondulatoire. C’est la fonction du modèle VCRM (Vectorial Complex Ray Model) développé récemment par K.F. Ren en 2d. Le but du projet Amocops est de mettre au point la version 3d de la méthode et de la valider sur la base d’expériences comme celles que nous avons conduites. La deuxième partie de la thèse est consacrée à la méthode VCRM. Nous en exposons les principes, et nous présentons quelques résultats des travaux en cours avec une version intermédiaire entre 2d et 3d, dite « 2d+ ». Quelques illustrations sont proposées sur des exemples impliquant des sphères et ellipsoïdes de grandes tailles. / This work is a contribution to the “AMOCOPS” project, funded by Agence Nationale de la Recherche. AMOCOPS is dedicated to the development of new computation schemes to simulate the light scattering patterns of large complexly shaped particles. Particle sizes are of the order of several 10s of micrometres, which is at the limit, or beyond the capabilities of currently available computation techniques.Our work indirectly deals with light scattering through the corresponding mechanical effects of light. Light scattering is the source of momentum transfer between light and matter, and therefore of the forces and torques acting on the exposed particles. The majority of Part A of this thesis is about the mechanical responses of ellipsoidal polystyrene particles of varying aspect ratios, under illumination by one or two laser beams. We investigate the case of weakly focused beams (optical levitation), and that of a single large aperture beam (optical tweezers). Different types of static equilibria, some of which are new, are observed and characterized in both geometries. We confirm the existence of dynamic states, whereby the particle permanently oscillates within the laser beam(s). Three new oscillation modes are observed, two of them in the conditions of optical levitation, and another one in the optical tweezer geometry. The study allows us to make a distinction between noise-driven oscillations in the linear regime, of the type predicted by Simpson and Hanna, and nonlinear oscillations such as those evidenced prior to this work, by Mihiretie et al..Results from our experiments are compared to simulations by J.C. Loudet, using simple ray-optics (RO) in two dimensions (2D). We show that results from 2D-RO qualitatively match most of our observations, and allow us to physically understand the main mechanisms at work in the observed phenomena. The simulations cannot be quantitatively exact, due to the 2D limitation, and because RO essentially ignores the wave nature of light. In Part B of the manuscript, we present the principles of the Vectorial Complex Ray Model (VCRM), which was recently developed by K.F. Ren in 2d. The goal of AMOCOPS is to develop a full 3D version of VCRM, able to simulate light scattering by particles of any shape with a smooth surface. We explain the basics of the model, as well as the “2D+” version, which is an extension of the basic 2D-VCRM. A few illustrative examples of light scattering patterns computed with 2d+-VCRM for large-sizes spheres and ellipsoids are presented

Cette thèse s’inscrit dans le contexte du développement des laboratoires sur puce (LOC, « Lab On a Chip », permettant de réaliser plusieurs opérations nécessaires à l’analyse d’un échantillon biologique à l'intérieur d'un seul microsystème. Dans ce type de dispositif, de nombreuses étapes sont nécessaires avant d’arriver au résultat d’une analyse donnée (introduction de l'échantillon, concentration, mélange, purification, séparation, etc.). L’équipe microsystèmes du laboratoire Ampère étudie depuis plusieurs années différentes techniques de manipulation sans contact de particules, pour le tri ou de manipulation de particules individuelles dans les laboratoires sur puce, telles que la diélectrophorèse ou la magnétophorèse. Dans cette thèse, nous nous intéressons à la manipulation acoustique de micro particules. Cette technique se révèle notamment avantageuse pour la manipulation d’objets biologiques comme des bactéries, car elle permet de s’affranchir de certaines contraintes de marquage ou de changement de milieu. Notre choix s’est porté sur l’emploi des ondes acoustiques de surface (SAW, « Surface Acoustic Waves »), compatibles avec la filière PDMS très utilisée dans la communauté des LOC. Outre la possibilité de simplifier l’intégration microfluidique de la pince acoustique, la technologie SAW offre une alternative aux dispositifs à pièges acoustiques fixes existant dans la littérature en permettant un contrôle en temps réel des particules piégées. C’est ce que nous avons réalisé expérimentalement : en jouant sur le déphasage entre les signaux d’alimentation électriques des transducteurs électromécaniques, nous pouvons modifier la position des noeuds et des ventres de l’onde acoustique résultante. Ainsi, nous avons pu contrôler en temps réel la position d’une bille en latex de 3 μm ou encore d’un faisceau de bactéries E.coli. Par ailleurs, nous avons réalisé une simulation par éléments finis de la puce acoustofluidique dans son ensemble permettant une meilleure compréhension de tous les phénomènes en jeu et l’optimisation du transfert énergétique entre la source électrique et la particule manipulée. Cette simulation nous indique notamment que l’amplitude de l’onde acoustique stationnaire sur le substrat piézoélectrique varie environ d’un facteur deux en fonction du déphasage imposé entre les deux sources électriques. Cela impacte donc dans la même proportion la force acoustique résultante. Cette variation semble être validée par nos dernières expériences. / In lab-on-a-chip (LOC) technologies, many sample preparation steps are required before achieving a biological analysis on a single chip (sample introduction, concentration, mixing, purification, separation, etc.). The microsystem team of the Ampere Lab has studied for many years different contactless particle manipulation techniques, for sorting or manipulating bioparticles in LOC platforms, such as dielectrophoresis and magnetophoresis. In this thesis, we focus on acoustic manipulation of microparticles. This technique is advantageous for the manipulation of biological objects such as bacteria, because labelling and medium exchange can be avoided. We chose to work with surface acoustic waves (SAW), because this approach is consistent with the use of PDMS, widely used in microfluidics. Besides an easier microfluidic integration of the acoustic tweezers, the SAW technology provides an alternative to the existing devices with fixed acoustic traps, allowing a real time control of the trapped particles. This was experimentally achieved by playing on the phase shift between the two electrical signals driving the IDT, thereby modifying the position of nodes and antinodes of the resulting pressure wave. As a result, we could control in real time the position of a 3 μm latex bead or an E.coli bacteria alignment. We have also developed a finite-element model of the whole acoustofluidic chip allowing a better understanding of the physics and the optimization of the energy transfer between the electrical source and the trapped particle. Among different results, this model informs us that the magnitude of the acoustic radiation force varies by a factor of two with the phase shift between the electrical sources. This result seems to be validated by our last experiments.

Ce travail est consacré au rôle pléotropique des microparticules endothéliales dans la réponse et l'homéostasie vasculaire. Un modèle de sénescence réplicative a été caractérisé en utilisant des cellules endothéliales de coronaires de porc en culture primaire. Ce modèle a mis en évidence des changements drastiques du phénotype endothélial avec la production de ROS, la dépolarisation de la membrane mitochondriale et la surexpression de régulateurs clés du cycle cellulaire incluant p53, p21 et p16. La sénescence a transformé le phénotype endothélial vers un statut procoagulant indiqué par la libération de microparticules (MP). L'induction d'activité Facteur Tissulaire (FT) et une réduction drastique de l'inhibition de l'agrégation plaquettaire due à la sécrétion réduite de NO endothélial. Simultanément, une augmentation importante des protéines du système de l'angiotensine à la surface des cellules sénescentes et des MPs qu'elles émettent a été mesurée. D'autres résultats obtenus avec les MPs circulantes de patients transplantés ou atteints de syndrome coronarien suggèrent l'existence dune boucle d'amplification des effets délétères des MPs au travers de la signalisation Redox et l'altération des fonctions vasculaires résultant d'une sénescence exacerbée. En plus de ses qualités reconnues d'immunosuppresseur, la cyclosporine A (CsA) est un inhibiteur puissant de l'ouverture des pores mitochondriaux (mPTP). Certaines études ont présenté le traitement bref et contrôlé par CsA comme un moyen de limiter les dommages vasculaires de l'ischémie reperfusion.Nos données suggèrent une possible modulation de la sénescence endothéliale induite par les MPs grâce au préconditionnement avec des concentrations faibles de CsA. nos résultats suggèrent aussi que de faibles doses de Cs A peuvent avoir un effet bénéfique dans les pathologies cardiovasculaires lorsque la sénescence est exacerbée et contribue les fonctions vasculaires de l’endothélium. / This scientific work has tackled the issue of the pleitropic role mediated by endothelial microparticles function and homeostasis. A replicative model of senescence using coronary endothelial cells was set showing drastic phenotype changes characterized by ROS production, mitochondrial membrane depolarization and the up-regulation of key regulators of cell cycle arrest including p53, p21 and p16.Replicative senescence shifted the coronary endothelial phenotype toward a procoagulant status as evidenced by (i) procoagulant MP shedding (ii) enhanced tissue factor (TF) expression and (iii) a marked decrease in the endothelial NO-mediated inhibition of platelet aggregation. In parallel, a drastic up regulation of the angiotensin system could be evidenced at the surface of senescent cells or derived MP. Results obtained with MPs from patients with acute coronary artery syndrome and from grafted patients,suggested a feedback loop disseminating the deleterious effect of circulating MPs redox signaling and alteration of vascular function owing to exaggerated senescence. In addition to its well-known immunosuppressive properties, cyclosporine A (Cs A) is a potent inhibitor of the opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), and several reports have indicated that a brief and timely administration of Cs A can limit ischemia-reperfusion injuries. Our data evidenced the possible pharmacological modulation of endothelial MP-mediated senescence by cell preconditioning with low concentrations of Cs A. our data are thus suggestive of a beneficial effect of CsA in cardiovascular disorders where senescence is altering the endothelial vascular functions.

Abstract The dielectric properties of material are of importance in various industrial and scientific applications of measurement technology. These properties are usually measured by microwave sensors, methods that provide an average result of the entire sample volume. However, the need to know the dielectric properties of single particles has increased in various segments. Dielectrophoresis (DEP) as a method provides a way to determine dielectric properties, such as permittivity and conductivity, of single particles with good precision by using a sufficiently simple system. In this thesis the DEP platform consists of four electrodes with hyperbolic edge geometry. Geometry produces a linear electric field gradient which leads to a constant DEP force in the active region and ensures fairly straightforward determination of particle properties by means of their DEP mobility. Particle mobility is dependent on particle size, the slope of the electric field gradient, the conductivity of the carrier fluid and the frequency of the electric field. For this thesis has been studied particle characterization on a 2D platform, particle 3D behavior, simultaneous multiphenomena observation and the applicability of transparent indium-tin-oxide (ITO) electrode material to DEP platforms. Experiments were made with polystyrene particles, using carrier fluids of varying conductivity. Electrode transparency enabled holographic 3D imaging and thus also the observation of particle behavior in the depth direction. This 3D imaging revealed the restricted working distance from the electrode plane, as well as the mobility of particles in the depth dimension under the DEP force. It was also observed that there was only a marginal difference between 3D mobility and 2D mobility inside the active region. The dielectric properties of the polystyrene particles were determined and found to differ from those of solid polystyrene, and thus the properties of the carrier fluid have a distinctive effect on particle properties. The measurement achieved good precision in a single particle measurement and thus the total particle consistency could be very low. The main restrictions of the DEP method are the limited working distance and restricted range of particle sizes: based on the results of this thesis, with a fixed size platform the particle size may not vary by more than tenfold. / Tiivistelmä Materiaalin dielektriset ominaisuudet ovat merkittäviä monissa teollisissa sekä tieteellisissä mittausteknisissä sovelluksissa. Yleensä nämä ominaisuudet mitataan mikroaaltosensoreilla, joilla mitataan näytetilavuuden keskiarvo. Tarve tietää yksittäisen partikkelin dielektriset ominaisuudet on kuitenkin lisääntynyt useilla segmenteillä. Dielektroforeesi (DEP) on menetelmä, jolla voidaan toistettavasti mitata yksittäisen partikkelin permittiivisyys ja johtavuus suhteellisen yksinkertaisella mittaussysteemillä. Tässä työssä DEP-alusta koostuu neljästä elektrodista, joilla on hyperbelin muotoinen elektrodin reunan muoto. Geometria tuottaa lineaarisen sähkökentän gradientin, mikä johtaa vakio DEP-voimaan alustan aktiivisella alueella. Niinpä partikkelin ominaisuuksien määrittely niiden liikkuvuuden perusteellä on suoraviivaista. Liikkuvuus on riippuvainen partikkelin koosta, sähkökentän gradientin kulmakertoimesta, kantajaliuoksen johtavuudesta sekä käytetyn sähkökentän taajuudesta. Työssä on tutkittu partikkelin karakterisointia 2D-alustalla, partikkelin 3D-käyttäytymistä, samanaikaista moni-ilmiötarkkailua sekä indium-tina-oksidi (ITO) elektrodimateriaalin soveltuvuutta DEP-alustoihin. Kokeet tehtiin polystyreenipartikkeleilla käyttäen eri johtavuuksisia kaliumkloridi-kantajaliuoksia. Elektrodien läpinäkyvyys mahdollisti holografisen 3D-kuvantamisen, jonka avulla havaittiin alustan rajallinen toimintaetäisyys sekä partikkelin syvyyssuuntainen liike DEP-voiman vaikutuksesta. Kuitenkin 3D- ja 2D-liikkeen välillä havaittiin vain vähäinen ero. Määritellyt partikkelin dielektriset ominaisuudet eroavat kiinteän polystyreenin arvoista, jolloin kantajaliuoksen ominaisuuksilla on merkittävä vaikutus määriteltyihin partikkelin ominaisuuksiin. Mittauksilla saavutettiin hyvä toistettavuus jopa yksittäisen partikkelin mittauksista, niinpä näytteen partikkelipitoisuus voi olla erittäin pieni. DEP-menetelmän merkittävimpiä rajoitteita ovat rajallinen toimintaetäisyys sekä rajallinen partikkelikoon variaatio, mikä voi olla yhdellä DEP-alustalla noin kymmenkertainen.

L’obésité représente un important facteur de risque prédisposant aux complications cardiovasculaires. Au niveau vasculaire, la dysfonction endothéliale est considérée comme l’une des altérations les plus précoces de ces complications, mais qui peut cependant être corrigé par l’exercice physique. Récemment, de nombreux travaux se sont intéressés aux microparticules circulantes (MPs) qui seraient impliquées dans de nombreux mécanismes cellulaires grâce à leur contenu en protéines et en microARNs. Nous nous sommes donc proposé dans le cadre de cette thèse de nous intéresser aux rôles que pourraient jouer ces MPs circulantes au niveau vasculaire dans un contexte d’obésité et suite à un exercice physique chronique. Notre travail a consisté dans un premier temps à évaluer l’intégrité vasculaire et notamment la fonction endothéliale chez des sujets obèses et normo-pondérés. Nous avons par la suite quantifié les MPs circulantes au niveau plasmatique et évalué leurs effets sur la fonction endothéliale d’aorte de rats ex vivo. Nous avons également étudié la composition de ces MPs circulantes en protéines impliquées dans la fonction endothéliale (eNOS et NADPH oxydase). Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à l’effet d’un programme d’exercice physique de 8 semaines au niveau vasculaire (fonction endothéliale, inflammation, stress oxydant) pour groupe de sujets sains et obèses. L’effet de l’exercice physique sur la concentration plasmatique et la composition de ces MPs en microARNs a également été évalué. Nos résultats nous ont permis de mettre en évidence une dysfonction endothéliale chez nos sujets obèses, un stress oxydant et une inflammation chronique. Les concentrations plasmatiques des MPs plasmatiques des sujets obèses étaient augmentées sans toutefois être corrélés avec les marqueurs de la dysfonction endothéliale. De plus, l’analyse fonctionnelle de ces MPs ex vivo et l’étude de leur composition nous a permis de conclure que, d’une part, ces MPs ne participaient à l’altération de la fonction endothéliale induite par l’obésité, et d’autre part, qu’elles reflétaient un mécanisme compensatoire au niveau vasculaire tendant à augmenter la biodisponibilité du NO et à contrebalancer les effets néfastes de la dysfonction endothéliale. Nous avons également pu observer que l’expression de nombreux micro-ARNs, qui seraient impliquées dans les mécanismes inflammatoires et athéroprotecteurs, étaient augmentées dans les MPs de sujets sains et obèses suite au programme d’exercice physique suggérant que ces MPs pourraient contribuer dans les effets bénéfiques de l’exercice observées au niveau vasculaire. / Obesity is a major risk factor predisposing to cardiovascular diseases. Endothelial dysfunction is considered as one of the earliest vascular alterations, but which could besides be restored by exercise. Recently, circulating microparticles (MPs) emerged as an important actor in many cellular mechanisms in the vasculature, through their protein and microRNA contain. In this thesis, we proposed to focus on these circulating MPs and their possible roles in the vasculature, in a context of obesity and in response to a chronic physical exercise. We previously evaluated vascular integrity, including endothelial function, in a population of obese and normal-weighted control group. Then, we quantified plasmatic circulating MPs and assessed their effects on endothelial function of rat aorta ex vivo. We also studied MPs composition on proteins implicated in endothelial function (eNOS and NADPH oxidase). In a second time, we interested on the effect of an 8 week training program on endothelial function and inflammatory and oxidative markers. The effect of exercise on plasmatic MPs level and their microRNAs-containing expression was also evaluated. Our results showed endothelial dysfunction, oxidative stress and inflammation in obese group. Moreover, MPs plasmatic level was enhanced for this group but were not correlated with endothelial dysfunction markers. In addition, functional analysis of obese MPs and their composition in eNOS and NADPH oxidase proteins allowed us to conclude that, firstly, these MPs are not implicated in obesity induced endothelial dysfunction and, secondly, they reflect a compensatory vascular mechanism which tends to increase nitric oxide bioavailability to offset endothelial dysfunction adverse effects. We also observed that microRNA expression, implicated in inflammatory and atheroprotective mechanisms, was enhanced in MPs of obese and normal-weighted subjects following the training program suggesting that these MPs could contribute in exercise beneficial effects.

Cerebral small vessel pathology is now known to be associated with the development of cognitive impairment and mild motor impairments such as gait disturbance in a variety of neurodegenerative diseases. This dissertation explores the hypothesis that blood brain barrier dysfunction is an early event in cerebral ischemia and contributes to the development of cerebral small vessel disease (CSVD). A common rodent model of CSVD is permanent bilateral common carotid artery occlusion in the rat. This model was used to study several aspects of the progression of CSVD including the timecourse of blood brain barrier permeability changes following the onset of ischemia, gait disturbance, the expression of tight junction proteins and cytokine expression. It was determined that BBB permeability was elevated for 2 weeks following BCCAO and ischemic rats displayed lower gait velocity. There was no change in expression of TJ proteins. However, ischemic rats had higher levels of some proinflammatory cytokines and chemokines in brain tissue with no obvious changes in plasma levels. The mechanisms underlying the increase in BBB permeability were studied in vitro using artificial barriers made of confluent rat brain microvascular endothelial cells. Cerebral ischemia has been reported to cause an increase in plasma toxicity, likely by elevating the numbers of circulating microparticles (MPs). MPs isolated from the plasma of ischemic rats were applied to artificial barriers where it was found that they act mainly as vectors of TNF-α signaling. MPs induce activation of caspase-3 and the Rho/Rho kinase pathways. It is concluded that most of the increase in barrier permeability is due to apoptosis and disassembly of actin cytoskeleton and disruption of adherens junctions IV and not an increase in transcellular transport. The effects of treatment with the type III phosphodiesterase inhibitor cilostazol on dye extravasation in the brain, glial activation, white matter damage and motor performance were evaluated. It was determined that cilostazol could improve the increased BBB permeability and gait disturbance and microglial activation in optic tract following BCCAO. Also, the effects of treatment with cilostazol on plasma toxicity in vivo (24h and 14d following BCCAO) and artificial barriers (in vitro) were assessed. It was found that cilostazol could reduce plasma toxicity at 24h and improve increased endothelial barrier permeability that is induced by MP treatment respectively. In summary BBB dysfunction occurs in the rat model of chronic cerebral hypoperfusion with no differences in expression of TJ proteins. There is a mild motor disturbance in the form of lower gait velocity following BCCAO. Cytokines released in brain tissue may be associated with pathological consequences following BCCAO while there is no significant difference in plasma levels and circulating MPs may play a role in BBB dysfunction.

En réponse à l'activation et/ou une apoptose, les cellules endothéliales (CE) libèrent dans le milieu environnant des microparticules endothéliales (MPE). Les microparticules sont des vésicules de petite taille résultant d'évènements membranaires liés à une perte de l'asymétrie des phospholipides. Peu de travaux concernent l'étude des mécanismes de génération des MPE et l'influence du territoire vasculaire sur la capacité de vésiculation des CE n'est pas connue. Nous avons montré que la thrombine induit la génération de MPE par un mécanisme complexe impliquant un lien entre coagulation et inflammation sur les CE macro et microvasculaires. A partir de l'étude du transcriptome, nous avons mis en évidence l'implication de TRAIL dans la génération des MPE procoagulantes par la thrombine. A l'état basal, les CE issues de différents territoires vasculaires présentent des capacités différentes de vésiculation, les CE microvasculaires présentant une plus grande capacité à libérer des MPE. L'étude du transcriptome a permis de déterminer des signatures moléculaires représentatives des territoires macro et microvasculaires. Nos travaux mettent en évidence une génération différentielle de MPE en fonction du calibre des vaisseaux et les signatures spécifiques pourraient permettre une meilleure caractérisation du territoire endothélial lésé. / In response to activation and/or apoptosis, endothelial cells (EC) release endothelial microparticles (EMP) in the extracellular space. Microparticles are small-sized vesicles resulting from membrane events leading to a loss of phospholipid asymmetry. Few works have documented the mechanisms underlying EMP generation and the influence of vascular bed on EMP release remains largely unknown. Our works showed that thrombin induced EMP generation through a complex mechanism involving a cross-talk between coagulation and inflammation in macro and microvascular EC. Using a global gene expression study, we have evidenced the involvement of TRAIL in the procoagulant EMP generation induced by thrombin. In a basal state, EC from various vascular beds showed different capacities of EMP release, with microvascular EC displaying the highest capacity. Gene expression study identified molecular signatures representative of EC from macro and microvascular beds. Our works highlight the role of the vascular beds in the capacity of EC to generate EMP according to the vessel caliber. The specific gene signatures could improve our knowledge the endothelial dysfunction and a better characterization of the damaged vascular beds.

<p>While drug-loaded biodegradable polymer microparticles have found many therapeutic applications, bulk manufacturing methods produce heterogeneous populations of particles. A more highly controlled manufacturing method may provide the ability improve the microparticle characteristics such as the drug release profile. Microfluidic droplet-makers manipulate liquids on the scale of tens of microns and can produce highly regular and controlled emulsions. However, microfluidic droplet manufacturing is not typically designed for clinical translation and the chemicals used are often not biocompatible.</p><p>I developed a two-chip PDMS-based microfluidic device that can manufacture PLGA microparticle loaded with hydrophilic or hydrophobic drugs. I characterized protein-loaded microparticles made using this device and compared them with bulk-generated microparticles. The microfluidics-generated microparticles had similar release curves and encapsulation efficiencies as bulk-generated microparticles but a much narrower size distribution. I generated peanut protein-loaded microparticles with this device and tested them in a mouse model of peanut allergy, improving the particles as the project evolved to have a higher loading level and lower burst release. The microparticles improved the safety and efficacy of an immunotherapy protocol. I also encapsulated hydrophilic and hydrophobic chemotherapeutic drugs for a brain cancer model.</p> / Dissertation

Ce travail porte sur la préparation, la caractérisation physico-chimique et l'évaluation biopharmaceutique de Microparticules Lipidiques Solides Composites (MLSC) innovantes assurant la gastrorétention et la libération progressive d'un principe actif modèle hydrophobe, l'ibuprofène. Une méthode d'émulsification à chaud est utilisée pour préparer ces MLSC, stabilisées par des nanoparticules de silice Aérosil® d'hydrophobie variée, selon le principe des « émulsions de Pickering », en remplacement de surfactifs organiques. Ces nanoparticules inorganiques se retrouvent en surface et dispersées au coeur des MLSC dans tous les cas. L'utilisation d'Aérosil® hydrophobe permet la formation de MLSC homogènes de plus de 100 µm de diamètre. Il est à noter que la présence de silice, en fonction de la charge en ibuprofène, a une influence certaine sur les cinétiques de libération du principe actif, que ce soit dans le PBS de pH 7.4 ou le milieu gastrique simulé de pH 1.2, principalement en modulant la taille des microparticules. Elle permet aussi de stabiliser sur une période de 6 mois les propriétés physico-chimiques et biopharmaceutiques des MLSC, d'améliorer leurs propriétés d'usage, comme l'écoulement, la résistance à l'écrasement et la flottaison dans un milieu gastrique simulé. Enfin, le recouvrement des MLSC par des polysaccharides assure la bioadhésion sur des membranes biologiques simulées à base de mucine en accélérant le plus souvent la libération de l'ibuprofène. Néanmoins, la stabilisation de MLSC avec des nanoparticules de silice dispersées au sein de matrices d'alginate gélifiées au CaCl2 avant lyophilisation constitue une nouvelle voie prometteuse pour la libération prolongée de principe actif hydrophobe dans l'estomac car ce polymère assure leur bioadhésion sur plus de 4h sans toutefois modifier le profil de libération de l'ibuprofène. / The aim of this work consists in the preparation, physic-chemical characterization and biopharmaceutical evaluation of innovative Composite Solid Lipid Microparticles (CSLM), allowing gastroretention and extended-release of a model hydrophobic drug, ibuprofen. Hot Melt emulsification's method is used to prepare these CSLM, stabilized by Aerosil® nanoparticles of various hydrophobicity as “emulsion of Pickering” instead of using an organic surfactant. Nanoparticles of silica take place on surface and are dispersed into CSLM in all cases. Using hydrophobic Aerosil allow the preparation of homogeneous over 100µm size CSLM. Presence of silica depending on the charge of ibuprofen influences the ibuprofen kinetics of release in both PBS ph 7.4 and simulated gastric fluid pH 1.2 by modulating the size of microparticles. Silica nanoparticles are also able to stabilize on a period of over 6 months the physic-chemical and biopharmaceuticals properties of CSLM, to improve their use properties, as helping free-flowing, enhancing crushing strength, and floating of CSLM in simulated gastric fluid. Finally CSLM coating with polysaccharides allows their bioadhesion on mucine simulated biological membrane, with an increased ibuprofen kinetics of release in most of the cases. Nevertheless, silica nanoparticles stabilized CSLM dispersed in CaCl2 gelified alginate matrices before freeze drying represent a new promising way for the extended release of hydrophobic drugs in stomach because this polymer can promote their bioadhesion for more than 4h without any change in the kinetics of ibuprofen release.