Deux études distinctes mettant en oeuvre la détection et l'analyse de signaux spectroscopiques optiques de molécules individuelles- colorants ou molécules organiques- ont été menées.<br />Par microscopie grand champ de fluorescence, l'émission de molécules uniques de pérylène orange insérées dans un film solgel mince, par enregistrement de films d'une large zone de l'échantillon sur laquelle plus d'une centaine d'émetteurs individuels sont détectés, fournit des informations sur cette espèce et la matrice sondée. Pour exploiter les films, un outil logiciel a été développé. Les processus de photoblanchiment, la mobilité moléculaire, la nucléation des molécules excitées sont mis en évidence et discutés. On note une grande richesse des dynamiques temporelles d'émission, mais aussi des spectres qui reflètent notamment la reconformation proposée du pérylène orange excité. Il s'ensuit l'existence de nombreux nanoenvironnements différents dans la matrice poreuse.<br />Par microscopie confocale à balayage, le signal de diffusion Raman exaltée de surface de molécules uniques organique adsorbées sur des agrégats d'argent de morphologie complexe est exploité. Certains objets présentent une exaltation géante, estimée être de plus de 14 ordres de grandeur, ce qui permet l'enregistrement de spectres résolus en seulement une seconde. L'analyse chimique offerte permet de distinguer différentes espèces, et la présence nécessaire sur ces points chauds d'Ag+ est démontrée. Une caractérisation corrélée par microscopie électronique des agrégats actifs repérés met aussi en avant l'existence d'une morphologie privilégiée, avec de nombreuses protubérances de dimension nanométrique et interstices.

Dans cette thèse, nous proposons un modèle complet de la formation de l'image, qui s'applique à des objets microscopiques 3D translucides.Dans notre modèle, un objet translucide est défini comme une répartition discrète d'indices de réfraction et de coefficients d'absorption. Pour simuler le trajet de la lumière, nous proposons un modèle physique utilisant des techniques de lancer de rayons de la source vers l'observateur. Ce modèle physique sert à calculer l'espace objet éclairé. Pour simuler la génération d'images par le système optique, nous utilisons des principes d'optique ondulatoire. Nous modélisons la fonction de transfert 3D du microscope, qui dépend de la défocalisation. Après avoir choisi un plan de focalisation, nous calculons une image simulée en appliquant cette fonction de transfert à chaque plan plus ou moins défocalisé de l'espace objet éclairé. Une séquence d'images simulées est obtenue en faisant varier la focalisation.

Les génomes de bactériophages sont connus pour être mosaïques. Avec l'augmentation des structures disponibles sur ces virus, leur morphologie aussi apparaît de plus en plus comme telle. Les structures de 4 différents intermédiaires dans l'assemblage de la capside icosaédrique du bactériophage Gifsy-2, infectant les bactéries Salmonella ont été résolues par cryo-microscopie électronique jusqu'à une résolution de 12Å. Au niveau génétique, un long gène code en partie Cterminale pour la protéine de capside majeure alors que sa partie Nterminale est fortement similaire du point de vue de sa séquence primaire aux protéases de la famille Clp. Ces résultats et ceux obtenus sur d'autres phages suggèrent que les 200 résidus en partie centrale regroupent les fonctions restantes, nécessaire à l'assemblage de la capside. Cette organisation en un gène unique est une nouvelle variante des stratégies développées par les phages pour modifier la voie d'assemblage de leur capside.<br />Nous avons aussi déterminé les structures de la capside et de la queue du phage T5 , infectant la bactérie E.Coli à des résolutions de 19 et 30 Å respectivement confirmant l'inhabituelle symétrie d'ordre 3 de sa queue. Sa capside icosaédrique est composée par des pentamères et hexamères de pb8 et par pb10 s'attachant au centre de ces derniers, le tout étant décrit par une géométrie T=13. La comparaison des séquences primaires de pb8 et gp5 d'HK97 et la modélisation du modèle atomique de gp5 dans la capside de T5 montrent que ces 2 protéines adoptent sûrement le même repliement 3D. Nous proposons aussi que le domaine Nterminal de la protéine pb8 soit impliqué dans l'assemblage initial de la capside d'une manière similaire à HK97.

Dans le Système International d'unités (SI) le kilogramme est l'unité de masse, qui est définie comme étant égale à la masse du prototype international du kilogramme en platine iridié. Le contrôle des étalons de masse est essentiel vis _a vis, entre autre, des industries qui doivent garantir une production calibrée. Ce travail est consacré à l'étude en champ proche et champ lointain des surfaces des étalons de masse métalliques, en lien avec différents instituts, laboratoires nationaux et internationaux de la métrologie. Nous avons mené deux types de mesures : mesures de type shear-force pour déterminer la topographie locale de la surface et mesures en champ proche optique pour approfondir l'analyse de la surface par mesure optique localisée à haute résolution. Une analyse de l'évolution de la topographie des surfaces des étalons de masse et de la structure du champ proche optique diffracté par les défauts des ces surfaces a été menée au cours de ce travail de thèse.

Le facteur TFIIH est un facteur multi-protéique impliqué, via ses dix sous-unités, dans la transcription des gènes de classe II et dans la réparation de l'ADN. Chez l'homme, des mutations dans les gènes codant pour des hélicases XPB et XPD de TFIIH sont à l'origine de trois maladies: le Xeroderma Pigmentosum, la Trichothiodystrophie et le Syndrome de Cockayne. Au cours de mes études doctorales, je me suis intéressée aux liens entre la structure et la fonction du facteur TFIIH humain. Nous avons observé le complexe TFIIH produit sous forme recombinante dans les cellules d'insectes en microscopie électronique et sa structure est identique à celle du facteur endogène. Nous y avons ensuite intégré les données biochimiques d'interaction protéine-protéine et nous proposons un modèle général de l'architecture du complexe. Afin de comprendre le rôle de TFIIH dans l'initiation de la transcription ou dans la réparation de l'ADN, nous avons développé une nouvelle technologie visant à observer les complexes ADN-protéine en microscopie. Nous avons également déterminé un modèle en cryomicroscopie du facteur TFIIE, qui interagit physiquement avec TFIIH, à une résolution de 1.6nm. Finalement, nous avons obtenu des cristaux de l'homologue de l'hélicase XPD chez une archaebactérie.

La combinaison des techniques de microscopie en champ proche avec celles d'imagerie par résonance magnétique permet une étude locale de la dynamique magnétique. Dans cet exposé, nous démontrerons que d'un point de vue à la fois analytique et expérimental, cette détection mécanique, mesurant la composante longitudinale de l'aimantation avec un levier oscillant dans la bande audio, permet de remonter à la dynamique de relaxation transverse et longitudinale, à l'échelle de la nanoseconde, aussi bien sur un système de spins paramagnétiques que ferromagnétiques.

L'étude de l'endommagement induit par les ions lourds dans le volume des isolants, nous a permis de classer les isolants en deux catégories : les matériaux amorphisables et les matériaux non amorphisables. Les résultats expérimentaux des matériaux non amorphisables posent plusieurs questions concernant l'origine défauts surfacique ainsi que la sensibilité des techniques de caractérisations utilisées. Notre étude concerne l'apparition des défauts créés à la surface, proche de la surface et dans le volume de trois isolants d'amorphisabilité différente : Y3Fe5O12, CaF2 et Al2O3. Pour cela trois techniques de caractérisations ont été utilisées : la profilométrie de surface, la rétro-diffusion Rutherford en canalisation et la microscopie à force atomique. Nos résultats montrent que la réponse de la surface est une conséquence de ce qui se produit dans le volume. De plus la sensibilité des matériaux non amorphisables aux ions lourds est identique à celle des matériaux amorphisables.

Nous avons conçu et réalisé un microscope associant l'imagerie du champ magnétique à l'échelle micrométrique avec l'imagerie topographique en champ proche, destiné à l'étude de la supraconductivité et du magnétisme à basse température. L'intégration du microscope à micro-SQUID dans un réfrigérateur à dilution offre un domaine d'étude encore inexploré en imagerie magnétique. Le champ magnétique est mesuré par un micro-SQUID qui est une boucle de 1 µm de diamètre fabriquée par lithographie électronique et comportant deux jonctions Josephson. L'imagerie topographique est implémentée à travers la microscopie de force. Un résonateur mécanique à quartz en forme de diapason constitue le capteur de force. Il maintient la pointe de Si contenant le micro-SQUID à quelques dizaines de nanomètres de la surface de l'échantillon et permet de connaître la topographie. En mode d'imagerie, le microscope atteint une sensibilité magnétique de 10-3 F0/Hz1/2 et une résolution spatiale magnétique inférieure à 2 µm. A l'aide du microscope, nous avons observé la dynamique des vortex dans un film d'aluminium contenant un réseau de trous. Nous avons pu mettre en évidence le rôle de la taille des trous, le dépiégeage des vortex quand la température approche Tc , la supraconductivité de surface et la relaxation de la distribution des vortex au cours du temps.

Comparaison, pour divers systemes de formation d'images x, des parametres tels que resolution des images, champ utilisable, flux disponible. Choix de la microscopie de contact, naturellement adaptee au rayonnement synchrotron. Principes de la microanalyse d'absorption x et limitations tant theoriques que pratiques; description de l'instrumentation. Obtention de resultats quantitatifs sur des echantillons tests de coupes de nodules oceaniques polymetalliques, en utilisant en particulier le traitement numerique des images .

Les bactéries forment des communautés spatiales adhérentes à des surfaces, appelées biofilms. Ces organisations bactériennes sont omniprésentes dans les milieux naturel, industriel et médical et peuvent porter atteinte à notre santé lorsqu'elles hébergent des agents pathogènes, parmi lesquels le médiatique Staphylococcus aureus sur lequel a porté l'ensemble de ce travail de thèse. Cette bactérie est l'une des principales causes d'infections chroniques, mais également d'infections nosocomiales, impliquant le plus souvent des biofilms. Il est aujourd'hui reconnu qu'une telle biostructure est un véritable bouclier à l'action des antimicrobiens et à celle du système immunitaire. Outre les résistances génétiques des bactéries pathogènes aux antibiotiques, l'hétérogénéité chimique et biologique de la structure tridimensionnelle des biofilms pourrait être à l'origine de ces phénomènes de tolérance et de chronicité d'infections. C'est à cette problématique que se rattache ce travail de thèse concernant l'action de la vancomycine sur des biofilms de S. aureus. Alors que les connaissances sur la réactivité de cet antibiotique clef avec S. aureus proviennent essentiellement d'études réalisées sur des cellules planctoniques, l'originalité de notre approche a été d'étudier la diffusion-réaction de la vancomycine in situ dans l'épaisseur des biofilms en utilisant en particulier des outils avancés de microscopie de fluorescence (Time-Lapse, FLIM, FRAP, et FCS). Nous avons ainsi évalué sa biodisponibilité dans la matrice d'exopolymères, ainsi que l'impact de la physiologie spécifique des bactéries incluses en biofilms sur l'activité de cet antibiotique, utilisé seul ou en association avec la rifampicine. Cette approche multidisciplinaire a permis une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la singulière tolérance de ces biostructures à l'action des antibiotiques, et de souligner l'urgence de développer des approches préventives telles que le diagnostic précoce des infections impliquant des biofilms.