Les méthodes actuelles pour détecter et identifier des microorganismes dans un échantillon sont lentes et complexes. Les techniques d'identification bactérienne, par exemple, nécessitent généralement une étape de culture bactérienne, introduisant des délais pouvant dépasser les 48 heures. Dans plusieurs domaines, telles la recherche arctique, la santé et l'industrie agroalimentaire, la lenteur des analyses bactériologiques peut avoir de lourdes conséquences humaines ou financières. Il existe donc un réel intérêt pour la conception de capteurs sensibles permettant d'outrepasser l'étape de culture bactérienne. Par le passé, notre groupe de recherche a développé une technique de biodétection basée sur les modes de galerie de multiples microsphères fluorescentes en suspension libre dans un échantillon. La sensibilité et la robustesse de cette approche permettent d'envisager son intégration dans un biocapteur rapide et portatif. Cependant, la technologie n'est pas assez mature sous sa forme actuelle pour permettre cette intégration. L'objectif de nos travaux de recherche était donc d'intégrer notre technologie dans un système de laboratoire efficace. Pour ce faire, une nouvelle instrumentation optofluidique est proposée. Cette dernière joint un microscope à fluorescence et un système microfluidique conçu pour mélanger une solution de microsphères avec un échantillon contenant des bactéries. Le mélange est réalisé par un micromélangeur utilisant des rainures dont l'orientation et la position sont optimisées pour favoriser la dispersion de particules solides en suspension dans un fluide. Différentes méthodes d'apprentissage machine servant à analyser les modes de galerie de microsphères fluorescentes sont également décrites. En termes de rapidité, ces dernières surpassent de loin l'algorithme IMARI originellement proposé par notre groupe. Au final, l'instrumentation optofluidique et les méthodes d'analyses présentées dans ce mémoire ont permis de détecter la présence de deux types de picocyanobactéries nordiques. Les avancées réalisées pendant la maîtrise confirment donc le potentiel de notre approche et son intégration éventuelle dans un capteur portatif. / The detection and the identification of microorganisms in a liquid sample is, more often than not, a slow and complex process. The current bacterial identification methodologies, for instance, typically require bacterial growth on culture media, a step which introduces delays of 48 hours or more. In fields such as arctic research, healthcare or food production, these delays can beget serious human and financial consequences. Thus, there is a growing interest for sensitive biosensors capable of bypassing the bacterial growth step. Our research group as previously presented a biodetection scheme based on the analysis of the whispering gallery modes of multiple fluorescent microspheres free-floating in the solution under test. The sensitivity and the robustness of this approach promote its eventual use in a fast and portable biosensing device. However, under its current form, our technology still lacks the appropiate maturity to be integrated in such a device. The research presented in this thesis thus aimed at integrating our technology in an effective laboratory system. To that end, an improved optofluidic instrumentation is proposed. It joins a fluorescent microscope to a microfluidic chip capabe of mixing a solution of microspheres with a sample containing bacteria. The mixing if achived via a staggered herringbone mixer with a groove orientation optimized to promote the dispersion of solide microparticles in suspension. Several machine learning algorithms are also proposed to analyse the whispering gallery modes of our free-floating fluorescent microspheres. In terms of analysis speed, these methods outperform, by a great margin, the IMARI algorithm previously proposed by our group. In the end, the proposed instrumentation and algorithms were used to sucessfully detect the presence of two types of arctic picocyanobacteria. The contributions presented in this thesis thus confirm the potential of our biodetection scheme and further pave the way towards portable biosensors.

La microscopie de fluorescence est devenue un outil incontournable en biologie. En particulier, il est possible de suivre dans le temps et dans l’espace en cellules vivantes l’activité de protéines en utilisant des biosenseurs FRET génétiquement encodés. Mon travail de thèse a consisté à développer de nouvelles méthodes de microscopie de fluorescence quantitative pour dépasser les limitations rencontrées dans le suivi de biosenseurs FRET. En premier lieu, j’ai eu à développer une méthodologie pour le suivi de deux biosenseurs FRET génétiquement encodés par mesure de durée de vie (FLIM) en simultané avec une seule longueur d’onde d’excitation. En effet, il n’est pas facile de suivre deux activités biochimiques par biosenseurs FRET dans un même échantillon vivant par microscopie de fluorescence à cause de l’existence de fuites spectrales dans les canaux de détection des différentes protéines fluorescentes et l’utilisation de deux longueurs d’onde d’excitation pour chacun des deux donneurs. En combinant les deux couples de protéines fluorescentes mTFP1/ShadowG et LSSmOrange/mKate2, les artefacts de fuite spectrale ont pu être négligés. Il a été possible de suivre les activités kinases des protéines ERK et PKA en simultané par FLIM. À l’aide de cette méthodologie, nous avons pu mettre en évidence une activation de la voie PKA lors d’une stimulation à l’EGF. En second lieu, j’ai développé une méthode pour le suivi de biosenseur FRET par la technique de spectroscopie à corrélation croisée de fluorescence (FCCS). Le suivi d’activité de certaines protéines peut s’avérer difficile du fait de leur faible expression au sein de l’échantillon vivant et de leur localisation. La méthode de FCCS nécessite une faible concentration de fluorophores et peut donc s’adapter à ces échantillons. Le FRET a un effet direct sur l’amplitude de corrélation croisée lorsque celle-ci est mesurée en suivant la co-diffusion de deux protéines fluorescentes attachées à un même biosenseur. Une diminution de ratio d’amplitude des courbes d’autocorrélation (verte ou rouge) sur l’amplitude de la courbe de corrélation croisée correspond à la présence de FRET. Nous avons pu mesurer cette diminution dans des cellules exprimant le biosenseur FRET Aurora A WT (FRET) en comparaison avec un mutant K162M (non FRET). Ces premiers résultats sont très prometteurs pour l’utilisation de cette approche au suivi d’un biosenseur faiblement exprimé en cellules vivantes. L’amélioration du suivi de biosenseur FRET, par les méthodes de microscopie de fluorescence quantitative présentées dans ce travail, doit pouvoir permettre la réponse à des questions d’intérêt biologiques nécessitant le suivi multiplex de FRET ou la mesure de biosenseurs à faible niveau d’expression, là où les techniques conventionnelles se heurtaient à leur limitation. / Fluorescence microscopy has become an invaluable tool in biology. In particular, it allows to follow in time and space the activity of proteins, using genetically encoded FRET biosensors, in live cell imaging. In my thesis work, I have developed new quantitative fluorescence microscopy methods to overcome the limitations encountered in monitoring FRET biosensors. First, I developed a methodology to monitor simultaneously two genetically encoded FRET biosensors by lifetime measures (FLIM) with a single excitation wavelength. Previously, it was not easy to follow two biochemical activities by FRET biosensors in the same live sample by fluorescence microscopy. Two reasons for that: the existence of spectral bleed through in the detection channel of each fluorescent proteins and the use of two excitation wavelengths for the two donors. By combining two fluorescent proteins pairs: mTFP1 / ShadowG and LSSmOrange / mKate2, the “spectral bleed through” artifact became negligible. It became then possible to follow the kinase activity of PKA and ERK proteins simultaneously by FLIM. Using this methodology, we were able to show an activation of the PKA pathway upon stimulation with EGF. Second, I developed a method to monitor FRET biosensor by fluorescence cross-correlation spectroscopy technique (FCCS). Monitoring the activity of certain proteins may be difficult due to their low expression in living sample and their sub-cellular localization. The FCCS methods requires a low concentration of fluorophores and can therefore be adapted to these samples. FRET has a direct effect on the cross-correlation amplitude when it is measured by following the co-diffusion of two fluorescent proteins attached to a same biosensor. An amplitude ratio decrease, of the autocorrelation curves (green or red) on the amplitude of the cross-correlation curve, corresponds to the presence of FRET. We were able to measure this ratio decreases in cells expressing the FRET biosensor Aurora A wild type (FRET) compared to the K162M mutant one (non-FRET). These first results are very promising to monitor the activity of a weakly expressed protein in living cells biosensor using this approach. The improvement of FRET biosensor monitoring, by quantitative fluorescence microscopy methods presented in this work, will help to answer biological questions of interest requiring the measurement of multiplex FRET monitoring or biosensors at low level expression, where conventional techniques are facing these limitations

Le cortex de la plupart des protistes ciliés contient un squelette membranaire dont le principal élément est l'épiplasme, une structure apposée à la membrane alvéolaire interne. Chez la paramécie, l'épiplasme se présente sous forme d'écailles indépendantes disposées autour de chaque appareil ciliaire ; il est composé d'une famille multigénique de protéines appelées épiplasmines. Nous avons réalisé une étude structurale de cette famille multigénique. L'analyse phylogénétique a permis de confirmer l'existence de 5 groupes d'épiplasmines divisé chacun en deux sous-groupes a et b. L'utilisation de la méthodologie HCA nous a permis de montrer que ces protéines sont modulaires et présentent un arrangement de leurs domaines structuraux. Elles peuvent ainsi être regroupées en trois classes symétriques, asymétriques et atypiques. L'analyse des régions 5'UTR des membres de cette famille multigénique montre la présence d'éléments putatifs de régulation d'expression. La comparaison des épiplasmines de la paramécie avec leurs orthologues de Tetrahymena montre une relation structurale entre les groupes 1,2,3 et 5 et les EpiT 1,2,3, et 5 respectivement suggérant l'existence d'un ancêtre commun pour l'épiplasme de Paramecium et Tetrahymena. Nous avons réalisé l'analyse fonctionnelle des épiplasmines à partir d'approche par ARN interférence et par localisation couplée à la GFP. La perturbation de l'expression des épiplasmines symétriques et asymétriques, aboutit à une réponse cellulaire commune qui se traduit par un changement de la forme cellulaire, un blocage de la cytocinèse et enfin l'apparition de formes plasmodiales. L'analyse du cortex par microscopie à fluorescence montre une altération des unités corticales qui est fonction des types structuraux des épiplasmines. Les épiplasmines se localisent de manière différentielle autour du corps basal définissant un territoire dont le modèle d'organisation est centrifuge. On définit alors des épiplasmines cinétomosales, péricinétomosales, core et enfin périphériques. Ce modèle est discuté en relation avec les phénotypes obtenus par l'analyse fonctionnelle. Il permet d'intégrer les différents niveaux de relation entre le corps basal, son territoire et l'ensemble de l'épiplasme.

Dans cette thèse, nous nous intéressons à la restauration d'image tridimensionnelle de microscopie de fluorescence. Deux difficultés majeures dans ce système d'imagerie sont traitées. La première est le flou variable en profondeur qui est dû aux aberrations induites par la variation des indices de réfraction dans le système optique et le spécimen imagé. La deuxième est le bruit qui est principalement dû au processus de comptage de photons. L'objectif de cette thèse est de réduire ces distorsions afin de fournir aux biologistes une image de meilleure qualité possible. Dans la première partie de cette thèse, nous étudions les modèles d'approximation du flou variable en profondeur et nous choisissons un modèle adéquat au problème d'inversion. Dans ce modèle, la réponse impulsionnelle (RI) variable en profondeur est approchée par une combinaison convexe d'un ensemble de RIs invariables spatialement. Nous développons pour ce modèle deux méthodes rapides de restauration non-aveugle par minimisation d'un critère régularisé, chacune d'elles est adaptée au type de bruit présent dans les images de microscopie confocale ou à champ large. Dans la deuxième partie, nous abordons le problème de restauration aveugle et proposons deux méthodes dans lesquelles le flou variable en profondeur et l'image sont conjointement estimés. Dans la première méthode, la RI est estimée en chaque voxel du volume considéré afin de laisser une grande liberté sur la forme de la RI, tandis que dans la deuxième méthode, la forme de la RI est contrainte par une fonction gaussienne afin de réduire le nombre de variables inconnues et l'espace des solutions possibles. Dans ces deux méthodes d'estimation aveugle, l'effet des aberrations optiques n'est pas efficacement estimé en raison du manque d'information. Nous améliorons ces méthodes d'estimation en alternant des contraintes dans les domaines fréquentiel et spatial. Des résultats sont montrés en simulation et sur des données réelles. / In this thesis, we focus on the restoration of three-dimensional image of fluorescence microscopy. Two major difficulties in this imaging system are considered. The first one is the depth-variant blur due to aberrations induced by the refractive index variation in the optical system and the imaged specimen. The second difficulty is the noise due to the photon counting process. The goal of this thesis is to reduce these distortions in order to provide biologists with a better image quality. In the first part of this thesis, we study the approximation models of the depth-variant blur and choose an appropriate model for the inversion problem. In that model, the depth-variant point spread function (PSF) is approximated by a convex combination of a set of space-invariant PSFs. We then develop for that model two fast non-blind restoration methods by minimizing a regularized criterion, each of these methods is adapted to the type of noise present in images of confocal or wide field microscopy. In the second part, we address the problem of blind restoration and propose two methods where the depth-variant blur and the image are jointly estimated. In the first method, the PSF is estimated at each voxel in the considered volume in order to allow high degree of freedom on the PSF shape while in the second method, the shape of the PSF is constrained by a Gaussian function in order to reduce the number of unknown variables and the space of possible solutions. In both blind estimation methods, the effect of optical aberrations is not effectively estimated due to the lack of information. We thus improve these estimation methods by alternating some constraints in the frequency and spatial domains. Results on simulated and real data are shown.

L'étude porte sur la réalisation d'un support plan fonctionnalisé et structuré pour l’immobilisation d’un nombre limité de biomolécules sondes telles que des carbohydrates, des protéines, des anticorps. Les supports sont des lames commerciales silanisées avec un amino-silane sur les deux faces. Des composés fluorescents porteurs de fonctions aldéhyde ou acide ont été utilisés comme modèles pour valider les greffages covalents sur ces supports via une liaison imine ou amide respectivement. Pour localiser les greffages, des puits en polymère de géométrie contrôlée à base de résine SU-8 ont été directement fabriqués sur la surface par un procédé de stéréolithographie. Le greffage de deux fluorophores acides a été réalisé simultanément dans différents puits sur un même support. La localisation des réactions a été caractérisée par spectroscopie et/ou microscopie de fluorescence. Pour permettre la fixation de composés porteurs d’une ou plusieurs fonctions aldéhyde, tels que des anticorps après oxydation des carbohydrates présents sur leur fragment Fc, un bras espaceur de type polyoxyéthylène terminé par une fonction aminooxy ou hydrazide a été synthétisé directement sur la surface des supports. / This work deals with manufacturing functionalized and patterned plane substrates to immobilize a few biological components like carbohydrates, proteins or antibodies. The substrates are commercial glass microscope slides silanized with an amino linker on the two sides. Covalent binding on such substrates has been successfully tested using fluorophores as models with carboxylic acid or aldehydic function to afford respectively amide or imine bond with the amino functions of the support. To localize chemical graftings, polymeric regular and geometrically controlled wells were manufactured from SU-8 photoresist directly on the glass support, applying stereolithography process. Grafting of two fluorophores with carboxylic functions activated by N-hydroxysuccinimide was led simultaneously inside polymeric wells on a same substrate. Localized bindings were characterized by fluorescence spectroscopy and/or microscopy. In order to enable covalent attachment through a stable chemical linkage of aldehydic components, like antibodies after oxidation of their Fc fragment, aminooxy and hydrazide terminated polyoxyethylene spacers were directly synthesized on substrates surface

Les techniques de super-résolution offrent un nouvel aperçu de la description de l'organisation moléculaire dynamique de la membrane plasmique. Parmi ces techniques, la microscopie par déplétion d'émission stimulée (stimulated emission depletion, STED) dépasse la limite de diffraction optique et atteint une résolution de quelques dizaines de nanomètres. Il est une technique polyvalente qui peut être combinée avec d'autres techniques telles que la spectroscopie par corrélation de fluorescence (fluorescence correlation spectroscopy, FCS), fournissant des résolutions spatiales et temporelles élevées pour explorer les processus dynamiques qui se produisent dans les cellules vivantes. Ce projet de doctorat vise à mettre en œuvre un microscope STED, puis à combiner ce module STED avec la technique FCS pour les applications biologiques. Des études théoriques du STED et de la technique combinant STED et FCS ont permis dans les aspects spatio-temporels. Une solution analytique pour la fonction d'autocorrélation FCS a été dérivée dans l'état de déplétion STED incomplet. et un nouveau modèle d'ajustement FCS a été proposé. La méthode de variation du volume d’observation FCS (spot variation FCS, svFCS) a démontré sa capacité à identifier la présence de nanodomaines limitant la diffusion latérale des molécules dans la membrane plasmique. L’approche STED-FCS permet d’étendre l’application de la svFCS à l'échelle nanométrique afin d’évaluer la persistance plus ou moins importante de tels nanodomaines. Dans ce contexte, des simulations préliminaires de Monte Carlo ont été réalisées figurant des molécules diffusant en présence d'auto-assemblage/désassemblage dynamique des nanodomaines. / Super-resolution techniques offer new insight into the description of the dynamic molecular organization at the plasma membrane. Among these techniques, the stimulated emission depletion (STED) microscopy breaks the optical diffraction limit and reaches the resolution of tens of nanometer. It is a versatile setup that can be combined with other techniques such as fluorescence correlation spectroscopy (FCS), providing both high spatial and temporal resolutions to explore dynamic processes occurring in live cells. This PhD project aims at implementing a STED microscope, and then at combining this STED module with FCS technique for biological applications. Detailed theoretical studies on STED and the combined STED-FCS technique in spatio-temporal aspects were performed. An analytical solution for FCS autocorrelation function was derived in the condition of incomplete STED depletion and a new FCS fitting model was proposed to overcome this problem. The spot variation FCS (svFCS) method has demonstrated its capability to identify the presence of nanodomains constraining the lateral diffusion of molecules at the plasma membrane. The STED-FCS can extend the svFCS approach to the nanoscale evaluating the long-lasting existence of such nanodomains. Within this frame, preliminary Monte Carlo simulations were conducted mimicking molecules diffusing in the presence of dynamic self-assembling/disassembling nanodomains.

La synthèse des protéines est un mécanisme central de la vie cellulaire dont la compréhension est un enjeu du domaine biomédical. Les études en molécule unique permettent d’observer chaque système réactionnel individuellement et donnent accès à des évènements asynchrones difficilement observables en mesure d’ensemble, tels la traduction de protéines.Cette thèse présente les premiers résultats en molécule unique sur la traduction par un ribosome eucaryote (mammifère). Nous observons les systèmes traductionnels grâce à des marqueurs fluorescents liés à des oligonucléotides pouvant s’hybrider sur les séquences d’ARN traduites. L’observation de ces marqueurs est faite par microscopie de fluorescence en onde évanescente (TIRF), les ARN étant fixés sur une lamelle de microscope. En lisant l’ARN, le ribosome détache les marqueurs, et leurs instants de départs donnent des informations sur le passage du ribosome à différentes positions sur l’ARN. Cette méthode permet d’obtenir des données cinétiques sur un grand nombre de systèmes traductionnels en parallèle pouvant alors être interpolées par des lois de probabilité. Nous obtenons par cette méthode des mesures de la cinétique in vitro de l’élongation eucaryote et nous observons un délai dû à une initiation non-canonique. En effet, nous complexons le ribosome sur l’ARN grâce à une structure de type IRES. Dans nos conditions d’expérience, l’incorporation d’un acide aminé prend environ une seconde tandis que cette structure induit un retard à la traduction de plusieurs dizaines de secondes. Ces résultats ouvrent des perspectives d’étude cinétique dans des cas plus complexes tels le franchissement de structures secondaires de l’ARN. / Protein synthesis is a central mechanism of cellular life and understanding it is a challenge in biomedical research. Single molecule studies permit each reactive system to be observed individually and provide access to asynchronous events difficult to observe in ensemble experiments, such as protein translation.This thesis presents the first results on single molecule eukaryotic (mammalian) translation. We observe the translational systems using fluorophores linked to oligonucleotides annealed to the RNA translated sequences. The observation of these fluorophores is done by total internal reflection fluorescence microscopy, the RNA being attached to a microscope slide. When reading the RNA, the ribosome unzips the fluorescent oligonucleotides and their departure times provide information about the position of the ribosome at different locations on the RNA strand. This method provides kinetic data on a large number of parallel translational systems that can be fitted using probability laws.With this method, we measure the in vitro kinetics of eukaryotic elongation and we reveal a delay due to a non-canonical initiation of the ribosome. Indeed, in our experiments, the ribosome is initially complexed on an RNA structure called Internal Ribosome Entry Site. In our experimental conditions, each incorporation of an amino acid in the nascent protein takes about one second while the IRES structure induces a delay of several tens of seconds on the first incorporation. These results open new perspectives for kinetic studies in more complex configurations such as the passage of the ribosome through RNA secondary structures.

L’objectif de cette thèse est de définir la chorégraphie de ségrégation des deux chromosomes circulaires de Vibrio cholerae, c’est à dire le positionnement de l’information génétique au cours de la croissance de la cellule, ainsi que les mécanismes dirigeant ces ségrégations. Il a longtemps été supposé que les bactéries étaient trop petites pour avoir une organisation intra-cellulaire, et le manque de techniques appropriées ne permettait pas d’infirmer cette hypothèse. Or la taille des chromosomes comparée à celle de la bactérie impose une compaction et aujourd’hui, de nouvelles techniques de microscopie et d’analyse génétique permettent d’affirmer que les chromosomes bactériens étudiés jusqu’à maintenant ont tous une organisation et une chorégraphie de ségrégation précises et différentes selon les espèces. Toutes les espèces étudiées à ce jour ont un chromosome circulaire unique : la réplication du chromosome commence à une origine unique bidirectionnelle, les deux fourches de réplication se déplacent le long des deux bras de réplication (ou réplichores) et finissent la réplication au terminus, diamétralement à l’opposée de l’origine de réplication sur la carte du chromosome. Peu d’espèces ont été étudiées, et Vibrio cholerae émerge progressivement comme un nouveau modèle : son génome est réparti sur deux chromosomes, et la chorégraphie de plusieurs chromosomes dans une cellule n’a jamais été décrite. De plus, cette espèce semble être au croisement évolutif entre Caulobacter crescentus et Escherichia coli : Vibrio cholerae a d’une part une morphologie en croissant, des systèmes de partition aux origines et un positionnement de l’origine du chromosome I, semblables à C. crescentus, et d’autre part un système de compaction du terminus et un set de gènes impliqués dans la maintenance du chromosome ayant co-évolué, qu’on ne retrouve que dans peu d’espèces proches d’E. coli. Une autre caractéristique intéressante de V. cholerae est que le chromosome II semble avoir été acquis récemment et n’est donc peut être pas gouverné par les mêmes mécanismes que le chromosome I, comme en témoignent le positionnement de son origine et son terminus, inédits pour des chromosomes bactériens. Parmi les Vibrios (environ 60 espèces principalement retrouvées dans les environnements aquatiques), certaines espèces sont des pathogènes dévastateurs pour les poissons, le corail, les crustacés ou les fruits de mer. Mais la plus documentée est Vibrio cholerae, car elle provoque chez l’Humain une maladie provoquée par l’ingestion d’eau contaminée qui peut être mortelle si le patient n’est pas réhydraté à temps. Bien que facilement traitable, le choléra fait encore de nombreuses victimes dans les pays en développement où les structures de santé et les règles d’hygiène font parfois défaut. Ainsi l’étude de Vibrio cholerae présente un intérêt médical, mais également par extension aux autres Vibrios, un intérêt environnemental non négligeable. / The aim of this thesis is to define the segregation choreography of the two circular chromosomes of Vibrio cholerae, which is the positionning of the genetic information during cell growth, as well as the mecanisms directing those segregations. It was supposed for a long time that bacteria were too small to have a intra-cellular organization and the lack of appropriate tools could not prove this hypothesis wrong. The size of the chromosomes compared to the size of the cell means there has to be a compaction and today, new tools for microscopy and genetic analysis allow us to affirm that all bacterial chromosomes studied so far have an organization and a segregation choreography which are precise and different between specie. Most bacterial specie studied to this day have a unique circular chromosome : the replication of the chromosome starts at a unique and bidirectionnal origin, both replication forks move along the two replication arms (or replichores) and end the replication at the terminus which is diametrically to the opposite of the origin on the chromosome map. A few specie have been studied, and Vibrio cholerae progressively emerges as a new model : its genome is divided between two chromosomes, and the choreography of several chromosomes in a cell has never been described. Moreover, this species seems to be at the crossover between Caulobacter crescentus and Escherichia coli : Vibrio cholerae as on one hand, a crescent shape, partition systems positionned at both origins and a positionning of the chromosome I origin similar to C. crescentus, and on the other hand a compaction system of the terminus and a set of genes involved on the maintenance of chromosomes that one only finds in very few specie closely related to E. coli. An other interesting characteristic of V. cholerae is that the chromosome II seems to have been acquired recently and thus might not be governed by the same mecanisms as the chromosome I, as shown by the positionning of its origin and terminus which are completely new to bacterial chromosomes. Among Vibrios (about 60 species mostly found in aquatic environments), some species are devastating pathogens for fish, coral, crustacean and shellfish. But the most documented one is Vibrio cholerae, because it induces a disease in humans caused by the ingestion of contaminated water, which can be deadly if the patient is not rehydrated on time. Although easily treatable, cholera still makes a lot of victims in developing countries where health structures and basic hygiene sometimes lack dramatically. The study of Vibrio cholerae has a medical interest, but also by extention to other Vibrios, a non-negligible environmental interest.

85% des patients atteints de cancer du pancréas présentent au diagnostic des formes avancées de la maladie qui empêchent leur prise en charge thérapeutique efficace. Il est donc urgent de mettre en évidence des marqueurs diagnostics permettant de détecter plus tôt ces cancers, mais également leur rechute, afin d'améliorer leur prise en charge. Les miARNs (micro acides ribonucléiques) sont des biomarqueurs du cancer du pancréas, présentant une valeur clinique démontrée pour la détection précoce des tumeurs et le suivi de la réponse au traitement. Cependant, les méthodes actuelles d'extraction et de détection de ces molécules ne sont pas adaptées à une utilisation clinique. Les nouvelles technologies issues des méthodes de micro et nanofabrication ont le potentiel de permettre la mise en place de tests diagnostiques, offrant un haut degré de portabilité et de robustesse, une lecture en temps réel, et à bas coût. Nous proposons ici une plateforme nanofluidique couplée à une détection en fluorescence permettant la mesure en temps réel d'interactions moléculaires en milieu hyper-confiné. Nous décrivons dans un premier temps la plateforme de détection via un modèle théorique à une dimension basé sur la dynamique moléculaire permettant de prédire la capture spécifique des miARNs dans un nanocanal fonctionnalisé. L'originalité du système réside dans une accroche non homogène des miARNs sur la surface du capteur. Ainsi, nous démontrons que l'étude du profil spatial d'hybridation engendré permet de déterminer l'affinité du miARN capturé avec la séquence sonde en une seule étape, sans lavage. Nous démontrons également l'excellente spécificité du biocapteur qui permet la discrimination rapide (moins de 10 minutes) de SND (single nucleotide difference). Les performances du dispositif pour des applications au plus près des problématiques biologiques dans le cadre de la détection du cancer du pancréas sont enfin discutées : les effets de la préparation d'échantillon types biofluides complexes sur l'extraction de miARNs sont étudiés, puis deux approches permettant la détection de miARNs endogènes sont décrites et comparées, conduisant à la détection de miARNs extraits de cultures cellulaires modèles du cancer du pancréas. / 85% of patients affected by pancreatic adenocarcinoma (PDA) are diagnosed at an advanced stage, preventing effective care and curative treatments. Therefore, it is urgent to identify reliable biomarkers for the early detection of disease status, including relapse. MiRNAs (micro ribonucleic acids) are biomarkers of PDA, with demonstrated clinical value for early detection of tumors and monitoring of response to treatment. However, current methods of extraction and detection of miRNA are not compatible with clinical use. New technologies derived from micro and nanofabrication methods have the potential to facilitate the implementation of diagnostic tests, by offering a high degree of portability and robustness, short time to results at low cost. Here, we propose a nanofluidic platform coupled to fluorescence detection for the real time measurement of molecular interactions in a confined environment. We first describe the detection platform via a one-dimension theoretical model based on molecular dynamics to predict the capture of miRNAs into biofunctionalized nanochannels. The originality of the system lies in the non-homogeneous hybridization of miRNA targets onto the sensor. We demonstrate that the analysis of the spatial hybridization profile enables the determination of the affinity of the captured miRNA with the probe sequence in a wash-free single step. We then show the rapid discrimination (less than 10 minutes) of single nucleotide difference (SND) using this strategy. The performance of the device in the context of pancreatic cancer detection is discussed: the effect of sample preparation of complex biofluids is studied and two labeling approaches compatible with the detection of endogenous miRNAs are described and compared, leading to the detection of miRNAs extracted from model cell cultures of pancreatic cancer.

De nombreuses protéines doivent localiser de courtes séquences-cibles sur de longues molécules d'ADN. Le temps nécessaire à cette localisation est souvent beaucoup plus court que celui qui résulterait d'une diffusion 3D des protéines. Plusieurs mécanismes ont été suggérés pour rendre compte de l'efficacité remarquable du processus de localisation (diffusion 1D le long de l'ADN, sauts...). Cependant, malgré les nombreuses études menées par des biochimistes depuis plus de vingt ans, en particulier sur les enzymes de restriction EcoRI et EcoRV, à ce jour aucune expérience n'a pu trancher définitivement entre les différents mécanismes proposés.<br /><br />Au cours de cette thèse, nous sommes parvenus à observer en microscopie de fluorescence l'interaction entre une enzyme de restriction EcoRV individuelle et une molécule d'ADN. Pour cela, nous avons développé une technique permettant d'étirer les molécules d'ADN au-dessus d'une surface, et nous avons couplé les enzymes EcoRV à des nanocristaux semi-conducteurs, sondes très fluorescentes non sujettes au photoblanchiment. Les enzymes ainsi marquées, toujours actives, sont détectables avec une résolution spatiale de l'ordre de 10 nm et une résolution temporelle de 20 ms.<br /><br />Nous avons observé de nombreux événements d'association/dissociation d'enzymes sur les molécules d'ADN étirées. L'analyse de ces événements nous a permis de mesurer la constante de dissociation des enzymes couplées, de mettre en évidence une diffusion facilitée d'EcoRV le long de l'ADN et d'estimer les caractéristiques de cette diffusion.