Mitochondria are usually considered simply as the “powerhouses of the cell”, however in recent years it has become apparent that mitochondria are also of fundamental importance in programmed cell death (PCD), which refers to cell death resulting from a controlled, genetically defined pathway. In Arabidopsis, PCD induced by either heat shock or treatment with strong oxidants is found to be correlated with an early and irreversible change in mitochondrial morphology which manifests as an increase in the size of individual mitochondria. In addition, PCD causes a clustering of mitochondria and loss of motility. In this study, I have used two arginase negative mutant Arabidopsis lines (argah1-1 and argah2-1) which have elevated cellular NO concentrations to examine the effect of nitrosative stress on mitochondria undergoing PCD. Another three different Arabidopsis lines (mito-GFP/mTalin-mCherry, mito-GFP/MAP4-mCherry, mito- mCherry/EB1b-GFP) were used to visualize cytoskeletal elements alongside mitochondria to examine the mechanisms responsible for the mitochondrial morphology transition, clustering and motility inhibition. Results indicate that the elevated concentration of NO found in arginase negative mutants is not sufficient to induce PCD. There was no significant mitochondrial morphology or dynamic change detected between arginase negative mutants and wild type plants, with or without a heat shock. Disruption of either actin or microtubule (MT) cytoskeletal elements leads to the formation of mitochondrial clusters, although they showed different cluster morphology and sizes. Mitochondrial clusters were observed to be moving along the remaining actin cables after a mild heat treatment or cytoskeletal depolymerizing drug treatment. Intact microtubules or MT plus ends visualized with EB1b did not show any interaction with mitochondria under normal conditions. However, after a mild heat stress, EB1b appeared to be associated with clusters of enlarged, possibly swollen mitochondria.

Dans cette thèse, des méthodes de la physique statistique hors équilibre sont utilisées pour décrire deux processus intracellulaires. Le transport bidirectionnel sur les microtubules est décrit à l'aide d'un gaz sur réseau stochastique quasi-unidimensionnel. Deux espèces de particules sautent dans des directions opposées en interagissant par exclusion. La présence habituelle d'accumulations de particules peut être supprimée en rajoutant la dynamique du réseau, c'est-à-dire de la microtubule. Un modèle simplifié pour la dynamique du réseau produit une transition de phase vers un état homogène avec un transport très efficace dans les deux directions. Dans la limite thermodynamique, une propriété de l'état stationnaire limite la longueur maximale des accumulations. La formation de voies peut être causée par des interactions entre particules. Néanmoins, ces mécanismes s'avèrent peu robustes face à une variation des paramètres du modèle. Dans presque tous les cas, la dynamique du réseau a un effet positif et bien plus important sur le transport que la formation de voies. Par conséquent, la dynamique du réseau semble un point-clé pour comprendre la régulation du transport intracellulaire. La dernière partie introduit un modèle pour la dynamique d'une microtubule sous l'action d'une protéine qui favorise les sauvetages. Des phénomènes intéressants de vieillissement apparaissent alors, et devraient être observables dans des expériences. / This thesis uses methods and models from non-equilibrium statistical physics to describe intracellular processes. Bidirectional microtubule-based transport within axons is modeled as a quasi-one-dimensional stochastic lattice gas with two particle species moving in opposite directions under mutual exclusion interaction. Generically occurring clusters of particles in current models for intracellular transport can be dissolved by additionally considering the dynamics of the transport lattice, i.e., the microtubule. An idealized model for the lattice dynamics is used to create a phase transition toward a homogenous state with efficient transport in both directions. In the thermodynamic limit, a steady state property of the dynamic lattice limits the maximal size of clusters. Lane formation mechanisms which are due to specific particle-particle interactions turn out to be very sensitive to the model assumptions. Furthermore, even if some particle-particle interaction is considered, taking the lattice dynamics into account almost always improves transport. Thus the lattice dynamics seems to be the key aspect in understanding how nature regulates intracellular traffic. The last part introduces a model for the dynamics of a microtubule which is limited in its growth by the cell boundary. The action of a rescue-enhancing protein which is added to the growing tip of a microtubule and then slowly dissociates leads to interesting aging effects which should be experimentally observable.

La mitose est une étape essentielle du cycle cellulaire à l’issue de laquelle le génome répliqué de la cellule mère est ségrégé de façon équitable entre les deux cellules filles. Pour cela, la cellule assemble une structure hautement dynamique et composée de microtubules, appelée le fuseau mitotique. En plus d’assurer la bonne ségrégation des chromosomes, le fuseau mitotique détermine l’axe de division, un phénomène particulièrement important pour la division asymétrique où des déterminants d’identité cellulaire doivent être distribués de façon inéquitable entre les deux cellules filles. L’assemblage et la dynamique de ce fuseau sont finement régulés par de nombreuses protéines qui sont associées aux microtubules. Au cour de ma thèse, nous avons identifié 855 protéines constituant l’interactome des microtubules de l’embryon de Drosophile par spectrométrie de masse puis criblé par ARNi 96 gènes peu caractérisés pour un rôle en mitose dans le système nerveux central larvaire. Par cette approche, nous avons identifié 18 candidats sur la base de leur interaction aux microtubules et de leur phénotype mitotique, dont Ensconsine/MAP7. Nous avons montré qu’Ensconsine est capable de s’associer aux microtubules du fuseau et favorise leur polymérisation. De plus, les neuroblastes des larves mutantes présentent des fuseaux raccourcis et une durée de mitose prolongée. Ce délai en mitose est dû à une activation prolongée du point de contrôle du fuseau mitotique qui est essentiel pour une ségrégation correcte des chromosomes en l’absence d’Ensconsine. D’autres part, en association avec la Kinésine-1, son partenaire fonctionnel en interphase, nous avons montré qu’Ensconsine est également impliquée dans la séparation des centrosomes au cours de l’interphase. Ceci entraine une distribution aléatoire des centrosomes pères et fils dans cellules filles. Grâce à cette étude, nous avons révélé deux nouvelles fonctions pour Ensconsine : elle favorise la polymérisation des microtubules et participe donc à l’assemblage du fuseau mitotique et est impliquée, avec la Kinésine-1 dans la dynamique des centrosomes. / Mitosis is a key step of the cell cycle that allows the mother cell to segregate its replicated genome equally into the two daughter cells. To do so, the cell assembles a highly dynamic structure composed of microtubules called the mitotic spindle. Additionally to its role in the faithful segregation of chromosomes, the mitotic spindle defines the axis of cell division. This phenomenon is particularly important for the asymmetric cell division in which cell fate determinants have to be unequally distributed between the two daughter cells. Spindle assembly and dynamics are subtly regulated by numerous microtubules-associated proteins. During my PhD, we identified using mass spectrometry, 855 proteins establishing the Drosophila embryo microtubule interactome. An RNAi screen was performed in the larval central nervous system for 96 poorly described genes, in order to identify new mitotic regulators. Based on microtubule interaction and mitotic phenotype, among 18 candidates we focused on Ensconsin/MAP7. We have shown that Ensconsin is associated with spindle microtubules and promotes their polymerization. Neuroblasts from mutant larvae display shorter spindles and a longer mitosis duration. This mitotic delay is a consequence of an extended activation of the spindle assembly checkpoint, which is essential for the proper chromosome segregation in the absence of Ensconsin. This study also showed that, in association with its interphase partner Kinesin-1, Ensconsin is involved in centrosome separation during interphase. As a result, mother and daughter centrosomes are randomly distributed between the daughter cells. In conclusion, we highlighted two news functions of Ensconsin : first, this protein promotes microtubule polymerization and is involved in spindle assembly ; second, Ensconsin and its partner Kinesin-1 regulate centrosome dynamics.

Pericentrin is a molecular scaffold protein. It anchors protein kinases, (PKB, (Purohit, personal communication), PKC, (Chen et al., 2004), PKA Diviani et al., 2000), the γ tubulin ring complex, (γ TuRC) (Zimmerman et al., 2004), and possibly dynein (Purohit et al., 1999) to the spindle pole. The γ TuRC is a ~ 2 MDa complex which binds the minus ends of microtubules and nucleates microtubules in vitro, (Zheng et al., 1995). Prior to this work, nothing was known about the association of the γTuRC with pericentrin. Herein I report the biochemical identification of a large protein complex in Xenopus extracts containing pericentrin, the γ TuRC, and other as yet unidentified proteins. Immunodepletion of γ tubulin results in co-depletion of pericentrin, indicating that virtually all the pericentrin in a Xenopus extract is associated with γ tubulin. However, pericentrin is not a member of the, γ TuRC, since isolated γ TuRCs do not contain pericentrin. The association of pericentrin with the γ TuRC is readily disrupted, resulting in two separable complexes, a small pericentrin containing complex of approximately 740 KDa and the the γ TuRC, 1.9 MDa in Xenopus. Co overexpression/ coimmunoprecipitation and yeast two hybrid studies demonstrate that pericentrin binds the γTuRC through interactions with both GCP2 and GCP3. When added to Xenopus mitotic extracts, the GCP2/3 binding domain uncoupled γ TuRCs from centrosomes, inhibited microtubule aster assembly and induced rapid disassembly of pre-assembled asters. All phenotypes were significantly reduced in a pericentrin mutant with diminished GCP2/3 binding, and were specific for mitotic centro somal asters as I observed little effect on interphase asters or on asters assembled by the Ran-mediated centrosome-independent pathway. Overexpression of the GCP2/3 binding domain of pericentrin in somatic cells perturbed mitotic astral microtubules and spindle bipolarity. Likewise pericentrin silencing by small interfering RNAs in somatic cells disrupted γ tubulin localization and spindle organization in mitosis but had no effect on γ tubulin localization or microtubule organization in interphase cells. Pericentrin silencing or overexpression induced G2/antephase arrest followed by apoptosis in many but not all cell types. I conclude that pericentrin anchoring of γ tubulin complexes at centrosomes in mitotic cells is required for proper spindle organization and that loss of this anchoring mechanism elicits a checkpoint response that prevents mitotic entry and triggers apoptotic cell death. Additionally, I provide functional and in vitro evidence to suggest that the larger pericentrin isoform (pericentrin B/ Kendrin) is not functionally homologous to pericentrin/pericentrin A in regard to it's interaction with the γ TuRC.

Les mégacaryocytes sont les précurseurs cellulaires hautement spécialisés qui produisent des plaquettes via des extensions cytoplasmiques appelées proplaquettes. La formation des proplaquettes exige de profonds changements dans l’organisation du cytosquelette: microtubules et actine. Les formines sont une famille de protéines hautement conservées chez les eucaryotes composées de plusieurs domaines qui régulent le remodelage et la dynamique du cytosquelette d'actine et des microtubules. La plupart des formines sont des effecteurs protéiques des Rho-GTPase. DIAPH1, un membre de la famille des formines, est un homologue chez les mammifères du gène diaphanous de la drosophile qui fonctionne comme un effecteur de la petite GTPase Rho et régule le cytosquelette d'actomyosine ainsi que les microtubules. Il contient le domaine de liaison à Rho (Rho-binding domain) dans la partie amino-terminale et deux régions distinctes d’homologie aux formines, FH1 localisée au centre de la protéine et FH2 dans la partie carboxy-terminale. DIAPH1 co-régule le cytosquelette des microtubules et d'actine à travers respectivement ses régions de FH2 et FH1. DIAPH1 est donc un gène candidat idéal dans toutes les fonctions cellulaires qui exigent une coopération entre cytosquelettes d’actine et de microtubules.L'objectif de ce projet de thèse était d’étudier le rôle de DIAPH1 dans la mégacaryopoïèse. A la fin de la maturation des mégacaryocytes, la formation de proplquettes et la migration sont associées à des modifications importantes de la structure du cytosquelette. Nous avons émis l’hypothèse que grâce à la sa double fonction dans la polymérisation de l'actine et la stabilisation des microtubules, DIAPH1 pourrait jouer un rôle essentiel dans les temps terminaux de la différenciation mégacaryocytaire.Nos résultats ont montré qu’au cours de la différenciation mégacaryocytaire, l’expression de DIAPH1 augmente, alors que celles de DIAPH2 et DIAPH3 diminuent, ce qui suggère que DIAPH1 pourrait jouer un rôle plus important que DIAPH2 et DIAPH3 dans les stades tardifs de la différenciation mégacaryocytaire. Les études en immunomarquage montrent que DIAPH1 co-localise avec l’actine F, la tubuline et la myosine IIa en niveau de la membrane plasmique et des proplaquettes. Nous avons étudié la fonction de DIAPH1 par des stratégies d’invalidation (knockdown) et de surexpression d’une forme active de DIAPH1. Les résultats montrent que DIAPH1 est un effecteur important de Rho, pour réguler négativement la formation des proplaquettes en remodelant le cytosquelette d’actine et les microtubules. Le travail antérieur de notre équipe avait montré que Rho-ROCK régulait aussi négativement la formation des proplaquettes, en inhibant l’activation de la myosine IIa. En inhibant simultanément DIAPH1 et ROCK/myosine, nous avons montré que ces deux voies jouent un rôle additif dans la formation des proplaquettes.Ces résultats suggèrent que la coopération entre les voies DIAPH1 et ROCK/myosine est nécessaire pour la formation de structures cellulaire dépendant de l'actomyosine, telles les fibres de stress et l'anneau contractile en agissant à la fois sur le remodelage du cytosquelette et en assurant un équilibre entre l'actomyosine et microtubules. / Megakaryocytes (MKs) are the highly specialized precursor cells that produce platelets via cytoplasm extensions called proplatelets. Proplatelet formation (PPF) requires profound changes in microtubule and actin organization. Formins are a family of highly conserved eukaryotic proteins with multidomains that govern dynamic remodeling of the actin and microtubule cytoskeletons. Most formins are Rho-GTPase effectors proteins. DIAPH1, a member of the formin family, is a mammalian homolog of Drosophila diaphanous gene that works as an effector of the small GTPase Rho and regulates the actomyosin cytoskeleton as well as microtubules. It contains the Rho-binding domain in the N-terminal and two distinct regions of formin homology, FH1 in the center and FH2 in the C-terminus. DIAPH coordinates microtubules and actin cytoskeleton through its FH2 and FH1 regions respectively, making DIAPH an ideal candidate in cell functions that depend closely on the cooperation between the actin and microtubule cytoskeletons.The objective of the project was to decipher the role of DIAPH1 in megakaryopoiesis. At the end of the MK maturation, PPF and MK migration are associated with profound changes in cytoskeleton organization. Due to its dual function in actin polymerization and microtubule stabilization, DIAPH1 was an obvious candidate to play an essential role in PPF and MK migration.Our results showed that DIAPH1 expression increased during MK differentiation, whereas DIAPH2 and DIAPH3 expression decreased, suggesting that DIAPH1 may play a more important role than DIAPH2 and DIAPH3 in the late stages of MK differentiation. Immunostaining showed that DIAPH1 co-localized with F-actin, tubulin and myosin IIa along the plasma membrane and proplatelet. Using a knockdown strategy with shRNA and expression of an active form of DIAPH1, we showed that DIAPH1 is an important effector of Rho that negatively regulates PPF by remodeling actin and microtubule cytoskeletons. A previous work of our team has shown that Rho-ROCK also negatively regulates in PPF by inhibiting myosin IIa activation. By the double inhibition of the DIAPH1 and the ROCK/Myosin pathway, we showed that DIAPH1 and ROCK played additive roles in the negative regulation of PPF. These observations suggest that the cooperation between DIAPH1 and ROCK is required for the formation of cell structures dependent on actomyosin, such as the stress fibers and the contractile ring. Collectively, these results strongly suggest that cooperation of DIAPH1/microtubules and ROCK/Myosin may regulate PPF by modifying the balance between actomyosin and microtubules.

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La Liver Kinase B1 (LKB1) est une protéine pléiotrope, impliquée dans divers processus biologiques. Dans le foie, LKB1 est notamment connue pour être un régulateur clé du métabolisme et de la polarité cellulaire. Au cours de notre étude, nous avons investigué l’implication de LKB1 dans le contrôle de la prolifération des hépatocytes au cours du processus de régénération hépatique physiologique (hépatectomie partielle des 2/3). Nous avons démontré que la perte de Lkb1, spécifiquement dans les hépatocytes, favorise la récupération de la masse hépatique après hépatectomie partielle, en induisant une augmentation drastique de la réponse proliférative hépatocytaire, indépendamment de la balance métabolique/énergétique. Ainsi, LKB1 agit comme un senseur négatif de la prolifération et régule la transition G0/G1, en particulier en contrôlant la signalisation de l’EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). Par ailleurs, plus tard pendant la régénération, LKB1 garantit également l’intégrité mitotique. En effet, la suppression de Lkb1 entraîne des altérations majeures de la formation du fuseau mitotique. Nos résultats établissent également que LKB1 contrôle la polarité de la division cellulaire, indépendamment de l'activité de l’AMPK (AMP-activated protein kinase), une cible clé de LKB1. Par conséquent, la perte de LKB1 conduit à une altération majeure du profil de ploïdie, au stade tardif du processus de régénération. L’ensemble de notre étude souligne le double rôle de LKB1, au cours de la régénération hépatique, en tant que gardien de la prolifération hépatocytaire et de l'intégrité génomique. / Liver Kinase B1 (LKB1) is involved in pleiotropic biological processes and known to be a key regulator of hepatic metabolism and polarity. Here, we investigated the contribution of LKB1 in hepatocyte proliferation and liver regeneration process. We demonstrated that loss of hepatic Lkb1 promotes liver mass recovery, through an increase of hepatocytes proliferation, independently on metabolic/energetic balance. LKB1 regulates G0/G1 progression, specifically by controlling Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) signaling. In addition, later during regeneration, LKB1 controls mitotic fidelity. Deletion of Lkb1 results in major alterations of mitotic spindle formation, along the polarity axis, independently of AMP- activated protein kinase (AMPK) activity, a key target of LKB1. Consequently, LKB1 deficiency leads to an alteration of ploidy profile, at late stage of regenerative process. Overall our study highlights the dual role of LKB1, during liver regeneration, as a guardian of hepatocyte proliferation and genomic integrity.

La CLIP-170 (Cytoplasmic Linker Protein of 170 kDa) est requise, in vitro, pour l'établissement d'un lien statique entre les endosomes et les microtubules (MTs). Elle se localise, in vivo, aux bouts « plus » des MTs en croissance et semble participer ainsi à la capture de ces derniers au cortex cellulaire et aux kinétochores. Elle contribue au contrôle de la dynamique des MTs et semble aussi recruter le complexe moteur dynéine cytoplasmique/dynactine sur les extrémités « plus » des MTs, via son domaine carboxy-terminal. La CLIP-170 s'associe également aux kinétochores d'une façon dépendante du complexe dynéine/dynactine et de son domaine C-terminal. Ce domaine C-terminal contient deux motifs de type « doigt de zinc » (proximal et distal) probablement impliqués dans des interactions avec d'autres protéines.<br />Nous rapportons ici la démonstration d'une interaction directe entre la CLIP-170 et LIS1, une protéine capable, par ailleurs, d'interagir directement avec le complexe dynéine/dynactine. LIS1 est mutée chez de nombreux patients atteints d'une lissencéphalie de type I et semble jouer le rôle de co-facteur activateur de la dynéine cytoplasmique. Nous avons montré que cette interaction dépendait du doigt de zinc distal de la CLIP-170 et nous avons apporté des éléments indiquant une possible régulation de cette interaction par phosphorylation.<br />L'étude des fonctions cellulaires potentielles de cette interaction nous a permis de mettre en évidence un enrichissement de LIS1 aux extrémités « plus » des MTs. Elle a fourni des éléments substantiels laissant supposer que cette localisation, comme celle de la dynactine au même endroit, était dépendante du domaine C-terminal de la CLIP-170. Par ailleurs, nous avons démontré que la localisation de la CLIP-170 sur le kinétochore dépendait de son domaine d'interaction avec LIS1, et que le recrutement de LIS1 au même site dépendait du complexe dynéine/dynactine. L'ensemble de ces données suggère que LIS1 constitue un adaptateur entre la CLIP-170 et le complexe moteur dynéine/dynactine.<br />Parallèlement, nous avons initié l'étude de protéines LIS1 qui présentent chacune une mutation ponctuelle dans diverses régions conservées. Ces mutations ponctuelles ont été découvertes chez des patients atteints d'une lissencéphalie de type I plus ou moins sévère. Par des approches biochimiques, moléculaires et cellulaires, nous avons montré que, selon la sévérité de la maladie, les différentes propriétés de LIS1 (repliement, stabilité, localisations sub-cellulaires, interaction avec ses partenaires et liaison aux MTs) étaient plus ou moins affectées. À l'occasion de cette étude, nous avons également identifié les domaines de LIS1 impliqués dans l'interaction avec les MTs et d'autres partenaires comme les sous-unités catalytiques du PAFAH(I) (Platelet-Activating Factor Acétylhydrolase).

Rubella virus (RUBV) is a positive-strand RNA virus and the causative agent of rubella and congenital rubella syndrome in humans. To replicate its RNA, RUBV forms membrane-associated spherules, called replication complexes (RCs), the induction of which requires the two virus nonstructural proteins (NSPs), P150 and P90. Interestingly, late in infection the NSPs form a unique cytoplasmic fiber network, similar in appearance to microtubules, the function of which is unknown. Little is known about the roles of the RUBV NSPs in forming these structures and, to this end, we scrutinized the behavior and biochemical properties of the NSPs, both after expression from plasmids and during RUBV infection, using mutagenic, biochemical and pharmacological approaches. The following findings were made: First, the precursor from which P150 and P90 are produced via an embedded protease at the C-terminus of P150, called P200, was required for initial targeting to cytoplasmic foci. P150 was the determinant of fiber formation and while P90 had no specific targeting sequences on its own, P90 sequences within P200 were required for correct targeting of P200. An alpha-helix at the N-terminus of P150 was also important for correct targeting of P200, putatively by mediating the interaction between P150 and P90 within the precursor. Second, the membrane binding domain within the NSPs was within the N-terminal ~450 amino acids of P150. P150 is in an exceptionally tight association with membranes. Third, both the N- and C-terminal regions of P150, and specifically long alpha-helices within these regions, are necessary for fiber formation. Fiber formation relied on an intact microtubule network, but neither microtubule repositioning nor dynamic movement along microtubules was required. Additionally, it was shown that microtubules were not necessary in RUBV replication. Finally, P150 fibers were not required for RUBV replication; however, it was shown that the fibers are likely important in formation of cytoplasmic extensions through which a novel system of cell-to-cell transport of viral RNA in the absence of virus particles appears to occur.

We developed new methods for controlling and studying microtubules (MTs) outside the complex workings of the living cell. Several surface treatments for preventing MT fouling on surfaces were analyzed and, for the first time, a self-assembled monolayer (SAM) was developed which prevented MT adsorption in the absence of passivating proteins. The morphology and thickness of the SAM was measured to determine the mechanism of formation and origin of the MT-resistant behavior. The SAM was integrated into electron beam lithography for patterning and manipulating MTs using electrophoresis. Reversible MT adsorption and patterning and alignment of single MTs were achieved. We characterized the mechanism for the MT migration under electric field with a focus on the electrodynamics of the flow cell and the forces acting on the MT, along with the time dependence of the process.