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An??lise de microves??culas purificadas do plasma de pacientes com mielofibrose quanto a presen??a de miRNAs e quanto ao impacto na migra????o de c??lulas-tronco mesenquimaisRodrigues, Leane Perim 20 March 2017 (has links)
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Previous issue date: 2017-03-20 / Myelofibrosis is a hematological disease inserted in the group of myeloproliferative neoplasias. It has as main characteristic fibrosis of the bone marrow, consequence of a variety of histological changes presented in the medullary microenvironment. The pathophysiology of myelofibrosis involves the activation of signal transduction pathways and nowadays several mutations such as JAK2V617F, CalR and MPL have been associated with this process. Recent studies have shown that microvesicles produced by body cells may be associated with the cellular communication process. These microvesicles carry in their content proteins, lipids and RNA capable of regulating diverse cellular processes. The literature shows that several miRNAs present in the microvesucular content can regulate the hematopoiesis of normal stem cells and also of compromised progenitors, having an important role in the pathogenesis of some acquired hematological neoplasias such as myeloproliferative diseases. With the objective of investigating the presence of specific miRNAs in microvesicles excreted in the peripheral blood plasma of patients with myelofibrosis, microvesicles were isolated from the plasma by ultracentrifugation and by means of molecular biology techniques it was possible to validate the presence of these microbes. Real-time PCR assays were performed to evaluate the expression of specific miRNAs (miR-146b, miR-221, miR-143 and miR-150) in the microvesic contents. In order to analyze the functional activity of MVs, the cell migration assay was performed, aiming at the progression of pathology and tumor invasiveness. The results show that there is no increase in the microvesicular concentration in peripheral blood when comparing the group of patients with the control group. The data found show that miR-146b and miR-150 are differentially expressed in patients with myelofibrosis, being little expressed. However, miR-221 and miR-143 didn???t show amplification in the technique, which leads to the conclusion that these miRNAs are specific to the medullary microenvironment or aren???t released in the microvesicular content. Regarding the migration test, the result shows that there was no influence of the microvesicles in the process of cell proliferation and migration and it can be considered that the microvesicles isolated in our study may not present this role because they are not exclusively of the bone marrow environment. As future prospects, assays with microvesicles removed from the bone marrow can be performed. / A Mielofibrose ?? uma doen??a hematol??gica inserida no grupo de neoplasias mieloproliferativas. Possui como principal caracter??stica a fibrose da medula ??ssea, consequ??ncia de uma variedade de mudan??as histol??gicas apresentadas no microambiente medular. A fisiopatog??nese da Mielofibrose envolve a ativa????o de vias de transdu????o de sinais e nos ??ltimos anos v??rias muta????es como a JAK2V617F, a CalR e a MPL foram associadas a doen??a. Estudos recentes demonstraram que microves??culas produzidas por c??lulas do organismo podem estar associadas ao processo de comunica????o celular. Estas microves??culas transportam em seu conte??do prote??nas, lip??dios e RNA capazes de regular variados processos celulares. A literatura mostra que diversos miRNAs presentes no conte??do microvesucular podem regular a hematopoiese de c??lulas-tronco normais e tamb??m de progenitores comprometidos, tendo um papel importante na patog??nese de algumas neoplasias hematol??gicas adquiridas como as doen??as mieloproliferativas. Com objetivo de investigar a presen??a de miRNAs espec??ficos em microves??culas excretadas no plasma de sangue perif??rico de pacientes portadores de mielofibrose, microves??culas foram isoladas do plasma por m??todo de ultracentrifuga????o e por meio de t??cnicas de biologia molecular foi poss??vel confirmar a presen??a destas. Ensaios com PCR em tempo real foram realizados afim de avaliar a express??o de miRNAs espec??ficos (miR-146b, miR-221, miR-143 e miR-150) no conte??do das microves??culas e para analisar a atividade funcional das M.Vs foi realizado o ensaio de migra????o celular que visa avaliar progress??o da patologia e a invasividade tumoral. Os resultados obtidos mostram que n??o h?? aumento da concentra????o microvesicular em sangue perif??rico quando comparado o grupo de pacientes com o grupo controle. Os dados encontrados mostram que o miR-146b e o miR-150 apresentam-se diferencialmente expressos em pacientes com mielofibrose, com pouca express??o. J?? o miR-221 e o miR-143 n??o apresentaram detec????o na t??cnica, o que o que leva a concluir que estes miRNAs s??o pr??prios do microambiente medular ou n??o s??o liberados no conte??do microvesicular. Quanto a ensaio de migra????o o resultado mostra que n??o houve influ??ncia das microves??culas no processo de prolifera????o e migra????o celular e pode ser considerado que as microves??culas isoladas em nosso estudo podem n??o apresentar este papel por n??o serem exclusivamente do ambiente medular. Como perspectivas futuras, ensaios com microves??culas retiradas da medula ??ssea poder??o ser realizados.
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Análise cromossômica por microarranjo em pacientes com mielofibrosePaula Junior, Milton Rego de 09 May 2018 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2018. / Submitted by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-10-02T21:33:20Z
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Previous issue date: 2018-10-09 / A Mielofibrose (MF), conhecida também como Metaplasia Mielóide Agnogênica ou Mielofibrose Crônica Idiopática, é a menos frequente das neoplasias mieloproliferativas, sendo uma doença clonal ocasionada pela transformação neoplásica de célula hematopoiética pluripotente acompanhada de alterações reacionais intensas do estroma medular com fibrose colagênica, osteoesclrose e angiogênese. A MF é caracterizada por citopenias e/ou leucocitose, leucoeritroblastose, fibrose progressiva da medula óssea e hematopoiese extramedular com esplenomegalia. A patogênese molecular ainda é desconhecida e envolve várias alterações citogenéticas. O principal objetivo deste estudo foi investigar a presença de rearranjos cromossômicos em pacientes com MF. A análise cromossômica por microarranjos (CMA) permitiu ampliar o alcance e a sensibilidade na detecção de deleções e duplicações submicroscópicas para a compreensão de seus papéis que podem influenciar o diagnósitico, prognóstiico e evolução da MF e tem revelado alterações associadas à MF. Foram selecionados 16 pacientes, sendo 13 com mielofibrose primária e 3 pacientes com MF pós TE (MF pós trombocitemia Essencial). Em todos eles foi realizada uma investigação de alterações cromossômicas submicroscópicas por meio da CMA utilizando a plataforma Affymetrix CytoScan™750k (Affymetrix, EUA) e CytoScan HD. A citogenética convencional revelou anormalidades cromossômicas em 3 dos 16 casos (18,75%), enquanto que a análise de microarranjos cromossômicos detectou variações no número de cópias (CNV) ou segmentos de perda de heterozigose (LOH) em 10 de 16 (62,5%) pacientes. Estes incluíram 48 LOHs, 14 deleções, uma trissomia e uma duplicação. Dez pacientes apresentaram anormalidades cromossômicas múltiplas, variando de duas a treze CNVs ou LOHs. As alterações incluíam um total de 6196 genes, sendo 69 já associados com cânceres e 17 descritos em neoplasias hematológicas. Considerando que a maioria das CNV identificadas foram menores do que a resolução do cariotipo e a alta freqüência de LOHs em nosso estudo, propomos que as plataformas de microarranjo cromossômico que combinem oligos e polimorfismo de único nucleotídeo (SNP) devem ser investigadas como um teste genético de primeira linha para auxiliar o diagnóstico em pacientes com mielofibrose. / Myelofibrosis (PM), also known as Agnogenic Myeloid Metaplasia or Idiopathic Chronic Myelofibrosis, is the least frequent of myeloproliferative neoplasms. It is characterized by a clonal disease caused by the neoplastic transformation of pluripotent hematopoietic cells accompanied by intense reactional alterations of the medullary stroma with collagen fibrosis, osteosclerosis and angiogenesis. It is characterized by cytopenias and / or leukocytosis, leukoeritroblastosis, progressive fibrosis of the bone marrow and extramedullary hematopoiesis with splenomegaly. Molecular pathogenesis is still unknown and involves several cytogenetic changes. The main goal of this study was to investigate the presence of chromosomal rearrangements in patients with MF Chromosome Microarray Analysis (CMA) has allowed increasing the sensitivity in the detection of submicroscopic deletions and duplications and the understanding of their roles in the pathogenic processes and has revealed alterations associated with MF. Sixteen patients were selected, 13 of whom had primary myelofibrosis and 3 patients with myelofibrosis pos- ET. In all of them, an investigation of submicroscopic chromosomal alterations was performed using the Affymetrix CytoScan ™ 750k (Affymetrix, USA) and CytoScan HD platform. Conventional cytogenetics revealed chromosomal abnormalities in 3 of the 16 cases (18.7%), whereas the analysis of chromosomal microarrays detected variations in number of copies (CNV) or loss of heterozygosity change (LOH) in 10 of 16 (66,5%) patients. These included 48 LOHs, 14 deletions, one trisomy and one duplication. Ten patients had multiple chromosomal abnormalities, ranging from two to thirteen CNVs or LOHs. The alterations encompassed a total of 6196 genes, 69 asociated to cancers and 17 described in hematological malignancies. Considering that most of the CNVs identified were smaller than the resolution of the karyotype and the high frequency of LOHs in our study, we propose that chromosomal microarray platforms that combine oligos and single nucleotide polymorphism (SNP) should be used as a genetic test of the first line to aid the diagnosis in patients with myelofibrosis.
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Análise do perfil de mutações driver por MLPA em pacientes com MielofibroseNascimento, Juliana Minuncio 28 November 2017 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2017. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-02-16T18:16:36Z
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Previous issue date: 2018-02-16 / A Mielofibrose é a mais rara e severa das Neoplasias Mieloproliferativas Crônicas Philadelphia negativas. Caracteriza-se por fibrose medular, hematopoese extramedular e expressão anormal de citocinas inflamatórias, que resultam em citopenias, organomegalias, sintomas constitucionais, eventos trombohemorrágicos e evolução para Leucemia Aguda. Pode ocorrer de novo ou pós Policitemia Vera ou Trombocitemia Essencial, a partir da expansão clonal de uma célula tronco hematopoética desencadeada por uma mutação somática envolvendo os genes JAK2, CALR ou MPL, combinada a desregulação dos nichos hematopoéticos, a mutações e a anomalias citogenéticas adicionais. Este estudo visou caracterizar o perfil de mutações driver de portadores de Mielofibrose primária e secundária acompanhados em um serviço público terciário de Hematologia, e correlacionar este perfil aos desfechos clínicos dos doentes. A pesquisa das mutações JAK2 V617F (éxon 14) e éxon 12, CALR c.1092_1143del52 e c.1154_1155insTTGTC (éxon 9) e MPL W515K e W515L foi realizada em 31 indivíduos por meio da técnica de MLPA, método de análise de DNA que permite a pesquisa simultânea de diferentes mutações, em diferentes amostras. A mutação JAK2V617F foi encontrada em 48,4% dos pacientes, mutações indel do éxon 9 da CALR em 38,7% (em 66,7% destes a mutação del52, e em 33,3% a mutação insTTGTC), e a mutação MPL W515L em 3,2% dos pacientes. 9,7% dos pacientes eram triplo-negativos. Os pacientes com JAK2 mutada eram mais idosos, com menor grau de anemia e maior frequência de leucocitose, enquanto os portadores de mutações da CALR apresentavam menor frequência de leucocitose e plaquetopenia. Os indivíduos triplo-negativos apresentaram a menor mediana de idade ao diagnóstico (49,3 anos) e fenótipo de falência medular semelhante a Síndrome Mielodisplásica. A estratificação de risco por DIPSS foi semelhante à relatada em outros centros. O tempo mediano de acompanhamento foi de 32 meses (variando de 10 meses a 13 anos), sendo registrados fenômenos tromboembólicos em 19,3% e evolução para LMA em 6,4% dos pacientes. A taxa de mortalidade foi de 29%, e a sobrevida média após o diagnóstico foi de 68,3 meses. Os indivíduos com mutação da CALR apresentaram maior sobrevida média. A mediana de sobrevida de acordo com o DIPSS foi superior à prevista pelo modelo prognóstico, possivelmente pela maior frequência de mutações da CALR observada nesta população. Maior tempo de seguimento e inclusão de novos pacientes são necessários para melhor avaliação de desfechos e confirmação da maior prevalência de mutações da CALR. A pesquisa de mutações driver é essencial para sustentação diagnóstica, define subgrupos de doentes com características clínicas peculiares e, aliada a pesquisa de mutações colaborativas, tem impacto prognóstico. O complexo panorama genético envolvido na iniciação e progressão das NMP, especialmente a Mielofibrose, instiga a adoção de modelos integrativos de estratificação prognóstica. Neste cenário, o MLPA é uma potente ferramenta para estudo molecular, e um promissor aliado na caracterização das NMP. / Myelofibrosis is the rarest and most severe Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasm and can present de novo or post Polycythemia Vera or Essential Thrombocythemia. It is characterized by bone marrow fibrosis, extramedullary hematopoiesis and abnormal expression of inflammatory cytokines, which result in cytopenias, organomegaly, constitutional symptoms, thrombohemorrhagic events and progression to Acute Leukemia. The disease arises from clonal expansion of a single hematopoietic stem cell (HSC), driven by a somatic mutation of JAK2, CALR or MPL genes combined with dysregulation of hematopoietic microenvironment, additional mutations and cytogenetic abnormalities. This study aimed to assess driver mutations status in patients with primary and secondary myelofibrosis accompanied at a tertiary Brazilian public hospital, and to correlate their mutational profile with clinical outcomes. The search for JAK2V617F, exon 12 JAK2, calreticulin exon 9 c.1092_1143del52 and c.1154_1155insTTGT, MPLW515K and MPLW515L mutations was performed in 31 subjects using MLPA technique, a method of DNA analysis that allows simultaneous appraisal of different mutations in multiple samples. JAK2V617F mutation was found in 48.4% of patients, indel CALR mutations in 38.7% of patients (of these, 66.7% harbored del52 bp, 33.3% harbored insTTGTC), MPL W515L in 3.2% of patients and 9.7% of patients were triple-negative. Patients with mutated JAK2 were older, with minor degree of anemia and more leukocytosis, whereas those with CALR mutations had less frequency of leukocytosis and thrombocytopenia. Triple-negative subjects displayed the lowest median age at diagnosis (49.3 years), and bone marrow failure phenotype, similar to Myelodysplastic Syndrome. Risk stratification provided by DIPSS was similar to other centers. Median follow-up time was 32 months (ranging from 10 months to 13 years). Thromboembolic phenomena were recorded in 19.3% of patients, and evolution to AML in 6.4% of patients. Mortality rate was 29%, and mean survival after diagnosis was 68.3 months. CALR mutated individuals presented higher average survival. Median survival according to DIPSS was higher than predicted by the prognostic model, possibly due to the higher frequency of CALR mutations reported. Longer follow-up and inclusion of new patients are necessary for better evaluation of outcomes and confirmation of the higher prevalence of CALR mutations. Driver mutations assessment is essential for diagnostic support, defines subgroups with peculiar clinical characteristics and, combined with collaborative mutations evaluation, has prognostic impact. The complex genetic landscape involved in initiation and progression of MPN, especially Myelofibrosis, instigates the adoption of integrative prognostic stratification models. In this scenario, MLPA is a powerful tool for molecular study, and a promising ally for MPN molecular characterization.
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Efeito de SMADs<i/> e de microRNAs na expressão gênica de TGF-β1 e seu papel na angiogênese em pacientes com mielofibrose e trombocitemia essencial / Effects of SMADs and microRNAs in TGF-β1 gene expression and its role in the angiogenesis pathophysiology in myelofibrosis and essential thrombocythemia patients.Nunes, Daniela Prudente Teixeira 07 August 2015 (has links)
OBJETIVO: Investigar o efeito da expressão de RNAm dos SMADs e de microRNAs (miRNAs) que possuem o TGFB1 como alvo na expressão gênica (RNAm e proteína) de TGF-β1 e seu papel na fisiopatologia da angiogênese em pacientes com mielofibrose (MF) e trombocitemia essencial (TE). MÉTODOS: Foram incluídos 21 pacientes com MF primária (MFP), 21 com MF pós-TE (MFPTE) e 24 com TE, além de 98 indivíduos controles pareados de acordo com gênero e idade com os pacientes. As análises realizadas no sangue periférico foram: quantificação das concentrações plasmáticas e de RNAm de TGFB1, VEGFA e FGF2; quantificação de RNAm de SMADs 1 a 7 e de miRNAs 193a-5p, 369-5p, 542-5p, 590-3p, e 590- 5p; e detecção das mutações JAK2V617F (com quantificação alélica), MPLW515K/L e CALR. Em 26 biópsias de medula óssea dos pacientes, foram determinados o grau de microvasculatura (angiogênese estimada - CD34), a imunoexpressão de TGF-b1 ativo, TGF-β1 latente e c-MPL. RESULTADOS: As concentrações de TGF- β1 plasmático foram semelhantes entre os pacientes e controles, enquanto o VEGFA plasmático foi maior em todos os grupos de pacientes comparados aos seus controles. O FGF2 plasmático também foi maior em todos os grupos de pacientes, e a expressão de seu RNAm foi maior nos pacientes com TE do que em seus controles. As expressões de SMADs e de miRNAs foram semelhantes entre pacientes e controles. TGF-β1 e FGF2 plasmáticos apresentaram correlações positivas nos pacientes com MFP, e correlações negativas nos seus controles, assim como nos controles de MFPTE. Em todos os grupos estudados foi observada correlação positiva entre TGF-β1 e VEGFA plasmáticos. Além disso, foram demonstrados diferentes perfis de correlações entre a expressão gênica de TGF-β1 e os diversos SMADs e miRNAs em cada grupo de pacientes e controles. Os pacientes com MFP com maior angiogênese (de acordo com a mediana da concentração plasmática de VEGFA e FGF2) apresentaram maiores concentrações plasmáticas de TGF-β1 do que aqueles com menor angiogênese. A angiogênese medular estimada (CD34) não foi diferente entre os três grupos de pacientes estudados. Além disso, não foram encontradas correlações entre a imunoexpressão de CD34 e as expressões de RNAm de TGFB1, VEGFA e FGF2 medulares nem em leucócitos de sangue periférico, ou a concentrações plasmáticas de TGF-β1, VEGFA e FGF2. As imunoexpressões de TGF-b1 ativo, TGF-β1 latente e c-MPL foram semelhantes entre os três grupos de pacientes. As frequências das mutações avaliadas foram similares às descritas na literatura. Os pacientes com MFPTE portadores de mutação CALR apresentaram menores concentrações plasmáticas de VEGFA e FGF2 do que os JAK2V617F positivos, enquanto os pacientes com TE portadores de mutação CALR exibiram menores concentrações plasmáticas de TGF-β1 do que os portadores de JAK2V617F. CONCLUSÕES: O presente trabalho permitiu confirmar a correlação positiva entre o TGF-β1 com outros dois marcadores de angiogênese (VEGFA e FGF2). As expressões de SMADs e de miRNAs estudados foram semelhantes entre pacientes e controles, visto não haver diferenças na expressão gênica de TGF-β1. Entretanto, disparidades encontradas nas correlações entre a expressão gênica de TGF-β1 e diferentes SMADs e miRNAs nos pacientes e controles poderiam indicar que a regulação da expressão gênica de TGF-β1 nas doenças estudadas seja distinta da apresentada nos indivíduos sem essas doenças. / AIM: To investigate the effects of the expression of SMADs mRNA and microRNAs (miRNAs) that target TGFB1 in TGF-β1 gene expression (mRNA and protein) and its role in the angiogenesis pathophysiology in myelofibrosis (MF) and essential thrombocythemia (ET) patients. METHODS: Twenty-one primary MF (PMF), twenty-one MF post-ET (MPET) and twenty-four ET patients were included, besides 98 controls matched for gender and age with patients. In peripheral blood were assessed: TGF-β1, VEGFA and FGF2 plasmatic levels and mRNA quantification; SMADs 1 to 7 mRNA quantification and miRNAs 193a-5p, 369-5p, 542-5p, 590-3p, and 590-5p quantification; and detection of JAK2V617F (and allele burden), MPLW515K/L and CALR mutations. Estimated angiogenesis (microvessel grade - CD34), active TGF-b1, latent TGF-β and c-MPL immunoexpression were determined in 26 bone marrow biopsies. RESULTS: Plasmatic TGF-β1 levels were similar in patients and controls, while all the patients groups had higher plasmatic VEGFA than controls. Plasmatic FGF2 was higher in all the patients groups, and its mRNA expression was higher in ET patients than in controls. No differences in SMADs and miRNAs expression were found between patients and controls. There was a positive correlation between plasmatic TGF-β1 and FGF2 in PMF, and a negative correlation between these variables in their controls, as well as in MPET controls. In all studied groups, there was a positive correlation between plasmatic TGF-β1 and VEGF. In addition, different profiles of correlations were demonstrated between TGF-β1 gene expression and the several SMADs and miRNAs studied in each group of patients and controls. PMF patients with higher angiogenesis (according to the median of VEGFA and FGF2 plasma levels) had higher plasmatic TGF-β1 levels than those with lower angiogenesis. Estimated angiogenesis (CD34) in bone marrow biopsies were not different among PMF, MPET and ET patients. Moreover, there were no correlation between CD34 immunoexpression and TGFB1, VEGFA and FGF2 mRNA bone marrow or peripheral blood expression or plasmatic levels, as well as latent TGF-β1, active TGF-b1, and c-MPL immunoexpression were similar in patients studied groups. The frequencies of evaluated mutations were similar to previously reported. MPET patients harboring CALR mutations had lower plasmatic VEGFA and FGF2 than JAK2V617F mutated, while ET patients carrying CALR mutations had lower plasmatic TGF-β1 than JAK2V617F mutated. CONCLUSIONS: This study confirmed the positive correlation among TGF-β1 and two other markers of angiogenesis (VEGFA and FGF2). SMADs and miRNAs expressions were similar between patients and controls, since there were no differences in TGF-β1 gene expression between patients and controls. However, disparities found in the correlations between TGF-β1 gene expression and different SMADs and miRNAs in patients and controls may indicate that TGF-β1 gene expression regulation in studied diseases is distinct from those presented by individuals without these diseases.
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Impacto da análise molecular da mutação JAK2V617F no diagnóstico de neoplasias mieloproliferativas crônicas de acordo com os critérios da OMS 2016Pedrazzani, Fabiane Spagnol January 2016 (has links)
As neoplasias mieloproliferativas (NMPs) são um grupo de doenças derivadas de uma transformação clonal de célula tronco hematopoiéticas no qual a linhagem celular mielóide é predominantemente expandida no sangue periférico. As NMPs Philadelphia-negativas incluem policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primária (MFP) que compartilham muitas características hematológicas, clínicas e evolutivas. A mutação da JAK2 (JAK2V617F) está presente em cerca de 95% dos pacientes com PV, entre 50 a 70% com TE e 40 a 50% com MFP. No entanto, os testes moleculares para diagnóstico são muitas vezes um desafio devido ao alto custo e a disponibilidade de equipamentos especializados. Objetivo: Verificar o impacto do teste molecular da mutação JAK2V617F para o diagnóstico de NMPs nos pacientes atendidos no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Métodos: Foram avaliados 87 pacientes com suspeita de NMPs. As amostras de sangue periférico foram analisadas para a mutação JAK2V617F pelo método genético molecular de PCR alelo-específico e os resultados correlacionados com os dados clínico-laboratoriais. Para estabelecimento do diagnóstico, foram utilizados os critérios da Organização Mundial da Saúde (OMS) de 2016. Resultados: Dos 87 pacientes avaliados, 27,6% foram diagnosticados como PV, 39,1% como TE, 4,6% como MFP e 28,7% não contemplavam os critérios para o diagnóstico NMPs. A comparação da utilização do teste da mutação JAK2V617F mostrou que, apenas 41,7% dos pacientes com PV sem utilizar o teste, teriam sido diagnosticados comparados a 91,7% utilizando este teste como um dos critérios no diagnóstico final (p = 0,004). Na TE e na MFP, este critério não foi estatisticamente significativo. Conclusão: O teste molecular para a mutação de JAK2V617F no nosso hospital teve um impacto significativo no diagnóstico dos pacientes com PV, mostrando ser uma ferramenta importante para o diagnóstico final desta NMP. / Myeloproliferative neoplasms (MPNs) are a group of disorders derived from a clonal transformation of stem cell on which myeloid cell lineage is predominantly expanded in the peripheral blood. Philadelphia-negative MPNs include polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET), and primary myelofibrosis (PMF) which share many hematological, clinical, and evolutionary characteristics. The JAK2 mutation (JAK2V617F) is present in about 95% of patients with PV, between 50 to 70% with ET and 40 to 50% PMF. However, the molecular diagnostic tests are often a challenge due to the high cost and the availability of specialized equipment. Objective: To verify the impact of molecular testing of the JAK2V617F mutation for the diagnosis of MPNs in patients attended at Hospital de Clinics, Porto Alegre. Methods: A total of 97 patients were evaluated with suspected of MPNs. The peripheral blood samples were analyzed for the JAK2V617F mutation by the molecular genetic allelespecific PCR method and the results correlated with the clinical-laboratory data. To establish the diagnosis, the 2016 World Health Organization (WHO) criteria were used. Results: Of the 87 patients evaluated, 27.6% were diagnosed as PV, 39.1% as ET, 4.6% as PMF and 28.7% did not meet criteria for MPNs diagnosis. Comparison of the use of the JAK2V617F test showed that only 41.7% of patients with PV without the mutation test were diagnosed compared to 91.7% using this test as one of the criteria for the final diagnosis (p = 0.004). In the ET and the PMF, this criterion was not statistically significant. Conclusion: The molecular test for the JAK2V617F mutation in our hospital had a significant impact in the diagnosis of patients with PV, showing to be an important tool for the final diagnosis of this MPN.
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Efeito do imatinibe em células provenientes do estroma da medula óssea de camundongos em cultura primária e linhagem celular fibroblástica S17 sob estímulo do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) in vitroChristofoletti, Larissa Duarte 25 October 2012 (has links)
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-graduação em Farmácia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T14:09:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1
282615.pdf: 1949422 bytes, checksum: 590c4d341ae6a1774c58a4fb5020771a (MD5) / A mielofibrose primária (MP) é uma desordem mieloproliferativa crônica caracterizada pela hiperplasia e fibrose medular. A fibrose característica dessa desordem está relacionada à liberação de fatores de crescimento hematopoiéticos, dentre eles o fator derivado de plaquetas, que estimula a proliferação de fibroblastos, com conseqüente depósito de fibras colágenas e reticulínicas. O desenvolvimento de fibras de colágeno no lugar do tecido hematopoiético normal é o responsável pela maioria dos sintomas da doença. O exame histopatológico revela o aumento da reticulina fibrilar, do colágeno e dos fibroblastos na medula óssea (MO). O tratamento da doença é paliativo, visando amenizar os sintomas e melhorar a qualidade de vida do paciente. Atualmente não existe nenhuma terapia capaz de inibir o processo fibrótico. O objetivo desse trabalho é verificar o efeito do fármaco imatinibe em linhagens de células provenientes do estroma da MO de camundongos e linhagem celular fibroblástica S17 sob estímulo do PDGF in vitro na busca de uma terapia eficaz para a MP. Este fármaco foi desenvolvido para o tratamento da leucemia mielóide crônica e atualmente tem sido alvo de estudo para outras doenças. A partir da realização de cultura primária da medula óssea de camundongos (CP) e cultura das células S17 foi avaliada: a viabilidade celular do estroma medular e das células hematopoéticas pelo método de azul de tripan e 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, a yellow tetrazole (MTT), a viabilidade celular/apoptose das células S17 pelo método de laranja de acridina/brometo de etídio (LA/BE) e o ciclo celular pelo iodeto de propídio (IP) das células S17. O imatinibe exerceu um efeito inibitório sobre a viabilidade celular em CP a partir da concentração de 2,5 ?M em células do estroma e em células hematopoéticas e sob o estímulo do PDGF o efeito inibitório foi a partir de 2,5 ?M e 1,0 ?M respectivamente. O tipo celular predominantemente afetado pelo imatinibe nas CP foi os fibroblastos. O imatinibe exerceu um efeito inibitório sobre a viabilidade celular em células fibroblásticas S17 a partir da concentração de 2,5 ?M sem estímulo e 1,0 ?M com estímulo de PDGF. As IC50 calculada para as CP sem estímulo foi 14,2 ?M e com estímulo 13,5 ?M; para as células S17 sem estímulo foi 9,1 ?M e com estímulo 8,8 ?M. Na concentração de 7,5 ?M, o efeito inibitório foi de 48% e 55% para células S17 com e sem estimulo de PDGF, respectivamente. Com auxílio da técnica LA/BE confirmou-se os resultados anteriores de viabilidade da célula S17 sob ação do Imatinibe e mostrou que, em 5,0 ?M não houve processo de apoptose, porém em 7,5 ?M induziu apoptose.O imatinibe exerceu bloqueio do ciclo celular das células S17 nas fases G0/G1 e G2/M sem estímulo e com estímulo do PDGF. Com estímulo de PDGF houve aumento de células na fase S, sugerindo que o PDGF estimula as células S17 e que o fármaco atua principalmente nos fibroblastos em proliferação. / The antineoplastic agents affect cells that are in the process of cell division, thus rapid rate of cell renewal and differentiation of bone marrow (BM) makes the hematopoietic system a susceptible target toxicity by these agents. The BM is formed by a stroma composed of many cell types (fibroblasts, macrophages, endothelial cells and adipocytes) and an extracellular matrix that together form an ideal microenvironment favoring the modulation of quiescence, self-renewal and commitment of mesenchymal stem cells (MSCs), as well as proliferation, maturation and apoptosis of hematopoietic cells. In this context, the objective this work was to evaluate the effects of Imatinib Mesylate (IM), a drug inhibitor of tyrosine kinase proteins and receptors as c-Kit, platelet derived growth factor (PDGF), stem cell factor (SCF), c-Abl, BCR-ABL, involved in different signaling pathways of hematopoietic progenitor cells (CFU-GM) and stromal cells from BM of healthy mice. By clonogenic assays in semisolid medium and culture of adherent stromal cells from the BM, we evaluated the potential myelosuppressive of IM through the test cell viability MTT and Acridine Orange/Ethidium Bromide (AO/EB), cytochemistry to identify of adipocytes, cell cycle, cell proliferation by incorporation of BrdU and expression of alpha-smooth muscle actin (a-SMA). As for hematopoietic cells, the results showed that the MI gradually reduced the growth of colonies of granulocytes/macrophages (CFU-GM), the IC50 obtained was 26.5µM and total inhibition occurred at 60µM. The stromal cells in 4 and 8 days of culture, no significant difference in the percentage of proliferation measured by BrdU incorporation, and in 10µM there was a tendency to increase proliferation. In 14 days the proliferation decreased gradually and at 7.5 µM proliferation was reduced to about 5%. The percentage of viable cells by MTT was similar at 7 and 14 days, rising to 10µM and then reducing to reach 0% at 25µM. The morphology of most cells untreated and cells treated with low concentrations of IM (2.5µM) was typically fibroblastic, and in more elevated concentrations of IM (mainly from 10µM), the predominant cells were rounded morphology of type macrophages, which were inhibited only at high concentrations (20-25µM). Fluorescence with AO/EB showed the same results seen in the MTT and revealed the presence of apoptotic bodies, especially in 20µM, confirming the drug effect on cell viability. The cell cycle of stromal cells from the BM on day 14 of culture indicates the occurrence of blockage of cells in G0/G1 phase (66.3% in control to 91.5% in 15µM) and decreased the percentage of cells in S phase and G2/M. At 2.5µM, the expression of a-SMA decreased to 45.74% and was almost completely inhibited from 10µM. The presence of adipocytes stained with Oil Red was observed only in the control group. These results together suggest a myelossupressive effect of IM on healthy cells of the BM, which is undesirable since the majority of patients of will be exposed for a long time with this drug.
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Impacto da análise molecular da mutação JAK2V617F no diagnóstico de neoplasias mieloproliferativas crônicas de acordo com os critérios da OMS 2016Pedrazzani, Fabiane Spagnol January 2016 (has links)
As neoplasias mieloproliferativas (NMPs) são um grupo de doenças derivadas de uma transformação clonal de célula tronco hematopoiéticas no qual a linhagem celular mielóide é predominantemente expandida no sangue periférico. As NMPs Philadelphia-negativas incluem policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primária (MFP) que compartilham muitas características hematológicas, clínicas e evolutivas. A mutação da JAK2 (JAK2V617F) está presente em cerca de 95% dos pacientes com PV, entre 50 a 70% com TE e 40 a 50% com MFP. No entanto, os testes moleculares para diagnóstico são muitas vezes um desafio devido ao alto custo e a disponibilidade de equipamentos especializados. Objetivo: Verificar o impacto do teste molecular da mutação JAK2V617F para o diagnóstico de NMPs nos pacientes atendidos no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Métodos: Foram avaliados 87 pacientes com suspeita de NMPs. As amostras de sangue periférico foram analisadas para a mutação JAK2V617F pelo método genético molecular de PCR alelo-específico e os resultados correlacionados com os dados clínico-laboratoriais. Para estabelecimento do diagnóstico, foram utilizados os critérios da Organização Mundial da Saúde (OMS) de 2016. Resultados: Dos 87 pacientes avaliados, 27,6% foram diagnosticados como PV, 39,1% como TE, 4,6% como MFP e 28,7% não contemplavam os critérios para o diagnóstico NMPs. A comparação da utilização do teste da mutação JAK2V617F mostrou que, apenas 41,7% dos pacientes com PV sem utilizar o teste, teriam sido diagnosticados comparados a 91,7% utilizando este teste como um dos critérios no diagnóstico final (p = 0,004). Na TE e na MFP, este critério não foi estatisticamente significativo. Conclusão: O teste molecular para a mutação de JAK2V617F no nosso hospital teve um impacto significativo no diagnóstico dos pacientes com PV, mostrando ser uma ferramenta importante para o diagnóstico final desta NMP. / Myeloproliferative neoplasms (MPNs) are a group of disorders derived from a clonal transformation of stem cell on which myeloid cell lineage is predominantly expanded in the peripheral blood. Philadelphia-negative MPNs include polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET), and primary myelofibrosis (PMF) which share many hematological, clinical, and evolutionary characteristics. The JAK2 mutation (JAK2V617F) is present in about 95% of patients with PV, between 50 to 70% with ET and 40 to 50% PMF. However, the molecular diagnostic tests are often a challenge due to the high cost and the availability of specialized equipment. Objective: To verify the impact of molecular testing of the JAK2V617F mutation for the diagnosis of MPNs in patients attended at Hospital de Clinics, Porto Alegre. Methods: A total of 97 patients were evaluated with suspected of MPNs. The peripheral blood samples were analyzed for the JAK2V617F mutation by the molecular genetic allelespecific PCR method and the results correlated with the clinical-laboratory data. To establish the diagnosis, the 2016 World Health Organization (WHO) criteria were used. Results: Of the 87 patients evaluated, 27.6% were diagnosed as PV, 39.1% as ET, 4.6% as PMF and 28.7% did not meet criteria for MPNs diagnosis. Comparison of the use of the JAK2V617F test showed that only 41.7% of patients with PV without the mutation test were diagnosed compared to 91.7% using this test as one of the criteria for the final diagnosis (p = 0.004). In the ET and the PMF, this criterion was not statistically significant. Conclusion: The molecular test for the JAK2V617F mutation in our hospital had a significant impact in the diagnosis of patients with PV, showing to be an important tool for the final diagnosis of this MPN.
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Impacto da análise molecular da mutação JAK2V617F no diagnóstico de neoplasias mieloproliferativas crônicas de acordo com os critérios da OMS 2016Pedrazzani, Fabiane Spagnol January 2016 (has links)
As neoplasias mieloproliferativas (NMPs) são um grupo de doenças derivadas de uma transformação clonal de célula tronco hematopoiéticas no qual a linhagem celular mielóide é predominantemente expandida no sangue periférico. As NMPs Philadelphia-negativas incluem policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primária (MFP) que compartilham muitas características hematológicas, clínicas e evolutivas. A mutação da JAK2 (JAK2V617F) está presente em cerca de 95% dos pacientes com PV, entre 50 a 70% com TE e 40 a 50% com MFP. No entanto, os testes moleculares para diagnóstico são muitas vezes um desafio devido ao alto custo e a disponibilidade de equipamentos especializados. Objetivo: Verificar o impacto do teste molecular da mutação JAK2V617F para o diagnóstico de NMPs nos pacientes atendidos no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Métodos: Foram avaliados 87 pacientes com suspeita de NMPs. As amostras de sangue periférico foram analisadas para a mutação JAK2V617F pelo método genético molecular de PCR alelo-específico e os resultados correlacionados com os dados clínico-laboratoriais. Para estabelecimento do diagnóstico, foram utilizados os critérios da Organização Mundial da Saúde (OMS) de 2016. Resultados: Dos 87 pacientes avaliados, 27,6% foram diagnosticados como PV, 39,1% como TE, 4,6% como MFP e 28,7% não contemplavam os critérios para o diagnóstico NMPs. A comparação da utilização do teste da mutação JAK2V617F mostrou que, apenas 41,7% dos pacientes com PV sem utilizar o teste, teriam sido diagnosticados comparados a 91,7% utilizando este teste como um dos critérios no diagnóstico final (p = 0,004). Na TE e na MFP, este critério não foi estatisticamente significativo. Conclusão: O teste molecular para a mutação de JAK2V617F no nosso hospital teve um impacto significativo no diagnóstico dos pacientes com PV, mostrando ser uma ferramenta importante para o diagnóstico final desta NMP. / Myeloproliferative neoplasms (MPNs) are a group of disorders derived from a clonal transformation of stem cell on which myeloid cell lineage is predominantly expanded in the peripheral blood. Philadelphia-negative MPNs include polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET), and primary myelofibrosis (PMF) which share many hematological, clinical, and evolutionary characteristics. The JAK2 mutation (JAK2V617F) is present in about 95% of patients with PV, between 50 to 70% with ET and 40 to 50% PMF. However, the molecular diagnostic tests are often a challenge due to the high cost and the availability of specialized equipment. Objective: To verify the impact of molecular testing of the JAK2V617F mutation for the diagnosis of MPNs in patients attended at Hospital de Clinics, Porto Alegre. Methods: A total of 97 patients were evaluated with suspected of MPNs. The peripheral blood samples were analyzed for the JAK2V617F mutation by the molecular genetic allelespecific PCR method and the results correlated with the clinical-laboratory data. To establish the diagnosis, the 2016 World Health Organization (WHO) criteria were used. Results: Of the 87 patients evaluated, 27.6% were diagnosed as PV, 39.1% as ET, 4.6% as PMF and 28.7% did not meet criteria for MPNs diagnosis. Comparison of the use of the JAK2V617F test showed that only 41.7% of patients with PV without the mutation test were diagnosed compared to 91.7% using this test as one of the criteria for the final diagnosis (p = 0.004). In the ET and the PMF, this criterion was not statistically significant. Conclusion: The molecular test for the JAK2V617F mutation in our hospital had a significant impact in the diagnosis of patients with PV, showing to be an important tool for the final diagnosis of this MPN.
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Efeito de SMADs<i/> e de microRNAs na expressão gênica de TGF-β1 e seu papel na angiogênese em pacientes com mielofibrose e trombocitemia essencial / Effects of SMADs and microRNAs in TGF-β1 gene expression and its role in the angiogenesis pathophysiology in myelofibrosis and essential thrombocythemia patients.Daniela Prudente Teixeira Nunes 07 August 2015 (has links)
OBJETIVO: Investigar o efeito da expressão de RNAm dos SMADs e de microRNAs (miRNAs) que possuem o TGFB1 como alvo na expressão gênica (RNAm e proteína) de TGF-β1 e seu papel na fisiopatologia da angiogênese em pacientes com mielofibrose (MF) e trombocitemia essencial (TE). MÉTODOS: Foram incluídos 21 pacientes com MF primária (MFP), 21 com MF pós-TE (MFPTE) e 24 com TE, além de 98 indivíduos controles pareados de acordo com gênero e idade com os pacientes. As análises realizadas no sangue periférico foram: quantificação das concentrações plasmáticas e de RNAm de TGFB1, VEGFA e FGF2; quantificação de RNAm de SMADs 1 a 7 e de miRNAs 193a-5p, 369-5p, 542-5p, 590-3p, e 590- 5p; e detecção das mutações JAK2V617F (com quantificação alélica), MPLW515K/L e CALR. Em 26 biópsias de medula óssea dos pacientes, foram determinados o grau de microvasculatura (angiogênese estimada - CD34), a imunoexpressão de TGF-b1 ativo, TGF-β1 latente e c-MPL. RESULTADOS: As concentrações de TGF- β1 plasmático foram semelhantes entre os pacientes e controles, enquanto o VEGFA plasmático foi maior em todos os grupos de pacientes comparados aos seus controles. O FGF2 plasmático também foi maior em todos os grupos de pacientes, e a expressão de seu RNAm foi maior nos pacientes com TE do que em seus controles. As expressões de SMADs e de miRNAs foram semelhantes entre pacientes e controles. TGF-β1 e FGF2 plasmáticos apresentaram correlações positivas nos pacientes com MFP, e correlações negativas nos seus controles, assim como nos controles de MFPTE. Em todos os grupos estudados foi observada correlação positiva entre TGF-β1 e VEGFA plasmáticos. Além disso, foram demonstrados diferentes perfis de correlações entre a expressão gênica de TGF-β1 e os diversos SMADs e miRNAs em cada grupo de pacientes e controles. Os pacientes com MFP com maior angiogênese (de acordo com a mediana da concentração plasmática de VEGFA e FGF2) apresentaram maiores concentrações plasmáticas de TGF-β1 do que aqueles com menor angiogênese. A angiogênese medular estimada (CD34) não foi diferente entre os três grupos de pacientes estudados. Além disso, não foram encontradas correlações entre a imunoexpressão de CD34 e as expressões de RNAm de TGFB1, VEGFA e FGF2 medulares nem em leucócitos de sangue periférico, ou a concentrações plasmáticas de TGF-β1, VEGFA e FGF2. As imunoexpressões de TGF-b1 ativo, TGF-β1 latente e c-MPL foram semelhantes entre os três grupos de pacientes. As frequências das mutações avaliadas foram similares às descritas na literatura. Os pacientes com MFPTE portadores de mutação CALR apresentaram menores concentrações plasmáticas de VEGFA e FGF2 do que os JAK2V617F positivos, enquanto os pacientes com TE portadores de mutação CALR exibiram menores concentrações plasmáticas de TGF-β1 do que os portadores de JAK2V617F. CONCLUSÕES: O presente trabalho permitiu confirmar a correlação positiva entre o TGF-β1 com outros dois marcadores de angiogênese (VEGFA e FGF2). As expressões de SMADs e de miRNAs estudados foram semelhantes entre pacientes e controles, visto não haver diferenças na expressão gênica de TGF-β1. Entretanto, disparidades encontradas nas correlações entre a expressão gênica de TGF-β1 e diferentes SMADs e miRNAs nos pacientes e controles poderiam indicar que a regulação da expressão gênica de TGF-β1 nas doenças estudadas seja distinta da apresentada nos indivíduos sem essas doenças. / AIM: To investigate the effects of the expression of SMADs mRNA and microRNAs (miRNAs) that target TGFB1 in TGF-β1 gene expression (mRNA and protein) and its role in the angiogenesis pathophysiology in myelofibrosis (MF) and essential thrombocythemia (ET) patients. METHODS: Twenty-one primary MF (PMF), twenty-one MF post-ET (MPET) and twenty-four ET patients were included, besides 98 controls matched for gender and age with patients. In peripheral blood were assessed: TGF-β1, VEGFA and FGF2 plasmatic levels and mRNA quantification; SMADs 1 to 7 mRNA quantification and miRNAs 193a-5p, 369-5p, 542-5p, 590-3p, and 590-5p quantification; and detection of JAK2V617F (and allele burden), MPLW515K/L and CALR mutations. Estimated angiogenesis (microvessel grade - CD34), active TGF-b1, latent TGF-β and c-MPL immunoexpression were determined in 26 bone marrow biopsies. RESULTS: Plasmatic TGF-β1 levels were similar in patients and controls, while all the patients groups had higher plasmatic VEGFA than controls. Plasmatic FGF2 was higher in all the patients groups, and its mRNA expression was higher in ET patients than in controls. No differences in SMADs and miRNAs expression were found between patients and controls. There was a positive correlation between plasmatic TGF-β1 and FGF2 in PMF, and a negative correlation between these variables in their controls, as well as in MPET controls. In all studied groups, there was a positive correlation between plasmatic TGF-β1 and VEGF. In addition, different profiles of correlations were demonstrated between TGF-β1 gene expression and the several SMADs and miRNAs studied in each group of patients and controls. PMF patients with higher angiogenesis (according to the median of VEGFA and FGF2 plasma levels) had higher plasmatic TGF-β1 levels than those with lower angiogenesis. Estimated angiogenesis (CD34) in bone marrow biopsies were not different among PMF, MPET and ET patients. Moreover, there were no correlation between CD34 immunoexpression and TGFB1, VEGFA and FGF2 mRNA bone marrow or peripheral blood expression or plasmatic levels, as well as latent TGF-β1, active TGF-b1, and c-MPL immunoexpression were similar in patients studied groups. The frequencies of evaluated mutations were similar to previously reported. MPET patients harboring CALR mutations had lower plasmatic VEGFA and FGF2 than JAK2V617F mutated, while ET patients carrying CALR mutations had lower plasmatic TGF-β1 than JAK2V617F mutated. CONCLUSIONS: This study confirmed the positive correlation among TGF-β1 and two other markers of angiogenesis (VEGFA and FGF2). SMADs and miRNAs expressions were similar between patients and controls, since there were no differences in TGF-β1 gene expression between patients and controls. However, disparities found in the correlations between TGF-β1 gene expression and different SMADs and miRNAs in patients and controls may indicate that TGF-β1 gene expression regulation in studied diseases is distinct from those presented by individuals without these diseases.
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Alterações da expressão de apoptomirs, de genes e proteínas pró- e anti-apoptóticos em Mielofibrose e Trombocitemia Essencial / Deregulated expression of apoptomirs and apoptosis-related genes and proteins in Primary Myelofibrosis and Essential ThrombocythemiaTognon-Ribeiro, Raquel 11 October 2011 (has links)
As Neoplasias Mieloproliferativas Crônicas (NMPC) Trombocitemia Essencial (TE), Mielofibrose (MF) - são desordens hematopoéticas resultantes da expansão clonal da célula tronco hematopoética alterada. Essas doenças caracterizam-se pela independência dos progenitores hematopoéticos aos estímulos dos fatores de crescimento e citocinas e pela proliferação exacerbada das células da linhagem mielóide com maturação preservada. Os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na patogênese e progressão da TE e MF não foram ainda esclarecidos, mas o mieloacúmulo presente nessas doenças parece estar associado à alteração de proliferação e apoptose celular. Nesse contexto, os objetivos deste trabalho foram avaliar em células CD34+ da medula óssea e leucócitos dos pacientes com TE e MF: (1) a expressão de apoptomirs e de genes pró- e anti-apoptóticos pertencentes à via intrínseca e extrínseca da apoptose pela metodologia de RT-PCR em tempo real; (2) expressão de proteínas pró- e anti-apoptóticas por Western-blot; (3) o perfil de sensibilidade das células mononucleares à apoptose induzida por diferentes agentes apoptogênicos pela técnica de citometria de fluxo e (4) correlacionar os resultados obtidos com dados clínico-laboratoriais dos pacientes e com a expressão do gene PRV-1. Em TE, nas células CD34+, foi detectado aumento da expressão de a1, mcl-1, bid, bok e noxa e diminuição de bax em relação aos controles. Nos leucócitos, foi detectada a elevação da expressão de a1, bcl-2, bcl-w e bcl-xL, bad e bok e diminuição de bid e bimEL. Em comparação com o grupo controle, os pacientes com MF apresentaram maior expressão dos genes a1, bcl-w bak, bok e noxa e menor de bcl-2 nas células CD34+. Nos leucócitos dos pacientes com MF foi verificado aumento da expressão dos genes bcl-2, bcl-w e bcl-xL, bad e bok. O c-iap-1 apresentou maior expressão nas células CD34+ dos pacientes com MF e TE, enquanto que o c-iap-2 estava elevado nos leucócitos e células CD34+. Foi ainda detectada a expressão diferencial em TE e MF dos genes pertencentes a via de receptor de morte, como a maior expressão dos genes fas, fas-L, faim e dr4 nas células CD34+ dos pacientes e menor expressão do fas-L e trail nos leucócitos dos pacientes com TE e MF. Os resultados indicaram associação da expressão do gene PRV-1 com a mutação JAK2V617F e com a expressão dos genes a1, bcl-w, bik, bax, c-iap-2 e trail. Com relação à expressão proteica, BCL-XL estava aumentada e TRAIL diminuída em leucócitos de pacientes com MF enquanto que a molécula BID estava diminuída em leucócitos de pacientes com TE. Os miRNA26a, let 7d e miR15a estavam mais expressos nos leucócitos de pacientes com TE e MF. Em pacientes com TE o miR130b estava elevado e o mIR16 diminuído, enquanto que nos pacientes com MF o miR198 estava aumentado. Os linfócitos dos pacientes com TE e MF apresentaram maior resistência à apoptose estimulada por: actinomicina, etoposídeo, teniposídeo, citarabina e estaurosporina do que os linfócitos dos controles. Em conclusão, os dados obtidos sugerem a ligação da alteração do processo de apoptose celular, com a expressão do gene PRV-1 e status da mutação JAK2V617F. Esses resultados contribuem para o melhor entendimento da fisiopatologia das NMPC visto que associam a fisiopatologia da TE e MF com a resistência das células alteradas à apoptose. Essas informações serão úteis no futuro, possibilitando o desenho de novos alvos terapêuticos e a descrição de novos marcadores de prognóstico. / Chronic Myeloproliferative Neoplasms (cMPN) - Essential Thrombocythemia (ET), Primary Myelofibrosis (PMF) and Polycythemia Vera (PV) - are clonal hematopoietic stem cell malignancies characterized by an accumulation of mature myeloid cells in bone marrow and peripheral blood. It seems that apoptotic machinery deregulation contribute to ET and PMF pathogenesis. Despite the advances in the molecular knowledge, the physiopathology of these diseases remains unknown. This study investigated cellular and molecular mechanisms involved in apoptosis process regulation in bone marrow haematopoietic progenitor CD34+ cells and leukocytes from ET and PMF patients. The specifics aims were: (1) to evaluate death receptors family members and Bcl-2 related genes expression as well apoptosis-related microRNAs by Real Time PCR; (2) apoptosis-related protein expression by Western Blot; (3) access mononuclear cells apoptosis resistance by flow cytometry and (4) to correlate the results with JAK2V617F mutation, PRV-1 gene expression and as well clinical data. In ET CD34+ cells, we found overexpression of a1, mcl-1, bid, bok e noxa and a decrease of bax compared to controls, while in leukocytes a1, bcl-2, bcl-w e bcl-xL, bad e bok expression was increased and bid and bimEL expression was lower than in controls. In PMF, a1, bcl-w bak, bok e noxa were overexpressed and bcl-2 downregulated in CD34+ cells. In PMF leukocytes bcl-2, bcl-w e bcl-xL, bad e bok mRNA levels were increased. c-iap-1 was increased in ET and PMF CD34+ cells and c-iap-2 expression elevated in ET and PMF CD34+ cells and leukocytes. Death receptor related genes showed overexpression of fas, fas-L, faim and dr4 in patients CD34+ cells and downregulation of fas-L and trail in ET and PMF leukocytes. We found differential expression of several genes between patients JAK2V617F positive and negative, as well we found correlation between gene expression and JAK2V617F allele burden, white blood cells and platelets count and splenomegaly. PRV-1 gene was overexpressed in ET and PMF leukocytes and showed correlation with JAK2V617F mutation and a1, bcl-w, bik, bax, c-iap-2 and trail gene expression. Regarding protein expression, BCL-XL was increased and TRAIL decreased in PMF leukocytes and BID was decreased in ET leukocytes. miRNA26a, let 7d e miR15a was overexpressed in ET and PMF leukocytes, while miR130b was increased only in ET and miR198 only in PMF. miR16 was downregulated in ET leukocytes comparing to controls. We also detected a resistance to apoptosis-inducers in ET and PMF lymphocytes and we observed correlation between apoptosis percentage and the expression of many studied genes. In conclusion, the results indicate the participations of Bcl-2 family genes and Death Receptor pathway genes, as well PRV-1 and JAK2V617F mutation in these disorders, which contribute to elucidate cMPN physiopathology and might lead to the discovery of new cMPN therapies and molecular markers.
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