Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Autorizada por el autor, pero con restricción para ser publicada a texto completo hasta diciembre de 2015, en el Portal de Tesis Electrónicas. / La diferenciación de fibroblastos cardiacos (FC) a miofibroblastos cardiacos (MFC) es gatillada por TGF-β1, la cual señaliza principalmente a través de las proteínas Smad. Los MFC muestran como principal característica la presencia de microfilamentos citoplásmicos de α-SMA, estructuradas como fibras de estrés, lo que les permite la contracción. Por otro lado, LPS es un ligando del receptor TLR4, que señaliza de manera dependiente e independiente de MyD88 teniendo como principal efector el NF-κB, induciendo así la expresión de genes de citoquinas proinflamatorias. Sin embargo, aunque se ha descrito un efecto antagónico entre la señalización inducida por LPS y la señalización canónica de TGF- β, a la fecha no se ha estudiado si en FC y en MFC la expresión de α-SMA inducida por TGF-β1 es antagonizada por LPS. Para responder estas interrogantes se utilizaron FC y MFC de ratas adultas, y se determinó in vitro la capacidad de LPS de inhibir la expresión de α-SMA. Además, utilizando TAK- 242, un inhibidor de las vías intracelulares dependientes de TLR4, se determinó que los efectos gatillados por LPS ocurrían a través de este receptor. La utilización de los inhibidores PD98059, LY29002 y BAY 11-7082 permitió determinar que en FC LPS a través de la vía de señalización PI3K/Akt, disminuye la expresión de α-SMA. Por lo que nuestros resultados demuestran que LPS inhibe la expresión de α-SMA en FC, a través del receptor TLR4 mediante la activación de vía de señalización PI3K/Akt y que LPS es capaz de disminuir la expresión de α-SMA en MFC a través de TLR4 inhibiendo la mantención del fenotipo miofibroblasto / The difference between cardiac fibroblasts (CF) and cardiac myofibroblast (CMF) is triggered by TGF-β1, which mainly signals via Smad proteins. The main characteristic of CMF is cytoplasmic microfilaments of α-SMA; this are structured as stress fibers, which allow the contraction of CMF. Also, LPS is a ligand of the TLR4 receptor that signals via a dependant and independent pathway of MyD88 whose main factor is NF-κB; this induces the expression of inflammatory cytokine genes. However, despite an opposite effect has been described between the signaling induced by LPS and the canonical signaling of TGF-β, the opposite effect that LPS may have on the expression of α-SMA on CF and CMF induced by TGF-β1 has not been studied so far. In order to answer these questions, CF and CMF of adult rats were used; this showed in vitro evidence that LPS is capable of inhibiting the expression of α-SMA. Also, with the use of TAK-242, which is an inhibitor of the dependant intracellular domain of TLR4, we determined that the effects triggered by LPS occurred through said receptor. Using PD98059, LY29002 and BAY11-7082 inhibitors allowed us to determine that, via the PI3K/Akt signaling pathway, LPS decreases the expression of α-SMA in CF. Therefore, our results show that LPS inhibit the expression of α-SMA in CF through the TLR4 receptor via the activation of the PI3K/Akt signaling pathway, and that LPS is capable of decreasing the expression of α-SMA in CMF through TLR4 receptor, which inhibits the maintenance of the myofibroblast phenotype

Os objetivos deste estudo foram avaliar o efeito da aplicação subcutânea do cloridrato de papaverina no processo de reparação de feridas cirúrgicas abertas no dorso de ratos e avaliar pelos métodos histomorfológico, histomorfométrico e imunoistoquímico eventos biológicos do processo de reparação. Foram realizadas feridas dérmicas padronizadas com punch, 5mm de diâmetro e 2mm de profundidade, no dorso de ratos. Os animais foram divididos em dois grupos conforme o tratamento realizado: no grupo controle, 25 ratos foram tratados através da injeção de cloreto de sódio 0,9% e no grupo teste, 25 ratos foram tratados através da injeção da solução de cloridrato de papaverina a 50mg/mL de cloreto de sódio a 0,9%. Em ambos os grupos foi aplicado subcutâneo (por quadrante da ferida), 0,25mL da solução correspondente aos frascos do grupo teste ou grupo controle totalizando 1 mL da solução. Os 50 espécimes foram processados para as análises macro e microscópica. Para análise do cálculo do edema, foram utilizados 10 ratos (5 animais do grupo teste e 5 animais do grupo controle). Fragmentos de pele padronizados (3cm2) foram removidos da área da ferida e pesados no período de 6 horas. Para análise morfométrica do fechamento da ferida/formação de cicatriz, 10 ratos foram utilizados (5 animais do grupo teste e 5 do grupo controle). As feridas cirúrgicas padronizadas foram fotografadas nos períodos de 0h, 3,7,14 e 21 dias pós-cirúrgico e as imagens foram analisadas por software de morfometria (ImageLab2000®) quanto a área, perímetro e fator de forma. Pela técnica de coloração da hematoxilina e eosina, a análise histomorfológica (análise qualitativa descritiva) e histomorfométrica (análise quantitativa em relação à reepitelização, formação do tecido de granulação, edema, celularidade e matriz colagênica) foram realizadas nos períodos de 6h, 3,7,14 e 21 dias e analisadas sob microscopia de luz. Reações de imunoistoquímica com o anticorpo anti-actina de músculo liso foi realizada para identificação e contagem do número de miofibroblastos nos períodos de 3, 7, 14 e 21 dias. A partir do modelo experimental avaliado, comprovou-se a ação vasodilatadora da papaverina. Os fragmentos padronizados do grupo teste apresentaram maior peso em relação ao grupo controle (p= 0,047). As feridas do grupo teste mostraram um fechamento maior e menor formação de cicatriz quando comparado ao grupo controle no período de 21 dias. No grupo teste, uma maior quantidade de edema (p = 0,028) e uma menor quantidade de matriz colagênica (colágeno) (p = 0,028) foram encontradas no período de 6 horas. Houve maior reepitelização no grupo teste no período de 7 dias e menor formação de tecido de granulação nos períodos de 14 e 21 dias para o mesmo grupo. No grupo controle, um maior número de miofibroblastos foi encontrado quando comparado ao grupo teste nos períodos de 14 e 21 dias (p=0, 016). Dentro dos limites deste estudo, a aplicação subcutânea do cloridrato de papaverina parece acelerar o processo de reparação de feridas cirúrgicas abertas no dorso de ratos. Sua aplicação promove vasodilatação e um maior exsudato inflamatório no início do processo de reparação. Tal efeito parece estar relacionado com a maior velocidade de reparação observada macro e microscopicamente. / The objectives of this study were to evaluate the effect of subcutaneous administration of papaverine hydrochloride in the process of open surgical repair of wounds in the back of rats and evaluate the methods histomorphological, immunohistochemical and histomorphometric biological events of the repair process. Standardized wounds were inflicted by dermal punch, 5mm in diameter and 2mm deep, in the backs of rats. Animals were divided into two groups according to treatment: control group, 25 rats were treated by injection of sodium chloride 0.9%) and test group (25 rats treated by the injection of papaverine hydrochloride 50 mg / mL sodium chloride 0.9%). In both groups was administered subcutaneously (by quadrant of the wound), 0.25 mL of the solution corresponding to bottles of the test group or control group, totaling 1 mL of the solution. The 50 specimens were processed for macro and microscopic analysis. For analysis of the calculation of edema, we used 10 rats (5 animals in the test group and 5 control animals). Standardized skin fragments (3cm2) were removed from the wound area and heavy during the 6 hours. For morphometric analysis of the closure of the wound / scar formation, 10 rats were used (five animals in the test group and 5 in the control group). Surgical wounds were photographed in standardized periods of 0h, 3,7,14 and 21 days after surgery and the images were analyzed by morphometry software (ImageLab2000 ®) as area, perimeter and form factor. By staining with hematoxylin and eosin, the histomorphologic analysis (descriptive qualitative analysis) and histomorphometric (quantitative analysis in relation to reepithelialization, formation of granulation tissue, edema, cellularity and collagen matrix) were recorded at 6h, 3.7 , 14 and 21 days and analyzed under light microscopy. Immunohistochemical reactions with anti-smooth muscle actin was performed to identify and count the number of myofibroblasts at 3, 7, 14 and 21 days. From the experimental model evaluated, proved the vasodilator papaverine. The fragments of the standardized test group had a higher weight in the control group (p = 0.047). The wounds of the test group showed a greater closing and less scarring compared to control group within 21 days. In the test group, a greater amount of edema (p = 0.028) and a smaller amount of collagen matrix (collagen) (p = 0.028) were found within 6 h. A greater reepithelialization in the test group after 7 days and less formation of granulation tissue during periods of 14 and 21 days for the same group. In the control group, a greater number of myofibroblasts was found when compared to the test group during the periods of 14 and 21 days (p = 0, 016). Within the limits of this study, subcutaneous administration of papaverine hydrochloride appears to accelerate the repair of surgical wounds opened in the back of rats. Its application promotes vasodilation and a greater inflammatory exudate in the early repair process. This effect appears to be related to a faster repair observed macroscopically and microscopically.

Os objetivos deste estudo foram avaliar o efeito da aplicação subcutânea do cloridrato de papaverina no processo de reparação de feridas cirúrgicas abertas no dorso de ratos e avaliar pelos métodos histomorfológico, histomorfométrico e imunoistoquímico eventos biológicos do processo de reparação. Foram realizadas feridas dérmicas padronizadas com punch, 5mm de diâmetro e 2mm de profundidade, no dorso de ratos. Os animais foram divididos em dois grupos conforme o tratamento realizado: no grupo controle, 25 ratos foram tratados através da injeção de cloreto de sódio 0,9% e no grupo teste, 25 ratos foram tratados através da injeção da solução de cloridrato de papaverina a 50mg/mL de cloreto de sódio a 0,9%. Em ambos os grupos foi aplicado subcutâneo (por quadrante da ferida), 0,25mL da solução correspondente aos frascos do grupo teste ou grupo controle totalizando 1 mL da solução. Os 50 espécimes foram processados para as análises macro e microscópica. Para análise do cálculo do edema, foram utilizados 10 ratos (5 animais do grupo teste e 5 animais do grupo controle). Fragmentos de pele padronizados (3cm2) foram removidos da área da ferida e pesados no período de 6 horas. Para análise morfométrica do fechamento da ferida/formação de cicatriz, 10 ratos foram utilizados (5 animais do grupo teste e 5 do grupo controle). As feridas cirúrgicas padronizadas foram fotografadas nos períodos de 0h, 3,7,14 e 21 dias pós-cirúrgico e as imagens foram analisadas por software de morfometria (ImageLab2000®) quanto a área, perímetro e fator de forma. Pela técnica de coloração da hematoxilina e eosina, a análise histomorfológica (análise qualitativa descritiva) e histomorfométrica (análise quantitativa em relação à reepitelização, formação do tecido de granulação, edema, celularidade e matriz colagênica) foram realizadas nos períodos de 6h, 3,7,14 e 21 dias e analisadas sob microscopia de luz. Reações de imunoistoquímica com o anticorpo anti-actina de músculo liso foi realizada para identificação e contagem do número de miofibroblastos nos períodos de 3, 7, 14 e 21 dias. A partir do modelo experimental avaliado, comprovou-se a ação vasodilatadora da papaverina. Os fragmentos padronizados do grupo teste apresentaram maior peso em relação ao grupo controle (p= 0,047). As feridas do grupo teste mostraram um fechamento maior e menor formação de cicatriz quando comparado ao grupo controle no período de 21 dias. No grupo teste, uma maior quantidade de edema (p = 0,028) e uma menor quantidade de matriz colagênica (colágeno) (p = 0,028) foram encontradas no período de 6 horas. Houve maior reepitelização no grupo teste no período de 7 dias e menor formação de tecido de granulação nos períodos de 14 e 21 dias para o mesmo grupo. No grupo controle, um maior número de miofibroblastos foi encontrado quando comparado ao grupo teste nos períodos de 14 e 21 dias (p=0, 016). Dentro dos limites deste estudo, a aplicação subcutânea do cloridrato de papaverina parece acelerar o processo de reparação de feridas cirúrgicas abertas no dorso de ratos. Sua aplicação promove vasodilatação e um maior exsudato inflamatório no início do processo de reparação. Tal efeito parece estar relacionado com a maior velocidade de reparação observada macro e microscopicamente. / The objectives of this study were to evaluate the effect of subcutaneous administration of papaverine hydrochloride in the process of open surgical repair of wounds in the back of rats and evaluate the methods histomorphological, immunohistochemical and histomorphometric biological events of the repair process. Standardized wounds were inflicted by dermal punch, 5mm in diameter and 2mm deep, in the backs of rats. Animals were divided into two groups according to treatment: control group, 25 rats were treated by injection of sodium chloride 0.9%) and test group (25 rats treated by the injection of papaverine hydrochloride 50 mg / mL sodium chloride 0.9%). In both groups was administered subcutaneously (by quadrant of the wound), 0.25 mL of the solution corresponding to bottles of the test group or control group, totaling 1 mL of the solution. The 50 specimens were processed for macro and microscopic analysis. For analysis of the calculation of edema, we used 10 rats (5 animals in the test group and 5 control animals). Standardized skin fragments (3cm2) were removed from the wound area and heavy during the 6 hours. For morphometric analysis of the closure of the wound / scar formation, 10 rats were used (five animals in the test group and 5 in the control group). Surgical wounds were photographed in standardized periods of 0h, 3,7,14 and 21 days after surgery and the images were analyzed by morphometry software (ImageLab2000 ®) as area, perimeter and form factor. By staining with hematoxylin and eosin, the histomorphologic analysis (descriptive qualitative analysis) and histomorphometric (quantitative analysis in relation to reepithelialization, formation of granulation tissue, edema, cellularity and collagen matrix) were recorded at 6h, 3.7 , 14 and 21 days and analyzed under light microscopy. Immunohistochemical reactions with anti-smooth muscle actin was performed to identify and count the number of myofibroblasts at 3, 7, 14 and 21 days. From the experimental model evaluated, proved the vasodilator papaverine. The fragments of the standardized test group had a higher weight in the control group (p = 0.047). The wounds of the test group showed a greater closing and less scarring compared to control group within 21 days. In the test group, a greater amount of edema (p = 0.028) and a smaller amount of collagen matrix (collagen) (p = 0.028) were found within 6 h. A greater reepithelialization in the test group after 7 days and less formation of granulation tissue during periods of 14 and 21 days for the same group. In the control group, a greater number of myofibroblasts was found when compared to the test group during the periods of 14 and 21 days (p = 0, 016). Within the limits of this study, subcutaneous administration of papaverine hydrochloride appears to accelerate the repair of surgical wounds opened in the back of rats. Its application promotes vasodilation and a greater inflammatory exudate in the early repair process. This effect appears to be related to a faster repair observed macroscopically and microscopically.

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OBJETIVOS: Determinar a correlação entre a completa regeneração da membrana basal epitelial (MBE) e o desaparecimento de miofibroblastos do estroma anterior e consequente restauração da transparência corneana após diferentes mecanismos de trauma em coelhos. MÉTODOS: Foram utilizados 32 coelhos que tiveram um de seus olhos incluídos em um dos três grupos de estudo: (1) -9 dioptrias (D) ceratectomia fotorrefrativa (PRK), (2) Incisões corneanas verticais de espessura parcial (350 um), ou (3) Ceratite bacteriana, enquanto os olhos contralaterais compuseram o grupo controle. Os animais foram examinados, sacrificados, e tiveram suas córneas analisadas em diferentes momentos afim de investigar com detalhes o processo de cicatrização corneano usando técnicas de imunohistoquímica (IHQ) e microscopia de transmissão eletrônica (MTE). RESULTADOS: No grupo \"-9D PRK\", as córneas apresentavam opacidade corneana densa e nenhuma evidência de regeneração da MBE 1 mês após a cirurgia. Dois meses após a cirurgia, no entanto, pequenas áreas de córnea transparente começaram a surgir em meio à opacidade difusa, correspondendo a pequenas ilhas de MBE completamente regenerada. Após 4 meses da cirurgia a MBE estava completamente regenerada e a transparência corneana havia sido reestabelecida na região ablada pelo laser. No grupo \"incisões corneanas\", o par de densas opacidades corneanas lineares observadas após 1 mês do procedimento tornou-se progressivamente mais tênue ao longo dos próximos 2 meses. A ultraestrutura da MBE estava completamente regenerada e não houve formação de miofibroblastos no local das incisões 1 mês após o procedimento, inclusive ao redor dos plugs epiteliais que se estendiam até o estroma. No grupo \"ceratite bacteriana\", as córneas que haviam sido infectadas apresentaram opacidade densa, vascularização, miofibroblastos em toda a sua espessura, e nenhuma evidência de regeneração da MBE 1 mês após a infecção. Observou-se ao longo dos próximos 3 meses substancial redução da opacidade, evidências ultraestruturais de regeneração da MBE, e desaparecimento de miofibroblastos das porções mais anteriores do estroma, persistindo apenas nas regiões do estroma mais posterior nas quais o endotélio e a membrana de Descemet encontravam-se lesadas. CONCLUSÃO: No modelo animal apresentado, a resolução espontânea da opacidade corneana tardia mediada por miofibroblastos após a ablação com excimer laser ou ceratites infeciosas graves é desencadeada pela completa regeneração da estrutura e função da MBE. As incisões corneanas de espessura parcial em coelhos, no entanto, cicatrizam sem geração de miofibroblastos devido à completa regeneração da MBE após 1 mês do procedimento. Determinou-se, portanto, a correlação entre a reparação da membrana basal epitelial e a consequente redução da opacidade e restauração da transparência corneana / PURPOSE: To determine the correlation between epithelial basement membrane (EBM) regeneration and the disappearance of myofibroblasts from anterior stroma and consequent restoration of corneal transparency after different types of injury in rabbits. METHODS: Thirty-two rabbits had one of their eyes included in one of the 3 study groups: (1) -9 diopters (D) photorefractive keratectomy (PRK), (2) Two vertical partial-thickness (350 um) corneal incisions, or (3) Bacterial keratitis, whereas the opposite eyes served as unwounded control group. The animals were examined, sacrificed, and had their corneas analysed in different time points in order to investigate the corneal wound healing process using immunohistochemistry and transmission electron microscopy. RESULTS: In the \"-9D PRK\" group, corneas at 1 month after surgery had dense corneal opacity and no evidence of regenerated EBM. However, by 2 months after surgery small areas of stromal clearing began to appear within the confluent opacity, and these corresponded to small islands of normally regenerated EBM. By 4 months after surgery, the EBM was fully regenerated and the corneal transparency was completely restored in the ablated zone. In the \"corneal incisions\" group, the two dense, linear corneal opacities observed at 1 month after the procedure progressively faded during the next 2 months. The EBM ultrastructure was fully regenerated and there were no myofibroblasts at the site of the incisions by 1 month after the procedure, including around the epithelial plugs that extended into the stroma. In the \"bacterial keratitis\" group, all the corneas that have been infected presented dense stromal scarring, vascularization, myofibroblasts in the full stromal thickness and no evidence of EBM regeneration by 1 month after the infection. There was a definite decrease in opacity during the next 3 months, besides ultrastructural evidence of EBM regeneration and disappearance of myofibroblasts in the most anterior part of the stroma, which persisted only in the most posterior stroma where the endothelium and Descemet\'s membrane were damaged. CONCLUSION: In the rabbit model, spontaneous resolution of myofibroblast-mediated corneal opacity (fibrosis) after high correction PRK or infectious keratitis is triggered by regeneration of normal EBM structure and function. Conversely, incisional wounds heal in rabbit corneas without the development of myofibroblasts because the EBM regenerates normally by 1 month after the injury. Therefore, it has been determined the correlation between the EBM regeneration and the restoration of corneal transparency after different types of corneal injury

OBJETIVOS: Determinar a correlação entre a completa regeneração da membrana basal epitelial (MBE) e o desaparecimento de miofibroblastos do estroma anterior e consequente restauração da transparência corneana após diferentes mecanismos de trauma em coelhos. MÉTODOS: Foram utilizados 32 coelhos que tiveram um de seus olhos incluídos em um dos três grupos de estudo: (1) -9 dioptrias (D) ceratectomia fotorrefrativa (PRK), (2) Incisões corneanas verticais de espessura parcial (350 um), ou (3) Ceratite bacteriana, enquanto os olhos contralaterais compuseram o grupo controle. Os animais foram examinados, sacrificados, e tiveram suas córneas analisadas em diferentes momentos afim de investigar com detalhes o processo de cicatrização corneano usando técnicas de imunohistoquímica (IHQ) e microscopia de transmissão eletrônica (MTE). RESULTADOS: No grupo \"-9D PRK\", as córneas apresentavam opacidade corneana densa e nenhuma evidência de regeneração da MBE 1 mês após a cirurgia. Dois meses após a cirurgia, no entanto, pequenas áreas de córnea transparente começaram a surgir em meio à opacidade difusa, correspondendo a pequenas ilhas de MBE completamente regenerada. Após 4 meses da cirurgia a MBE estava completamente regenerada e a transparência corneana havia sido reestabelecida na região ablada pelo laser. No grupo \"incisões corneanas\", o par de densas opacidades corneanas lineares observadas após 1 mês do procedimento tornou-se progressivamente mais tênue ao longo dos próximos 2 meses. A ultraestrutura da MBE estava completamente regenerada e não houve formação de miofibroblastos no local das incisões 1 mês após o procedimento, inclusive ao redor dos plugs epiteliais que se estendiam até o estroma. No grupo \"ceratite bacteriana\", as córneas que haviam sido infectadas apresentaram opacidade densa, vascularização, miofibroblastos em toda a sua espessura, e nenhuma evidência de regeneração da MBE 1 mês após a infecção. Observou-se ao longo dos próximos 3 meses substancial redução da opacidade, evidências ultraestruturais de regeneração da MBE, e desaparecimento de miofibroblastos das porções mais anteriores do estroma, persistindo apenas nas regiões do estroma mais posterior nas quais o endotélio e a membrana de Descemet encontravam-se lesadas. CONCLUSÃO: No modelo animal apresentado, a resolução espontânea da opacidade corneana tardia mediada por miofibroblastos após a ablação com excimer laser ou ceratites infeciosas graves é desencadeada pela completa regeneração da estrutura e função da MBE. As incisões corneanas de espessura parcial em coelhos, no entanto, cicatrizam sem geração de miofibroblastos devido à completa regeneração da MBE após 1 mês do procedimento. Determinou-se, portanto, a correlação entre a reparação da membrana basal epitelial e a consequente redução da opacidade e restauração da transparência corneana / PURPOSE: To determine the correlation between epithelial basement membrane (EBM) regeneration and the disappearance of myofibroblasts from anterior stroma and consequent restoration of corneal transparency after different types of injury in rabbits. METHODS: Thirty-two rabbits had one of their eyes included in one of the 3 study groups: (1) -9 diopters (D) photorefractive keratectomy (PRK), (2) Two vertical partial-thickness (350 um) corneal incisions, or (3) Bacterial keratitis, whereas the opposite eyes served as unwounded control group. The animals were examined, sacrificed, and had their corneas analysed in different time points in order to investigate the corneal wound healing process using immunohistochemistry and transmission electron microscopy. RESULTS: In the \"-9D PRK\" group, corneas at 1 month after surgery had dense corneal opacity and no evidence of regenerated EBM. However, by 2 months after surgery small areas of stromal clearing began to appear within the confluent opacity, and these corresponded to small islands of normally regenerated EBM. By 4 months after surgery, the EBM was fully regenerated and the corneal transparency was completely restored in the ablated zone. In the \"corneal incisions\" group, the two dense, linear corneal opacities observed at 1 month after the procedure progressively faded during the next 2 months. The EBM ultrastructure was fully regenerated and there were no myofibroblasts at the site of the incisions by 1 month after the procedure, including around the epithelial plugs that extended into the stroma. In the \"bacterial keratitis\" group, all the corneas that have been infected presented dense stromal scarring, vascularization, myofibroblasts in the full stromal thickness and no evidence of EBM regeneration by 1 month after the infection. There was a definite decrease in opacity during the next 3 months, besides ultrastructural evidence of EBM regeneration and disappearance of myofibroblasts in the most anterior part of the stroma, which persisted only in the most posterior stroma where the endothelium and Descemet\'s membrane were damaged. CONCLUSION: In the rabbit model, spontaneous resolution of myofibroblast-mediated corneal opacity (fibrosis) after high correction PRK or infectious keratitis is triggered by regeneration of normal EBM structure and function. Conversely, incisional wounds heal in rabbit corneas without the development of myofibroblasts because the EBM regenerates normally by 1 month after the injury. Therefore, it has been determined the correlation between the EBM regeneration and the restoration of corneal transparency after different types of corneal injury