Les biothérapies (anticorps monoclonaux, récepteurs solubles) ciblant les cytokines IL-6 etTNF-alpha pour le traitement des maladies inflammatoires chroniques ont constitué un succèsmajeur de l’industrie pharmaceutique. Elles présentent néanmoins des inconvénientsimportants : résistances, mode d’administration contraignant, coût élevé.Notre équipe travaille sur l’identification de petites molécules inhibant directement cescytokines, afin d’élargir l’offre thérapeutique existante. Administrées par voie orale, ellesconstitueraient une alternative particluièrement favorable aux patients.Durant ma thèse, j’ai réalisé le criblage expérimental (tests cellulaires et tests biochimiquesde liaison) des meilleurs composés identifiés par criblage virtuel d’un grande chimiothèque dediversité, ainsi que de composés dérivés de pyridazine issus d’une chimiothèque médicinale. J’aiainsi pu identifier plusieurs inhibiteurs directs du TNF-alpha et de l’IL-6. De plus, mon travail apermis d’affiner les procédures de criblage du Laboratoire.Ces travaux ouvrent de nouvelles pistes pour le développement de médicaments anti-cytokines. / Anti-cytokine biologics (monoclonal antibodies, soluble receptors) targeting TNF-alpha and IL-6in chronic inflammatory diseases have been a major success for pharmaceutical industry.However, they exhibit several drawbacks : resistance, difficult administration, high costs.Our team works on the discovery of small molecule inhibitors of cytokines suck as TNF-alphaand IL-6, in order to widen the range of therapeutic drugs. Orally active drugs would represent ahighly beneficial alternative for patients.During my PhD, I have performed an experimental screening (using cellular and biochemicalbinding testings) of the best compounds identified through virtual screening of a large chemicallibrary, and on pyridazine compounds of a medicinal chemical library. I have been able toidentify several small molecules inhibiting the interaction of TNF-! and IL-6 with their receptor.Moreover, my work will have an impact on the laboratory screening strategies.Overall, this work opens new avenues for anti-cytokine drug discovery.

Cette thèse décrit des expériences sur la synthèse de nanotubes de carbone (CNT) mono-paroi, leur intégration dans des dispositifs ultra-propres, ainsi que l'étude de leurs propriétés électroniques par des mesures de transport à très basse température. La première partie de ce travail décrit l'optimisation des paramètres de synthèse par déposition chimique en phase vapeur (CVD) tels que les précurseurs de carbone, les flux de gaz, la température, ou le catalyseur pour la croissance de CNT de très bonne qualité. Parmis tous ces paramètres, la composition du catalyseur joue un rôle decisif pour permettre une croissance sélective en mono-paroi ansi qu'une distribution de faible diamètre. Dans la deuxième partie nous développons la nanofabrication de boites quantiques ultra-propres à base de CNT ainsi que les mesures de transport de ces échantillons à basse température (40 mK). Le spectre de la première couche électronique du nanotube est mesuré par spectroscopie de cotunneling inélastique sous champ magnétique, montrant alors un fort couplage spin-orbite négatif, dans ce système. Nous montrons que la séquence de remplissage d'électrons dans notre cas (ΔSO < 0) est différente de celle que l'on obtiendrait en régime Kondo SU (4) (ΔSO = 0). En effet, un effet Kondo purement orbital est observé pour N =2e à champ magnétique fini. Dans la dernière partie de cette thèse, nous décrivons la mise en œuvre expérimentale d'un évaporateur thermique à aimants à molécule unique (SMM) pour la fabrication future de dispositifs hybrides CNT-SMM ultra-propres. / This thesis describes experiments on the synthesis of single wall carbon nanotubes (SWNTs), fabrication of ultra-clean CNT devices, and study of electronic properties of CNTs with transport measurements. The first part of this work describes the optimization of the synthesis parameters (by chemical vapor deposition - CVD) such as carbon precursor, gas flows, temperature, catalyst for the growth of high quality SWNTs. In all these parameters, the catalyst composition plays a very important role on the high selective growth of SWNTs with a narrow diameter distribution. The second part deals with the nanofabrication of ultra-clean CNT devices and the low temperature (40 mK) transport measurements of these CNT quantum dots. The level spectra of the electrons in the first shell are investigated using inelastic cotunneling spectroscopy in an axial magnetic field, which shows a strong negative spin-orbit coupling of electron. We find that the sequence of electron shell filling in our case (ΔSO < 0) is different from which would be obtained in the pure SU(4) Kondo regime (ΔSO = 0). Indeed, a pure orbital Kondo effect is observed in N=2e at a finite magnetic field. In the last part of this thesis, we describe the experimental implementation of the thermal evaporation of single-molecule magnet (SMM) for the future fabrication of ultra-clean CNT-SMM hybrid devices.

Dans cette thèse, sur la base de l'approche du mode local "étendu" et de la théorie générale de la substitution isotopique, nous obtenons un ensemble de relations analytiques simples entre les paramètres spectrocopiques (fréquences harmoniques, coefficients d'anharmonicité, paramètres rovibrationels, différents types de paramètres d'interaction de Fermi et de Coriolis) des molécules de CH2D2, CH3D et CHD3. Tous ces paramètres sont exprimés en termes de relations simples à partir des paramètres spectroscopiques de la molécule mère CH4. Des calculs tests avec des relations isotopiques montrent que même sans introduire d'informations majeures sur les espèces isotopiques, les résultats numériques de ces calculs sont en bon accord avec les données expérimentales et les calculs ab initio. A partir de le théorie des opérateurs de perturbation et des propriétés de symétrie des molécules axiales XYZ3 (C3v), nous déterminons des formules générales permettant la détermination des paramètres spectroscopiques sous la forme de fonctions des paramètres structuraux et des paramètres de la fonction potentiel intramoléculaire. Nous présentons aussi une approche permettant la détermination du hamiltonien de molécules polyatomiques qui permet de résoudre le problème de la description de la surface d'énergie potentielle via la construction et la diagonalisation d'une matrice hamiltonienne de grande dimension. / In this thesis, on the base of the "expanded", local mode approach and general isotopic substitution theory we obtain sets of simple analytical relations between spectroscopic parameters (harmonic frequencies, anharmonic coefficients, ro-vibrational parameters, different kinds of Fermi and Coriolis-type interaction parameters) of the CH2D2, CH3D and CHD3 molecules. All of them are expressed as simple functions of spectroscopic parameters of the mother CH4 molecule. Test calculations with the isotopic relations show that even without including prior informations about the isotopic species, numerical results of calculations are in a good agreement both with experimental data and results of ab initio calculations. On the base of operators perturbation theory and the symmetry properties of the axially symmetric XYZ3 (C3v) type molecules, we derive general formulae for the determination of the spectroscopic parameters in the form of functions of structural parameters and parameters of the intramolecular potential function. We present also an approach for determination of the Hamiltonian of polyatomic molecules that allows to solve the problem of potential energy surface determination via the construction and the diagonalization of a Hamiltonian matrix of large dimension.

Cette thèse est consacrée à l’étude de films minces ouverts de cristaux liquides colonnaires sur un substrat solide. Ces matériaux, capables de s’auto-organiser en de larges domaines orientés, sont généralement obtenus à partir de molécules discotiques dérivées de colorants aromatiques. Ces différentes caractéristiques, associées à une bonne mobilité de charges, permettent d'envisager l'utilisation des cristaux liquides colonnaires en film mince dans des dispositifs photovoltaïques. Afin de bénéficier de leurs bonnes propriétés optoélectroniques, les cristaux liquides colonnaires doivent être déposés en film mouillant, d’épaisseur inférieure à 100 nm, et leur orientation contrôlée. Ainsi, pour des applications photovoltaïques, un alignement homéotrope (colonnes normales au substrat) est requis. Inversement, l’orientation planaire uniaxe (colonnes parallèles au substrat), est quant à elle requise pour une utilisation de ces composés dans les polariseurs ou dans les transistors organiques à effet de champ. Dans ce travail, différentes méthodes permettant de contrôler l’alignement de films minces ouverts de cristaux liquides colonnaires ont été développées, permettant d’obtenir aussi bien un ancrage homéotrope par traitement thermique spécifique, qu’un ancrage planaire uniaxe par dépôt préalable d’une couche de téflon. Le contrôle de l’orientation a ainsi permis d’une part de produire un film mince (e ? 50 nm) mouillant en ancrage homéotrope ouvrant la voie vers des cellules solaires organiques efficaces, et d’autre part de déterminer l’ensemble des propriétés optiques (indices complexes anisotropes) de ces matériaux cristallins liquides colonnaires. La dynamique du démouillage et l’état d’équilibre d’un film mince ouvert de cristal liquide colonnaire ont également été étudiés. Les résultats expérimentaux révèlent la formation de gouttelettes anisotropes et la présence d’un film nanométrique lors du démouillage de ce film mince / This thesis deals with columnar liquid crystal studied in the geometry of open supported thin films. Columnar liquid crystals are usually made of disk-shaped molecules derived from aromatic dyes. They are efficient charge transporters with the added capacity to self-assemble in large oriented domains. Consequently, such materials may be used in photovoltaic devices. In order to benefit from their good uniaxial charge mobility, their organization has to be controlled in uniform oriented thin films in the range of thicknesses of typically 100 nm. Homeotropic alignment (columns normal to the interface) is required for solar cells whereas uniaxial planar anchoring (columns parallel to the interface) is needed for applications such as polarizers or organic field effect transistor. Different methods to monitor the alignment in open thin films have been developed in this work, which make possible to achieve either homeotropic anchoring by a specific thermal treatment, or uniaxial planar orientation using a Teflon layer. Based on these orientation skills, a uniform ultra-thin film, free of dewetting and homeotropically oriented, is achieved (down to 50 nm thick) opening the way towards efficient solar cells, and a complete study of the optical properties has been performed (with the determination of the anisotropic complex indices) for different columnar liquid crystals. The dynamics of dewetting and the equilibrium state of a thin supported film have also been investigated. Experimental results show the formation of anisotropic droplets and reveal a nanometric film during dewetting.

Dans cette thèse est décrite la synthèse et les propriétés magnétiques des composés de coordination contenant des liaisons Co-Co ou Cr-Cr. Le contexte général sera discuté dans la première partie de ce travail en considérant l'évolution historique de ce type de chimie de coordination. Dans le deuxième chapitre, la possibilité d'intégrer un cluster {Co3} avec des ligands dipyridylamide et liaisons intermétalliques, dans des polymères de coordination unidimensionnels est discutée. Les interactions entre les porteurs de spin et l'effet du ligand pontant sont étudiés. Les changements des propriétés de transition de spin sont contrôlés en comparant par rapport au précurseur. Dans le troisième chapitre, les propriétés de molécule aimant d'un cluster de {Cr3} analogue à celui du {Co3}, sont étudiées. L'influence du ligand axial et la symétrie de la molécule sont également considérés et corrélées avec les propriétés de la molécule. Dans le quatrième chapitre, l'effet de la transition de spin induite par la coordination est étudié sur un exemple de cluster de {Co3} avec des ligands dipyridylformamidinate. La rupture et le rétablissement d'une liaison Co-Co est contrôlée par le biais de la température et de la lumière. L'effet de la rupture de la liaison intermétallique sur les propriétés magnétiques et structurales est aussi étudié. / In this thesis is described the synthesis, structures and magnetic properties of coordination compounds containing Co-Co or Cr-Cr bonds. In the first part of this work a general background is given on the historical evolution of this type of coordination chemistry. In the second chapter the possibility of incorporating a {Co3} cluster with dipyridylamide ligands and intermetallic bonds into one-dimentional coordination polymers is discussed. The interactions between spin centers and the effect of the bridging ligand were studied, and changes in the spin crossover properties were monitored and compared to the precursor. In the third chapter the Single-Molecule Magnet properties of a series of {Cr3} clusters are presented. The influence of the axial ligand and the symmetry of the molecule was considered and correlated to the magnetic properties. In the fourth chapter the phenomenon of coordination induced spin transition in a {Co3} cluster with dipyridylformamidinate ligands is discussed. Changes in magnetism and optical properties as a result of the breaking and restoring of a Co-Co bond were monitored as a function of temperature and light irradiation.

Les ions jouent un rôle majeur sur les processus biologiques affectant la molécule d'ADN que ce soit en termes d'activité de liaison de protéines à l'ADN ou d'encapsulation de l'ADN dans les capsides virales ou le noyau. L'activité de protéines sur l'ADN est, par ailleurs, fréquemment liée à une courbure locale de l'axe de la double hélice, que ce soit en raison d'une séquence intrinsèquement courbée, ou, via la capacité de protéines à courber la séquence sur laquelle elles se fixent. Être capable de caractériser et comprendre l'effet des ions présents en solution, de la courbure et de la dénaturation locale de la molécule d'ADN sur les conformations de cette dernière est donc crucial pour approfondir la compréhension de nombreux processus biologiques. Des travaux, tant expérimentaux que théoriques, ont déjà été menés sur ces questions mais celles-ci sont encore largement débattues. En effet, pour y répondre, doivent notamment être développées des méthodes expérimentales qui ne perturbent pas significativement la conformation de l'ADN ou le complexe ADN-protéine, ainsi que des modèles théoriques associés permettant une analyse précise des données expérimentales et leur compréhension physique. L'objectif de ce travail est de proposer des outils expérimentaux et théoriques permettant de décrire physiquement l'influence de défauts locaux présents sur la molécule d'ADN et de paramètres physico-chimiques de la solution environnante. A cette fin, des données expérimentales ont été acquises à l'échelle de la molécule unique grâce à la technique haut-débit de "Tethered Particle Motion" (HT-TPM). Le TPM consiste à enregistrer, au cours du temps, les positions d'une particule accrochée à l'extrémité d'une molécule d'ADN, immobilisée par son autre extrémité sur un support en verre. L'utilisation d'une biopuce permettant la parallélisation des complexes ADN/particule et l'acquisition "à haut débit" de données TPM a permis d'obtenir une grande accumulation de statistiques individuelles. Une procédure d'analyse efficace a été élaborée afin de déterminer les amplitudes du mouvement des assemblages ADN-particules valides. En parallèle, ont été effectuées des simulations basées sur un modèle de physique statistique mésoscopique dans lequel la molécule d'ADN est assimilée à une chaîne de billes de rayons variables dont les déplacements sont régis par la diffusion brownienne et une énergie potentielle d'interaction prenant en compte notamment l'énergie de courbure du polymère ADN. Une première étude a porté sur l'effet de la force ionique de la solution environnante sur la longueur de persistance Lp, qui traduit la rigidité du polymère d'ADN. Les valeurs de Lp extraites des données de HT-TPM ont fait apparaître une décroissance de la longueur de persistance de 55 à 30 nm, corrélée à l'augmentation de la force ionique, avec une décroissance plus forte observée pour les ions divalents Mg2+ que pour les ions monovalents Na+. Les valeurs de Lp déterminées sur une plage étendue de force ionique ont permis de valider l'approche théorique proposée par Manning en 2006 dans la cas Na+. Une deuxième étude a conduit à l'élaboration d'une méthode permettant de quantifier l'angle de courbure locale induite par une séquence spécifique ou la liaison d'une protéine sur la molécule d'ADN. L'échantillon modèle a été obtenu en insérant de une à sept séquences CAAAAAACGG en phase. Une description théorique de la chaîne d'ADN appelée "kinked Worm-Like Chain" a été proposée. Elle conduit à une formule simple de la distance bout-à-bout de l'ADN qui permet d'extraire la valeur de l'angle de courbure à partir des mesures de HT-TPM. Ainsi, il a pu être montré que la séquence CAAAAAACGG induit un angle de 19° ± 4° en accord avec les données de la littérature. Une troisième étude concernant la mesure de l'impact de la dénaturation partielle de l'ADN, induite par la température, sur sa rigidité apparente globale a été menée. Des résultats préliminaires sont proposés. / Ions play an important role in many biological processes affecting the DNA molecule, both for binding activities of DNA-protein interaction, and the DNA packaging in viral capsids or in the cell nucleus. Proteins actions on DNA are also often associated to the double helix curvature, be it because of an intrinsic curved sequence, or of the ability of the proteins, to curve the sequence they are trying to bind. Being able to characterize and understand the effects on the DNA conformation of ions present in solution, DNA local curvature, and local denaturation bubble is essential and crucial for the thorough understanding of many biological processes. Many experimental, and theoretical studies have already been conducted to address these questions. However they remain highly debated. To answer then one must notably develop experimental approaches that minimize alteration of the conformation of the DNA molecule or the complex protein-DNA, as well as associated theoretical models that permit a precise analysis of experimental data as well as their physical understanding. The goal of this work is to develop and propose experimental and theoretical tools which would provide a physical description of the influence of DNA local defects on the DNA molecule as well as of physicochemical conditions of the DNA environmental solution. For this purpose, experimental data have been collected, at a single molecule level, using the High-Throughput Tethered Particle Motion" (HT-TPM) technique. TPM consists of recording the location of a particle grafted by one end of a single DNA molecule and immobilized, at the other end, to a glass surface. The use of a biochip that enables the parallelization of DNA/particle complexes and the ensuing high-throughput data acquisition permitted to obtain a large accumulation of individual statistics. A strong analysis procedure has been developed to extract and quantify the amplitude of motion of the valid DNA/particle complexes . Alongside that, simulations have been run, based on a mesoscopic statistical mechanics model in which the DNA molecule is related to a chain of monomers with varying radius and in which the amplitude of motion is governed by both the Brownian motion and by the interaction potential associated to stretching and bending energies of the polymer. A first study was conducted on the effect of the ionic strength induced by surrounding ions in solution on the DNA persistence length (Lp) which characterizes the DNA polymer rigidity. The extracted Lp values of HT-TPM measurement decrease from 55 to 30 nm when the ionic strength increases. A stronger decrease was observed in presence of divalent ions Mg2+ than with monovalent ions Na+. This quantification of Lp dependence, on a large and strongly prospected range of ionic strengthes, tends to validate the theoretical approach proposed in 2006 by Manning in presence of monovalent ions Na+. A second project allows us to develop a method of evaluation and quantification of local DNA bending angles, induced either by specific intrinsic sequence, or by the binding of proteins on DNA. Constructs made of 575 base-pair DNAs with in-phase assemblies of one to seven sequences CAAAAAACGG was used. A theoretical description of the polymer chain, named "kinked Worm-Like Chain" was proposed which leads to a simple formulation of the end-to-end distance of DNA molecules allowing to extract local bend angles from HT-TPM measurement. As a result, we find that the sequence CAAAAAACGG induces a bend angle of 19° ± 4° in agreement with other value from the literature. A third study concerning the influence of temperature-induced partial denaturation on the global apparent rigidity parameters of the polymer was conducted. Preliminary results are proposed.

Le facteur de transcription T-bet joue un rôle central dans la régulation de la différenciation des lymphocytes T. La protéine tyrosine kinase, la glycogène synthase kinase 3 (GSK-3), inhibe l'activation des lymphocytes T et contrôle l'expression de leurs récepteurs inhibiteurs PD-1 et LAG- 3. Bien que l'inhibition de GSK-3 puisse augmenter l'expression de T-bet, l'interrelation entre T-bet et GSK-3 dans l'immunité tumorale est inconnue. Dans cette étude, nous montrons que les souris knock-out T-bet (Tbet - / -) sont compromises dans leur capacité à contrôler la croissance des cellules tumorales du mélanome B16. Cependant, l'injection d'une petite molécule inhibitrice (SMI) de GSK-3 inverse cette condition compromise entraînant le contrôle de la croissance tumorale similaire à celle observée chez les souris de type sauvage. Un examen de Tbet - / - a montré une perte de cellules dendritiques (DC) et de cellules leucocytes polymorphonucléaires (PMN) potentiellement suppressives et de lymphocytes tumoraux T (TILs) CD4 + accompagnée d'une augmentation de cellules T CD8 +. L'analyse viSNE (avancé tSNE) a en outre montré une réduction de la population effectrice expérimentée à l'antigène dans les TILs CD8 + chez Tbet -/-. Cette population est marquée par la réduction de CD44. L'inhibition de GSK-3 n'a montré aucun effet sur la perte de DC, TILs CD4 +, PMN et les TILs CD8 + ainsi que l’expression de Granzyme B (GZMB) sur les cellules T CD8 +. La seule exception était une augmentation mineure néanmoins statistiquement significative du facteur de transcription Eomesdermin (Eomes) dans les TILs CD8 +. L'étude démontre un effet compensatoire inattendu de l'inhibition de GSK-3 sur la perte de T-bet. Il reste à élucider la nature complète du parcours de cette compensation. / The transcription factor T-bet plays a central role in regulating T-cell differentiation, while the protein tyrosine kinase, glycogen synthase kinase 3 (GSK-3) inhibits T-cell activation and controls the expression of inhibitory receptors PD-1 and LAG-3 on T-cells. Although GSK-3 inhibition can increase T-bet expression, the inter-relationship between T-bet and GSK-3 in tumor immunity is unknown. In this study, we show that T-bet knock-out (Tbet-/-) mice are compromised in their ability to control the growth of the B16 melanoma tumor cells. However, the injection of a small molecule inhibitor (SMI) of GSK-3 reverses this compromised condition resulting in the control of tumor growth similar to that seen in wild type mice. An examination of Tbet-/- showed a loss of dendritic cells (DC) and potentially suppressive polymorphonuclear leucocytes (PMN) and CD4+ cell tumor infiltrating lymphocytes (TILs) accompanied by an increase in CD8+ cells. viSNE analysis (advanced tSNE- t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding) further showed a reduction of antigen experienced effector marker CD44 in CD8+ TILs in Tbet-/-. GSK-3 inhibition showed no effect on the loss of DCs, CD4+ TILs or the presence of PMNs or CD8+ T-cells or the loss of Granzyme B (GZMB) on CD8+ cells. The one exception was a minor but statistically significant increase in the transcription factor Eomesodermin (Eomes) in CD8+ TILs. The study demonstrates an unexpected compensatory effect of GSK-3 inhibition on the loss of T-bet. The full nature of the pathway that accounts for this compensation remains to be elucidated.

Telomeres are nucleoprotein structures that cap the physical ends of eukaryotic chromosomes. They consist of repetitive DNA sequences 5’-TTAGGG-3’ assembled with proteins which form the shelterin complex. This complex protects the ends of chromosomes by inhibiting DNA repair pathways at telomeres and avoid their recognition as double-strand breaks. Telomeres have been identified as a transcriptionally silent zone until 2007 when a noncoding RNA called TERRA (TElomeric Repeat containing RNA) transcribed from telomeres was discovered. This RNA gave rise to many questions: How is TERRA regulated? How is TERRA expressed? Does TERRA interact with proteins, DNA or RNA? After several studies, we know that TERRA is frequently expressed in cancer cells and it interacts with a large proteome. Nevertheless, its specific function remains unknown. In this thesis, we studied this RNA in human cancer cells using live-cell microscopy which allowed us to get information on TERRA’s dynamics, localization and its interactome. Moreover, we used single-molecule imaging on TERRA 15q labeled by the MS2-GFP system, which allowed the visualization of TERRA transcripts. This study resulted in the discovery of two types of TERRA population from telomere 15q: one of the population is characterized by the formation of clusters and a second population is constituted of unique molecules more dynamic in the nucleus. Finally, in order to better understand TERRA’s functions, we developed a new approach which consists on immunoprecipitating TERRA using the MS2 stem-loops as a tag to identify TERRA-interacting proteins such as the telomeric factor TRF2 or RNA-binding proteins like hnRNP -A1 or FUS. / Les télomères forment les extrémités des chromosomes chez les eucaryotes. Ces séquences répétées en tandem 5’-TTAGGG-3’ font partie d’un complexe nucléoprotéique appelé shelterin. En effet, cet assemblage de protéines télomériques permet la protection des extrémités des chromosomes, permettant à celles-ci de ne pas être reconnues comme des cassures dans l’ADN et d’activer les voies de réparation de l’ADN. Les télomères ont longtemps été reconnus comme étant des zones de transcription inactives, ce jusqu’en 2007 lorsqu’une équipe de recherche découvrit un ARN non codant appelé TERRA (Telomeric Repeat containing RNA). Ce dernier a suscité de nombreuses questions : quel est le rôle de cet ARN? Comment est-il exprimé et régulé? Interagit-il avec d’autres facteurs cellulaires? Les différentes recherches menées sur cet ARN ont permis de conclure que celui-ci était fréquemment induit dans les cellules de cancer, que ses partenaires d’interactions sont nombreux, mais que ses fonctions restent encore mal définies. Par ailleurs, ces différentes études ont toujours été ou presque réalisées sur des cellules fixées, sur une population totale d’ARN télomérique TERRA. Afin d’apporter de nouvelles réponses et de mieux caractériser cet ARN, nous avons étudié ce transcrit dans des cellules de cancer humain en utilisant la technique de microscopie en temps réel, qui permet de récolter des données sur la dynamique, la localisation de cet ARN et ses éventuels partenaires. De plus, nous nous sommes intéressés à des molécules uniques de TERRA issues du télomère 15q en exploitant la technique de marquage avec des tiges-boucles MS2 (MS2-GFP). Cette étude de microscopie a permis de découvrir deux types de population de l’ARN TERRA 15q : une population caractérisée par des assemblages d’ARN dit clusters (agrégats d’ARN) et une population plus singulière qui semble avoir une diffusion plus importante dans le noyau de la cellule. Par ailleurs, l’expression de l’ARN TERRA semble être différente d’un type cellulaire à un autre et nous avons donc cherché à connaître le niveau d’expression de cet ARN au sein de la lignée étudiée au cours de ce projet de recherche. Enfin, afin de découvrir de nouveaux rôles pour cet ARN, nous avons développé une approche de co-immunoprécipitation de l’ARN TERRA pour identifier des interactions avec des protéines du complexe shelterin comme TRF2, ou des protéines liant l’ARN comme hnRNP-A1 ou encore FUS.

La translocation de biopolymères à travers un nanopore intervient dans de nombreux processus biologiques et technologiques, comme le transport nucléocytoplasmique dans le pore nucléaire des cellules eucaryotes, la sécrétion de protéines, le séquençage rapide de l’ADN ou l’électrophorèse capillaire.Nous proposons une technique optique en molécule unique originale pour l’étude de la translocation de biopolymères à travers un nanopore basée sur l’effet Zero-Mode Waveguide. Nous nous sommes intéressés au passage d’ADN double-brin de plusieurs tailles, d’ADN simple-brin et d’ARN, entraînés par un flux à travers une membrane nanoporeuse track-etched. Nous montrons qu’il existe un flux critique régissant le passage des biopolymères indépendant du rayon des pores ainsi que de la taille des biopolymères et de leur nature, conformément aux prédictions théoriques de Brochard et de Gennes.Le pore nucléaire est un nanopore biologique responsable du transport sélectif entre le noyau et lecytoplasme des cellules. Nous avons étudié l’influence de la concentration en importinBeta1 – une protéine nécessaire au transport nucléocytoplasmique – sur l’organisation du canal central du pore nucléaire deXenopus laevis en mesurant la diffusion de molécules de Dextran fluorescentes à travers celui-ci. Nous observons une ouverture du canal central à basse concentration suivi d’un rétrécissement de celui-ci à plus forte concentration. Cette évolution du rayon du canal central avec la concentration en importin Beta1est conforme aux modèles en champ moyen de Opferman et coll. et de Ando et coll. et aux observations expérimentales sur des systèmes reconstitués in vitro de Lim et coll. et Zahn et coll. / The translocation of biopolymers through a nanopore is a feature common to many biological andtechnological processes such as the nucleocytoplasmic transport through the nuclear pore complex(NPC), protein secretion, fast DNA sequencing or capillary electrophoresis.We have developed an original single molecule optical detection technique for the study of biopolymerstranslocation through a nanopore based on the Zero-Mode Waveguide effect. We studied thepassage of double stranded DNA of different sizes, of single stranded DNA and of double-stranded RNAdriven by a flux through track-etched nanoporous membranes. We demonstrate that translocation isgoverned by a critical flux independent of both biopolymer size and nature and of the pore radius inagreement with the theoretical predictions of Brochard and de Gennes.The NPC is a biological nanopore responsible for the selective transport between cytoplasm andnucleus in cells. We studied the influence of importinBeta1 concentration – a protein involved in the nucleocytoplasmictransport – on the structure of the central channel of the NPC of Xenopus laevis byassessing the diffusion of fluorescently labeled Dextran molecules through the NPC. We observe anopening of the central channel at low concentration followed by a shrinking at higher concentrationin importinBeta1 in agreement with mean-field models from Opferman et al. and Ando et al. and withexperiments on biomimetic in vitro systems from Lim et al. and Zahn et al.

Le complexe de pores nucléaires est le seul point d'entrée et de sortie du transport nucléocytoplasmique. Le panier nucléaire, l'un de ses principaux composants, s'est avéré impliqué dans la régulation des gènes et pourrait jouer un rôle majeur dans le contrôle de la qualité de l'export d'ARNm. Cependant, on sait peu de choses sur le fonctionnement du panier dans l'export nucléaire et la régulation des gènes. La principale composante structurelle du panier, la TPR (Translocated Promoter Region), est considérée comme l'acteur principal de la fonction de contrôle de la qualité du panier. Il reste à établir par quel mécanisme cette protéine assure la sélection des mRNP compétentes pour l'exportation. Malgré son implication connue dans le contrôle de la qualité des mRNP, l'exportation et la maturation, des questions demeurent: que fait vraiment le panier, qu'est-ce qui définit le contrôle qualité, comment le panier nucléaire est-il capable d'identifier l'ARN qui n'est pas compétent pour l'exportation et quels sont les rôles de différentes protéines composant le panier nucléaire. Récemment, il a été montré que la protéine TPR est présente dans deux populations, l'une dans le nucléoplasme et l'autre liée au NPC. Nos études préliminaires utilisant FRAP (Fluorescence Recorvery After Photobleaching) et la microscopie à molécule unique montrent que les molécules nucléoplasmiques de TPR ne sont pas impliquées dans un échange rapide avec les molécules assemblant avec les paniers ancrés au NPC et présentent différentes sous-populations basées sur la diffusion. L'analyse de études protéomiques préliminaires de notre laboratoire a révélé que l’interactome de TPR présente un enrichissement inattendu en protéines impliquées dans la maturation de l'ARNm, notamment l'épissage et les facteurs de traitement de l'extrémité 3'. Ces résultats pourraient suggérer des interactions complexes des nouvelles fractions nucléoplasmiques de TPR avec la machinerie de maturation des ARNms et nous amènent à poser les questions suivantes : Quelle est la fonction de la protéine du panier TPR lorsqu'elle n'est pas associée au NPC, et la TPR nucléoplasmique participe-t-elle au métabolisme de l'ARN nucléaire, reliant potentiellement les processus nucléaires au contrôle de la qualité au NPC? Mon projet s'est concentré sur l'étude des fonctions et de la dynamique de la protéine du panier nucléaire TPR à l'aide de techniques d'imagerie fluorescente en cellule vivante et de suivi de protéine unique. Nous avons pu identifier la dynamique et la localisation des différentes populations de TPR à partir des profils de diffusion de leurs trajectoires, qui peuvent être réparties en 5 catégories : Dirigée, Brownienne, Restreinte, Confinée et Butterfly. Nos données suggèrent que les trajectoires confinées pourraient être liée à l’association de TPR à la chromatine tandis que les browniennes représenteraient les molécules de TPR diffusant librement dans le noyau. De plus, nous avons constaté que les trajectoires dirigées et restreintes pourraient être liées à la maturation de l'ARN vu que ces deux sous-populations de TPR sont les plus affectées lorsque la transcription est inhibée. Également, en absence de la transcription par l’ARN polymérase II, TPR forme des granules dans le nucléoplasme, suggérant son implication durant la transcription active. Ainsi, notre étude montre que la fraction nucléoplasmique du TPR est subdivisée en fractions non associées aux pores hétérogènes qui pourraient jouer plusieurs rôles dans le métabolisme de l'ARN et la qualité de l'export. / The nuclear pore complex is the only entry and exit point for the nucleocytoplasmic transport. The nuclear basket, one of its main components, was shown to be involved in gene regulation and could play a major role in quality control of mRNA export. However, little is known on how the basket functions in nuclear export and gene regulation. The main structural component of the basket, TPR (Translocated Promoter Region), is thought to be the main actor in the quality control function of the basket. It is yet to be establish by which mechanism this protein ensures the selection of competent mRNPs for export. With all these involvement of the basket in quality control, export, and maturation, one question remains: What is the basket really doing, what defines quality control, how the nuclear basket can identify RNAs that aren’t competent for export, and what are the roles of the different proteins that make up the basket. Recently it was shown that TPR is present in two populations, one in the nucleoplasm and another bound at the NPC. Our preliminary studies using FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and single molecule microscopy shows that the nucleoplasmic TPR molecules aren’t exchanging with the baskets anchored at the NPC and present different subpopulations based on diffusion. Analysis of preliminary proteomics studies from our laboratory revealed an interactome with an unexpected enrichment of proteins involved in mRNA maturation notably splicing and 3’ end processing factors. These results imply complex interactions of the new fractions of TPR and lead us to ask these following questions: What is the function of the basket protein TPR when it is not associated with the NPC, and does nucleoplasmic TPR participate in nuclear RNA metabolism, potentially linking nuclear processes to quality control at the NPC? My project focused on investigating the functions and dynamics of the nuclear basket protein TPR using fluorescent live-cell and single-protein imaging techniques. We were able to identify the dynamics and localization of the different populations of TPR based on the diffusion profiles of their trajectories, which can be divided in 5 categories: Directed, Brownian, Restricted, Confined and Butterfly. Our data suggest that the confined population might be linked to chromatin association of TPR, whereas the Brownian would represent the free diffusing TPR molecules in the nucleus. We further found that the Directed and Restricted trajectories could be linked to RNA maturation as these two subpopulations of TPR are most affected when transcription is inhibited. Moreover, in absence of transcription, TPR forms granules in the nucleus, suggesting its implication during active transcription. Altogether, our study shows that the nucleoplasmic fraction of TPR is subdivided in heterogenous diffusive fractions that could play several roles in the metabolism of RNA and quality of export