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Gene expression regulation is dynamic and specific to various factors such as developmental stages, environmental conditions, and stimulation of pathogens. Nowadays, a tremendous amount of transcriptome data sets are available from diverse species. This trend enables us to perform comparative transcriptome analysis that identifies conserved or diverged gene expression responses across species using transcriptome data. The goal of this dissertation is to develop and apply approaches of comparative transcriptomics to transfer knowledge from model species to non-model species with the hope that such an approach can contribute to the improvement of crop yield and human health. First, we presented a comprehensive method to identify cross-species modules between two plant species. We adapted the unsupervised network-based module finding method to identify conserved patterns of co-expression and functional conservation between Arabidopsis, a model species, and soybean, a crop species. Second, we compared drought-responsive genes across Arabidopsis, soybean, rice, corn, and Populus in order to explore the genomic characteristics that are conserved under drought stress across species. We identified hundreds of common gene families and conserved regulatory motifs between monocots and dicots. We also presented a BLS-based clustering method which takes into account evolutionary relationships among species to identify conserved co-expression genes. Last, we analyzed single-cell RNA-seq data from monocytes to attempt to understand regulatory mechanism of innate immune system under low-grade inflammation. We identified novel subpopulations of cells treated with lipopolysaccharide (LPS), that show distinct expression patterns from pro-inflammatory genes. The data revealed that a promising therapeutic reagent, sodium 4-phenylbutyrate, masked the effect of LPS. We inferred the existence of specific cellular transitions under different treatments and prioritized important motifs that modulate the transitions using feature selection by a random forest method. There has been a transition in genomics research from bulk RNA-seq to single-cell RNA-seq, and scRNA-seq has become a widely used approach for transcriptome analysis. With the experience we gained by analyzing scRNA-seq data, we plan to conduct comparative single-cell transcriptome analysis across multiple species. / Doctor of Philosophy / All cells in an organism have the same set of genes, but there are different cell types, tissues, organs with different functions as the organism ages or under different conditions. Gene expression regulation is one mechanism that modulates complex, dynamic, and specific changes in tissues or cell types for any living organisms. Understanding gene regulation is of fundamental importance in biology. With the rapid advancement of sequencing technologies, there is a tremendous amount of gene expression data (transcriptome) from individual species in public repositories. However, major studies have been reported from several model species and research on non-model species have relied on comparison results with a few model species. Comparative transcriptome analysis across species will help us to transform knowledge from model species to non-model species and such knowledge transfer can contribute to the improvement of crop yields and human health. The focus of my dissertation is to develop and apply approaches for comparative transcriptome analysis that can help us better understand what makes each species unique or special, and what kinds of common functions across species have been passed down from ancestors (evolutionarily conserved functions). Three research chapters are presented in this dissertation. First, we developed a method to identify groups of genes that are commonly co-expressed in two species. We chose seed development data from soybean with the hope to contribute to crop improvement. Second, we compared gene expression data across five plant species including soybean, rice, and corn to provide new perspectives about crop plants. We chose drought stress to identify conserved functions and regulatory factors across species since drought stress is one of the major stresses that negatively impact agricultural production. We also proposed a method that groups genes with evolutionary relationships from an unlimited number of species. Third, we analyzed single-cell RNA-seq data from mouse monocytes to understand the regulatory mechanism of the innate immune system under low-grade inflammation. We observed how innate immune cells respond to inflammation that could cause no symptoms but persist for a long period of time. Also, we reported an effect of a promising therapeutic reagent (sodium 4-phenylbutyrate) on chronic inflammatory diseases. The third project will be extended to comparative single-cell transcriptome analysis with multiple species.

Introduction: La fibromyalgie (FM) et la dépression majeure (MDD) sont des comorbidités fréquentes qui partagent des altérations communes dans la neurotransmission sérotoninergique. Cependant, on ignore encore si ces altérations sont persistantes ou transitoires. Objectifs : Le but principal de cette étude était (i) de mesurer les changements dans l’expression du transporteur de sérotonine (SERT) chez les patients FM, MDD et FM/MDD, par rapport aux volontaires sains (VS); et (ii) d’évaluer l’effet des traitements pharmacologiques (quétiapine et divers antidépresseurs) sur l’expression du SERT chez ces sujets. Des analyses exploratoires de l’expression du transporteur de dopamine (DAT) ont aussi été réalisées. Méthodologie: Les PBMC sont isolées chez les patients FM (n=55), MDD (n=50), et FM/MDD (n=120), et chez les VS (n=62). L’expression de SERT et de DAT a été analysée au niveau de l’ARNm par PCRq. La signification statistique est analysée par des analyses de variance et des modèles linéaires mixtes. Résultats: L’expression de l’ARNm du SERT est significativement diminuée chez les patients MDD, par rapport aux VS (p<0.001), mais pas elle est inchangée chez les patients FM et FM/MDD. Les traitements pharmacologiques entrainaient une amélioration des symptômes cliniques de la FM et de la MDD, mais ils n’avaient aucun effet sur l’expression de l’ARNm du SERT chez les patients. Comparativement au SERT, l’ARNm du DAT est indétectable chez plusieurs participants. Discussion/Conclusion : Ces résultats corroborent le rôle du SERT dans la physiopathologie de la MDD. De plus, ils démontrent que la diminution de l’expression du SERT est un phénomène persistant plutôt que transitoire. / Introduction: Fibromyalgia (FM) and major depression disorder (MDD) are frequent comorbidities. Both disorders may share common serotonergic alterations, but it is still unclear whether these alterations are persistent or transient. Objectives: The primary objective of this study was to (i) examine the changes in expression of serotonin transporter (SERT) in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in FM, MDD and FM/MDD subjects, compared to healthy controls; and to (ii) evaluate the effect of drug treatment (quetiapine and various antidepressants) on the expression of SERT in these subjects. Exploratory analyses on the expression of the dopamine transporter (DAT) were also performed. Methods PBMC were isolated from FM, MDD and FM/MDD subjects, and healthy controls. SERT and DAT expression were analysed at the mRNA level by qPCR. Statistical analyses were performed using analyses of variance and linear mixed-effects model. Results: The mRNA expression of SERT was significantly reduced in MDD subjects compared to healthy controls (p<0.001), but not in FM nor in FM/MDD subjects. Although drug treatments improved symptoms in FM, MDD and FM/MDD subjects, they had no significant effect on SERT mRNA expression. Comparatively to SERT, DAT mRNA expression was undetectable in several participants. Discussion/Conclusion: These results corroborate the role of SERT in the pathophysiology of MDD. They also show that the decreased expression of SERT mRNA is a persistent rather than a transient phenomenon in MDD.

Le LPS est un puissant agent pro-inflammatoire bactérien, dont la partie lipide A est considérée comme le principe actif. Néanmoins, la chaîne O des LPS influence leur agrégation en solution aqueuse. Notre but a été de déterminer le rôle de la chaîne O sur les effets biologiques et physiopathologiques des LPS.Nos travaux, menés selon trois axes stratégiques complémentaires, ont donné lieu aux avancées suivantes :- développement d'un dosage innovant des LPS par LC-MS/MS et d'un ratio d'inactivation des LPS sur la base d'une utilisation combinée dudit dosage et du test LAL. Ce ratio traduit la capacité d'un organisme hôte à inactiver les LPS, notamment par leur transfert aux HDL par la PLTP. Ce ratio pourrait être utile dans l'évaluation des patients à haut risque.- la longueur de la chaîne O module l'inflammation induite par les LPS. Au-delà de leur concentration d'agrégation critique, les LPS forment des agrégats dotés d’une architecture et de propriétés physico-chimiques dépendant de leur chaîne O. Ces deux paramètres déterminent l'activité biologique des LPS et leur métabolisme ;- développement d'un double marquage innovant des LPS confirmant leur voie principale d'élimination : le transport inverse du LPS. Ce travail définit donc les effets physiopathologiques induits par les LPS comme résultant de deux composantes : leur activité biologique et leur métabolisme. Toute stratégie de recherche ou thérapeutique ciblant les LPS, devrait donc prendre en compte leur structure moléculaire, leur agrégabilité et la relation entre ces deux paramètres, déterminants majeurs de l'activité biologique des LPS et de leur métabolisme. / LPS is a potent bacterial pro-inflammatory agent, consisting of hydrophilic, polysaccharide part and of a lipid A which is considered like active moiety. Nevertheless, the O chain of LPS influences their aggregation in aqueous media. Therefore, our goal has been to determine the role of O chain on the LPS biological and physiopathological effects. Our work was organized according to three main axes, and led to the following findings :- development of a new LPS assay by LC-MS/MS. The combination of this new technique with LAL test allowed us to calculate an inactivation ratio which reflects the ability of host organism to inactivate LPS, especially through their transfer to HDL by PLTP. The ratio could be useful in predicting outcome of high risk patients.- the length of O chain modulates LPS-induced inflammation. Above their critical aggregation concentration, LPS form aggregates with an architecture and physiochemical properties dependent on their O chain. Both parameters determine LPS biological activity and their metabolism.- development of an innovative dual labelling of LPS as a new tool to explore LPS elimination pathway : the reverse LPS transport. This work brings evidence that the physiopathological effects of LPS depend on two parameters : their biological activity and their metabolism. Any strategy of research or therapeutic targeting LPS should take into account their molecular structure, their aggregability and the relation between the both parameters, which are major determinants of their biological activity and their metabolism.

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Les cellules myéloïdes incluant les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques (DCs, dendritic cells) contribuent à la pathogénèse de l’infection à VIH-1 en participant à la dissémination du virus, mais également en représentant des réservoirs viraux potentiels. Leurs fonctions sont exploitées par le VIH-1 afin d’assurer sa propagation à travers l’organisme. Notamment, une infection à VIH-1 est associée à une altération de la présentation antigénique et la perte de lymphocytes T CD4+ spécifiques à des antigènes. L’autophagie est un processus catabolique universel impliqué dans la régulation de la présentation antigénique subséquente à la neutralisation/destruction du pathogène. Des études récentes suggèrent que le VIH-1 altère le mécanisme d’autophagie afin d’assurer sa survie. Le premier volet de ce projet de maîtrise a visé la caractérisation des effets du VIH-1 sur l’autophagie dans les DCs dérivées de monocytes circulants (MDDC, monocyte-derived dendritic cells) et l’identification des stratégies thérapeutiques pour contrecarrer ces effets. Les objectifs spécifiques ont été de : (i) caractériser l’expression de marqueurs de maturation sur des MDDC exposées au VIH-1 in vitro, (ii) quantifier l’expression des protéines liées à la régulation positive (i.e., ATG5, LC3, p62) et négative (i.e., mTOR) de l’autophagie dans les MDDC exposées au VIH, (iii) déterminer le rôle de l’autophagie dans la trans infection du VIH-1 aux lymphocytes T CD4+ et (iv) explorer l’impact de l’autophagie sur la présentation antigénique par les MDDC infectées à VIH-1 in vitro. Nos résultats démontrent qu’une exposition des MDDC au VIH-1 in vitro altère dramatiquement leur maturation et leur habileté à induire la prolifération des cellules T autologues en réponse à Staphylococcus aureus et Cytomegalovirus (CMV) mais pas la réponse induite par Staphylococcal enterotoxin B (SEB). Nous démontrons que l’exposition des MDDC au VIH s’associe à une augmentation de l’expression de la protéine mTOR totale et de sa forme phosphorylée (phospho-mTOR) et de la protéine p62. Le traitement des MDDC à la rapamycine diminue l’expression de mTOR et réduit la capacité de trans infection du VIH-1 par les MDDC, sans toutefois restaurer leur potentiel immunogène. En effet, nous observons que la rapamycine réduit l’expression de CD83 par les MDDC et augmente l’expression de CCR7, indiquant ainsi que l’effet immunosuppresseur documenté de la rapamycine est associé à une défaillance de maturation des MDDC. Le second volet de ce projet de recherche s’est intéressé à la contribution des cellules myéloïdes à la persistance virale chez les sujets infectés par le VIH-1 sous thérapie antirétrovirale. Les objectifs spécifiques ont été : (i) d’évaluer la présence de différentes formes d’ADN viral dans les monocytes circulants de patients infectés par le VIH-1 et (ii) de mesurer l’intégration et la réplication virale dans des macrophages dérivés de monocytes (MDM) de patients infectés sous ART. Nos résultats indiquent que les monocytes portent des formes précoces de transcription virale inverse (ADN du VIH RU5) et que, malgré une charge virale plasmatique indétectable sous ART, les MDM supportent la réplication virale. Ces données très préliminaires apportent des évidences en faveur de la contribution des cellules myéloïdes à la persistance virale sous ART et représentent une ouverture pour un projet de recherche plus complexe dans le futur. En somme, nos résultats démontrent que le VIH-1 altère le potentiel immunogène des MDDC et que la rapamycine peut être employée pour limiter la trans infection des lymphocytes T CD4+ par les MDDC. Néanmoins, l’incapacité de la rapamycine à rétablir le potentiel immunogène des MDDC incite à identifier de nouvelles stratégies manipulant l’autophagie pour une restauration optimale de la compétence immunitaire chez les sujets infectés à VIH-1. Les cellules myéloïdes jouent un rôle primordial dans la dissémination et la persistance virale et doivent donc être ciblées par les stratégies actuelles d’éradication des réservoirs du VIH sous ART. / Myeloid cells including monocytes, macrophages and dendritic cells (DC) contribute to HIV-1 pathogenesis by participating in viral dissemination but also by representing potential viral reservoirs. Myeloid cells functions are exploited by HIV in order for the virus to spread throughout the organism. Notably, HIV-1 infection is associated with alterations in antigen presentation and the loss of pathogen-specific CD4+ T-cells. Autophagy is a universal catabolic process involved in the regulation of antigen presentation subsequent to pathogen neutralization/destruction. Recent studies suggest that HIV inhibits autophagy in DC so that it survives within the host. The goal of the main part of this master’s research project was to characterize the effects of the HIV exposure on the autophagy process in monocytes-derived DC (MDDC) and to identify therapeutic strategies to counteract these effects. The specific aims were to : (i) measure the expression of maturation markers on MDDC exposed to HIV-1 in vitro (ii) quantify the expression of proteins that positively (i.e., ATG5, LC3, p62) or negatively regulate autophagy (i.e., mTOR), (iii) determine autophagy role in HIV-1 trans infection to CD4+ lymphocytes T and (iv) explore the impact of autophagy on antigen presentation by in vitro HIV-infected MDDC. Our results demonstrated that exposure to HIV in vitro dramatically impaired MDDC maturation and their ability to induce proliferation of autologous CD4+ T-cells in response to Staphylococcus aureus and Cytomegalovirus (CMV) but not Staphylococcal enterotoxin B (SEB). Exposition of MDDC to HIV-1 was associated with an increase of mTOR, phosphomTOR and p62 expression. Treatment of MDDC with rapamycin decreased mTOR expression and altered MDDC trans infection ability although it failed to restore MDDC immunogenic potential. Indeed, rapamycin diminished CD83 expression on MDDC surface and increased CCR7 expression, indicating that the documented immunosuppressive property of this drug is associated with an impaired MDDC maturation. The second part of this master’s research project focused on the contribution of myeloid cells to HIV-1 reservoir persistence under ART. The objectives were to: (i) evaluate the presence of different forms of viral DNA in circulating monocytes from HIV-1 infected subjects and (ii) determine the viral integration and replication in monocytes-derived macrophages (MDM) from infected individuals receiving viral suppressive ART. Our results show that monocytes harbor early products from viral transcription (RU5 HIV-DNA) and that MDM support viral replication. Together, these very preliminary findings bring evidences that monocytes contribute to viral persistence under ART. Overall, our results indicate that HIV alters the immunogenic potential of DC and that rapamycin limits HIV trans-infection by DC. However, the fact that rapamycin fails to restore the immunogenic potential of DC stresses the need to identify additional strategies to manipulate the autophagy process for an optimal restoration of immune competence in HIV-infected subjects. Myeloid cells play a crucial role in HIV persistence and dissemination and thus must be aimed at when elaborating an antiviral therapy.

Les études d'associations en génome entier ("GWAS") ont récemment permis la découverte de nombreux polymorphismes génétiques impliqués dans la susceptibilité aux maladies multifactorielles. Cependant, ces polymorphismes n'expliquent qu'une faible part de l'héritabilité génétique de ces maladies, nous poussant ainsi à explorer de nouvelles pistes de recherche. Une des hypothèses envisagées serait qu'une partie de cette héritabilité manquante fasse intervenir des phénomènes d'interactions entre polymorphismes génétiques. L'objectif de cette thèse est d'explorer cette hypothèse en adoptant une stratégie de recherche d'interactions basée sur des critères statistiques et biologiques à partir de données issues de différentes études "GWAS". Ainsi, en utilisant différentes méthodes statistiques, nous avons commencé par rechercher des interactions entre polymorphismes qui pourraient influencer le risque de thrombose veineuse. Cette recherche n'a malheureusement pas abouti à l'identification de résultats robustes vis à vis du problème des tests multiples. Dans un deuxième temps, à partir d'hypothèses "plus biologiques", nous avons tenté de mettre en évidence des interactions entre polymorphismes impliqués dans les mécanismes de régulation de l'expression génique associés aux microARNs. Nous avons pu ainsi montrer de manière robuste dans deux populations indépendantes qu'un polymorphisme au sein de la séquence du microARN hsa-mir-219-1 interagissait avec un polymorphisme du gène HLA-DPB1 pour en moduler l'expression monocytaire. Nous avons également montré que l'expression monocytaire du gène H1F0 était influencée par un phénomène d'interaction impliquant un polymorphisme du microARN hsa-mir-659. En apportant sa propre contribution à l'engouement récent que suscite la recherche d'interactions entre polymorphismes dans les maladies dites complexes, ce travail de thèse illustre clairement la difficulté d'une telle tâche et l'importance de réfléchir à de nouvelles stratégies de recherches.

Seit 20 Jahren unterteilt man Monozyten in eine klassische CD14++/CD16-Population und eine proinflammatorische CD16+ Population. Letztere macht 10-20 % der peripheren Blutmonozyten aus und ist unter verschiedenen pathologischen Zuständen drastisch erhöht. Seit Kurzem wird die CD16+ Fraktion in zwei weitere Untergruppen aufgeteilt, die CD14++/CD16+ und die CD14+/CD16+ Monozyten. In der hier vorliegenden Arbeit wurde versucht, die relativ neue und wenig charakterisierte Subpopulation der CD14++/CD16+ Monozyten näher zu beschreiben. Es sollte die Frage beantwortet werden, ob diese sich von den übrigen Subpopulationen abzugrenzen lässt und damit als eigenständige Zellgruppe anzusehen ist. Die von gesunden Spendern gewonnen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) wurden mithilfe einer Magnetsäulenvorseparation von einem Großteil der T-, B- und NK-Zellen befreit. Die restlichen Zellen wurden mit Anti-CD14-FITC und Anti-CD16-PE markiert. In einem Hochgeschwindigkeitssortierer wurden diese, anhand ihres Fluoreszenzmusters, in die drei Subpopulationen CD14++/CD16- (Sub1), CD14++/CD16+ (Sub2) und CD14+/CD16+ (Sub3) aufgeteilt. Durch dieses Verfahren konnte ein hoher Reinheitsgrad erreicht werden. Die erhaltenen Subpopulationen wurden mit heterologen CD4+ T-Lymphozyten zusammen gebracht. Die Reaktion dieser T-Zellen auf die verschiedenen Subpopulationen wurde im Proliferations- und Sekretionsassay (IFN-γ, IL-4) studiert. Des Weiteren wurde die Zytokinsekretion der Monozytenarten nach definierter Stimulierung (LPS, Zymosan, aktivierte T-Zellen) analysiert. In einem zweiten Versuchskomplex wurden aus den jeweiligen Subpopulationen unreife dendritische Zellen (Sub-DCs) differenziert und diese auf bestimmte Oberflächenmarker bzw. deren Verhalten mit heterologen CD4+ T-Zellen im Proliferations-/Sekretionsassay (IFN-γ, IL-4) untersucht. Nach 7 Tagen Inkubation fanden sich im Sub2- und Sub3-Ansatz ca. 10 % mehr proliferierende T-Zellen als im Sub1-Ansatz. Dabei lag der Anteil der CD25+ T-Zellen in diesen beiden Versuchsansätzen ebenfalls um 10 % höher. Der Proliferationsassay über 14 Tage zeigte für die Sub3 ca. 10-15 % mehr proliferierende T-Zellen als für die anderen Populationen. Das Niveau der CD25-Expression der T-Zellen war hierbei in allen drei Ansätzen gleich. Im Sekretionsassay induzierten alle drei Subpopulationen eine Th1-Antwort, jedoch mit einem leicht höheren Anteil IFN-γ-positiver T-Zellen für die CD16+ Monozyten. Durch LPS-Gabe produzierten die CD14+/CD16+ Monozyten am meisten TNF-α, gefolgt von den CD14++/CD16+. Bei den CD14++/CD16- fanden sich die geringsten Mengen an TNF-α. Zusammen mit aktivierten T-Zellen demonstrierten die CD14++/CD16+ Monozyten die stärkste TNF-α-Sekretion unter allen anderen Subpopulationen. Für die beiden CD16+ Populationen wurden nach LPS-Stimulation höhere Werte für IL-1β bestimmt als für die klassischen Monozyten. Sowohl im LPS- als auch im Zymosanansatz lag die IL-6-Sekretion der CD14++/CD16- Subpopulation über der der anderen zwei Fraktionen. Unter allen drei Stimuli wurden die höchsten Werte für IL-8 bei den CD14++/CD16- Monozyten detektiert, gefolgt von den CD14++/CD16+. Am niedrigsten lag die IL-8-Produktion bei den CD14+/CD16+. Die IL-10-Sekretion im LPS- und im Zymosanansatz der CD14++/CD16- und CD14++/CD16+ Monozyten war gegenüber der CD14+/CD16+ Subpopulation erhöht. Nach Entwicklung der unreifen dendritischen Zellen aus den entsprechenden Monozytenarten weisen diese eine differenzierte Morphologie auf. Die DCs der CD14+/CD16+ Monozyten hatten eine stärkere HLA-DR-Expression in der mittleren Fluoreszenzintensität als die anderen beiden Sub-DC-Populationen, wobei sich keine Unterschiede in der HLA-DRExpressionsintensität zwischen Sub1- und Sub2-DCs feststellen ließen. Der Anteil der CD11c positiven Zellen war bei den Sub1-DCs deutlich größer als bei den Sub2-DCs. Dagegen exprimierten die Sub3-DCs praktisch kein CD11c. Im Proliferationsassay über 7 Tage ergaben sich keine signifikanten Differenzen zwischen den Subpopulationen. Allerdings zeigte sich eine Tendenz zu geringeren Werten im Anteil proliferierender bzw. CD25-positiver T-Lymphozyten für den Sub2-DC-Ansatz. Nach 14 Tagen im Assay war der Anteil der proliferierenden T-Zellen bei den Sub1-DCs um 10 % höher als bei den Sub2-DCs. Es fanden sich ca. 10 % mehr CD25+ T-Zellen im Sub1-DC-Ansatz als in den anderen beiden Ansätzen. Der Sekretionsassay erbrachte für alle Sub-DCs eine Th1-Induktion der T-Zellen. Dabei ließen sich keine Abweichungen im Anteil IFN-γ-positiver T-Zellen zwischen den einzelnen Sub-DC-Kulturen nachweisen. Die gewonnen Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen auf der einen Seite das proinflammatorische Potential (z.B. TNF-α-Sekretion, erhöhte Proliferation), auf der anderen Seite die antiinflammatorische Komponente (IL-10-Sekretion) der CD14++/CD16+ Monozyten. Eine Rolle in der Regulation von entzündlichen und infektiologischen Erkrankungen erscheint für diese Subpopulation denkbar. Die Subpopulation 2 kann dabei als eigenständige Monozytenfraktion betrachtet werden. Die funktionellen Unterschiede zwischen den analysierten Monozytensubpopulationen zeigten sich auch nach deren Differenzierung zu unreifen dendritischen Zellen. In Anbetracht des erhöhten Anteils der CD16+ Monozyten im Rahmen diverser autoimmuner Krankheiten und der immer klarer werdenden Unterteilung in eine CD14++/CD16+ und eine CD14+/CD16+ Subpopulation, sollten weitere Untersuchungen zur klinischen Relevanz dieser Monozytengruppen durchgeführt werden. Die in der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnisse könnten bei der Zuordnung und Interpretation in diese zukünftigen klinischen Befunde behilflich sein. / For more than 20 years monocytes were subdivided in the classical CD14++/CD16- population and the proinflammatory CD16+ populations. The latter one includes about 10-20 % of the peripheral blood monocytes and is dramatically expanded under different pathological circumstances. Recently, the CD16+ fraction was further subdivided into two subpopulations: The CD14++/CD16+ and CD14+/CD16+ monocytes. In the present paper, the subpopulation of CD14++/CD16+ monocytes was characterized in order to answer the question if this subset can be distinguished as an independent cell population. T cells, B cells and NK cells were depleted from peripheral mononuclear blood cells (PBMCs) from healthy donors using immunomagnetic cell separation. Subsequently, the pre-separated cells were stained with anti-CD14-FITC and anti-CD16-PE and separated by fluorescence activated cell sorting (FACS) in three subpopulations: The CD14++/CD16- (Sub1), the CD14++/CD16+ (Sub2) and the CD14+/CD16+ (Sub3). The achieved purity was sufficient for the subsequent experiments. The obtained subpopulations were co-cultured together with heterologous CD4+ T lymphocytes. The reaction of these T cells to the different subpopulations was studied in the proliferation and secretion assay (IFN-γ, IL-4). Furthermore, the cytokine secretion of the monocyte subsets after defined stimulation (LPS, Zymosan, activated T cells) was analysed. In a second set of experiments, immature dendritic cells were differentiated from the monocyte subpopulations (Sub-DCs) and phenotypically and functionally characterized according to the expression of cell surface markers and the response to heterologous CD4+ T cells in the proliferation/secretion assay (IFN-γ, IL-4). After 7 days of incubation, the Sub2 and Sub3 of the monocytes induced approximately 10 % higher proliferation rates of T cells than the Sub1. The resulting frequency of CD25+ T cells in these two co-culture settings was also 10 % higher. The proliferation analysis after 14 days again showed for the Sub3 ca. 10-15 % more proliferating T cells than for the other populations. At this, the frequency of CD25 expression was equal in all co-cultures. In the secretion assay all three subpopulations induced a Th1 response, but the range of IFN-γ-positive T cells was somewhat higher for the CD16+ monocytes. Under LPS stimulation the CD14+/CD16+ monocytes produced the highest amounts of TNF-α followed by the CD14++/CD16+. The CD14++/CD16- showed the lowest amounts of TNF-α. In co-culture with activated T cells the CD14++/CD16+ monocytes demonstrated the strongest TNF-α secretion from all subpopulations. After LPS stimulation, a higher level of IL-1β was measured for both CD16+ populations than for the classical monocytes. In the LPS and the Zymosan stimulated cultures, the IL-6 secretion of the CD14++/CD16- subpopulation was higher than in the two other fractions. Under all three stimuli the highest levels of IL-8 were detected for the CD14++/CD16- monocytes followed by the CD14++/CD16+. The lowest IL-8 production was found by the CD14+/CD16+. The IL-10 secretion of the CD14++/CD16- and CD14++/CD16+ monocytes was increased compared to the CD14+/CD16+ subpopulation after LPS and Zymosan stimulation. The in vitro generated immature dendritic cells from the different monocyte subsets showed a differentiated morphology. The DCs of the CD14+/CD16+ monocytes had the strongest HLA-DR expression compared to the other two Sub-DC populations. No differences in the HLA-DR intensity were found between the Sub1- and Sub2-DCs. The rate of CD11c-positive cells was significantly higher in the Sub1-DCs than in the Sub2-DCs. However, the Sub3-DCs expressed no CD11c altogether. The proliferation assay over 7 days showed no significant differences between the subpopulations. Nevertheless, a tendency for lower levels of proliferating or CD25-positive T lymphocytes was seen in T cells co-cultured with the Sub2-DC. After 14 days, the ratio of proliferating T cells was 10 % higher with the Sub1-DCs than with the Sub2-DCs. The Sub1-DC co-culture yielded ca. 10 % more CD25+ T cells than the other two. The secretion assay revealed for all Sub-DCs a Th1 response of the T cells, with no differences in the amount of IFN-γ-positive T cells between the Sub-DC cultures. The results illustrate on one hand the proinflammatory potential (e.g. TNF-α secretion, higher proliferation), on the other hand the antiinflammatory effect (IL-10 secretion) of CD14++/CD16+ monocytes. A role in the regulation of inflammatory and infectious diseases seems to be possible for this subpopulation. The subpopulation 2 can be regarded as an independent fraction of monocytes. The functional differences between the analyzed monocyte subpopulations are further underscored following differentiation into immature dendritic cells. Considering the increased proportion of CD16+ monocytes in various autoimmune diseases and their clear subdivision in a CD14++/CD16+ and a CD14+/CD16+ subpopulation, new investigations about the clinical relevance are warranted. The findings obtained in the work presented could be in the basis for these future clinical studies.