Introdução: A infecção pelo HIV causa um profundo comprometimento da resposta imune do hospedeiro, podendo levar à aids. Várias estratégias terapêuticas têm sido testadas ao longo dos anos, entre elas a imunoterapia com células dendríticas diferenciadas a partir de monócitos (MoDCs), pulsadas com HIV-1 inativado. Neste caso, a produção de vírus para o pulso das MoDCs consiste inicialmente no isolamento do vírus a partir de amostras de sangue do paciente e, em seguida, sua expansão em culturas de células CD4. Também deve ser considerado que quantidade excessiva de vírus pode ser tóxica para as MoDCs a serem pulsadas e do mesmo modo, quantidade insuficiente de vírus pode não ser efetiva para ativar uma resposta imune especifica. Neste contexto, a investigação do efeito de diferentes concentrações de vírus sobre o perfil fenotípico e funcional de MoDCs poderia auxiliar na determinação de uma quantidade ótima de vírus para o pulso das MoDCs e contribuir para o aperfeiçoamento da vacina terapêutica. Objetivo: Avaliar o efeito de diferentes quantidades de partículas virais, sobre o perfil fenotípico e funcional das MoDCs. Metodologia: Monócitos obtidos de indivíduos HIV+ foram diferenciados em MoDCs e pulsadas com HIV quimicamente inativado (3 partículas/MoDC, 30 partículas/MoDC, 300 partículas/MoDC). As células foram analisadas com relação ao perfil fenotípico, capacidade de internalizar p24, expressão de CD38, HLA-DR e CD69 e a produção de IFN-y por linfócitos T CD4+ e CD8+ autólogos. Resultados: O pulso com concentrações crescentes de vírus parece não interferir no perfil fenotípico e funcional das MoDCs. Conclusão: As diferentes quantidades de partículas virais utilizadas para o pulso parecem não ser tóxicas para as MoDCs estudadas, não tendo sido observadas diferenças com relação ao perfil fenotípico ou funcional das MoDCs / Introduction: The infection from HIV causes a profound impairment of the host immune response, which can lead to aids. Several therapeutic strategies have been tested over the years, including immunotherapy with monocyte - derived dendritic cells (MoDCs), pulsed with inactivated HIV-1. In this case, the production of virus for the pulse of the MoDCs initially consists of isolating the vírus from the patient\'s blood samples and then it into CD4+ cell cultures. It should also be considered that excessive amount of virus can be toxic to the MoDCs to be pulsed and likewise, insufficiently amount may not be effective for properly activate a specific immune response. In this context, the investigation of the effect of different virus concentrations on the phenotypic and functional profile of MoDCs could assist in the determination of an optimal amount of virus for the pulse of the MoDCs and contribute to the improvement of the therapeutic vaccine. Objectives: To evaluate the effect of different amounts of viral particles on the phenotypic and functional profile of MoDCs. Methods: MoDCs generated from HIV+ individuals were differentiated into MoDCs and pulsed with chemically inactivated HIV (3 particles /MoDC, 30 particles /MoDC, 300 particles /MoDC). Cells were analyzed for phenotypic profile, ability to internalize p24, expression of CD38, HLA-DR and CD69, and the production of IFN-y by autologous CD4 + and CD8 + T lymphocytes. Results: The pulse with increasing concentrations of virus does not seem to interfere in the phenotypic and functional profile of the MoDCs. Conclusion: The different amounts of viral particles used for the pulse appear to be non-toxic to the MoDCs studied, and no differences were observed regarding the phenotypic or functional profile of the MoDCs

O presente estudo avaliou a ocorrência de imunoparalisia e sua associação com pior prognóstico em pacientes pediátricos internados em uma UTI de hospital terciário. Para determinar a presença de imunoparalisia procedeu-se a dosagem da expressão de mHLA-DR usando o QuantiBRITE TM Anti HLA-DR/ Anti- Monocyte, um novo reagente que padroniza os valores da citometria de fluxo para o mHLA-DR. Determinamos a expressão de mHLA-DR em 30 pacientes com sepse grave ou choque sépticos admitidos na UTI Pediátrica no período do estudo, mHLA-DR foi quantificado por duas vezes: entre os dias 3 a 5 (mHLA-DR1) e 5 a 7 (mHLA-DR2) após o inicio do quadro séptico. Também foi calculado o deltamHLA-DR (mHLA-DR2 - mHLA-DR1). Dosamos, ainda, o mHLA-DR em vinte e um controles hígidos. O objetivo do estudo foi determinar se a expressão de mHLA-DR correlaciona-se com a mortalidade em pacientes sépticos pediátricos. Os resultados mostram que o mHLA-DR foi significativamente menor nos pacientes sépticos do que nos controles (p = 0.0001). A mortalidade foi de 46% nos pacientes com valores negativos ou < 1000 mAb/cell de deltaHLA-DR, e 7% em pacientes com valores positivos ou > 1000 mAb/cell de deltaHLADR. O deltamHLA-DR médio foi significativamente diferente entre sobreviventes e pacientes que foram a óbito (p = 0.023). Dessa forma, após a análise estatística dos resultados concluímos que o deltaHLA-DR correlaciona-se com a mortalidade em pacientes pediátricos com sepse grave e choque séptico / This study analysis the presence of Immunoparalysis and its association with prognosis in pediatric septic patients of a Tertiary Intensive Care Unit. To determine the presence of immunoparalysis we performed the mHLA-DR dosage using the QuantiBRITE TM Anti HLA-DR/ Anti- Monocyte, a novel reagent that standardizes flow cytometry values. We determined mHLA-DR expression in 30 patients with severe sepsis or septic shock admitted to PICU, mHLA-DR expression was quantified between days 3-5 and 5-7 after the onset of sepsis and calculated the deltamHLA-DR (mHLA-DR2 - mHLADR1). We also measured mHLA-DR levels in twenty-one healthy patients. The objective of this study was to determine if mHLA-DR values correlate with mortality in pediatric septic patients. The results showed that the mean mHLA-DR expression was significantly lower in septic patients compared with controls (p = 0.0001). Mortality was 46% in patients with negative deltaHLA-DR or < 1000 mAb/cell and 7% in patients with positive deltaHLA-DR or > 1000 mAb/cell. Mean deltamHLA-DR levels were significantly different between survivors and non-survivors (p = 0.023). After statistical analysis we concluded that deltaHLA-DR correlates with mortality in pediatric patients with septic shock or severe sepsis

Le sepsis constitue une pathologie fréquente, grevée d’une morbi-mortalité encore élevée. Sa physiopathologie fait notamment intervenir des dysrégulations du système immunitaire inné et adaptatif et des voies de l’apoptose. Ce travail aborde l’expression leucocytaire de deux familles de protéines potentiellement impliquées dans sa physiopathologie :les phosphodiestérases (PDE) et les apolipoprotéines L (apoL). L’étude de l’expression des PDE sous-tend le fait que ces enzymes, qui dégradent les nucléotides cycliques (AMPc et GMPc), sont impliquées dans la modulation de nombreux processus inflammatoires, tant d’origine infectieuse que non-infectieuse. L’expression des PDE après administration de LPS chez l’Homme est cependant mal caractérisée, de même qu’au cours du sepsis. Le présent travail teste l’hypothèse selon laquelle le sepsis, caractérisé par un état de dysrégulation immune complexe, s’accompagne d’une répression de l’expression des PDE au sein des leucocytes circulants, contrairement à ce qui est observé dans des modèles standardisés d’inflammation aiguë (LPS) ;il met également en perspective, dans une démarche observationnelle, l’expression des PDE avec l’expression du complexe HLA-DR, un ensemble protéique permettant la présentation de l’antigène et dont l’expression est partiellement dépendante de l’AMPc. Trois études ont ainsi été menées :étude de l’expression des PDE au cours d’une endotoxinémie chez le volontaire sain (1), et au cours du sepsis au sein de leucocytes totaux circulants (2) ou de sous-populations leucocytaires de l’immunité innée (monocytes CD14+ou granulocytes CD15+) (3). Alors que l’administration intraveineuse de LPS chez le volontaire sain mène à l’induction précoce et transitoire de certaines PDE, de façon similaire aux observations in vitro, les patients septiques présentent au contraire dès leur admission, et jusqu’au 5ème jour, une réduction de l’expression de plusieurs PDE en comparaison aux volontaires sains, tant dans les leucocytes totaux que dans les populations CD14+ et CD15+. L’expression de plusieurs de ces PDE est corrélée aux ratios TNF-α/IL-10 qui sont suggestifs d’un état d’immunodépression, attesté par une réduction significative de l’expression du complexe HLA-DR. L’étude des apoL au cours du sepsis sous-tend quant à elle le fait que cette famille de protéines, qui partage des homologies avec des membres du groupe Bcl-2 impliqué dans l’apoptose, a été associée notamment à l’induction de phénomènes pro-apoptotiques ;or, le sepsis est associé à une apoptose retardée des polynucléaires neutrophiles, un phénomène potentiellement délétère au niveau tissulaire. L’hypothèse d’une répression de l’expression des apoL leucocytaires au cours du sepsis est ainsi posée. Dans le présent travail, une diminution de l’expression des apoL-1, 2, 3 et -6 est observée chez les patients de soins intensifs présentant ou non un sepsis en comparaison à des volontaires sains ;cette réduction, corrélée aux taux de protéine C-réactive, concerne tant les populations leucocytaires totales que les granulocytes CD15+, et intéresse tant les ARNm que l’expression protéique (apoL-6 excepté). Le pourcentage de cellules CD15+ apoptotiques est par ailleurs fortement corrélé aux taux d’ARNm des apoL-1 et -2. Ces observations sont reproduites in vitro en incubant des granulocytes CD15+ de volontaire sain avec du sérum de patients septiques ou non septiques. Ces résultats préliminaires suggèrent ainsi une implication des apoL dans la régulation de l’apoptose des neutrophiles au cours du sepsis. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

O presente estudo avaliou a ocorrência de imunoparalisia e sua associação com pior prognóstico em pacientes pediátricos internados em uma UTI de hospital terciário. Para determinar a presença de imunoparalisia procedeu-se a dosagem da expressão de mHLA-DR usando o QuantiBRITE TM Anti HLA-DR/ Anti- Monocyte, um novo reagente que padroniza os valores da citometria de fluxo para o mHLA-DR. Determinamos a expressão de mHLA-DR em 30 pacientes com sepse grave ou choque sépticos admitidos na UTI Pediátrica no período do estudo, mHLA-DR foi quantificado por duas vezes: entre os dias 3 a 5 (mHLA-DR1) e 5 a 7 (mHLA-DR2) após o inicio do quadro séptico. Também foi calculado o deltamHLA-DR (mHLA-DR2 - mHLA-DR1). Dosamos, ainda, o mHLA-DR em vinte e um controles hígidos. O objetivo do estudo foi determinar se a expressão de mHLA-DR correlaciona-se com a mortalidade em pacientes sépticos pediátricos. Os resultados mostram que o mHLA-DR foi significativamente menor nos pacientes sépticos do que nos controles (p = 0.0001). A mortalidade foi de 46% nos pacientes com valores negativos ou < 1000 mAb/cell de deltaHLA-DR, e 7% em pacientes com valores positivos ou > 1000 mAb/cell de deltaHLADR. O deltamHLA-DR médio foi significativamente diferente entre sobreviventes e pacientes que foram a óbito (p = 0.023). Dessa forma, após a análise estatística dos resultados concluímos que o deltaHLA-DR correlaciona-se com a mortalidade em pacientes pediátricos com sepse grave e choque séptico / This study analysis the presence of Immunoparalysis and its association with prognosis in pediatric septic patients of a Tertiary Intensive Care Unit. To determine the presence of immunoparalysis we performed the mHLA-DR dosage using the QuantiBRITE TM Anti HLA-DR/ Anti- Monocyte, a novel reagent that standardizes flow cytometry values. We determined mHLA-DR expression in 30 patients with severe sepsis or septic shock admitted to PICU, mHLA-DR expression was quantified between days 3-5 and 5-7 after the onset of sepsis and calculated the deltamHLA-DR (mHLA-DR2 - mHLADR1). We also measured mHLA-DR levels in twenty-one healthy patients. The objective of this study was to determine if mHLA-DR values correlate with mortality in pediatric septic patients. The results showed that the mean mHLA-DR expression was significantly lower in septic patients compared with controls (p = 0.0001). Mortality was 46% in patients with negative deltaHLA-DR or < 1000 mAb/cell and 7% in patients with positive deltaHLA-DR or > 1000 mAb/cell. Mean deltamHLA-DR levels were significantly different between survivors and non-survivors (p = 0.023). After statistical analysis we concluded that deltaHLA-DR correlates with mortality in pediatric patients with septic shock or severe sepsis

Le système nerveux central est un organe complexe et privilégié, protégé, entre autres, par la barrière hémato-encéphalique (BHE), sur laquelle se trouvent des transporteurs d'efflux telle que la P-glycoprotéine (Pgp).<br />La BHE est impliquée dans la neuro-inflammation et les maladies cérébrales associées, et la littérature laisse penser que l'endothéline 1 (ET-1) y joue un rôle important. En utilisant un modèle in vitro autologue de BHE humaine adulte et un modèle in vitro de BHE humaine fœtale (co-culture de cellules gliales et de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales), nous avons étudié l'effet de l'ET-1 sur la Pgp.<br />Une différence, en termes de modulation de l'activité de la Pgp, a été observée entre la BHE fœtale et la BHE adulte suite à l'exposition à l'ET-1. Nous avons également évalué la modulation induite par l'ET-1 sur la sécrétion de la MCP-1 (Monocyte chemoattractant protein 1) et de l'IL-8. Les résultats montrent que l'ET-1 diminue l'activité de la Pgp et induit la sécrétion de MCP-1 et d'IL-8.

Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazellulär lebender einzelliger Parasit, der sich durch ein breites Wirtsspektrum sowie lebenslang persistierende Infektionen bei Menschen und Tieren auszeichnet. T. gondii hat für ein langfristiges Überleben unterschiedliche Mechanismen entwickelt, die ein Gleichgewicht zwischen der Pathogenität des Erregers und der intakten Immunabwehr des Wirtes gewährleisten. In diesem Kontext stellt die Modulation von Signalwegen der Wirtszelle eine wichtige Überlebensstrategie von Toxoplasmen dar. Frühere Arbeiten mit murinen Monozyten haben gezeigt, dass T. gondii die Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen auf der Oberfläche infizierter Wirtszellen hemmt und dadurch eine effektive Antigenpräsentation an T-Helfer-Lymphozyten verhindert. Das Ziel der vorliegenden Dissertation war es herauszufinden, inwieweit Toxoplasma gondii auch die Interferon-γ-induzierte MHC-Expression von Monozyten des Menschen vermindert. Analysen mittels Immunfluoreszenzfärbung und Durchflusszytometrie zeigten, dass sowohl primäre, aus PBMC des Menschen isolierte Monozyten als auch permanente humane Monozyten (THP-1) durch eine Infektion mit T. gondii in der Expression von HLA-A, -B, -C und HLA-DR, -DP, -DQ signifikant gehemmt werden. Das Ausmaß der Inhibition ist dabei von der Infektionsdosis des Parasiten abhängig und betrifft sowohl die HLA-Expression auf der Zelloberfläche als auch den intrazellulären HLA-Pool. Interessanterweise kann dieser Effekt auch durch hohe Konzentrationen des stimulierenden Zytokins Interferon-γ nicht aufgehoben werden. Es zeigt sich außerdem eine signifikant reduzierte Expression von HLA-DR, -DP, -DQ bei Parasit-negativen Zellen einer T. gondii-infizierten Kultur, was möglicherweise durch sezernierte Proteine des Parasiten oder durch die Produktion hemmender Zytokine durch infizierte Wirtszellen begründet sein kann. Die HLA-Expression in in vitro-infizierten und nicht-infizierten primären Monozyten wurde darüberhinaus zwischen T. gondii-negativen Individuen und Spendern mit chronischer Toxoplasmose verglichen. Chronisch mit T. gondii infizierte Blutspender wurden serologisch anhand von spezifischen IgG-Antikörpern identifiziert. Durchflusszytometrische Analysen zeigten, dass Monozyten aus chronisch mit T. gondii infizierten Blut-Spendern signifikant mehr HLA-A, -B, -C und HLA-DR, -DP, -DQ exprimieren als Monozyten aus Toxoplasma-negativen Spendern. Eine Erklärung für diese gesteigerte MHC-Expression könnte eine Dominanz bestimmter Monozyten-Subpopulationen in Abhängigkeit vom Infektionsstatus ihres Spenders sein. Die Expression von HLA-A, -B, -C und HLA-DR, -DP, -DQ wird jedoch sowohl bei Monozyten von T. gondii-positiven als auch nicht-infizierten Individuen durch eine Infektion mit Toxoplasmen in vitro signifikant inhibiert. Analysen mit Hilfe von RT-qPCR zeigten deutlich, dass T. gondii mit der HLA-DR-, -DP-, -DQ-Expressions-Kaskade interferiert und die Synthese der Transkripte von IRF-1 und CIITA dosisabhängig inhibiert. Außerdem sind die Transskripte für HLA-A und HLA-DRα in infizierten Monozyten deutlich reduziert. Dies legt die Annahme nahe, dass T. gondii die Aktivierung von STAT1-abhängigen Promotoren effektiv inhibiert und so die Synthese der sich anschließenden HLA-Expressionskaskade supprimiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit eröffnen interessante Ansätze für weitere Untersuchungen, insbesondere eine genauere Charakterisierung von Monozyten-Subpopulationen bei T. gondii-positiven Individuen sowie die Erforschung einer möglicherweise gesteigerten Immunreaktivität gegen andere Infektionserreger im Rahmen einer chronischen Toxoplasmose.

Grâce aux avancées de la recherche de ces dix dernières années, qui ont permis l'implémentation de plus en plus de fonctions au sein d'un système microfluidique, les " laboratoires sur puce " connaissent un essor important notamment dans le domaine de la santé. Les premiers dispositifs voient le jour dans le domaine commercial, mais un verrou important reste d'identifier des éléments circulants en faible concentration dans le sang par exemple. Les techniques de séparation simples, efficaces et modulables sont la clef de cette problématique. Nous présentons dans ce travail une voie originale de séparation magnétique grâce à des bobines planaires en cuivre combinées à un système microfluidique 3D permettant une séparation verticale efficace. L'étude consiste en la conception, la modélisation, la réalisation et le test de dispositifs appliqués à des solutions tests constituées de billes magnétiques dans un premier temps, puis de composés biologiques de culture. La réalisation des laboratoires sur puce a été faite par des procédés de photolithographie et grâce à une technologie originale de laminage de film sec. De par sa très bonne robustesse, dans le temps et face aux solvants, ainsi que sa biocompatibilité, la SU-8 est un candidat de choix pour la réalisation de ces LOC. Cette technologie nous a permis de réaliser des dispositifs tout-polymère tridimensionnels et intégrant des fonctions actives dont l'actionnement magnétique. La microélectronique a depuis longtemps permis de miniaturiser tous les éléments électroniques courants tels les capteurs et les bobines. Il est alors très intéressant de voir comment nous pouvons les intégrer dans un dispositif microfluidique pour créer des fonctions plus complexes. Nous avons pu ainsi démontrer une séparation continue de monocyte THP1 de culture avec une efficacité de 82% et des voies d'amélioration prometteuses validées avec des billes magnétiques.

Infection is a leading cause of death in hemodialysis patients, partly due to dysfunctional immunity. Frequent dialysis therapy improves patient outcomes and quality of life. We hypothesize that extended home hemodialysis (EHHD) also improves immune function compared to conventional in-hospital hemodialysis (CHD); therefore, we designed a prospective matching-cohort clinical study to assess serum inflammatory markers and the functional capacity of monocyte-derived dendritic cells (MDDCs) and T-lymphocytes. Serum CRP was decreased in EHHD patients suggesting that extended dialysis may decrease inflammatory solute/cytokine levels. Compared to controls, MDDCs from hemodialysis patients had similar endocytic capacity, expression of co-stimulatory molecules, and T-cell activation capacity. However, CHD was associated with the highest expression of CD83 and CD40. Activated T-cells in CHD patients also produced significantly more immunosuppressive IL-10 compared to EHHD patients and controls. Therefore, EHHD may improve immune function by decreasing inflammation, MDDC pre-activation, and synthesis of immunosuppressive cytokines.

Autoantikörper gegen Proteinase 3 (cANCA) stellen einen hochsensitiven und spezifischen Seromarker für das Krankheitsbild der Wegenersche Granulomatose dar. Während die Ätiologie dieser systemischen Vaskulitis unbekannt ist, weisen zahlreiche klinische und experimentelle Daten darauf hin, daß cANCA an der Entstehung und Chronifizierung dieser Erkrankung beteiligt sind. Insbesondere die Konsequenzen einer cANCA-Ligation an Proteinase 3 (PR3)-exprimierende Neutrophile wurden intensiv untersucht und man geht davon aus, daß Anti-PR3-Antikörper über die Aktivierung inflammatorischer, neutrophiler Zellfunktionen die Vaskulitis fördern. Über die Auswirkungen von cANCA auf Monozyten, die eine wichtige Rolle in der Regulation der Immunantwort spielen und weitere Zielzellen dieser Antikörper darstellen, ist hingegen bisher wenig bekannt. Aktivierte Monozyten sind nicht nur ein wesentlicher Bestandteil der Granulome, sondern sind auch entscheidend an den vaskulären Entzündungsinfiltraten beteiligt. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, die Effekte von cANCA auf inflammatorische Zellfunktionen PR3-exprimierender Monozyten zu charakterisieren. Dabei war insbesondere ihr Einfluß auf die transendotheliale Migration und die Sekretion proinflammatorischer Mediatoren von Interesse. Die Isolation humaner Monozyten erfolgte mittels Gegenstromzentrifugation. Die monozytäre Transmigration wurde in mit humanen Endothelzellen bewachsenen Filtereinsätzen untersucht und mittels eines chemotaktischen Gradienten und/oder TNF-Stimulation der Endothelzellen gefördert. Die transendotheliale Migration von mit murinen, monoklonalen Anti-PR3-Antikörpern vorinkubierten Monozyten war, unabhängig vom Aktivierungszustand der Endothelzellen, deutlich vermindert. Dieser Effekt konnte sowohl durch vier von fünf cANCA-IgG-Fraktionen von Patienten mit aktiver WG als auch durch F(ab´)2-Fragmente der Autoantikörper reproduziert werden. Da bekannt ist, daß cANCA die proteolytische Aktivität von PR3 inhibieren und membrangebundenen Formen der leukozytären Serinproteasen PR3, humaner leukozytärer Elastase (HLE) und Cathepsin G (CathG) eine Rolle bei der Extravasion von Leukozyten zugesprochen wird, wurde daraufhin überprüft, ob PR3 für die monozytäre Transmigration von Bedeutung ist. Der physiologische Inhibitor dieser Serinproteasen, 1-Antitrypsin, und ein synthetischer Inhibitor von PR3 und HLE, CE-2072, verminderten die Anzahl migrierender Monozyten in gleichem Maße wie der vollständige Anti-PR3-Antikörper bzw. dessen F(ab´)2-Fragmente. Dahingegen hatte SLPI, ein Serpin, das lediglich CathG und HLE inhibiert, keinen Effekt auf die Anzahl migrierender Zellen. Dabei waren die Effekte von Anti-PR3-Antikörpern und 1-Antitrypsin nicht additiv, wodurch die Annahme, daß die Anti-PR3-mediierte Reduktion der monozytären Transmigration auf einer funktionellen Inhibition von PR3 beruht, untermauert wird. Die Reduktion der monozytären Transmigration ging nicht mit einer modifizierten endothelialen Adhäsion der Monozyten einher, wie unter dynamischen und statischen Bedingungen gezeigt werden konnte. Weder die rollende noch die feste Adhäsion der Monozyten wurde durch Anti-PR3-Antikörper oder Serinproteaseinhibitoren beeinträchtigt. Auch die durchflußzytometrisch quantifizierte Expression monozytärer ß1- und ß2-Integrine wurde durch die Autoantikörper nicht beeinflußt. Diese Ergebnisse zeigen erstmals, daß PR3 an der transendothelialen Migration, nicht aber der Adhäsion von Monozyten teilhat. Ein weiteres, wesentliches Ergebnis der vorliegenden Studie ist die, im Vergleich zu entsprechenden IgG-Kontrollen, massive Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren aus Monozyten in Gegenwart muriner Anti-PR3-Antikörper bzw. humaner cANCA, die mittels ELISA ermittelt wurde. Die Sekretion war zeitabhängig, wobei die Sekretion von TNF- und IL-1ß der von Thromboxan A2, IL-6 und IL-8 vorausging. Im Gegensatz zu den Auswirkungen von cANCA auf die monozytäre Transmigration, konnten diese Effekte nicht durch die alleinige Ligation des Antikörpers an das Antigen PR3 reproduziert werden, sondern waren von einer simultanen Ligation der Autoantikörper an PR3 und FcR auf der monozytären Oberfläche abhängig. Eine cANCA-mediierte Retention adhärenter Monozyten im Gefäßbett bei gleichzeitiger Aktivierung der monozytären Freisetzung inflammatorischer Zytokine und Prostanoide durch cANCA, könnte nicht nur die Entstehung der extra- und perivaskulären, granulomatösen Entzündung, sondern auch die Aufrechterhaltung der nekrotisierenden Vaskulitis fördern. Insgesamt weisen die Ergebnisse dieser Studie erstmals auf eine funktionelle Rolle von PR3 bei der transendothelialen Migration von Monozyten hin. Außerdem liefern sie weitere wesentliche Hinweise darauf, wie die Interaktion von cANCA mit Monozyten an der Pathogenese der Wegenerschen Granulomatose beteiligt sein könnten.

Abstract Osteoclasts are multinuclear bone degrading cells differentiated from monocytes which can be isolated from bone marrow and peripheral blood. Complex signaling between osteoclast precursors and other bone cells, such as mesenchymal stromal cells (MSC) occurs during the differentiation. Gap junctional communication (GJC) is one of the mechanisms in the cell fusion. GJC can be modulated with several substances such as the specific GJC stimulators, antiarrhythmic peptides (AAP). Due to their promising clinical value in the treatment of cardiac disorders, the effects of AAPs in cardiac tissue are studied extensively. This study was conducted in order to investigate the roles of GJC and AAPs in bone cell cultures. Further, the contribution of the MSCs on the effects of AAPs was studied along with comparison of two types of osteoclastogenesis cultures with differing quantities of MSCs. GJC in osteoclastogenesis was studied with both GJC inhibitors and stimulators in mouse monocyte line RAW 264.7 cells and primary cultures with bone marrow hematopoietic cells. The following studies were made with human monocytes from peripheral blood and bone marrow where the effects of AAP10 were investigated in normal and acidic environments. In addition, comparison of osteoclastogenesis from bone marrow and peripheral blood monocytes was carried out in in vitro cell cultures on bovine or human bone slices. The cells were analyzed with regard to multinuclearity, bone resorption and the expression of several osteoclast markers. The results show that GJC is utilized in osteoclastogenesis, but it is not indispensable. GJC in monocytes can be stimulated with the AAPs during osteoclastogenesis, but the effects depend on the culture conditions as well as on the presence of MSCs in the culture. The AAPs can also activate the MSCs leading to indirect regulation of osteoclastogenesis, as the MSCs produce several molecules affecting the differentiation. Further, monocytes from peripheral blood showed increased potential for osteoclastogenic differentiation compared to bone marrow derived monocytes. This can be explained by the presence of the osteoclastogenesis-controlling MSCs in the bone marrow culture, while the peripheral blood cultures contain only few of these cells and thus lack their regulatory effects. / Tiivistelmä Osteoklastit ovat monitumaisia luuta hajottavia soluja, jotka ovat erilaistuneet monosyyteistä. Monosyyttejä voidaan eristää luuytimestä tai perifeerisestä verestä. Erilaistumisen aikana osteoklastien esiastesolujen sekä muiden luusolujen, kuten mesenkymaalisten stroomasolujen (MSC) välillä tapahtuu monimutkaista signalointia. Aukkoliitoskommunikointi (GJC) on eräs solufuusiossa tapahtuvista mekanismeista. GJC:tä voidaan muunnella useilla aineilla, esimerkiksi spesifisillä stimulaattoreilla, antiarytmisillä peptideillä (AAP). AAP-yhdisteiden vaikutuksia on tutkittu laajalti sydänkudoksessa johtuen niiden lupaavista kliinisistä ominaisuuksista sydänperäisten oireiden hoidossa. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää GJC:n ja AAP-yhdisteiden roolia luusoluviljelmissä. Lisäksi tutkittiin MSC-solujen osallistumista AAP-yhdisteiden vaikutuksiin sekä vertailtiin kahta erilaista osteoklastogeneesiviljelmää, joissa oli eri määrä MSC-soluja. GJC:tä osteoklastogeneesissä tutkittiin sekä sitä estävillä että stimuloivilla yhdisteillä hiiren monosyyttilinjan RAW 264.7 -soluissa sekä luuytimen hematopoieettisten solujen primääriviljelmissä. Seuraavat tutkimukset tehtiin ihmisen luuytimen ja perifeerisen veren monosyyteillä, ja niissä selvitettiin AAP10-yhdisteen vaikutuksia fysiologisissa sekä happamissa olosuhteissa. Lisäksi vertailtiin luuytimen ja perifeerisen veren monosyyttien osteoklastogeneesiä. In vitro -soluviljelmät tehtiin naudan tai ihmisen luulastujen päällä, ja soluista analysoitiin monitumaisuus, luun resorptio sekä useiden osteoklastimarkkereiden ilmentyminen. Tulokset osoittavat, että GJC:tä hyödynnetään osteoklastogeneesissä, mutta se ei ole korvaamaton mekanismi. GJC:tä voidaan stimuloida AAP-yhdisteillä osteoklastogeneesin aikana, mutta vaikutukset riippuvat viljelyolosuhteista sekä MSC-solujen läsnäolosta. AAP-yhdisteet voivat aktivoida myös MSC-soluja johtaen osteoklastogeneesin epäsuoraan säätelyyn, kun MSC-solut tuottavat useita erilaistumiseen vaikuttavia molekyylejä. Lisäksi perifeerisen veren monosyyteillä havaittiin korkeampi osteoklastogeeninen erilaistumispotentiaali verrattuna luuytimen monosyytteihin. Tulokset voidaan selittää osteoklastogeneesiä säätelevien MSC-solujen läsnäololla luuydinviljelmissä, kun taas perifeerisen veren monosyyttiviljelmissä näitä soluja on vain vähän, jolloin myös niiden säätelyominaisuudet puuttuvat.