Submitted by Alexandre Sousa (alexandre.sousa@incqs.fiocruz.br) on 2014-08-01T12:58:03Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Izabela.pdf: 1302143 bytes, checksum: ab457123bfc94643d499a3062e8b2cc2 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-08-01T12:58:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Izabela.pdf: 1302143 bytes, checksum: ab457123bfc94643d499a3062e8b2cc2 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / O teste de detecção de pirogênio é preconizado nas farmacopeias como teste de segurança imprescindível para a avaliação da qualidade de produtos injetáveis. Os métodos alternativos ao teste de pirogênio em coelhos são o Teste de Lisado de Amebócitos de Limulus (LAL) e o Teste de Ativação de Monócitos (MAT). Esses métodos ainda não podem substituir o teste em coelhos por completo, pois no caso do LAL os resultados podem não ser confiáveis quando a análise é realizada na presença de algumas substâncias interferentes com alto teor de lipídios e proteínas (encontrados nos medicamentos biológicos) e glucanas, além disso, o teste só detecta endotoxinas. Em relação ao MAT, já que o teste é sensível para todos os tipos de pirogênios e tem o mesmo mecanismo biológico responsável pela reação de febre em humanos, o Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) recomendou sua utilização desde que fique demonstrada a equivalência de seus resultados ao teste em coelhos, em conformidade com a regulamentação aplicável. Verifica-se assim, que a literatura carece de dados que envolvam a comparação entre a dose limite que causa febre em coelhos e a correspondência para o MAT relacionado ao ácido lipoteicóico (ALT), sendo assim, esse estudo tem como objetivo principal avaliar a utilização do MAT na detecção da contaminação de ALT de S. aureus em Cloreto de Sódio 0,9 % apirogênico artificialmente contaminado, através do estabelecimento de curva dose-resposta de ALT em coelhos; curva concentração-resposta de ALT para o MAT e avaliação em paralelo dos resultados obtidos utilizando ALT no teste em coelhos, LAL cromogênico e MAT. A resposta de febre foi observada a partir de 75.000 ng de ALT/Kg nos coelhos e no MAT para sangue criopreservado/IL-1β foi estabelecida em 50.000 ng/mL de ALT, ou 5,41 UEE/mL. O teste de LAL apresentou resultado falso-reativo a partir de 10.000 ng/mL de ALT. Os resultados apresentados neste estudo fornecem informações importantes sobre a comparação entre o teste de pirogênio em coelhos, MAT e LAL, contribuindo com dados para a validação do MAT, envolvendo outros pirogênios que não a endotoxina, e também para a aceitação deste teste pelos órgãos regulatórios no Brasil visando uma possível substituição do uso de animais, garantindo, assim, a segurança da saúde da população. / The pyrogenic test is preconized in the Pharmacopeias as a safety test indispensable for the quality of evaluation of injectable products. The alternative methods to the rabbit pyrogen test are the Limulus Amebocite Lysate (LAL) Test and the Monocyte Activation Test (MAT). These methods cannot replace the rabbit test completely yet, for in the case of LAL the results may not be reliable when the analysis is carried out in the presence of some interfering substances with high content of lipids and proteins (found in biological medicines) and glucans, moreover, the test only detects endotoxins. Concerning the MAT, since the test is sensitive to all types of pyrogens and has the same biological mechanism responsible for the fever reaction in humans, the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (Comitê de Coordenação Interagências sobre Validação de Métodos Alternativos - ICCVAM) have recommended its utilization provided that the equivalence of its results from the rabbit test, in conformity with the applicable regulation. It can be verified, then, that the literature lacks the data which involves the comparison between the limit dose that causes fever in rabbits and the consequence for the MAT related to the lipoteichoic acid (LTA), that being so, the aim of this study is mainly the utilization of MAT in the detection of the contamination of LTA of S. aureus in apyrogenic 0.9 % Sodium Chloride artificially contaminated, through the establishment of the dose-response curve of LTA in rabbits; concentration-response curve of LTA for the MAT and parallel evaluation of the results obtained by utilizing LTA in the test in rabbits, chromogenic LAL and MAT. The fever response was observed from 75.000 ng of LTA/Kg in rabbits and in MAT and for cryopreserved blood/IL-1β was established in 50.000 ng/mL of LTA, or 5,41 UEE/mL. The LAL test presented a false-positive result from 10.000 ng/mL of ALT. The results presented in this study provide important information on the comparison between the rabbit pyrogen test, MAT and LAL, contributing with data to the evaluation of MAT, involving pyrogens other than endotoxin, and also to the acceptance of this test by the regulatory organs in Brazil aiming at a possible animal substitution, and guaranteeing, then, the health security of the population.

Les monocytes classiques (cMo) sont des phagocytes mononucléés circulant dans le sang et capables de migrer vers les tissus enflammés pour s’y différencier en monocytes inflammatoires, cellules dendritiques dérivées de monocytes (MoDC), macrophages (MoM) ou cellules myéloïdes suppressives. Selon le contexte physiopathologique, les cellules dérivées de cMo peuvent être bénéfiques ou néfastes. Dans l’infection par le cytomégalovirus murin (MCMV) leur rôle est controversé. Les divergences apparentes dans la littérature pourraient s’expliquer par l’utilisation de souches distinctes de souris ou de virus, l’étude d’organes différents, et la confusion existante sur l’identité et la plasticité de différents sous-types de cellules dérivées de cMo. Par des analyses transcriptionnelles, morphologiques et fonctionnelles, mon travail de thèse montre que, dans la rate de souris infectées par MCMV, les cMo se différencient simultanément en monocytes inflammatoires, MoDC et MoM. Cette différenciation est abrogée lorsque les cMo sont incapables de répondre aux interférons de type I (IFN-I), massivement produits dans les infections virales, qui boostent l’immunité intrinsèque antivirale et promeuvent l’activation des cellules immunitaires innées et adaptatives. La déplétion des cMo compromet le contrôle de l’infection et les réponses des cellules Natural Killer et des lymphocytes T CD8+. Mon travail montre que, dans les souris infectées par MCMV, les cMo se différencient, de manière dépendante de l’IFN-I, en trois sous-types cellulaires distincts qui contribuent à la fois au contrôle de la réplication virale et à la promotion de réponses immunitaires innées et adaptatives protectrices. / Classical monocytes (cMo) are mononuclear phagocytes mainly localized in the blood at steady state. Upon inflammation cMo migrate into inflamed tissues where they can differentiate in inflammatory monocytes, monocyte-derived dendritic cells (MoDC), monocyte-derived macrophages (MoM) or myeloid derived suppressor cells (MDSC). Depending on the physiopathological context, cMo-derived cells can be beneficial or detrimental. There are major discrepancies between published reports on the role of cMo during MCMV infection. This may be due to the use of distinct strains of mice or of virus, to the study of different organs, or to the confusion existing in the field regarding the identity and the plasticity of the different types of cMo-derived cells. During my PhD, by combining gene expression profiling, morphological, phenotypical and functional studies, I have shown that splenic cMo in MCMV-infected mice encompass cells that had simultaneously differentiated in vivo into either inflammatory monocytes, MoDC or MoM. This cMo differentiation is abrogated in the absence of responsiveness to type I interferons (IFN-I), which are highly produced during viral infections and boosting cell-intrinsic anti-viral immunity as well as promoting the activation of innate and adaptive immune responses. cMo depletion compromises the control of MCMV replication and the antiviral responses of Natural Killer cells and CD8+ T lymphocytes. My PhD work demonstrates that, in MCMV-infected mice, cMo differentiate, via an IFN-I-dependent pathway, into three distinct cell subtypes that are involved both in the control of MCMV replication and in the induction of protective innate and adaptive immunity.

(EN) Reduced microbial stimulation of an immature neonatal immune system can lead to a poor balance adjustment of immune responses, thus contributing to the development of allergic diseases, whose incidence continues to rise. One of the promising precautionary measures seems to be an early preventive administration of probiotic bacteria to pregnant or nursing mothers, or to newborns. Previous works have described a beneficial effect of Escherichia coli O83:K24:H31 (E. coli O83) in the prevention of allergic diseases. In order to contribute to the clarification of E. coli O83 effects on the neonatal immune system, its immune- modulating properties were tested in vitro on umbilical cord blood cells. The ability of E. coli O83 to support the maturation of in vitro-derived dendritic cells from cord blood precursors (moDCs) of the children of healthy (children with a relatively low risk of allergy) and allergic (children at a relatively high risk of developing allergies) mothers was tracked by flow cytometry, qPCR and ELISA. Probiotic bacteria-stimulated moDCs were subsequently cultured with autologous naive CD4+ T lymphocytes and immune response polarization was also characterised by flow cytometry, qPCR, and ELISA. It was evident from the results that E. coli O83 promoted moDCs maturation. The presence of...

Infection is a leading cause of death in hemodialysis patients, partly due to dysfunctional immunity. Frequent dialysis therapy improves patient outcomes and quality of life. We hypothesize that extended home hemodialysis (EHHD) also improves immune function compared to conventional in-hospital hemodialysis (CHD); therefore, we designed a prospective matching-cohort clinical study to assess serum inflammatory markers and the functional capacity of monocyte-derived dendritic cells (MDDCs) and T-lymphocytes. Serum CRP was decreased in EHHD patients suggesting that extended dialysis may decrease inflammatory solute/cytokine levels. Compared to controls, MDDCs from hemodialysis patients had similar endocytic capacity, expression of co-stimulatory molecules, and T-cell activation capacity. However, CHD was associated with the highest expression of CD83 and CD40. Activated T-cells in CHD patients also produced significantly more immunosuppressive IL-10 compared to EHHD patients and controls. Therefore, EHHD may improve immune function by decreasing inflammation, MDDC pre-activation, and synthesis of immunosuppressive cytokines.

La maladie de Crohn (Crohn’s disease; CD) et la colite ulcéreuse (Ulcerative colitis ;CU) représentent deux formes distinctes de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), qui sont associées à une réponse immunitaire aberrante des tissus intestinaux à la flore intestinale. Les phagocytes mononucléés (MNPs) qui dialoguent, via les cytokines qu'ils produisent, avec les cellules immunitaires innées et adaptatives sont impliqués dans l’induction, la perpétuation et le maintien de la réponse inflammatoire des MICI. Chez la souris, les MNPs sont stratifiées en cellules dendritiques conventionnelles (cDCs), macrophages (M) et cellules dérivées de monocytes, une entité qui regroupe dans le tissu des cellules dendritiques dérivées de monocytes (Mo-DC), des M dérivés de monocytes et des « monocyte-like ». Toutefois, la diversité phénotypique, moléculaire et fonctionnelle des monocytes et des MNPs ainsi que la plasticité des monocytes restent à élucider dans les MICI. Les anticorps bloquant les cytokines IL12 et IL23 contrôlent la pathogénicité et la plasticité des cellules Th17, réduisant l'inflammation intestinale chez les patients atteints de MII. Cependant, il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. L’étude approfondie de la plasticité des cellules T et du site tissulaire où elle pourrait se produire ne sont toujours pas clarifiés. Dans le premier chapitre, nous avons révélé l’existence de deux sous-populations distinctes de CD14+MNPs dans le colon de patients atteints de CU. Les cellules de type « inflammatory monocyte-like » CD14+CD163-CD64+ (P3) à l’opposé des CD14+CD163+CD64+ M (P4) s'accumulent dans le côlon inflammatoire. Nos résultats ont de plus établi un lien entre les P3 MNPs, l’IL12, l’IL1β et la détection de cellules Th17 mémoires produisant de l'IFN et de l'IL8, qui contribueraient collectivement à la pathogenèse de la CU. De plus, deux sous-populations CD14+ MNPs similaires sur le plan fonctionnel et moléculaire a ceux trouvés en CU, ont été détectées dans le côlon de patients atteints de CD. En revanche, dans le deuxième chapitre, nous fournissons des évidences que la sous-population monocytaire Slan+ pourrait contribuer à l’immunopathogenèse de la CD, mais pas à celle de la CU. La fréquence, le phénotype et la fonction des cellules Slan+ ont été examinés dans le sang, les ganglions mésentériques (MLN) et le côlon de patients atteints de MICI. Nous proposons que les cellules pro-inflammatoires CD14hiCD172α+Slan+ discriminent les tissus de CD et CU. En effet, elles ne s'accumulent que dans les MLNs et la muqueuse colique des patients atteints de CD. Dans le troisième chapitre, nous avons montré que les MLNs de CD et de CU, qui sont des tissus difficiles d'accès pour leur étude fonctionnelle en recherche, peuvent également être distingués par la distribution et le profil moléculaire des cellules T mémoire effectrices CXCR3-CCR6+ (Th17TEM). Nos données suggèrent également que la plasticité de Th17 se produit dans les MLNs avant leur migration vers l'intestin. Cette étude pourrait avoir des implications pour améliorer notre compréhension de la maladie. Enfin, il a été démontré qu’à l’homéostasie chez la souris, les monocytes sont continuellement recrutés dans la muqueuse intestinale où ils se différencient progressivement en M anti-inflammatoires. Ce processus de maturation est interrompu dans le contexte d'une inflammation. Les signaux environnementaux qui régulent la « cascade » de maturation d’un monocyte classique tissulaire demeurent inconnus chez l'homme. Dans le quatrième chapitre, nous avons récapitulé in vitro la cascade de différenciation des monocytes humains de «CD163- P3-like» en «CD163+P4-like» et avons montré leurs similitudes moléculaires avec les CD14+ MNP tissulaires. La manipulation de cette voie de différentiation pourrait ouvrir des pistes thérapeutiques pour restaurer l'homéostasie intestinale dans les MICI. En conclusion, une meilleure compréhension des sous-populations de MNPs, leurs fonction et plasticité dans la pathogenèse des MICI aidera à identifier des nouvelles cibles thérapeutiques et contribuera à augmenter les connaissances pour la mise au point de traitements personnalisés. / Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC), the two forms of inflammatory bowel diseases (IBD), are associated with dysregulated immune response in the intestinal tissue. It is mediated by mononuclear phagocytes (MNPs) that dialogue via the cytokine they produce with innate and adaptive immune cells. In mice, MNPs are stratified into conventional dendritic cells (DCs), macrophages (M) and monocyte-derived cells that regroup tissue monocyte-derived DCs, monocyte-derived M and monocytes-like cells. However, the phenotypic, molecular and functional diversity of MNPs and their plasticity remain to be elucidated in IBD patients. Therapies in IBD employ antibodies that block IL12 and IL23, thus control Th17 pathogenicity and plasticity and decrease intestinal inflammation. However, no cure exist nowadays for the treatment of IBD. In-depth study of T cell plasticity and the tissue where it occurs remain to be investigated. In the first chapter, we revealed the existence of two distinct CD14+ MNP subsets in colon of UC patients. Only, CD163-CD64+ inflammatory monocyte-like cells (P3) but not anti-inflammatory CD163+CD64+ M (P4) accumulate in inflamed UC colon. Our findings further established a link between monocyte-like CD14hiCD172α+ CD163- MNPs, IL12, IL1β and the detection of colonic memory Th17 cells that produce IFN and IL8, which might all contribute to UC pathogenesis. Two CD14+ MNP subsets, resembling their counterparts in UC mucosa at the functional and molecular level, were also detected in CD colon. In contrast, in the second chapter, we provide evidence that Slan+ monocyte subset may contribute to CD but not UC immunopathogenesis. Frequency, phenotype, and function of Slan+ cells were examined in blood, colon, and mesenteric lymph nodes (MLN) of patients with IBD. We showed that pro-inflammatory CD14hiCD172α+Slan+ cells are a distinguishing feature between CD and UC, as they only accumulate in MLNs and colonic mucosa of CD patients. In the third chapter, we showed that MLNs of CD and UC, tissues that were hard to access for research use, can also be distinguished by frequencies of CXCR3−CCR6+ Th17 effector memory T cells (TEM) and their molecular profile. Our data further suggested that Th17 plasticity is taking place in MLN, before T cell homing to gut tissues. This investigation has clear implications in furthering our understanding of the disease. Finally, it has been demonstrated that monocytes are continuously recruited into murine gut mucosa and progressively differentiate into macrophages under homeostatic conditions, a maturation process interrupted in the context of inflammation. However, the environmental cues that regulate tissue inflammatory monocyte “waterfall” remain to be investigated in humans. In the fourth chapter we recapitulated in vitro human monocyte differentiation cascade, from CD163- inflammatory monocyte-like cells (P3) towards anti-inflammatory CD163+ macrophages (P4) and showed their molecular similarities to tissue CD14+ MNPs. Manipulating this pathway might open therapeutic avenues to restore tissue homeostasis. In conclusion, a better understanding of MNP subsets, function and plasticity in IBD pathogenesis would help identify novel therapeutic targets and shed light for the development of personalized treatments.

Depuis sa découverte en 1983, la recherche sur le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) a connu un essor exemplaire, permettant la mise en place de tests de dépistage sensibles et de traitements antirétroviraux (TARs) efficaces. Malgré ces traitements qui contrôlent la réplication virale à des niveaux plasmatiques indétectables, l’éradication du VIH n’est pas atteinte. L’ADN intégré du VIH persiste dans des sous-populations cellulaires et la réplication virale reprend après l’arrêt du traitement. Alors que la persistance des réservoirs du VIH dans les lymphocytes T CD4+ est bien documentée, la contribution des cellules myéloïdes n’est pas bien définie. De plus, les TAR ne bloquent pas la transcription du VIH, permettant ainsi une réplication virale résiduelle dans certains tissus tels que la muqueuse intestinale. Cette réplication résiduelle est une source d‘activation immunitaire chronique et une barrière contre la guérison. La survie des lymphocytes T CD4+ mémoires portant les réservoirs du VIH est dépendante, en partie, de l’interaction avec les cellules dendritiques (DCs), dans le cadre du processus de présentation antigénique. L’identification des signaux fournis par les DCs et menant à la réactivation transcriptionnelle des réservoirs du VIH reste un axe de recherche prioritaire afin d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques. Mes études doctorales ont eu pour but de comprendre la contribution directe et indirecte des cellules myéloïdes à la persistance du VIH-1 sous TAR. Dans la première partie de mon doctorat, je me suis intéressée à la contribution directe de différentes sous-population myéloïdes à la persistance des réservoirs du VIH sous TAR dans le sang et le colon des personnes vivant avec le VIH (PLWH). Nous avons démontré que la présence des réservoirs du VIH dans ces cellules myéloïdes était un évènement rare. En parallèle, j’ai réalisé des travaux dans un modèle de souris humanisées pour explorer l’existence et la contribution des cellules myéloïdes d’origine embryonnaire de longue durée de vie et capables d’autorenouvèlement à la persistance des réservoirs viraux sous TAR. Nous avons démontré que, contrairement aux lymphocytes T CD4+, les cellules myéloïdes résidant dans le foie et les poumons portent de l’ADN viral intégré avant, mais pas après la TAR, ce qui est un indicateur de leur faible contribution à la persistance du VIH sous TAR. Dans la deuxième partie de mon doctorat, je me suis intéressée à la contribution indirecte des cellules myéloïdes, et en particulier celle des DCs dérivées des monocytes (MDDCs) classiques CD16- versus intermédiaires/non-classiques CD16+. Nous avons démontré que les MDDCs CD16+ se distinguent des MDDC CD16- par l’activité élevée de leur enzyme RALDH métabolisant la vitamine A en acide rétinoïque et leur capacité supérieure à transmettre le VIH aux lymphocytes T CD4+ spécifiques/réactives au Staphylococcus aureus (S. aureus). De plus, nous avons démontré que les MDDC RALDH+ contribuent à l'établissement et à la réactivation des réservoirs du VIH dans les cellules T spécifiques à certains pathogènes non-VIH, tels que S. aureus, via un mécanisme dépendant de la production de l’acide rétinoïque par les MDDC en réponse à des ligands du recepteur de type Toll (TLR) 2. Ensemble, mes études doctorales démontrent que, bien que les cellules myéloïdes contribuent rarement de façon directe à la persistance des réservoirs du VIH, leur rôle indirect est important dans ce processus via l’interaction avec les lymphocytes T CD4+. De plus, les résultats que j’ai générés élargissent les connaissances sur la spécificité antigénique des lymphocytes T CD4+ mémoires portant les réservoirs du VIH et identifient l’enzyme RALDH comme une potentielle cible thérapeutique pour limiter la dissémination du virus et la persistance des réservoirs au niveau des muqueuses. Dans la première partie de mon doctorat, je me suis intéressée à la contribution directe de différentes sous-population myéloïdes à la persistance des réservoirs du VIH sous TAR dans le sang et le colon des personnes vivant avec le VIH (PLWH). Nous avons démontré que la présence des réservoirs du VIH dans ces cellules myéloïdes était un évènement rare. En parallèle, j’ai réalisé des travaux dans un modèle de souris humanisées pour explorer l’existence et la contribution des cellules myéloïdes d’origine embryonnaire de longue durée de vie et capables d’autorenouvèlement à la persistance des réservoirs viraux sous TAR. Nous avons démontré que, contrairement aux lymphocytes T CD4+, les cellules myéloïdes résidant dans le foie et les poumons portent de l’ADN viral intégré avant, mais pas après la TAR, ce qui est un indicateur de leur faible contribution à la persistence du VIH sous TAR. Dans la deuxième partie de mon doctorat, je me suis intéressée à la contribution indirecte des cellules myéloïdes, et en particulier celle des DCs dérivées des monocytes (MDDCs) classiques CD16- versus intermédiaires/non-classiques CD16+. Nous avons démontré que les MDDCs CD16+ se distinguent des MDDC CD16- par l’activité élevée de leur enzyme RALDH métabolisant la vitamine A en acide rétinoïque et leur capacité supérieure à transmettre le VIH aux lymphocytes T CD4+ spécifiques/réactives au Staphylococcus aureus (S. aureus). De plus, nous avons démontré que les MDDC RALDH+ contribuent à l'établissement et à la réactivation des réservoirs du VIH dans les cellules T spécifiques à certains pathogènes non-VIH, tels que S. aureus, via un mécanisme dépendant de la production de l’acide rétinoïque par les MDDC en réponse à des ligands du recepteur de type Toll (TLR) 2. Ensemble, mes études doctorales démontrent que, bien que les cellules myéloïdes contribuent rarement de façon directe à la persistance des réservoirs du VIH, leur rôle indirect est important dans ce processus via l’interaction avec les lymphocytes T CD4+. De plus, les résultats que j’ai générés élargissent les connaissances sur la spécificité antigénique des lymphocytes T CD4+ mémoires portant les réservoirs du VIH et identifient l’enzyme RALDH comme une potentielle cible thérapeutique pour limiter la dissémination du virus et la persistance des réservoirs au niveau des muqueuses. / Since the discovery of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) in 1983, significant breakthroughs have led to efficient and sensitive viral tests, as well as potent antiviral therapies (ART). However, although ART controls viral replication to undetectable plasma levels, viral eradication is yet not achieved. Integrated HIV-DNA persists in different cell subsets, and viral replication resumes after treatment interruption. While HIV persistence is well characterized in CD4+ T-cells, the contribution of myeloid cells remains elusive. Notably, ART does not inhibit HIV transcription, thus allowing for residual viral replication in tissues such as the gut. This low level of viral replication contributes to chronic immune activation and represents a major challenge in developing a cure. Memory CD4+ T-cells bearing HIV reservoirs interact with dendritic cells (DCs) in an antigen specific manner, resulting in T-cell clonal expansion. Hence, we need to identify cellular signals provided by DCs that lead to transcriptional reactivation of HIV reservoirs. During my Ph.D., I studied the direct and indirect mechanisms by which myeloid cells contribute to HIV persistence during ART. In the first part of my thesis, I studied the direct contribution of myeloid subsets to the persistence of the HIV reservoir during ART. We demonstrated that HIV persistence in myeloid cells is a rare event in the blood and colon of ART-treated people living with HIV (PLWH). In parallel, we used humanized mice (hu-BLT) to explore the contribution of long-lived tissue-resident macrophages (LL-TRM), with embryonic origin and self-renewal capacity to the HIV reservoir during ART. We demonstrated that myeloid cells in this hu-BLT mouse model, are permissive to HIV infection, but are not HIV reservoirs during ART. These results point to the need for establishing new models allowing LL-TRM development for HIV reservoir studies. In the second part of my thesis, I studied the indirect contribution of DCs derived from classical (CD16-) or intermediate/non-classical (CD16+) monocyte origin. We identified that, in contrast to CD16- monocyte-derived DCs (MDDCs), CD16+ MDDCs exhibit a superior activity of the RALDH enzyme, involved in retinoic acid metabolism, and a higher capacity to transmit HIV to CD4+ T-cells specific/reactivated to Staphylococcus aureus (S. aureus). Furthermore, we demonstrated that RALDH+ MDDCs contribute to HIV reservoir establishment and reactivation in T-cells with specificity to non-HIV pathogens (e.g. S. aureus) through a retinoic acid-dependent mechanism in response to Toll like receptor (TLR) 2 stimulation. Together, these results underline the key role of CD16+ MDDCs and bacterial/fungal pathogens in fueling HIV reservoir establishment/outgrowth via a RALDH/RA-dependent mechanism that may be therapeutically targeted. In conclusion, my doctoral work demonstrated that, despite the rare direct contribution of myeloid cells to the HIV reservoir, these cells play an important indirect role through their ability to interact with CD4+ T-cells and to modulate their functions. These results extend the knowledge on the antigenic specificity of memory CD4+ T-cells harboring HIV reservoirs and they identify the RALDH/retinoic acid pathway as a potential therapeutic target to limit viral dissemination and persistence of viral reservoirs in mucosal sites.

Inflammaging is a hallmark of human aging. Defined as low-grade, chronic inflammation, it is characterized by heightened proinflammatory cytokines in the blood and tissues and predicts morbidity and mortality. Despite this, the etiology of inflammaging and its role in infection have remained elusive, an issue this thesis addressed. First, we provided a comprehensive overview of an intranasal Streptococcus pneumoniae colonization model (Chapter 2). We described in detail the colonization technique, and demonstrated how to isolate and phenotype recruited cells, quantify bacterial load and measure production of immune mediators in the nasopharynx. Since both myeloid cell recruitment and tumour necrosis factor (TNF) production were increased following S. pneumoniae colonization with age, we investigated whether TNF directly augmented monocyte frequency (Chapter 3). TNF increased CCR2 expression on monocytes in old mice, leading to their enhanced egress from the bone marrow, resulting in enrichment of this population in the circulation. Monocyte numbers directly influenced plasma IL-6 levels, and this negatively impacted anti-bacterial responses, as monocyte blockade improved pneumococcal clearance in old mice. Lastly, to better understand the fundamental source of inflammaging, we studied the impact of the host microbiome on its development. This work was rooted in Elie Metchnikoff’s early predictions that leakage of intestinal bacterial products could dysregulate macrophage function, resulting in inflammation that would progress aging (Chapter 4). We showed that old mice had increased intestinal permeability, aberrant expression of cellular junction genes and increased microbial translocation from the gut to the blood. Germ-free mice lived longer than their conventionally colonized counterparts, and were protected from the development of inflammaging and defective macrophage function. Together, these studies resolve a major disparity in the field by demonstrating that systemic TNF production is initiated by increased levels of circulating bacterial products, driving functional defects in myeloid cells, which ultimately impairs anti-bacterial immunity. / Thesis / Candidate in Philosophy

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