A doação de plaquetas por aférese é um procedimento automatizado que permite a obtenção deste hemocomponente em grande quantidade e com ato grau de pureza; deste processo obtém-se um subproduto chamado Câmara de Leucorredução (CLR) que é descartado ao final da doação. São permitidas até 24 doações/ano; porém as possíveis consequências de doações frequentes para esses doadores são pouco investigadas. Assim, foram identificados e quantificados os leucócitos de doadores de plaquetas frequentes e de 1ª vez. Também foi avaliada a viabilidade do uso das células mononucleares da CLR para pesquisas. Observou-se mais células na CLR que no sangue e que a frequência das populações é similar. O estado de ativação e a capacidade funcional (proliferação e produção de citocinas) foram similares entre CLR e sangue, assim como a taxa de apoptose espontânea. Entre doadores frequentes e de primeira vez não houve diferença no número de leucócitos, sugerindo que doações recorrentes não alteraram as populações leucocitárias. / Plateletpheresis is an automatized procedure to obtain high purity platelet for transfusions. From this procedure its possible to obtain a byproduct: The Leukoreduction system chamber (LRSC), which is discarded at the end of donation process. This type of donation allows 24 donation/year, but the consequences of frequent donations are poorly investigated. Therefore, we identified and quantified leukocytes of frequent and first time platelet donor. Also, was evaluated the viability, for research, of mononuclear cells recovery from LRSC. The total number of mononuclear cells was higher in LRSC than in peripheral blood samples, but the frequencies were similar in all the samples. Activation state and functional capacity (measured by cell proliferation and cytokine production) were similar in both, blood and LRSC mononuclear cells, as well as spontaneous apoptosis. Among frequent (6 or more donations in 1 year) and first time donor, there was no difference in the leukocyte total number, suggesting that frequent donation do not modify these cells.

A esclerose múltipla (EM), doença neurodegenerativa do sistema nervoso central (SNC) com característica auto-imune e inflamatória, com eventos iniciais, bem como a evolução da EM. É uma doença heterogênea (três principais formas clínicas) e multifatoriais. A imunidade inata demonstrou recentemente ser um fator importante na EM e as variantes genéticas dos componentes do inflamassoma têm sido associadas a doenças autoimunes e neurodegenerativas, com isso hipotetizamos que o inflamassoma e suas citocinas IL-1Beta e IL-18, podem representar importantes contribuintes na patogênese da EM e eventualmente explicar, pelo menos em parte, a heterogeneidade observada em pacientes com EM. Fizemos uma análise multivariada que foi realizada com base na forma clínica (recorrente remitente/RR, primária progressivo /PP ou secundário progressiva /SP, índice de gravidade (EDSS) e índice de progressão (IP). Os monócitos do sangue periférico (PBMC) dos pacientes foram examinados para ativação do inflamassoma (Produção de IL-1Beta e IL-18, clivagem de caspase-1). Com os objetivos de avaliar a contribuição do inflamassoma na EM, em termos de (a) efeito genético sobre o desenvolvimento, gravidade e / ou prognóstico, e (b) ativação complexa de células de sangue periférico como uma forma de avaliar a inflamação sistêmica. Para isso, utilizamos variantes genéticas funcionais em componentes do inflamassoma, que foram analisadas em uma coorte de pacientes com EM, pelo uso de ensaios específicos de alelos e qPCR. A analise multivariada resultou em associação com a variante -511C / T IL1B ganho de função, sendo essa mais frequente em formas progressivas (especialmente SP) do que em RR. A variante de ganho de função NLRP3 Q705K resultou mais frequente em pacientes com EDSS > 3 do que em pacientes com EDSS < 3 e, consequentemente, esse SNP está associado a um IP mais elevado. A análise de PBMC mostrou que as células de indivíduos EM, são mais propensas a responder a um estímulo NLRP3 clássico (isto é, LPS) do que as dos doadores saudáveis. Em conjunto, esses achados indicaram que os pacientes com EM apresentam uma desregulação no inflamassoma NLRP3, podendo ser avaliada no sangue periférico facilitando um prognóstico, e que esse perfil pode ser secundário a um mecanismo genético pró-inflamassoma / The multiple sclerosis (MS), neurodegenerative disease of the central nervous system (CNS) with autoimmune and inflammatory characteristics, with initial events, as well as the evolution of MS, are heterogeneous (three main clinical forms) and multifactorial. Innate immunity has recently been shown to be an important factor in MS and the genetic variants of the components of inflammassoma have been associated with autoimmune and neurodegenerative diseases, thereby hypothesizing that the inflammassoma and its IL-1Beta and IL-18 cytokines may represent important contributors in the pathogenesis of MS and possibly explain, at least in part, the heterogeneity observed in MS patients. We performed a multivariate analysis that was performed based on clinical form (recurrent recurrent / RR, progressive primary / PP or progressive secondary / SP, EDSS and progression index.) Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of patients were examined for inflammatory activation (IL-1Beta and IL-18 production, caspase-1 cleavage). With the objectives of evaluating the contribution of inflammassoma in MS in terms of (a) genetic effect on development, severity and / or prognosis, and (b) complex activation of peripheral blood cells as a way of assessing systemic inflammation. For this, we used functional genetic variants in components of the inflammassoma, which were analyzed in a cohort of MS patients, through the use of specific allele and qPCR assays. For this, we used functional genetic variants in components of the inflammassoma, which were analyzed in a cohort of MS patients, through the use of specific allele and qPCR assays. Multivariate analysis resulted in association with the -511C / T IL1B function gain, which is more frequent in progressive forms (especially SP) than in RR. The gain variant of NLRP3 Q705K function was more frequent in patients with EDSS > 3 than in patients with EDSS < 3 and, consequently, this SNP is associated with a higher PI. PBMC analysis showed that cells from MS individuals are more likely to respond to a classical NLRP3 (ie LPS) stimulus than healthy donors. Taken together, these findings indicated that patients with MS have a dysregulation in the NLRP3 inflammassoma and can be evaluated in the peripheral blood facilitating a prognosis and that this profile may be secondary to a pro-inflammatory genetic mechanism

A esclerose múltipla (EM), doença neurodegenerativa do sistema nervoso central (SNC) com característica auto-imune e inflamatória, com eventos iniciais, bem como a evolução da EM. É uma doença heterogênea (três principais formas clínicas) e multifatoriais. A imunidade inata demonstrou recentemente ser um fator importante na EM e as variantes genéticas dos componentes do inflamassoma têm sido associadas a doenças autoimunes e neurodegenerativas, com isso hipotetizamos que o inflamassoma e suas citocinas IL-1Beta e IL-18, podem representar importantes contribuintes na patogênese da EM e eventualmente explicar, pelo menos em parte, a heterogeneidade observada em pacientes com EM. Fizemos uma análise multivariada que foi realizada com base na forma clínica (recorrente remitente/RR, primária progressivo /PP ou secundário progressiva /SP, índice de gravidade (EDSS) e índice de progressão (IP). Os monócitos do sangue periférico (PBMC) dos pacientes foram examinados para ativação do inflamassoma (Produção de IL-1Beta e IL-18, clivagem de caspase-1). Com os objetivos de avaliar a contribuição do inflamassoma na EM, em termos de (a) efeito genético sobre o desenvolvimento, gravidade e / ou prognóstico, e (b) ativação complexa de células de sangue periférico como uma forma de avaliar a inflamação sistêmica. Para isso, utilizamos variantes genéticas funcionais em componentes do inflamassoma, que foram analisadas em uma coorte de pacientes com EM, pelo uso de ensaios específicos de alelos e qPCR. A analise multivariada resultou em associação com a variante -511C / T IL1B ganho de função, sendo essa mais frequente em formas progressivas (especialmente SP) do que em RR. A variante de ganho de função NLRP3 Q705K resultou mais frequente em pacientes com EDSS > 3 do que em pacientes com EDSS < 3 e, consequentemente, esse SNP está associado a um IP mais elevado. A análise de PBMC mostrou que as células de indivíduos EM, são mais propensas a responder a um estímulo NLRP3 clássico (isto é, LPS) do que as dos doadores saudáveis. Em conjunto, esses achados indicaram que os pacientes com EM apresentam uma desregulação no inflamassoma NLRP3, podendo ser avaliada no sangue periférico facilitando um prognóstico, e que esse perfil pode ser secundário a um mecanismo genético pró-inflamassoma / The multiple sclerosis (MS), neurodegenerative disease of the central nervous system (CNS) with autoimmune and inflammatory characteristics, with initial events, as well as the evolution of MS, are heterogeneous (three main clinical forms) and multifactorial. Innate immunity has recently been shown to be an important factor in MS and the genetic variants of the components of inflammassoma have been associated with autoimmune and neurodegenerative diseases, thereby hypothesizing that the inflammassoma and its IL-1Beta and IL-18 cytokines may represent important contributors in the pathogenesis of MS and possibly explain, at least in part, the heterogeneity observed in MS patients. We performed a multivariate analysis that was performed based on clinical form (recurrent recurrent / RR, progressive primary / PP or progressive secondary / SP, EDSS and progression index.) Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of patients were examined for inflammatory activation (IL-1Beta and IL-18 production, caspase-1 cleavage). With the objectives of evaluating the contribution of inflammassoma in MS in terms of (a) genetic effect on development, severity and / or prognosis, and (b) complex activation of peripheral blood cells as a way of assessing systemic inflammation. For this, we used functional genetic variants in components of the inflammassoma, which were analyzed in a cohort of MS patients, through the use of specific allele and qPCR assays. For this, we used functional genetic variants in components of the inflammassoma, which were analyzed in a cohort of MS patients, through the use of specific allele and qPCR assays. Multivariate analysis resulted in association with the -511C / T IL1B function gain, which is more frequent in progressive forms (especially SP) than in RR. The gain variant of NLRP3 Q705K function was more frequent in patients with EDSS > 3 than in patients with EDSS < 3 and, consequently, this SNP is associated with a higher PI. PBMC analysis showed that cells from MS individuals are more likely to respond to a classical NLRP3 (ie LPS) stimulus than healthy donors. Taken together, these findings indicated that patients with MS have a dysregulation in the NLRP3 inflammassoma and can be evaluated in the peripheral blood facilitating a prognosis and that this profile may be secondary to a pro-inflammatory genetic mechanism

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Alternatives have been proposed to accelerate the tissue repair process, foremost among them the use of stem cells (SC). For implantation of these cells are needed biodegradable carriers, which allow better adhesion, provide a microenvironment suitable for adaptation and cell implantation site. The Platelet Rich Plasma (PRP) is an autologous source and cost of growth factors (GFs), which concentrates platelets and GFs released by them, accelerating bone formation and improving the quality of newly formed bone. It may be a carrier suitable for implantation of SC, therefore, not induce immune responses, and contains factors that induce osteoblastic differentiation. The goal of this work was to evaluate by clinical, biochemical, radiological and histological findings, the use of PRP associated with mononuclear stem cells (MoSC) in the cortical bone healing in dogs. Also proposed to elaborate a PRP protocol efficient in dogs by means of a small volume of whole blood standardize the use of two force plates simultaneously in orthostatic pattern, and comparing this kind with the use of a platform. To evaluate the effectiveness of this association, was used 30 adult dogs, female, mixed breed, weighing between 5 and 10 kg, separated by random draw in six treatments. Was made a failure elliptical 1,0x0,4cm medial cortical diaphyseal tibia of each animal, being completed in accordance with the proposed treatment: solution of sodium chloride 0,9% (G1), PRP (G2), the total fraction of mononuclear cells TFMC originated of bone marrow (G3), stromal vascular fraction - SVF derived of adipose tissue (G4), TFCM associated with PRP (G5) and SVF associated with PRP (G6). In the preoperative period was collected blood for preparation laboratory protocol of PRP, bone marrow collection and adipose tissue, and processing of fractions of MoSC. Were evaluated daily clinical degrees of lameness, radiological, girth before, and biomechanics in the immediate postoperative period, at 7, 14, 21, 30, 37 and 45 days, and biopsies at 15 and 45 days. In biopsy of 15 days, the failure was enlarged to 1,5x0,4cm and treatment redone, which is currently regarded as the immediate postoperative period in subsequent evaluations. The protocol of the PRP showed efficiency made, focusing on average 7,29 ± 3,21 times the original number of platelets from whole blood, from 7,5 ml of blood. The use of two force platforms simultaneously, was successful, without difference between using one or two platforms. In the X-ray analysis and biomechanical G2, G3, G5 and G6 groups were more effective in bone healing and support of the limb, followed by G4, and after G1. Histological evaluation showed higher degree of advancement scar G5 and G6, G4 in sequence and finally G1. Concluding that association MoSC and PRP is effective, being responsible for an early neoangiogenesis, accelerated osteogenesis, with better quality of bone formation, osteoblast density and intense. The groups G5 and G6 are the best adjuvant treatment of bone healing in dogs, followed by G2, after G3, G4 then, and lastly G1. / Alternativas têm sido propostas para acelerar o processo reparativo tecidual, destacando-se entre elas o uso das células-tronco (CT). Para o implante destas células são necessários carreadores biodegradáveis, que permitem melhor adesão, fornecem um microambiente adequado, e favorecem a adaptação celular no local de implantação. O Plasma rico em plaquetas (PRP) é uma fonte autógena e de baixo custo de fatores de crescimento (FCs), que concentra as plaquetas e os FCs liberados por elas, acelerando a formação óssea e melhorando a qualidade do osso neoformado. Pode ser um carreador adequado para o implante das CT, pois, não induz resposta imune, além de conter fatores indutores da diferenciação osteoblástica. O objetivo deste trabalho foi avaliar por estudos clínicos, biomecânicos, radiográficos e histológicos, o uso do PRP associado às células-tronco mononucleares (CTMo) na cicatrização óssea cortical em cães. Também se objetivou elaborar um protocolo de PRP eficiente em cães, por meio de um pequeno volume de sangue total, padronizar o uso de duas plataformas de força, simultaneamente, em padrão ortostático, nesta espécie e comparar com o uso de uma plataforma. Para avaliar a efetividade dessa associação, foram utilizados 30 cães adultos, fêmeas, sem raça definida, pesando entre 5 e 10kg, separados por sorteio aleatório em seis tratamentos. Foi confeccionada uma falha elíptica de 1,0x0,4cm na cortical medial diafisária da tíbia direita de cada animal, sendo preenchida de acordo com o tratamento proposto: solução de cloreto de sódio a 0,9% (G1), PRP (G2), fração total das células mononucleares - FTCM originadas da medula óssea (G3), fração vascular estromal - FVE derivada do tecido adiposo (G4), FTCM associada ao PRP (G5) e FVE associada ao PRP (G6). No período préoperatório foi realizada coleta de sangue, protocolo laboratorial para confecção do PRP, coleta de medula óssea e tecido adiposo, e processamento das frações das CTMo. Realizou-se avaliação clínica diária, dos graus de claudicação, radiográfica, perimetria da coxa antes, e biomecânica no pós-operatório imediato, aos 7, 14, 21, 30, 37 e 45 dias, e biópsias aos 15 e 45 dias. Na biópsia de 15 dias, a falha foi ampliada para 1,5x0,4cm e o tratamento refeito, sendo este momento considerado como o pós-operatório imediato nas avaliações subsequentes. O protocolo de PRP confeccionado demonstrou eficiência, concentrando em média, 7,29 ± 3,21 vezes o número inicial de plaquetas do sangue total, a partir de 7,5ml de sangue. O uso de duas plataformas de força, simultaneamente, obteve sucesso, não havendo diferença entre usar uma ou duas plataformas. Nas análises radiográficas e biomecânicas G2, G3, G5 e G6 foram os grupos mais efetivos na cicatrização óssea e no apoio do membro operado, seguidos de G4, e após G1. Na avaliação histológica e imuno-histoquímica observou-se maior grau de adiantamento cicatricial em G5 e G6, em sequência G4 e por fim G1. Concluí-se que associação CTMo e PRP é eficiente, sendo responsável por uma neoangiogênese precoce, osteogênese acelerada, com melhor qualidade do osso neoformado, e intensa densidade osteoblástica. Os grupos G5 e G6 são os melhores tratamentos adjuvantes da cicatrização óssea em cães, seguidos de G2, após G3, depois G4, e por último G1.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A fibrose hepática é o resultado de uma resposta cicatrizante frente a repetidas lesões no fígado, e é caracterizada pelo acúmulo excessivo de proteínas da matriz extracelular (MEC) no parênquima hepático, incluindo colágeno, fibronectina, elastina, laminina e proteoglicanos, com a participação de diferentes populações celulares do fígado. As principais células responsáveis pela síntese de proteínas da MEC na fibrose hepática são as células estreladas hepáticas ativadas e os miofibroblastos, que surgem após estímulo inflamatório e são caracterizadas pela expressão de alfa-actina de músculo liso (&#945;-SMA). Sabe-se que durante a progressão da fibrose hepática, ocorre a morte de hepatócitos e sua substituição por células fibrogênicas &#945;-SMA+. A apoptose dessas células fibrogênicas é de grande relevância para a regressão da fibrose e regeneração hepática. Nos últimos anos, a terapia com células tronco de medula óssea tem sido utilizada para estimular a regeneração hepática em diferentes modelos experimentais e protocolos clínicos. A fração mononuclear da medula óssea adulta possui duas populações de células-tronco importantes no tratamento de diversas doenças hepáticas: células-tronco hematopoiéticas e células-tronco mesenquimais. O objetivo deste estudo foi analisar a expressão de &#945;-SMA e o processo de apoptose de células hepáticas durante a fibrose hepática induzida por ligadura do ducto biliar (LDB) e após o transplante de células mononucleares de medula óssea (CMMO). Os fígados foram coletados de ratos dos seguintes grupos: normal, 14 dias de LDB, 21 dias de LDB e animais que receberam CMMO após 14 dias de LDB, e foram analisados após 7 dias (totalizando 21 dias de LDB). Para quantificar a expressão de &#945;-SMA por células fibrogênicas nos grupos experimentais, foi realizada imunoperoxidase para &#945;-SMA, seguida de morfometria no programa Image Pro Plus. Para analisar a apoptose nas células hepáticas, foi realizada imunoperoxidase e Western Blotting (WB) para caspase-3 (proteína apoptótica) e imunofluorescência com dupla-marcação para caspase-3 e &#945;-SMA, seguida de observação em microscópio confocal. Os resultados da quantificação de &#945;-SMA por morfometria mostraram que a expressão de &#945;-SMA aumentou significativamente 14 e 21 dias após a LDB. Entretanto, essa expressão diminuiu significativamente no grupo tratado com CMMO, que apresentou parênquima hepático mais preservado em relação ao grupo com 21 dias de LDB. Os resultados de imunoperoxidase, WB e microscopia confocal para expressão de caspase-3 demonstraram que essa proteína diminuiu nos animais fibróticos com 14 e 21 dias de LDB com relação ao grupo normal, e estava significativamente elevada no grupo tratado com CMMO. A análise por microscopia confocal demonstrou que algumas células coexpressaram &#945;-SMA e caspase-3 nos animais tratados com CMMO, sugerindo a morte de células fibrogênicas e remodelamento do parênquima hepático. / Hepatic fibrosis is the result of a scarring response due to continued injury to the liver, and is featured by excessive accumulation of extracellular matrix (MEC) proteins in hepatic parenchyma. These proteins include collagen, fibronectin, elastin, laminin and proteoglicans, along with the participation of different cell populations within the liver. The main cells responsible for the synthesis of MEC proteins are activated hepatic stellate cells and myofibroblasts, which appear after inflammatory stimuli and are characterized by the expression of alpha-smooth muscle actin (&#945;-SMA). It is known that hepatic fibrosis progression is accompanied by hepatocyte death and its substitution by &#945;-SMA+ fibrogenic cells. Therefore, apoptosis of these fibrogenic cells is of main relevance to fibrosis regression and hepatic regeneration. In the later years, bone marrow stem cell therapy has been used to stimulate hepatic regeneration in different experimental models and clinical protocols. The adult bone marrow mononuclear fraction contains two stem cell populations particularly important in the treatment of diverse hepatic diseases: hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells. The aim of this study was to analyze &#945;-SMA expression and the apoptotic process in hepatic cells during hepatic fibrosis induced by bile duct ligation (BDL) and after bone marrow mononuclear cell (BMMC) transplantation. Livers were collect from rats of the following groups: normal, 14 days of BDL, 21 days of BDL and rats that received BMMC 14 days after BDL and were analyzed after 7 days (total of 21 days of BDL). To quantify &#945;-SMA expression by fibrogenic cells in the experimental groups, immunoperoxidase to &#945;-SMA followed by morphometry in the Image Pro Plus software was performed. To analyze apoptosis in hepatic cells, immunoperoxidase and western blotting (WB) against caspase-3 (apoptotic protein) were used, along with double immunofluorescence against caspase-3 and &#945;-SMA to confocal microscopy analysis. Results of &#945;-SMA quantification by morphometry showed that &#945;-SMA expression increased significantly 14 and 21 days after BDL. However, this expression was significantly decreased in the BMMC treated group, which presented a more preserved hepatic parenchyma in relation to the group with 21 days of BDL. Immunoperoxidase, WB and confocal microscopy results showed that caspase-3 is decreased in fibrotic livers with 14 and 21 days of BDL in comparison to normal group, and was significantly augmented in the BMMC treated group. Confocal microscopy analysis showed that were cells coexpressing &#945;-SMA and caspase-3 in rats treated with BMMC, suggesting fibrogenic cells death and hepatic remodeling.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A fibrose hepática é o resultado de uma resposta cicatrizante frente a repetidas lesões no fígado, e é caracterizada pelo acúmulo excessivo de proteínas da matriz extracelular (MEC) no parênquima hepático, incluindo colágeno, fibronectina, elastina, laminina e proteoglicanos, com a participação de diferentes populações celulares do fígado. As principais células responsáveis pela síntese de proteínas da MEC na fibrose hepática são as células estreladas hepáticas ativadas e os miofibroblastos, que surgem após estímulo inflamatório e são caracterizadas pela expressão de alfa-actina de músculo liso (&#945;-SMA). Sabe-se que durante a progressão da fibrose hepática, ocorre a morte de hepatócitos e sua substituição por células fibrogênicas &#945;-SMA+. A apoptose dessas células fibrogênicas é de grande relevância para a regressão da fibrose e regeneração hepática. Nos últimos anos, a terapia com células tronco de medula óssea tem sido utilizada para estimular a regeneração hepática em diferentes modelos experimentais e protocolos clínicos. A fração mononuclear da medula óssea adulta possui duas populações de células-tronco importantes no tratamento de diversas doenças hepáticas: células-tronco hematopoiéticas e células-tronco mesenquimais. O objetivo deste estudo foi analisar a expressão de &#945;-SMA e o processo de apoptose de células hepáticas durante a fibrose hepática induzida por ligadura do ducto biliar (LDB) e após o transplante de células mononucleares de medula óssea (CMMO). Os fígados foram coletados de ratos dos seguintes grupos: normal, 14 dias de LDB, 21 dias de LDB e animais que receberam CMMO após 14 dias de LDB, e foram analisados após 7 dias (totalizando 21 dias de LDB). Para quantificar a expressão de &#945;-SMA por células fibrogênicas nos grupos experimentais, foi realizada imunoperoxidase para &#945;-SMA, seguida de morfometria no programa Image Pro Plus. Para analisar a apoptose nas células hepáticas, foi realizada imunoperoxidase e Western Blotting (WB) para caspase-3 (proteína apoptótica) e imunofluorescência com dupla-marcação para caspase-3 e &#945;-SMA, seguida de observação em microscópio confocal. Os resultados da quantificação de &#945;-SMA por morfometria mostraram que a expressão de &#945;-SMA aumentou significativamente 14 e 21 dias após a LDB. Entretanto, essa expressão diminuiu significativamente no grupo tratado com CMMO, que apresentou parênquima hepático mais preservado em relação ao grupo com 21 dias de LDB. Os resultados de imunoperoxidase, WB e microscopia confocal para expressão de caspase-3 demonstraram que essa proteína diminuiu nos animais fibróticos com 14 e 21 dias de LDB com relação ao grupo normal, e estava significativamente elevada no grupo tratado com CMMO. A análise por microscopia confocal demonstrou que algumas células coexpressaram &#945;-SMA e caspase-3 nos animais tratados com CMMO, sugerindo a morte de células fibrogênicas e remodelamento do parênquima hepático. / Hepatic fibrosis is the result of a scarring response due to continued injury to the liver, and is featured by excessive accumulation of extracellular matrix (MEC) proteins in hepatic parenchyma. These proteins include collagen, fibronectin, elastin, laminin and proteoglicans, along with the participation of different cell populations within the liver. The main cells responsible for the synthesis of MEC proteins are activated hepatic stellate cells and myofibroblasts, which appear after inflammatory stimuli and are characterized by the expression of alpha-smooth muscle actin (&#945;-SMA). It is known that hepatic fibrosis progression is accompanied by hepatocyte death and its substitution by &#945;-SMA+ fibrogenic cells. Therefore, apoptosis of these fibrogenic cells is of main relevance to fibrosis regression and hepatic regeneration. In the later years, bone marrow stem cell therapy has been used to stimulate hepatic regeneration in different experimental models and clinical protocols. The adult bone marrow mononuclear fraction contains two stem cell populations particularly important in the treatment of diverse hepatic diseases: hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells. The aim of this study was to analyze &#945;-SMA expression and the apoptotic process in hepatic cells during hepatic fibrosis induced by bile duct ligation (BDL) and after bone marrow mononuclear cell (BMMC) transplantation. Livers were collect from rats of the following groups: normal, 14 days of BDL, 21 days of BDL and rats that received BMMC 14 days after BDL and were analyzed after 7 days (total of 21 days of BDL). To quantify &#945;-SMA expression by fibrogenic cells in the experimental groups, immunoperoxidase to &#945;-SMA followed by morphometry in the Image Pro Plus software was performed. To analyze apoptosis in hepatic cells, immunoperoxidase and western blotting (WB) against caspase-3 (apoptotic protein) were used, along with double immunofluorescence against caspase-3 and &#945;-SMA to confocal microscopy analysis. Results of &#945;-SMA quantification by morphometry showed that &#945;-SMA expression increased significantly 14 and 21 days after BDL. However, this expression was significantly decreased in the BMMC treated group, which presented a more preserved hepatic parenchyma in relation to the group with 21 days of BDL. Immunoperoxidase, WB and confocal microscopy results showed that caspase-3 is decreased in fibrotic livers with 14 and 21 days of BDL in comparison to normal group, and was significantly augmented in the BMMC treated group. Confocal microscopy analysis showed that were cells coexpressing &#945;-SMA and caspase-3 in rats treated with BMMC, suggesting fibrogenic cells death and hepatic remodeling.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / This work presentes the study realized with monopodal and bipodal aroyl(N,N-dialkylchalcogenoureas) involving different metallic ions to obtain mononuclear, dinuclear and trinuclear compounds. The compounds were characterized by X-ray diffraction, 1H NMR, I.R., ESI+ MS and elemental analysis. In the first part, the chemistry of aroyl(N,N-dialkylchalcogenoureas) with {ReVO}3+ was investigated, where mononuclear and dinuclear compounds were obtained. In the second part, the chemistry of isophthaloylbis(N,N-diethylchalcogenoureas) was investigated against different metallic ions. Dinuclear complexes of AuI, CuII, HgII and InIII, and polymeric compounds with PbII and SnII were obtained. Compounds were also obtained with CuI and TeII. The structural analysis of the AuI, CuII, PbII and InIII compounds with isophthaloylbis(N,N-diethylthiourea), H2L1, have shown that the ligand can exhibit different orientations of the arms‟ to make bis(bidentate) chelate coordination, by the oxygen and sulphur atoms, or bis(monodentate), by the sulphur atoms. These orientations occur due the metal characteristics, as geometry or the influency of the lone pair of electrons. The third part was focused in exploring the synthesis of trinuclear compounds using combinations of metals with dipicolinoylbis(N,N-diethylchalcogenoureas). With the derivatized ligand, 4-chlorodipicolinoylbis(N,N-diethylthiourea), H2L4, trinuclear [MIIBaIIMII] and [MIIGdIIIMII] (where MII = Mn, Co) compounds were obtained; and with the dipicolinoylbis(N,N-diethylselenourea), H2L5, the compounds [MnIIBaIIMnII] and [MIISmIIIMII] (MII = Mn, Co) were obtained. The composition of these compounds for the charge compensation follows that observed for the known compounds with the dipicolinoylbis(N,N-diethylthiourea) ligand, H2L2, in the way that, depending on the combination of metals used, two or three bis(chalcogenourea) anions are involved, where also acetate and/or chloride anions can be involved. The derivatization (additional Cl atom in the pyridine ring of the ligand molecule) led to the connection of the trinuclear molecules due to Ba∙∙∙Cl interactions, verified by the structural analysis of one compound. With the H2L2 and H2L4 ligands the incorporation of PbII in the trinuclear systems was explored, and [PbIIBaIIPbII] compounds were obtained. In these compounds the PbII metallic centers are located in the border positions by the chelate S,O coordination of three bis(thioureato) anions. On the other hand, [MIIPbIIMII] compounds were obtained for MII = Mn and Ni with H2L2, in which PbII is located in the central cavity formed by the S,O chelate coordination to the MnII and NiII metallic centers. However, from the combination PbII/NiII, a tetranuclear compound was also obtained, leading to a discussion of radius ratio between the metals as an aspect to be considered to obtain trinuclear systems, seeking the alignment of the metallic centers in the complexes. / Este trabalho apresenta um estudo realizado com aroil(N,N-dialquil-calcogenoureias) monopodais e bipodais envolvendo diferentes íons metálicos, na obtenção de compostos mononucleares, dinucleares e trinucleares. Os compostos foram caracterizados por difração de raios X, 1H RMN, I.V., IES+ EM e análise elementar. Na primeira parte, foi investigada a química de aroil(N,N-dialquilcalcogenoureias) envolvendo núcleos de {ReVO}3+, onde foram obtidos compostos mononucleares e dinucleares. Na segunda parte, foi investigada a química de isoftaloilbis(N,N-dietilcalcogenoureias) frente a diferentes íons metálicos. Foram obtidos complexos dinucleares de AuI, CuII, HgII e InIII, e poliméricos com PbII e SnII. Também foram obtidos compostos envolvendo CuI e TeII. A análise estrutural dos compostos de AuI, CuII, PbII e InIII com isoftaloilbis(N,N-dietiltioureia), H2L1, mostrou que o ligante pode apresentar diferentes orientações dos braços‟ para coordenação quelato bis(bidentada), pelos átomos de oxigênio e enxofre, ou bis(monodentada), pelo átomo de enxofre. Estas orientações ocorrem devido às características dos metais, como geometria ou influência do par isolado de elétrons. Na terceira parte explorou-se a síntese de compostos trinucleares utilizando-se combinações de metais, com dipicolinoilbis(N,N-dietilcalcogenoureias). Com o ligante derivatizado, 4-clorodipicolinoilbis(N,N-dietiltioureia), H2L4, foram obtidos compostos trinucleares [MIIBaIIMII] e [MIIGdIIIMII] (onde MII = Mn, Co); já com o ligante dipicolinoilbis(N,N-dietilselenoureia), H2L5, foram obtidos os compostos [MnIIBaIIMnII] e [MIISmIIIMII] (MII = Mn, Co). A composição destes compostos para o balanceamento de cargas segue à observada para os compostos conhecidos com o ligante dipicolinoilbis(N,N-dietiltioureia), H2L2, de forma que, dependendo da combinação de metais utilizada, são envolvidos dois ou três ânions bis(calcogenoureatos), podendo ainda estar envolvidos ânions acetato e/ou cloreto. A derivatização (átomo de Cl adicional no anel piridínico da molécula do ligante) levou à conexão de moléculas trinucleares a partir de interações Ba∙∙∙Cl, verificada pela análise estrutural de um dos compostos. Com os ligantes H2L2 e H2L4 foi explorada a incorporação de PbII em sistemas trinucleares, sendo obtidos compostos [PbIIBaIIPbII]. Nestes, os centros metálicos de PbII localizam-se nas posições das extremidades, pela coordenação quelato S,O de três ânions bis(tioureatos). Por outro lado, compostos [MIIPbIIMII] foram obtidos para MII = Mn e Ni com H2L2, nos quais PbII localiza-se na cavidade central formada pela coordenação quelato S,O aos centros metálicos de MnII e NiII. Porém, da combinação PbII/NiII, um composto tetranuclear também foi obtido, o que levou à uma discussão de razão de raios entre os metais como aspecto a ser considerado para a obtenção de sistemas trinucleares, buscando o alinhamento dos centros metálicos nos complexos.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:18:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3931.pdf: 5591864 bytes, checksum: b4873ba462675328d3fc2005b8032afb (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Osteoarthritis (OA), a degenerative joint disease, is one of the most frequent causes of pain in the musculoskeletal system and of the inability to work in Brazil and the world. It is a multifactor, chronic disease, leading to progressive functional inability. It can arise as a result of injuries to structures such as the anterior crossed ligament and/or meniscus (post-traumatic OA), which, in this case, can affect individuals in any age range. The development of osteoarthritis includes multiple changes in the extracellular cartilage matrix, altering the normal morphological configuration of the joint involved, leading to a lack of equilibrium between the synthesis and degradation of products in this matrix. Although OA is not considered primordially as an inflammatory disease, inflammation of the joint has been shown to be a potential amplifier of the degenerative process. Thus the objective of the present study was to analyze potential biological markers in the serum and synovial fluid, and then correlate them with one another and with the morphological, inflammatory and functional alterations found in individuals with chronic injury of the anterior crossed ligament (ACL). The following techniques were used in the study: zymography, to determine the activity of the metallopeptidases 2 and 9 (MMP-2 and MMP-9); an immune-enzymatic assay (ELISA) to determine the presence of systemic and local cytokines; and a manual count of inflammatory cells (mononuclear and polymorphonuclear) by optical microscopy and spectrophotometry, in order to analyze for sulfated glycosaminoglycans (GAGs). The results indicated joint and systemic inflammation in chronic injury of the ACL by the detection of systemic and local cytokines, by the activity of MMP-9 and by the inflow of neutrophils. There were interactions between systemic and local cytokines, in which a cytokine did not always exert the same function in the serum as in the synovial fluid. The interleucines (IL) connected to degradation of the cartilage in chronic injury of the ACL were IL-12, IL-6 and IL-8, and those connected to pain and loss of function were IL-6 and IL-9. In counterpart, MMP-2 showed a negative correlation with the damage to the cartilage. It was concluded that the molecules studied had potential as biomarkers, since alterations were suggestive of injury and degradation of the cartilage. In addition, after the traumatic event resulting in rupture of the ACL, the ambient remained chronically inflamed and this inflammation was crucial for the high index of posttraumatic OA. / A osteoartrite (OA), doença articular degenerativa, é uma das causas mais freqüentes de dor do sistema músculo-esquelético e de incapacidade para o trabalho no Brasil e no mundo. É uma doença crônica, multifatorial, que leva a uma incapacidade funcional progressiva. Pode surgir em decorrência de lesões em estruturas como ligamento cruzado anterior e/ou meniscos (OA pós-traumática), e neste caso, pode afetar indivíduos em qualquer faixa etária. O desenvolvimento da osteoartrite inclui múltiplas mudanças na matriz extracelular da cartilagem, o que altera a configuração morfológica normal da articulação envolvida, levando a um desequilíbrio entre a síntese e degradação dos produtos desta matriz. Apesar da OA não ser considerada primordialmente como uma doença inflamatória, a inflamação articular tem demonstrado um potencial amplificador do processo degenerativo. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi analisar potenciais marcadores biológicos no soro e no líquido sinovial, e em seguida correlacioná-los uns com os outros e com as alterações morfológicas, inflamatórias e funcionais encontradas em sujeitos com lesão crônica do ligamento cruzado anterior (LCA). Para este estudo foram utilizadas técnicas de: zimografia, para verificar a atividade das metalopeptidases 2 e 9 (MMP-2 e MMP-9); Ensaio imunoenzimático (ELISA), para constatar a presença das citocinas sistêmicas e locais; contagem manual de células inflamatórias (mononucleares e polimorfonucleares) por microscopia óptica e espectrofotometria para a análise dos glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs). Os resultados apontaram para uma inflamação articular e sistêmica na lesão crônica do LCA, pela detecção de citocinas sistêmicas e locais, pela atividade das MMP-9 e pelo influxo de neutrófilos. Houve interações entre citocinas sistêmicas e locais, nas quais nem sempre uma citocina exerce a mesma função no soro e no líquido sinovial. As interleucinas (IL) ligadas à degradação da cartilagem na lesão crônica do LCA foram IL-12, IL-6 e IL-8 e as ligadas à dor e a perda de função foram IL-6 e IL-8. Em contrapartida, a MMP-2 apresentou correlação negativa com os danos na cartilagem. Conclui-se que, as moléculas estudadas apresentam potencial como biomarcadores, sendo suas alterações sugestivas de lesão e degradação da cartilagem. E ainda, que após o evento traumático responsável pelo rompimento do LCA, o ambiente permanece inflamado cronicamente e que esta inflamação é crucial para o alto índice de OA pós-traumática.

A tuberculose é uma doença crônica granulomatosa caracterizada por um déficit de imunidade antígeno específica do hospedeiro, cuja resposta imune é ativamente regulada por citocinas. No Brasil há mais de 50 milhões de habitantes infectados pelo Mycobacterium tuberculosis. O objetivo foi avaliar a linfoproliferação e a produção de citocinas por células mononucleares do sangue periférico (PBMC) estimuladas por quatro diferentes antígenos do M. tuberculosis, um complexo, o antígeno sonicado, e três purificados, ESAT-6, antígeno 85B e antígeno HBHA, eventuais candidatos à vacina anti-tuberculose. Para avaliação da produção de IFN-g e IL-10 foram utilizados dois métodos: Elispot e Elisa à partir de sobrenadante de cultura de PBMC. Para essas avaliações, os pacientes com tuberculose ativa (TB-A) foram comparados a dois subgrupos de indivíduos controles. O primeiro subgrupo foi constituído por indivíduos saudáveis PPD+ e o segundo por indivíduos curados de um episódio de tuberculose (TB-C). Nossos resultados de linfoproliferação e de Elisa revelaram diminuição da resposta linfoproliferativa e da produção de IFN-g dos pacientes em comparação com os indivíduos PPD+, enquanto os indivíduos TB-C apresentaram em geral resultados intermediários. Observou-se também que as respostas à PHA não diferiam significativamente entre os grupos, ressaltando a natureza antígeno específica da hiporreatividade na tuberculose. Adicionalmente, verificamos maior reatividade ao antígeno complexo, sonicado, que aos antígenos purificados, e entre estes, a reatividade foi maior para ESAT-6 e 85B que para HBHA, A resposta ao HBHA pode ter sido eventualmente subestimada por razões técnicas, como utilização de dose sub-ótima ou perda da atividade biológica. Em relação ao Elispot para IFN-g, não pudemos observar diferenças entre os grupos, tanto quando se considerou o número total de spots, como quando se contou apenas spots com diâmetro > 65 mm, apresentando portanto uma sensibilidade aparentemente menor comparado aos outros 2 métodos. A comparação entre os métodos revelou pouca correlação entre seus resultados, que pode ser eventualmente explicado pela diferente contribuição das populações celulares (T CD4+ e T CD8+) para cada uma das provas munológicas. Finalmente, a análise da produção de IL-10 medida por Elisa no sobrenadante de cultura e por spots de IL10, também não revelou diferenças entre os grupos. Convém notar que o Elisa detectou baixas concentrações de IL-10 nos sobrenadantes, porém o Elispot demonstrou número elevado de spots e boa correlação entre as resposta aos antígenos. Em conclusão, nossos resultados sugerem que métodos \'clássicos\', e já estabelecidos, como linfoproliferação e Elisa, persistem válidos para se avaliar a imunidade celular, e que em nossas condições laboratoriais, a técnica de Elispot não representou, até o momento, uma melhora na qualidade da avaliação imunológica. / Tuberculosis is a chronic granulomatous disease characterized by a deficit of the antigen-specific immunity of the host, whose immune response is actively regulated by cytokines. In Brazil there are 50 million people infected with Mycobacterium tuberculosis. The objective of the present work was to evaluate the lymphoproliferative response e the IFN-g response by peripheral blood mononuclear cells (PBMC) indiced with 4 different antigens isolated from Mycobacterium tuberculosis: a complex, crude, the sonicate antigen, and 3 other, purified ones, Esat-6, 85B, and HBHA, the last 3 eventual candidates to the design of a vaccine against tuberculosis. We used 2 methods to evaluate the IFN-g and IL-10 productions, namely Elispot and Elisa of supernatant of PBMC cultures. We studied a group of active tuberculosis patients (TB-A), and compared them with controls individuals comprising 2 groups, one made of healthy PPD+ individuals and the second one of individuals who have been cured from an episode of tuberculosis in the past (TB-C). Our results of lymphoproliferation and Elisa revealed decrease in the lymphoproliferative and IFN-g responses by patients\' PBMC as compared to the PPD+ group, with the TB-C group in general presenting intermediate results. We also observed that the responses to the mitogen PHA were not statisically different among the groups, denoting the antigen-specific nature of the immune deficit in tuberculosis. In addition, we verified that stronger reactivity to the complex antigen than with the purified antigens, and, among the latter, the reactivity was stronger with Esat-6 and 85B as compared to HBHA, Reactivity to HBHA may have been understimated due to technical reasons, such as loss of .the biological activity of the molecule or use of a sub-optimal dose. By using the Elispot for IFN-g we were not able to detect differences among the groups, even when we counted all spots formed or spots with more than > 65 mm in diameter. Thus our Elispot for IFN-g apparently showed lower sensitivity than the other 2 methods. Furthermore, comparisons between the methods revealed low correlation between their results, a finding that may be explained by the differning contribution of different subpopulations (T CD4+ and T CD8+) to each of the results. Finally, analysis of the production of IL-10 as measured by Elisa in the culture supernatants as well as by Elispot revealed no differences among the groups. It is noteworthy that the levels of IL-10 detected by Elisa were low, but the Elispot revealed high number of spots and a good correlation between the antigen responses. In conclusion, we may say that our well standardized \'classical\' methods Elisa and lymphoproliferation persist useful to evaluate cellular immunity responses, and that the Elispot technique, up to now and in our laboratorial conditions, did not represent an improvement in the quality of the immunological evaluation.

A doação de plaquetas por aférese é um procedimento automatizado que permite a obtenção deste hemocomponente em grande quantidade e com ato grau de pureza; deste processo obtém-se um subproduto chamado Câmara de Leucorredução (CLR) que é descartado ao final da doação. São permitidas até 24 doações/ano; porém as possíveis consequências de doações frequentes para esses doadores são pouco investigadas. Assim, foram identificados e quantificados os leucócitos de doadores de plaquetas frequentes e de 1ª vez. Também foi avaliada a viabilidade do uso das células mononucleares da CLR para pesquisas. Observou-se mais células na CLR que no sangue e que a frequência das populações é similar. O estado de ativação e a capacidade funcional (proliferação e produção de citocinas) foram similares entre CLR e sangue, assim como a taxa de apoptose espontânea. Entre doadores frequentes e de primeira vez não houve diferença no número de leucócitos, sugerindo que doações recorrentes não alteraram as populações leucocitárias. / Plateletpheresis is an automatized procedure to obtain high purity platelet for transfusions. From this procedure its possible to obtain a byproduct: The Leukoreduction system chamber (LRSC), which is discarded at the end of donation process. This type of donation allows 24 donation/year, but the consequences of frequent donations are poorly investigated. Therefore, we identified and quantified leukocytes of frequent and first time platelet donor. Also, was evaluated the viability, for research, of mononuclear cells recovery from LRSC. The total number of mononuclear cells was higher in LRSC than in peripheral blood samples, but the frequencies were similar in all the samples. Activation state and functional capacity (measured by cell proliferation and cytokine production) were similar in both, blood and LRSC mononuclear cells, as well as spontaneous apoptosis. Among frequent (6 or more donations in 1 year) and first time donor, there was no difference in the leukocyte total number, suggesting that frequent donation do not modify these cells.