Objetivo: O objetivo geral deste trabalho foi desenvolver um modelo farmacocinético/farmacodinâmico (PK/PD) para descrever o efeito bactericida in vitro das fluoroquinolonas levofloxacino (LEV) e moxifloxacino (MXF)contra Escherichia coli, baseando-se em dados in vivo de concentração livre prostática. Métodos: Ratos Wistar machos foram utilizados nos experimentos in vivo para determinação da farmacocinética plasmática e prostática do LEV (7 mg/kg) e MXF (6 e 12 mg/kg) após dose i.v. bolus. As concentrações livres prostáticas foram determinadas por microdiálise. A coleta das amostras de plasma e dialisado de tecido foi realizada simultaneamente nos animais previamente anestesiados com uretano para determinação do fator de distribuição tecidual (fT). Para a quantificação do LEV e MXF nas amostras de plasma e dialisado, métodos analíticos foram validados. Análise farmacocinética não-compartimental e modelagem compartimental dos dados foram realizadas utilizando o WinNonlin® e NONMEM® v. 6, respectivamente. Os experimentos de farmacodinâmica in vitro foram executados utilizando sistema composto de caldo de cultura Mueller-Hinton no qual a bactéria teste (Escherichia coli ATCC 25922) foi exposta a concentrações constantes e flutuantes dos antimicrobianos. O número de colônias bacterianas viáveis (CFU/mL) foi determinado em função do tempo e utilizado como parâmetro farmacodinâmico para construção das curvas de morte bacteriana (time-kill curves). Nos experimentos de time-kill curves estáticos, concentrações baseadas em múltiplos da MIC na faixa de 0.008–2 mg/L foram utilizadas, enquanto que no dinâmico a meia-vida de eliminação do LEV em humanos foi simulada no sistema in vitro através de diluição constante do caldo de cultura. Resultados e Discussão: Um método analítico por HPLC-fluorescência foi desenvolvido e validado para a quantificação do MXF nas amostras biológicas. Método analítico também foi validado para quantificação do LEV nas amostras. Os perfis plasmáticos e teciduais das duas fluoroquinolonas foram modelados simultaneamente utilizando modelo de três compartimentos considerando transporte linear (difusão passiva) e saturável (cinética de Michaelis-Menten). O modelo, que foi o mais adequado para descrever os dados experimentais, sugere a presença de transportadores de efluxo na próstata. A penetração prostática média do MXF foi significativamente maior que a do LEV (fT = 1.24 vs. 0.78) e foi independente da dose. Em ratos, não foi observada diferença na meia-vida plasmática média entre LEV (5.0 h) e MXF (4.9 h), embora a meia-vida tecidual foi ligeiramente maior para o MXF (3.3 vs. 2.3 h). Usando a abordagem populacional de modelagem PK/PD, modelo de Emax sigmoidal foi utilizado para descrever o efeito das duas quinolonas frente a E. coli tanto nos experimentos de concentração estática quanto dinâmica. A comparação dos parâmetros PK/PD estimados mostrou que o MXF apresenta potência superior ao LEV contra a cepa através da comparação dos valores de EC50, embora ambos tenham apresentado eficácia comparável (Emax de 1.85 e 1.83 h-1 para MXF e LEV, respectivamente). Para o LEV, os esquemas posológicos de 500 mg q12 h e 1000 mg q24 h apresentaram maior eficácia no período de 24 h, pois promoveram a inibição completa do recrescimento bacteriano observado nos outros dois regimes de dose testados. Conclusões: A correlação dos dados de farmacocinéticain vivo com os experimentos de farmacodinâmica in vitro, seguida da construção do modelo PK/PD de efeito máximo, possibilitou explorar a relação do efeito antimicrobiano em função do tempo baseada em concentrações livres esperadas na prostatite. / Objective: The aim of this study was to develop a pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) model to describe the in vitro bactericidal effect of the fluoroquinolones levofloxacin (LEV) and moxifloxacin (MXF) against Escherichia coli based on free concentrations in prostate tissue measured in vivo. Methods: Pharmacokinetic experiments were conducted in male Wistar rats for the determination of plasma and free prostate concentrations of LEV (7 mg/kg) and MXF (6 and 12 mg/kg) after i.v. bolus administration. Blood and tissue dialysate samples were collected simultaneously in the group of rats previously anesthetized with urethane to determine the tissue distribution factor (fT). To quantify MXF and LEV in plasma and dialysate samples obtained after administration of the quinolones, analytical methods based on HPLC-fluorescence were developed and validated accordingly. Non-compartmental analysis and compartmental PK modeling of the data was performed in WinNonlin® and NONMEM® v. 6, respectively. The in vitro pharmacodynamic experiments were executed by using a system composed of Mueller-Hinton growth medium in which the test bacterial strain (Escherichia coli ATCC 25922) was exposed to constant and fluctuating antimicrobial concentrations. The number of viable colony-forming units (CFU/mL) was determined as a function of time and used as the pharmacodynamic parameter for construction of bacterial time-kill curves. In the static time-kill curves, concentrations in the range of 0.008-2 mg/L were tested based on multiples of the MIC, whereas in the dynamic time-kill curves the half-life of LEV in humans was simulated in the in vitro system by stepwise dilution of the growth medium. Results and Discussion: An HPLC-fluorescence method was developed and fully validated to quantify MXF in biological fluids. A method was also validated to determine LEV in the samples. Plasma and prostate concentrations of both drugs were simultaneously fitted using a three-compartment model considering linear (passive diffusion) and saturable transport (Michaelis-Menten kinetics), suggesting the presence of efflux transporters in the prostate. The average tissue penetration of MXF in the prostate was significantly higher than that of LEV (fT = 1.24 vs. 0.78) and was independent of the dose. In rats, differences in average plasma half-life between plasma LEV (5.0 h) and MXF (4.9 h) were not observed, even though the tissue half-life was slightly longer for MXF (3.3 vs. 2.3 h). Using a population PK/PD modeling approach, a sigmoidal Emax model was used to describe the effect of the two quinolones against E. coli both in the static as well as in the dynamic time-kill curves. Comparison of the PK/PD parameter estimates showed that the in vitro potency of MXF is higher than LEV against the strain tested as shown by EC50 values, but both presented equivalent efficacy (Emax of 1.85 and 1.83 h-1 for MXF and LEV, respectively). For LEV, the dosing regimens of 500 mg q12 h and 1,000 mg q24 h showed overall greater efficacy over the 24 h period as they resulted in complete inhibition of bacterial regrowth observed in the other two dosing regimens tested. Conclusions: The correlation of in vivo pharmacokinetic data with in vitro pharmacodynamic experiments, followed by the development of an Emax PK/PD model, allowed determining the relationship between the bactericidal effect as a function of time based on free tissue concentrations expected in the site of infection.

Objetivo: O objetivo geral deste trabalho foi desenvolver um modelo farmacocinético/farmacodinâmico (PK/PD) para descrever o efeito bactericida in vitro das fluoroquinolonas levofloxacino (LEV) e moxifloxacino (MXF)contra Escherichia coli, baseando-se em dados in vivo de concentração livre prostática. Métodos: Ratos Wistar machos foram utilizados nos experimentos in vivo para determinação da farmacocinética plasmática e prostática do LEV (7 mg/kg) e MXF (6 e 12 mg/kg) após dose i.v. bolus. As concentrações livres prostáticas foram determinadas por microdiálise. A coleta das amostras de plasma e dialisado de tecido foi realizada simultaneamente nos animais previamente anestesiados com uretano para determinação do fator de distribuição tecidual (fT). Para a quantificação do LEV e MXF nas amostras de plasma e dialisado, métodos analíticos foram validados. Análise farmacocinética não-compartimental e modelagem compartimental dos dados foram realizadas utilizando o WinNonlin® e NONMEM® v. 6, respectivamente. Os experimentos de farmacodinâmica in vitro foram executados utilizando sistema composto de caldo de cultura Mueller-Hinton no qual a bactéria teste (Escherichia coli ATCC 25922) foi exposta a concentrações constantes e flutuantes dos antimicrobianos. O número de colônias bacterianas viáveis (CFU/mL) foi determinado em função do tempo e utilizado como parâmetro farmacodinâmico para construção das curvas de morte bacteriana (time-kill curves). Nos experimentos de time-kill curves estáticos, concentrações baseadas em múltiplos da MIC na faixa de 0.008–2 mg/L foram utilizadas, enquanto que no dinâmico a meia-vida de eliminação do LEV em humanos foi simulada no sistema in vitro através de diluição constante do caldo de cultura. Resultados e Discussão: Um método analítico por HPLC-fluorescência foi desenvolvido e validado para a quantificação do MXF nas amostras biológicas. Método analítico também foi validado para quantificação do LEV nas amostras. Os perfis plasmáticos e teciduais das duas fluoroquinolonas foram modelados simultaneamente utilizando modelo de três compartimentos considerando transporte linear (difusão passiva) e saturável (cinética de Michaelis-Menten). O modelo, que foi o mais adequado para descrever os dados experimentais, sugere a presença de transportadores de efluxo na próstata. A penetração prostática média do MXF foi significativamente maior que a do LEV (fT = 1.24 vs. 0.78) e foi independente da dose. Em ratos, não foi observada diferença na meia-vida plasmática média entre LEV (5.0 h) e MXF (4.9 h), embora a meia-vida tecidual foi ligeiramente maior para o MXF (3.3 vs. 2.3 h). Usando a abordagem populacional de modelagem PK/PD, modelo de Emax sigmoidal foi utilizado para descrever o efeito das duas quinolonas frente a E. coli tanto nos experimentos de concentração estática quanto dinâmica. A comparação dos parâmetros PK/PD estimados mostrou que o MXF apresenta potência superior ao LEV contra a cepa através da comparação dos valores de EC50, embora ambos tenham apresentado eficácia comparável (Emax de 1.85 e 1.83 h-1 para MXF e LEV, respectivamente). Para o LEV, os esquemas posológicos de 500 mg q12 h e 1000 mg q24 h apresentaram maior eficácia no período de 24 h, pois promoveram a inibição completa do recrescimento bacteriano observado nos outros dois regimes de dose testados. Conclusões: A correlação dos dados de farmacocinéticain vivo com os experimentos de farmacodinâmica in vitro, seguida da construção do modelo PK/PD de efeito máximo, possibilitou explorar a relação do efeito antimicrobiano em função do tempo baseada em concentrações livres esperadas na prostatite. / Objective: The aim of this study was to develop a pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) model to describe the in vitro bactericidal effect of the fluoroquinolones levofloxacin (LEV) and moxifloxacin (MXF) against Escherichia coli based on free concentrations in prostate tissue measured in vivo. Methods: Pharmacokinetic experiments were conducted in male Wistar rats for the determination of plasma and free prostate concentrations of LEV (7 mg/kg) and MXF (6 and 12 mg/kg) after i.v. bolus administration. Blood and tissue dialysate samples were collected simultaneously in the group of rats previously anesthetized with urethane to determine the tissue distribution factor (fT). To quantify MXF and LEV in plasma and dialysate samples obtained after administration of the quinolones, analytical methods based on HPLC-fluorescence were developed and validated accordingly. Non-compartmental analysis and compartmental PK modeling of the data was performed in WinNonlin® and NONMEM® v. 6, respectively. The in vitro pharmacodynamic experiments were executed by using a system composed of Mueller-Hinton growth medium in which the test bacterial strain (Escherichia coli ATCC 25922) was exposed to constant and fluctuating antimicrobial concentrations. The number of viable colony-forming units (CFU/mL) was determined as a function of time and used as the pharmacodynamic parameter for construction of bacterial time-kill curves. In the static time-kill curves, concentrations in the range of 0.008-2 mg/L were tested based on multiples of the MIC, whereas in the dynamic time-kill curves the half-life of LEV in humans was simulated in the in vitro system by stepwise dilution of the growth medium. Results and Discussion: An HPLC-fluorescence method was developed and fully validated to quantify MXF in biological fluids. A method was also validated to determine LEV in the samples. Plasma and prostate concentrations of both drugs were simultaneously fitted using a three-compartment model considering linear (passive diffusion) and saturable transport (Michaelis-Menten kinetics), suggesting the presence of efflux transporters in the prostate. The average tissue penetration of MXF in the prostate was significantly higher than that of LEV (fT = 1.24 vs. 0.78) and was independent of the dose. In rats, differences in average plasma half-life between plasma LEV (5.0 h) and MXF (4.9 h) were not observed, even though the tissue half-life was slightly longer for MXF (3.3 vs. 2.3 h). Using a population PK/PD modeling approach, a sigmoidal Emax model was used to describe the effect of the two quinolones against E. coli both in the static as well as in the dynamic time-kill curves. Comparison of the PK/PD parameter estimates showed that the in vitro potency of MXF is higher than LEV against the strain tested as shown by EC50 values, but both presented equivalent efficacy (Emax of 1.85 and 1.83 h-1 for MXF and LEV, respectively). For LEV, the dosing regimens of 500 mg q12 h and 1,000 mg q24 h showed overall greater efficacy over the 24 h period as they resulted in complete inhibition of bacterial regrowth observed in the other two dosing regimens tested. Conclusions: The correlation of in vivo pharmacokinetic data with in vitro pharmacodynamic experiments, followed by the development of an Emax PK/PD model, allowed determining the relationship between the bactericidal effect as a function of time based on free tissue concentrations expected in the site of infection.

Le développement des méthodes de séquençage de nouvelle génération a permis d’approfondir les connaissances sur le rôle des communautés bactériennes commensales pour la santé de leur hôte, et l’impact négatif de la perturbation de leur équilibre. Les antibiotiques sont les principaux perturbateurs de cet équilibre, mais leur impact n’a pas été quantifié précisément.Nous avons quantifié la relation entre les concentrations fécales d’antibiotiques et la perturbation de la diversité bactérienne au sein du microbiote intestinal, et modélisé le lien entre la perte de diversité bactérienne et la probabilité de décès dans un modèle animal de colite à Clostridium difficile induite par les antibiotiques. Nous avons montré que l’indice de diversité de Shannon et la distance UniFac non pondérée étaient les indices de diversité qui étaient le plus prédictif du décès dans ce modèle d’infection.Chez des volontaires sains, nous avons développé un modèle mathématique semimécanistique de l’évolution de la diversité au sein du microbiote, mesurée par deux indices de diversité, après perturbation antibiotique, et quantifié la relation entre l’exposition individuelle plasmatique et fécale à un antibiotique, et son effet sur la perturbation de la diversité bactérienne au cours du temps. Nous avons également analysé le rôle de la voie d’élimination des antibiotiques pour la limitation de l’impact d’un antibiotique sur le microbiote. Ces travaux nous ont permis de montrer que le microbiote intestinal présente une grande sensibilité aux antibiotiques, et que la voie d’élimination ne semble de ce fait pas jouer un rôle prépondérant dans la perspective de limiter l’impact des antibiotiques sur le microbiote intestinal. / The development of next generation sequencing broadened our knowledge on the role of commensal bacterial communities on their host’s health, and the negative impact of their disruption. Antibiotics are the main disrupting factor, but their impact has not been precisely quantified.We quantified the relationship between antibiotic fecal concentrations and the loss of bacterial diversity in the intestinal microbiota, and modelled the link between the loss of diversity and mortality in a hamster model of antibiotic-induced Clostridium difficile infection. We showed that the Shannon diversity index and the unweighted UniFrac distance are the 2 indices that best predict mortality in this model. In healthy volunteers, we developed a semi-mechanistic model of the evolution over time of bacterial diversity – measured by two indices – after an antibiotic perturbation, and quantified the relationship between antibiotic concentrations in plasma and feces and the loss of bacterial diversity in the intestinal microbiota. We also analyzed the role of the antibiotic elimination pathway in the reduction of their impact on the microbiota. In this work, we showed that the intestinal microbiota is highly susceptible to antibiotics, and that the elimination route doesn’t have a major role, in the perspective of limiting antibiotics’ impact on the intestinal microbiota.

Introduction : La chronicité de la rhinosinusite, sa résistance aux antibiotiques, et ses exacerbations aiguës laissent croire que les biofilms sont impliqués dans la rhinosinusite chronique. Objectifs : Nous avons évalué la capacité des bactéries Pseudomonas aeruginosa, staphylocoques à coagulase négative et Staphylococcus aureus à former des biofilms par un essai in vitro, et si cette capacité de formation a un lien avec l’évolution de la maladie. Nous avons évalué in vitro l’effet de la moxifloxacine, un antibiotique utilisé dans le traitement de la rhinosinusite chronique sur des biofilms matures de Staphylococcus aureus. Méthodes : Trent et une souches bactériennes ont été isolées de 19 patients atteints de rhinosinusite chronique et qui ont subit au moins une chirurgie endoscopique des sinus. L’évolution de la maladie a été notée comme "bonne" ou "mauvaise" selon l’évaluation du clinicien. La production de biofilm a été évaluée grâce à la coloration au crystal violet. Nous avons évalué la viabilité du biofilm après traitement avec la moxifloxacine. Ces résultats ont été confirmés en microscopie confocale à balayage laser et par la coloration au LIVE/DEAD BacLight. Résultat et Conclusion : Vingt deux des 31 souches ont produit un biofilm. La production d’un biofilm plus importante chez Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus était associée à une mauvaise évolution. Ceci suggère un rôle du biofilm dans la pathogenèse de la rhinosinusite chronique. Le traitement avec la moxifloxacine, à une concentration de 1000X la concentration minimale inhibitrice réduit le nombre des bactéries viables de 2 à 2.5 log. Ces concentrations (100 µg/ml - 200 µg/ml) sont faciles à atteindre dans des solutions topiques. Les résultats de notre étude suggèrent que l’utilisation de concentrations supérieure à la concentration minimale inhibitrice sous forme topique peut ouvrir des voies de recherche sur de nouveaux traitements qui peuvent être bénéfiques pour les patients atteints de forme sévère de rhinosinusite chronique surtout après une chirurgie endoscopique des sinus. / Introduction: The role of biofilms in chronic diseases is increasingly recognized. Chronic rhinosinusitis, with its chronic indolent course, resistance to antibiotics, and acute exacerbations, has an evolution that parallels that of other biofilm-related diseases. Objectives: 1-To develop an in vitro method to assess the biofilm formation capacity. 2- To determine whether biofilm-forming capacity of bacteria demonstrated in chronic rhinosinusitis has an impact on persistence of the disease following endoscopic sinus surgery. 3- To determine the in vitro activity of moxifloxacin against Staphyylococcus aureus in biofilm form. Method: Thirty-one bacterial strains recovered from 19 patients with chronic rhinosinusitis at least one year post-endoscopic sinus surgery. Evolution of disease was assessed by questionnaire and endoscopy as favorable or unfavorable. The bacteria were cultured on a 96-well culture plaque and a semi-quantitative method using crystal violet to quantify biofilm production was used. Confirmation of the effect of the antimicrobial agents on viability was performed with confocal laser microscopy, using a LIVE/DEAD BacLight staining. Results: Twenty-two of 31 samples produced a biofilm thicker or equal to the positive control. Biofilm formation was associated with a poor evolution for Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus, but not for coagulase-negative staphylococci. Biofilm treated with moxifloxacin at 1000X (0.1mg/ml – 0.2 mg/ml) gave a 2 to 2.5 log reduction in number of viable bacteria. Conclusion: We have shown that Crystal violet method is able to detect biofilm formation. There is a correlation between in vitro biofilm production by Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus and unfavorable evolution after endoscopic sinus surgery, suggesting a role for biofilm in chronic rhinosinusitis. Increased concentrations of moxifloxacin, easily attainable in topical solutions have a potential role in the management of biofilm infections.

Introduction : La chronicité de la rhinosinusite, sa résistance aux antibiotiques, et ses exacerbations aiguës laissent croire que les biofilms sont impliqués dans la rhinosinusite chronique. Objectifs : Nous avons évalué la capacité des bactéries Pseudomonas aeruginosa, staphylocoques à coagulase négative et Staphylococcus aureus à former des biofilms par un essai in vitro, et si cette capacité de formation a un lien avec l’évolution de la maladie. Nous avons évalué in vitro l’effet de la moxifloxacine, un antibiotique utilisé dans le traitement de la rhinosinusite chronique sur des biofilms matures de Staphylococcus aureus. Méthodes : Trent et une souches bactériennes ont été isolées de 19 patients atteints de rhinosinusite chronique et qui ont subit au moins une chirurgie endoscopique des sinus. L’évolution de la maladie a été notée comme "bonne" ou "mauvaise" selon l’évaluation du clinicien. La production de biofilm a été évaluée grâce à la coloration au crystal violet. Nous avons évalué la viabilité du biofilm après traitement avec la moxifloxacine. Ces résultats ont été confirmés en microscopie confocale à balayage laser et par la coloration au LIVE/DEAD BacLight. Résultat et Conclusion : Vingt deux des 31 souches ont produit un biofilm. La production d’un biofilm plus importante chez Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus était associée à une mauvaise évolution. Ceci suggère un rôle du biofilm dans la pathogenèse de la rhinosinusite chronique. Le traitement avec la moxifloxacine, à une concentration de 1000X la concentration minimale inhibitrice réduit le nombre des bactéries viables de 2 à 2.5 log. Ces concentrations (100 µg/ml - 200 µg/ml) sont faciles à atteindre dans des solutions topiques. Les résultats de notre étude suggèrent que l’utilisation de concentrations supérieure à la concentration minimale inhibitrice sous forme topique peut ouvrir des voies de recherche sur de nouveaux traitements qui peuvent être bénéfiques pour les patients atteints de forme sévère de rhinosinusite chronique surtout après une chirurgie endoscopique des sinus. / Introduction: The role of biofilms in chronic diseases is increasingly recognized. Chronic rhinosinusitis, with its chronic indolent course, resistance to antibiotics, and acute exacerbations, has an evolution that parallels that of other biofilm-related diseases. Objectives: 1-To develop an in vitro method to assess the biofilm formation capacity. 2- To determine whether biofilm-forming capacity of bacteria demonstrated in chronic rhinosinusitis has an impact on persistence of the disease following endoscopic sinus surgery. 3- To determine the in vitro activity of moxifloxacin against Staphyylococcus aureus in biofilm form. Method: Thirty-one bacterial strains recovered from 19 patients with chronic rhinosinusitis at least one year post-endoscopic sinus surgery. Evolution of disease was assessed by questionnaire and endoscopy as favorable or unfavorable. The bacteria were cultured on a 96-well culture plaque and a semi-quantitative method using crystal violet to quantify biofilm production was used. Confirmation of the effect of the antimicrobial agents on viability was performed with confocal laser microscopy, using a LIVE/DEAD BacLight staining. Results: Twenty-two of 31 samples produced a biofilm thicker or equal to the positive control. Biofilm formation was associated with a poor evolution for Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus, but not for coagulase-negative staphylococci. Biofilm treated with moxifloxacin at 1000X (0.1mg/ml – 0.2 mg/ml) gave a 2 to 2.5 log reduction in number of viable bacteria. Conclusion: We have shown that Crystal violet method is able to detect biofilm formation. There is a correlation between in vitro biofilm production by Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus and unfavorable evolution after endoscopic sinus surgery, suggesting a role for biofilm in chronic rhinosinusitis. Increased concentrations of moxifloxacin, easily attainable in topical solutions have a potential role in the management of biofilm infections.

Introdução: O Clostridium difficile é um bacilo Gram-positivo, anaeróbio estrito, formador de esporos, que produz toxinas que podem causar diarreia, colite pseudomembranosa, dilatação do cólon, sepse e até morte. Nos últimos anos o quadro clínico e epidemiológico das infecções por Clostridium difficile tem se modificado e as limitações das opções terapêuticas tornaram-se mais evidentes. Objetivo Primário: Comparar as metodologias de disco-difusão e ágar-diluição na detecção de sensibilidade/resistência de isolados de Clostridium difficile. Objetivos Secundários: Avaliar prospectivamente o perfil de sensibilidade/resistência de isolados clínicos hospitalares de Clostridium difficile provenientes de seis hospitais terciários da cidade de São Paulo e fornecer evidências para fundamentar o diagnóstico e o tratamento empírico das diarreias causadas por Clostridium difficile. Métodos: utilizamos os métodos de disco-difusão e ágar-diluição, de acordo com os critérios estabelecidos pelo CLSI e EUCAST. Resultados: Os coeficientes de correlação observados entre os diâmetros dos halos de inibição e Concentração Inibitória Mínima foram abaixo do esperado tornando inviável o método de disco-difusão para determinação de sensibilidade aos antimicrobianos nitazoxanida, teicoplanina e tigeciclina. Todas as 50 cepas deste estudo foram sensíveis ao metronidazol (MIC50 foi de 1 ?g/mL a MIC90 foi de 2 ug/mL). Para o método de disco-difusão, sugerimos que halos de inibição >= 33mm possam ser interpretados como sensíveis. Devido à moderada correlação, significância estatística e distribuição de halos de inibição das amostras próximos aos valores encontrados utilizando a cepa ATTC, sugere-se a utilização do método de disco-difusão para vancomicina, onde halos com diâmetro >= 22mm possam ser considerados como sensíveis pelo método. Para o moxifloxacino houve uma boa correlação entre as duas metodologias: discodifusão e de ágar-diluição (O coeficiente de Pearson foi de -0,84, e o valor de p foi menor que 0,00001), sugerindo que halos de inibição >= 18mm possam ser interpretados como sensíveis pela metodologia de disco-difusão. A nitazoxanida foi à droga que mostrou melhor atividade in vitro (MIC50 foi 0,06 ?g/mL e a MIC90 de 0,12 ug/mL). Por se mostrar uma droga com potente atividade in vitro (MIC50 e a MIC90 foi de 0,12 ug/mL), a tigeciclina poderia ser mais uma opção terapêutica em infecções por Clostridium difficile, dependendo de mais estudos para avaliar sua real eficácia clínica e segurança. Conclusão: Os resultados verificados neste estudo indicam a necessidade de mais estudos in vitro e clínicos para definir os limites de sensibilidade/resistência para a teicoplanina e a nitazoxanida, pois faltam critérios de interpretação tanto para disco-difusão quanto para ágar-diluição. Os resultados deste trabalho in vitro confirmaram a utilidade do metronidazol como uma droga eficaz no tratamento de infecção por Clostridium difficile. A nitazoxanida foi à droga que mostrou melhor atividade in vitro por método dilucional. Sugerimos a utilização do método de disco-difusão para: metronidazol, vancomicina e moxifloxacino. Os resultados desse trabalho sugerem que halos de inibição para metronidazol ( >= 33mm), moxifloxacino ( >= 18mm) e vancomicina ( >= 22mm) poderiam ser considerados como sensíveis pelo método de disco-difusão. O método de ágardiluição é um método de boa acurácia, porém trabalhoso para ser executado na rotina laboratorial / Introduction: Clostridium difficile is a Gram-positive bacillus, strictly anaerobic, spore-forming, which produces toxins that can cause diarrhea, colitis pseudomembranous, colon expansion, sepsis and even death. In recent years the clinical and epidemiological picture of infection by Clostridium difficile has been modified and limitations of therapeutic options have become more evident. Primary Objective: Comparing the methods of disk diffusion and agar dilution in the detection sensitivity/resistance isolates of Clostridium difficile. Secondary Objectives: Prospectively evaluate the profile of sensitivity/resistance of hospital clinical isolates of Clostridium difficile from six tertiary hospitals in São Paulo city and provide evidence to support the diagnosis and empirical treatment of diarrhea caused by Clostridium difficile. Methods: We use the disk diffusion method and agar dilution method, according to the established criteria by CLSI and EUCAST. Results: The observed correlation coefficients between the inhibitions diameter zone of the and Minimum Inhibitory Concentration were under expectations impeding the disk diffusion method for determining sensitivity to nitazoxanide antimicrobial, teicoplanin and tigecycline. All 50 strains of this study were sensitive to metronidazole (MIC50 was 1 Ug/ml to MIC90 was 2 ug/ml). For the method disk diffusion, we suggest that inhibition zones >= 33mm can be interpreted as sensitive. Due to the moderate correlation, statistical significance and distribution of zones of inhibition on samples of the next found values using the strain ATTC, we suggest using the disk diffusion method for vancomycin where halos diameter >= 22mm can be considered as sensitive by the method. There was a good correlation to moxifloxacin between the two methodologies: disk diffusion and agar dilution (Pearson\'s coefficient was -0.84 , and the \"p\" value was less than 0.00001), suggesting that inhibition zones >= 18mm can be interpreted as sensitive by disk diffusion method. Nitazoxanide was the drug that showed a better performance in vitro activity (MIC50 was 0.06 ?g/ml and MIC90 0.12 ug/ml). For a drug that shows potent activity in vitro (MIC50 and MIC90 was 0.12 ug/ml), the tigecycline could be a therapeutic option in infection by Clostridium difficile, depending on further studies to evaluate their real clinical efficacy and security. Conclusion: Obtained results in this study indicate the need for further studies in vitro and clinicians to define the limits of sensitivity/resistance to teicoplanin and nitazoxanide, so there is no interpretation criteria for both disk diffusion and for agar dilution. Results of this work in vitro study confirmed the utility of metronidazole as an effective drug in the treatment of infection by Clostridium difficile. Nitazoxanide was the drug that showed better performance in vitro by dilutional method. We suggest the use of disk diffusion method: metronidazole, vancomycin and moxifloxacin. This work suggest that inhibition zones for metronidazole ( >= 33mm), moxifloxacin ( >= 18mm) and vancomycin ( >= 22mm) could be considered as sensitive by disk diffusion method. The agar dilution method is a method to be accurate, but laborious to run in the laboratory routine

Introdução: O Clostridium difficile é um bacilo Gram-positivo, anaeróbio estrito, formador de esporos, que produz toxinas que podem causar diarreia, colite pseudomembranosa, dilatação do cólon, sepse e até morte. Nos últimos anos o quadro clínico e epidemiológico das infecções por Clostridium difficile tem se modificado e as limitações das opções terapêuticas tornaram-se mais evidentes. Objetivo Primário: Comparar as metodologias de disco-difusão e ágar-diluição na detecção de sensibilidade/resistência de isolados de Clostridium difficile. Objetivos Secundários: Avaliar prospectivamente o perfil de sensibilidade/resistência de isolados clínicos hospitalares de Clostridium difficile provenientes de seis hospitais terciários da cidade de São Paulo e fornecer evidências para fundamentar o diagnóstico e o tratamento empírico das diarreias causadas por Clostridium difficile. Métodos: utilizamos os métodos de disco-difusão e ágar-diluição, de acordo com os critérios estabelecidos pelo CLSI e EUCAST. Resultados: Os coeficientes de correlação observados entre os diâmetros dos halos de inibição e Concentração Inibitória Mínima foram abaixo do esperado tornando inviável o método de disco-difusão para determinação de sensibilidade aos antimicrobianos nitazoxanida, teicoplanina e tigeciclina. Todas as 50 cepas deste estudo foram sensíveis ao metronidazol (MIC50 foi de 1 ?g/mL a MIC90 foi de 2 ug/mL). Para o método de disco-difusão, sugerimos que halos de inibição >= 33mm possam ser interpretados como sensíveis. Devido à moderada correlação, significância estatística e distribuição de halos de inibição das amostras próximos aos valores encontrados utilizando a cepa ATTC, sugere-se a utilização do método de disco-difusão para vancomicina, onde halos com diâmetro >= 22mm possam ser considerados como sensíveis pelo método. Para o moxifloxacino houve uma boa correlação entre as duas metodologias: discodifusão e de ágar-diluição (O coeficiente de Pearson foi de -0,84, e o valor de p foi menor que 0,00001), sugerindo que halos de inibição >= 18mm possam ser interpretados como sensíveis pela metodologia de disco-difusão. A nitazoxanida foi à droga que mostrou melhor atividade in vitro (MIC50 foi 0,06 ?g/mL e a MIC90 de 0,12 ug/mL). Por se mostrar uma droga com potente atividade in vitro (MIC50 e a MIC90 foi de 0,12 ug/mL), a tigeciclina poderia ser mais uma opção terapêutica em infecções por Clostridium difficile, dependendo de mais estudos para avaliar sua real eficácia clínica e segurança. Conclusão: Os resultados verificados neste estudo indicam a necessidade de mais estudos in vitro e clínicos para definir os limites de sensibilidade/resistência para a teicoplanina e a nitazoxanida, pois faltam critérios de interpretação tanto para disco-difusão quanto para ágar-diluição. Os resultados deste trabalho in vitro confirmaram a utilidade do metronidazol como uma droga eficaz no tratamento de infecção por Clostridium difficile. A nitazoxanida foi à droga que mostrou melhor atividade in vitro por método dilucional. Sugerimos a utilização do método de disco-difusão para: metronidazol, vancomicina e moxifloxacino. Os resultados desse trabalho sugerem que halos de inibição para metronidazol ( >= 33mm), moxifloxacino ( >= 18mm) e vancomicina ( >= 22mm) poderiam ser considerados como sensíveis pelo método de disco-difusão. O método de ágardiluição é um método de boa acurácia, porém trabalhoso para ser executado na rotina laboratorial / Introduction: Clostridium difficile is a Gram-positive bacillus, strictly anaerobic, spore-forming, which produces toxins that can cause diarrhea, colitis pseudomembranous, colon expansion, sepsis and even death. In recent years the clinical and epidemiological picture of infection by Clostridium difficile has been modified and limitations of therapeutic options have become more evident. Primary Objective: Comparing the methods of disk diffusion and agar dilution in the detection sensitivity/resistance isolates of Clostridium difficile. Secondary Objectives: Prospectively evaluate the profile of sensitivity/resistance of hospital clinical isolates of Clostridium difficile from six tertiary hospitals in São Paulo city and provide evidence to support the diagnosis and empirical treatment of diarrhea caused by Clostridium difficile. Methods: We use the disk diffusion method and agar dilution method, according to the established criteria by CLSI and EUCAST. Results: The observed correlation coefficients between the inhibitions diameter zone of the and Minimum Inhibitory Concentration were under expectations impeding the disk diffusion method for determining sensitivity to nitazoxanide antimicrobial, teicoplanin and tigecycline. All 50 strains of this study were sensitive to metronidazole (MIC50 was 1 Ug/ml to MIC90 was 2 ug/ml). For the method disk diffusion, we suggest that inhibition zones >= 33mm can be interpreted as sensitive. Due to the moderate correlation, statistical significance and distribution of zones of inhibition on samples of the next found values using the strain ATTC, we suggest using the disk diffusion method for vancomycin where halos diameter >= 22mm can be considered as sensitive by the method. There was a good correlation to moxifloxacin between the two methodologies: disk diffusion and agar dilution (Pearson\'s coefficient was -0.84 , and the \"p\" value was less than 0.00001), suggesting that inhibition zones >= 18mm can be interpreted as sensitive by disk diffusion method. Nitazoxanide was the drug that showed a better performance in vitro activity (MIC50 was 0.06 ?g/ml and MIC90 0.12 ug/ml). For a drug that shows potent activity in vitro (MIC50 and MIC90 was 0.12 ug/ml), the tigecycline could be a therapeutic option in infection by Clostridium difficile, depending on further studies to evaluate their real clinical efficacy and security. Conclusion: Obtained results in this study indicate the need for further studies in vitro and clinicians to define the limits of sensitivity/resistance to teicoplanin and nitazoxanide, so there is no interpretation criteria for both disk diffusion and for agar dilution. Results of this work in vitro study confirmed the utility of metronidazole as an effective drug in the treatment of infection by Clostridium difficile. Nitazoxanide was the drug that showed better performance in vitro by dilutional method. We suggest the use of disk diffusion method: metronidazole, vancomycin and moxifloxacin. This work suggest that inhibition zones for metronidazole ( >= 33mm), moxifloxacin ( >= 18mm) and vancomycin ( >= 22mm) could be considered as sensitive by disk diffusion method. The agar dilution method is a method to be accurate, but laborious to run in the laboratory routine