A forma larval de Echinococcus granulosus (metacestóide) é o agente causador da hidatidose cística, zoonose endêmica no Rio Grande do Sul. Essa parasitose caracteriza-se pelo crescimento de uma massa cística preenchida de líquido hidático que causa compressão em órgãos e tecidos vizinhos. O antígeno B (AgB) é um dos maiores componentes do líquido hidático. Apesar da função do AgB ser mal conhecida, alguns indícios sugerem que ele está envolvido na interação parasito/hospedeiro. Sabe-se que os genes de contingência em microparasitas (protozoários e bactérias) são os responsáveis pela evasão da resposta imune do hospedeiro, e estão localizados, freqüentemente, na região sub-telomérica dos cromossomos. A localização sub-telomérica poderia estar relacionada com a alta variabilidade encontrada na família multigênica do AgB, uma vez que tais regiões costumam estar mais sujeitas à mutação. No presente trabalho procuramos verificar a proximidade dos genes de AgB dos telômeros através de experimentos de Southern blot utilizando a técnica de TRF (Telomere Restriction Fragment) onde o DNA genômico de E. granulosus e E. multilocularis foi clivado com seis diferentes enzimas de restrição e hibridizado com um inserto que possui o motivo telomérico C3TA2 (caracterizado para E. granulosus) e re-hibridizado com produtos de PCR dos genes AgB, ambos marcados com fluoresceína. Os nossos resultados permitiram a identificação de heterogeneidade no tamanho dos telômeros de E. granulosus. Ainda, utilizamos um PCR extra longo (XL-PCR) com primers específicos para os genes de AgB e um primer contendo o motivo telomérico de E. granulosus. Foram obtidos amplicons de aproximadamente 1600 pb para AgB2 , AgB3 e AgB4, e de 1300 e 3500 pb para AgB3. Não foram obtidos amplicons para AgB1. Com base nos dados obtidos neste trabalho, sugerimos que os genes AgB2, AgB3 e AgB4 estão localizados próximos a um motivo telomérico, mas ainda não podemos definir a precisa localização dos genes nos cromossomos. / The larval stage of Echinococcus granulosus (metacestode) causes the cystic hydatic disease, an endemic zoonosis from the state of Rio Grande do Sul. The disease is characterized by the growth of a cyst filled with liquid (hydatic fluid), leading to the compression of the neighbouring organs and tissues. Although the biological role of antigen B (AgB) is still uncertain, several clues show that it is involved in the parasite/host interaction. Contingency genes are known to be responsible for the evasion of host imune response in microparasites, and are frequently localized in chromosome sub-telomeric regions. A sub-telomeric localization could be related to the high variability found in the AgB multigene family, since these regions are usually more prone to mutations. In the present work we tried to verify the proximity of AgB genes to the telomeres with Southern blot experiments using the TRF (Telomeric Restriction Fragment) technique, where the genomic DNA from 35 E. granulosus and 5 E. multilocularis isolates were digested with 6 different restriction enzimes and hybridized with an insert containg the E. granulosus telomeric motif (C3TA2) and re-hybridized with PCR products derived from AgB genes, both labeled with fluorescein. Our results show heterogenity in the E. granulosus telomere size. Furthermore, we used an extra long PCR (XL-PCR) with specific primers for AgB genes and a primer containing the E. granulosus telomeric motif. We obtained amplicons with about 1600 bp for AgB2, AgB3 and AgB4, and with 1300 and 3500 bp for AgB3. No amplicons were obtained using AgB1 specific primers. Based on these data, we suggest that the E. granulosus AgB2, AgB3 and AgB4 genes are localized in the vincinity of telomeric motifs, but we are still unable to define the precise localization of the genes at chromosomes.

O antígeno B (AgB) é uma proteína polimérica de aproximadamente 160 kDa secretada durante a fase larval dos parasitos do gênero Echinococcus. Sua função provavelmente está relacionada com a evasão da resposta imune do hospedeiro, e tem sido relatado que seus genes apresentam alta diversidade de seqüências, mesmo dentro de um único metacestóide de E. granulosus. Em E. multilocularis o AgB é codificado por uma família multigênica composta por pelo menos cinco genes. Neste trabalho nós avaliamos o efeito do sistema imune dependente de célula T sobre a diversificação somática dos genes do antígeno B em metacestóides de E. multilocularis obtidos de camundongos secundariamente infectados com microcistos: uma linhagem proficiente e outra não proficiente quanto à resposta imune celular (BALB/c e nude, respectivamente). Os animais foram sacrificados após um ou dois meses de infecção para coleta da massa parasitária e extração do RNA. Após a síntese do cDNA foram feitas PCRs específicas para quatro genes (EmAgB1, EmAgB2, EmAgB3 e EmAgB4) e o produto desta reação foi clonado. Os clones resultantes foram analisados quanto à presença de polimorfismo através de PCR-SSCP e os alelos descobertos foram seqüenciados. A diversidade alélica foi calculada através do Índice de Diversidade de Shannon e desvios da neutralidade foram testados através do Teste D de Tajima e através do Teste Exato de Fisher, que detecta excesso de mutações não-sinônimas em relação às mutações sinônimas. Um teste adicional, que calcula a probabilidade (através da distribuição binomial) de ocorrência das mutações não-sinônimas, foi realizado. Comparando a diversidade encontrada nos genes do AgB não encontramos evidências de que a pressão imposta pelo sistema imune esteja relacionada com a diversidade de seqüências encontrada em nosso estudo. O gene EmAgB2 apresentou Índices de diversidade mais elevados (principalmente quando coletado do camundongo BALB/c após um mês de infecção) e também apresentou maior quantidade de indels. Apenas um dos alelos encontrados em nossa amostragem foi compartilhado por parasitos coletados de diferentes camundongos, sugerindo que os alelos possam ter surgido após a infecção dos camundongos. O Teste D de Tajima resultou em valores negativos em todas as análises. Entretanto, nem o Teste Exato de Fisher nem a análise da probabilidade binomial encontraram excesso de mutações não sinônimas para qualquer dos genes analisados. Portanto, nossos dados indicam que os genes do AgB durante a fase de metacestóide evoluem segundo o modelo neutro e o valor D de Tajima negativo pode ser explicado devido a rápida proliferação celular do metacestóide após a infecção secundária. / The Antigen B (AgB) is a polymeric protein secreted during the larval stage of the Echinococcus flatworms. The AgB is involved with the evasion of host immune response and its genes show high variability, even inside a single E. granulosus metacestode. To date, five AgB genes have been reported in the E. multilocularis genome. In this work we analyzed the AgB diversification in E. multilocularis recovered from secondarily infected mice. Two different mouse strains were infected with microcysts of E. multilocularis: BALB/c and nude, which are T-Cell immune response proficient and non-proficient, respectively. The mice were necropsed one or two months post infection and the parasite mass was collected for RNA extraction. Following the cDNA synthesis, each AgB gene (EmAgB1, EmAgB2, EmAgB3 and EmAgB4) was amplified in a specific PCR and the products of these reactions were cloned. The polymorphism present in each AgB gene was assessed by PCR-SSCP and the variant alleles were sequenced. The allele diversity for each gene was calculated by the Shannon Diversity Index and neutrality departures were tested by Tajima’s D Test, and Fisher’s Exact Test, which evaluates the excess of non-synonymous over synonymous substitutions. An additional test, which estimates the binomial probability of occurrence of nonsynonymous mutations, was also performed. We did not find association between the AgB diversity and the immune response of the host. The EmAgB2 gene showed the largest diversity index among the four genes (especially when collected from BALB/c at first month post infection) and it also presented a large quantity of alleles containing indels. The parasites collected from different mice do not share AgB alleles (with a single exception), and suggest that the new alleles could have arisen after the mice infection. The Tajima’s D Test resulted in negative values in all analyses. However, both Fisher’s Exact Test and the binomial probability analysis did not detect excess of non-synonymous mutation in our samples. Therefore, our data suggest that AgB genes evolve by the neutral model during the metacestode stage, and the negative Tajima’s D value could be explained by the fast cellular proliferation of the metacestode after secondary infection.

O antígeno B (AgB) é uma proteína polimérica de aproximadamente 160 kDa secretada durante a fase larval dos parasitos do gênero Echinococcus. Sua função provavelmente está relacionada com a evasão da resposta imune do hospedeiro, e tem sido relatado que seus genes apresentam alta diversidade de seqüências, mesmo dentro de um único metacestóide de E. granulosus. Em E. multilocularis o AgB é codificado por uma família multigênica composta por pelo menos cinco genes. Neste trabalho nós avaliamos o efeito do sistema imune dependente de célula T sobre a diversificação somática dos genes do antígeno B em metacestóides de E. multilocularis obtidos de camundongos secundariamente infectados com microcistos: uma linhagem proficiente e outra não proficiente quanto à resposta imune celular (BALB/c e nude, respectivamente). Os animais foram sacrificados após um ou dois meses de infecção para coleta da massa parasitária e extração do RNA. Após a síntese do cDNA foram feitas PCRs específicas para quatro genes (EmAgB1, EmAgB2, EmAgB3 e EmAgB4) e o produto desta reação foi clonado. Os clones resultantes foram analisados quanto à presença de polimorfismo através de PCR-SSCP e os alelos descobertos foram seqüenciados. A diversidade alélica foi calculada através do Índice de Diversidade de Shannon e desvios da neutralidade foram testados através do Teste D de Tajima e através do Teste Exato de Fisher, que detecta excesso de mutações não-sinônimas em relação às mutações sinônimas. Um teste adicional, que calcula a probabilidade (através da distribuição binomial) de ocorrência das mutações não-sinônimas, foi realizado. Comparando a diversidade encontrada nos genes do AgB não encontramos evidências de que a pressão imposta pelo sistema imune esteja relacionada com a diversidade de seqüências encontrada em nosso estudo. O gene EmAgB2 apresentou Índices de diversidade mais elevados (principalmente quando coletado do camundongo BALB/c após um mês de infecção) e também apresentou maior quantidade de indels. Apenas um dos alelos encontrados em nossa amostragem foi compartilhado por parasitos coletados de diferentes camundongos, sugerindo que os alelos possam ter surgido após a infecção dos camundongos. O Teste D de Tajima resultou em valores negativos em todas as análises. Entretanto, nem o Teste Exato de Fisher nem a análise da probabilidade binomial encontraram excesso de mutações não sinônimas para qualquer dos genes analisados. Portanto, nossos dados indicam que os genes do AgB durante a fase de metacestóide evoluem segundo o modelo neutro e o valor D de Tajima negativo pode ser explicado devido a rápida proliferação celular do metacestóide após a infecção secundária. / The Antigen B (AgB) is a polymeric protein secreted during the larval stage of the Echinococcus flatworms. The AgB is involved with the evasion of host immune response and its genes show high variability, even inside a single E. granulosus metacestode. To date, five AgB genes have been reported in the E. multilocularis genome. In this work we analyzed the AgB diversification in E. multilocularis recovered from secondarily infected mice. Two different mouse strains were infected with microcysts of E. multilocularis: BALB/c and nude, which are T-Cell immune response proficient and non-proficient, respectively. The mice were necropsed one or two months post infection and the parasite mass was collected for RNA extraction. Following the cDNA synthesis, each AgB gene (EmAgB1, EmAgB2, EmAgB3 and EmAgB4) was amplified in a specific PCR and the products of these reactions were cloned. The polymorphism present in each AgB gene was assessed by PCR-SSCP and the variant alleles were sequenced. The allele diversity for each gene was calculated by the Shannon Diversity Index and neutrality departures were tested by Tajima’s D Test, and Fisher’s Exact Test, which evaluates the excess of non-synonymous over synonymous substitutions. An additional test, which estimates the binomial probability of occurrence of nonsynonymous mutations, was also performed. We did not find association between the AgB diversity and the immune response of the host. The EmAgB2 gene showed the largest diversity index among the four genes (especially when collected from BALB/c at first month post infection) and it also presented a large quantity of alleles containing indels. The parasites collected from different mice do not share AgB alleles (with a single exception), and suggest that the new alleles could have arisen after the mice infection. The Tajima’s D Test resulted in negative values in all analyses. However, both Fisher’s Exact Test and the binomial probability analysis did not detect excess of non-synonymous mutation in our samples. Therefore, our data suggest that AgB genes evolve by the neutral model during the metacestode stage, and the negative Tajima’s D value could be explained by the fast cellular proliferation of the metacestode after secondary infection.

A forma larval de Echinococcus granulosus (metacestóide) é o agente causador da hidatidose cística, zoonose endêmica no Rio Grande do Sul. Essa parasitose caracteriza-se pelo crescimento de uma massa cística preenchida de líquido hidático que causa compressão em órgãos e tecidos vizinhos. O antígeno B (AgB) é um dos maiores componentes do líquido hidático. Apesar da função do AgB ser mal conhecida, alguns indícios sugerem que ele está envolvido na interação parasito/hospedeiro. Sabe-se que os genes de contingência em microparasitas (protozoários e bactérias) são os responsáveis pela evasão da resposta imune do hospedeiro, e estão localizados, freqüentemente, na região sub-telomérica dos cromossomos. A localização sub-telomérica poderia estar relacionada com a alta variabilidade encontrada na família multigênica do AgB, uma vez que tais regiões costumam estar mais sujeitas à mutação. No presente trabalho procuramos verificar a proximidade dos genes de AgB dos telômeros através de experimentos de Southern blot utilizando a técnica de TRF (Telomere Restriction Fragment) onde o DNA genômico de E. granulosus e E. multilocularis foi clivado com seis diferentes enzimas de restrição e hibridizado com um inserto que possui o motivo telomérico C3TA2 (caracterizado para E. granulosus) e re-hibridizado com produtos de PCR dos genes AgB, ambos marcados com fluoresceína. Os nossos resultados permitiram a identificação de heterogeneidade no tamanho dos telômeros de E. granulosus. Ainda, utilizamos um PCR extra longo (XL-PCR) com primers específicos para os genes de AgB e um primer contendo o motivo telomérico de E. granulosus. Foram obtidos amplicons de aproximadamente 1600 pb para AgB2 , AgB3 e AgB4, e de 1300 e 3500 pb para AgB3. Não foram obtidos amplicons para AgB1. Com base nos dados obtidos neste trabalho, sugerimos que os genes AgB2, AgB3 e AgB4 estão localizados próximos a um motivo telomérico, mas ainda não podemos definir a precisa localização dos genes nos cromossomos. / The larval stage of Echinococcus granulosus (metacestode) causes the cystic hydatic disease, an endemic zoonosis from the state of Rio Grande do Sul. The disease is characterized by the growth of a cyst filled with liquid (hydatic fluid), leading to the compression of the neighbouring organs and tissues. Although the biological role of antigen B (AgB) is still uncertain, several clues show that it is involved in the parasite/host interaction. Contingency genes are known to be responsible for the evasion of host imune response in microparasites, and are frequently localized in chromosome sub-telomeric regions. A sub-telomeric localization could be related to the high variability found in the AgB multigene family, since these regions are usually more prone to mutations. In the present work we tried to verify the proximity of AgB genes to the telomeres with Southern blot experiments using the TRF (Telomeric Restriction Fragment) technique, where the genomic DNA from 35 E. granulosus and 5 E. multilocularis isolates were digested with 6 different restriction enzimes and hybridized with an insert containg the E. granulosus telomeric motif (C3TA2) and re-hybridized with PCR products derived from AgB genes, both labeled with fluorescein. Our results show heterogenity in the E. granulosus telomere size. Furthermore, we used an extra long PCR (XL-PCR) with specific primers for AgB genes and a primer containing the E. granulosus telomeric motif. We obtained amplicons with about 1600 bp for AgB2, AgB3 and AgB4, and with 1300 and 3500 bp for AgB3. No amplicons were obtained using AgB1 specific primers. Based on these data, we suggest that the E. granulosus AgB2, AgB3 and AgB4 genes are localized in the vincinity of telomeric motifs, but we are still unable to define the precise localization of the genes at chromosomes.

A forma larval de Echinococcus granulosus (metacestóide) é o agente causador da hidatidose cística, zoonose endêmica no Rio Grande do Sul. Essa parasitose caracteriza-se pelo crescimento de uma massa cística preenchida de líquido hidático que causa compressão em órgãos e tecidos vizinhos. O antígeno B (AgB) é um dos maiores componentes do líquido hidático. Apesar da função do AgB ser mal conhecida, alguns indícios sugerem que ele está envolvido na interação parasito/hospedeiro. Sabe-se que os genes de contingência em microparasitas (protozoários e bactérias) são os responsáveis pela evasão da resposta imune do hospedeiro, e estão localizados, freqüentemente, na região sub-telomérica dos cromossomos. A localização sub-telomérica poderia estar relacionada com a alta variabilidade encontrada na família multigênica do AgB, uma vez que tais regiões costumam estar mais sujeitas à mutação. No presente trabalho procuramos verificar a proximidade dos genes de AgB dos telômeros através de experimentos de Southern blot utilizando a técnica de TRF (Telomere Restriction Fragment) onde o DNA genômico de E. granulosus e E. multilocularis foi clivado com seis diferentes enzimas de restrição e hibridizado com um inserto que possui o motivo telomérico C3TA2 (caracterizado para E. granulosus) e re-hibridizado com produtos de PCR dos genes AgB, ambos marcados com fluoresceína. Os nossos resultados permitiram a identificação de heterogeneidade no tamanho dos telômeros de E. granulosus. Ainda, utilizamos um PCR extra longo (XL-PCR) com primers específicos para os genes de AgB e um primer contendo o motivo telomérico de E. granulosus. Foram obtidos amplicons de aproximadamente 1600 pb para AgB2 , AgB3 e AgB4, e de 1300 e 3500 pb para AgB3. Não foram obtidos amplicons para AgB1. Com base nos dados obtidos neste trabalho, sugerimos que os genes AgB2, AgB3 e AgB4 estão localizados próximos a um motivo telomérico, mas ainda não podemos definir a precisa localização dos genes nos cromossomos. / The larval stage of Echinococcus granulosus (metacestode) causes the cystic hydatic disease, an endemic zoonosis from the state of Rio Grande do Sul. The disease is characterized by the growth of a cyst filled with liquid (hydatic fluid), leading to the compression of the neighbouring organs and tissues. Although the biological role of antigen B (AgB) is still uncertain, several clues show that it is involved in the parasite/host interaction. Contingency genes are known to be responsible for the evasion of host imune response in microparasites, and are frequently localized in chromosome sub-telomeric regions. A sub-telomeric localization could be related to the high variability found in the AgB multigene family, since these regions are usually more prone to mutations. In the present work we tried to verify the proximity of AgB genes to the telomeres with Southern blot experiments using the TRF (Telomeric Restriction Fragment) technique, where the genomic DNA from 35 E. granulosus and 5 E. multilocularis isolates were digested with 6 different restriction enzimes and hybridized with an insert containg the E. granulosus telomeric motif (C3TA2) and re-hybridized with PCR products derived from AgB genes, both labeled with fluorescein. Our results show heterogenity in the E. granulosus telomere size. Furthermore, we used an extra long PCR (XL-PCR) with specific primers for AgB genes and a primer containing the E. granulosus telomeric motif. We obtained amplicons with about 1600 bp for AgB2, AgB3 and AgB4, and with 1300 and 3500 bp for AgB3. No amplicons were obtained using AgB1 specific primers. Based on these data, we suggest that the E. granulosus AgB2, AgB3 and AgB4 genes are localized in the vincinity of telomeric motifs, but we are still unable to define the precise localization of the genes at chromosomes.

O antígeno B (AgB) é uma proteína polimérica de aproximadamente 160 kDa secretada durante a fase larval dos parasitos do gênero Echinococcus. Sua função provavelmente está relacionada com a evasão da resposta imune do hospedeiro, e tem sido relatado que seus genes apresentam alta diversidade de seqüências, mesmo dentro de um único metacestóide de E. granulosus. Em E. multilocularis o AgB é codificado por uma família multigênica composta por pelo menos cinco genes. Neste trabalho nós avaliamos o efeito do sistema imune dependente de célula T sobre a diversificação somática dos genes do antígeno B em metacestóides de E. multilocularis obtidos de camundongos secundariamente infectados com microcistos: uma linhagem proficiente e outra não proficiente quanto à resposta imune celular (BALB/c e nude, respectivamente). Os animais foram sacrificados após um ou dois meses de infecção para coleta da massa parasitária e extração do RNA. Após a síntese do cDNA foram feitas PCRs específicas para quatro genes (EmAgB1, EmAgB2, EmAgB3 e EmAgB4) e o produto desta reação foi clonado. Os clones resultantes foram analisados quanto à presença de polimorfismo através de PCR-SSCP e os alelos descobertos foram seqüenciados. A diversidade alélica foi calculada através do Índice de Diversidade de Shannon e desvios da neutralidade foram testados através do Teste D de Tajima e através do Teste Exato de Fisher, que detecta excesso de mutações não-sinônimas em relação às mutações sinônimas. Um teste adicional, que calcula a probabilidade (através da distribuição binomial) de ocorrência das mutações não-sinônimas, foi realizado. Comparando a diversidade encontrada nos genes do AgB não encontramos evidências de que a pressão imposta pelo sistema imune esteja relacionada com a diversidade de seqüências encontrada em nosso estudo. O gene EmAgB2 apresentou Índices de diversidade mais elevados (principalmente quando coletado do camundongo BALB/c após um mês de infecção) e também apresentou maior quantidade de indels. Apenas um dos alelos encontrados em nossa amostragem foi compartilhado por parasitos coletados de diferentes camundongos, sugerindo que os alelos possam ter surgido após a infecção dos camundongos. O Teste D de Tajima resultou em valores negativos em todas as análises. Entretanto, nem o Teste Exato de Fisher nem a análise da probabilidade binomial encontraram excesso de mutações não sinônimas para qualquer dos genes analisados. Portanto, nossos dados indicam que os genes do AgB durante a fase de metacestóide evoluem segundo o modelo neutro e o valor D de Tajima negativo pode ser explicado devido a rápida proliferação celular do metacestóide após a infecção secundária. / The Antigen B (AgB) is a polymeric protein secreted during the larval stage of the Echinococcus flatworms. The AgB is involved with the evasion of host immune response and its genes show high variability, even inside a single E. granulosus metacestode. To date, five AgB genes have been reported in the E. multilocularis genome. In this work we analyzed the AgB diversification in E. multilocularis recovered from secondarily infected mice. Two different mouse strains were infected with microcysts of E. multilocularis: BALB/c and nude, which are T-Cell immune response proficient and non-proficient, respectively. The mice were necropsed one or two months post infection and the parasite mass was collected for RNA extraction. Following the cDNA synthesis, each AgB gene (EmAgB1, EmAgB2, EmAgB3 and EmAgB4) was amplified in a specific PCR and the products of these reactions were cloned. The polymorphism present in each AgB gene was assessed by PCR-SSCP and the variant alleles were sequenced. The allele diversity for each gene was calculated by the Shannon Diversity Index and neutrality departures were tested by Tajima’s D Test, and Fisher’s Exact Test, which evaluates the excess of non-synonymous over synonymous substitutions. An additional test, which estimates the binomial probability of occurrence of nonsynonymous mutations, was also performed. We did not find association between the AgB diversity and the immune response of the host. The EmAgB2 gene showed the largest diversity index among the four genes (especially when collected from BALB/c at first month post infection) and it also presented a large quantity of alleles containing indels. The parasites collected from different mice do not share AgB alleles (with a single exception), and suggest that the new alleles could have arisen after the mice infection. The Tajima’s D Test resulted in negative values in all analyses. However, both Fisher’s Exact Test and the binomial probability analysis did not detect excess of non-synonymous mutation in our samples. Therefore, our data suggest that AgB genes evolve by the neutral model during the metacestode stage, and the negative Tajima’s D value could be explained by the fast cellular proliferation of the metacestode after secondary infection.

Le parasite Echinococcus multilocularis cause l’échinococcose alvéolaire (EA), infection fatale si non prise en charge. Le traitement médical, pour les patients inopérables, est uniquement parasitostatique, et présente des effets secondaires. Néanmoins, chez certains patients, la viabilité du parasite régresserait suffisamment pour envisager un arrêt de ce traitement. Actuellement, les biomarqueurs pour estimer la viabilité parasitaire ne sont qu’indirects, évaluant la réponse immunitaire du patient. Trois études ont été menées, visant à évaluer des biomarqueurs, innovants ou déjà disponibles sur le marché.Nous avons étudié la présence d’ADN libre circulant (ADNlc), au moment du diagnostic, mais aussi quelques mois après la mise en place du traitement. Notre étude valide pour la première fois la présence d’ADNlc dans les cas d’EA, sur modèle animal puis sur des échantillons de patients. Même si la méthode n’est pas encore utilisable en diagnostic ou en suivi, c’est un point de départ vers l’utilisation de l’ADNlc pour la prise en charge de l’EA.De plus, nous avons mené une étude exploratoire sur des lésions parasitaires chez la souris et chez un patient ayant reçu un traitement médicamenteux très court. A partir d’un même échantillon, nous avons analysé l’ADN, afin d’estimer la proportion de cellules parasitaires, et nous avons quantifié différents transcrits parasitaires, afin d’estimer la viabilité du parasite de manière directe. Cet axe a permis de choisir la cible la plus transcrite : elle pourrait être utilisée sur une cohorte plus large, puis corrélée avec les biomarqueurs indirects utilisés aujourd’hui.Enfin, nous avons évalué un test de diagnostic rapide de l’échinococcose kystique, présentant de fortes réactions croisées en cas d’EA.Ces travaux ouvrent de nouvelles perspectives, principalement pour améliorer le suivi des patients atteints d’EA. / The parasite Echinococcus multilocularis is the causative agent of alveolar echinococcosis (AE), a fatal infection if not adequately managed. Medical treatment, for inoperable patients, is only parasitostatic, with many side effects. Nevertheless, in some patients, the viability of the parasite could regress sufficiently for treatment to be stopped. Currently, biomarkers for estimating parasite viability are only indirect, evaluating the immune response of the patient. Three studies were conducted to evaluate biomarkers that are innovative or already available on the market.We investigated the presence of circulating cell-free DNA (ccfDNA) at diagnosis, and after a few months of treatment. For the first time, our study identified the presence of ccfDNA in cases of AE, in an animal model and in human samples. Although the method cannot yet be used for diagnosis or follow-up, it is a starting-point for the use of ccfDNA in the management of AE.In addition, we conducted an exploratory study of parasitic lesions in mice, and in a patient who had only received medical treatment for a very short time. We analyzed DNA to estimate the proportion of parasite cells present in each sample. We then quantified different parasite transcripts from each sample, in order to directly estimate parasite viability. This approach allowed us to identify the most abundantly transcribed gene, which could potentially be used to study a larger cohort, in order to correlate results with the indirect biomarkers used today.Finally, we evaluated a rapid diagnostic test for cystic echinococcosis, which produces strong cross-reactions in the case of AE infection.This work opens new perspectives, mainly to improve the follow-up of patients with AE.

Parmi les parasites, les échinocoques revêtent une importance majeure en santé publique de par leur distribution mondiale et les maladies potentiellement très graves, qu’ils occasionnent. En Europe, les espèces présentes sont E. multilocularis, qui a un cycle sylvatique et E. granulosus spp., dont les hôtes sont essentiellement domestiques.En France, peu de données étaient disponibles quant à la distribution de ces espèces parasitaires lors de la création du LNR Echinococccus spp. en 2006. Une forte réduction supposée des zones et du niveau d’enzootie pour E. granulosus laissait envisager un risque zoonotique moindre voire désormais absent. S’agissant d’E. multilocularis, l’expansion constatée en Europe était également suspectée en France. La modification des techniques de parasitologie classique ainsi que le développement d’outils moléculaires par le LNR ont contribué à l’actualisation et à une meilleure connaissance de la distribution des espèces parasitaires en France.Une large étude de surveillance menée chez le renard avec la méthode SSCT validée par le LNR a révélé une expansion de la zone d’enzootie d’E. multilocularis jusqu’en Ille-et-Vilaine. L’analyse par microsatellite EmsB a permis d’estimer à plusieurs décennies la dispersion du parasite vers l’ouest et le nord à partir du foyer historique de l’est. Cette expansion a été confirmée à l’ouest chez des rongeurs aquatiques et rétrospectivement au sud chez le renard.Des études de surveillance d’E. granulosus en abattoir ont confirmé sa présence dans le sud de la France et en Corse. Les caractérisations moléculaires ont permis d’identifier E. granulosus sensu stricto dans le sud et E. canadensis G6-7 en Corse. Un plan de surveillance national en abattoir a ensuite montré la présence d’E. granulosus s.s. à travers l’ensemble du territoire continental. Les niveaux de prévalence d’infestation par E. granulosus s.s. estimés chez les ovins à 15,3 et chez les bovins à 8,3 cas pour 1 million de têtes abattues sont très inférieurs à ceux décrits il y a vingt ans. Deux foyers majeurs constitués par les Alpes pour E. granulosus s.s. et la Corse pour E. canadensis G6-7 demeurent, alors que l’identification d’E. ortleppi confirme le maintien de cette espèce zoonotique pourtant désormais rare en Europe.Les niveaux de prévalence d’infestation par E. multilocularis chez le chien et le chat en France confirment leurs importances mineures dans le maintien du cycle parasitaire. Le rôle zoonotique du chat semble négligeable d’après les observations d’infestations naturelles, corroborées par les données obtenues lors d’infestations expérimentales. La vermifugation régulière et adaptée des chiens, en particulier des chiens de chasse, apparait nécessaire. Cette recommandation de vermifugation canine s’applique également pour E. canadensis G6-7 en Corse, où l’accès aux viscères des porcs et des sangliers implique un volet sylvatique dans le cycle.La reconnaissance de l’expertise du LNR a permis d’initier des collaborations internationales qui ont en retour enrichi la diversité des situations épidémiologiques étudiées. Ainsi, l’étude de la diversité génétique d’E. multilocularis (microsatellite EmsB) a contribué à une meilleure compréhension de la dynamique d’expansion du parasite en Europe (Pologne, Suède, Danemark). L’étude des foyers d’hyper enzootie d’E. granulosus (Moldavie, Maroc, Algérie) et la caractérisation des espèces présentes et de leurs niveaux d’infestation chez les hôtes intermédiaires a permis d’envisager des actions de lutte adaptées. Le LNR a participé à l’expérimentation de méthodes de lutte contre E. multilocularis, démontrant la complexité des conditions requises pour leur efficacité tant par la vermifugation des renards que par la régulation de leur population. Au bilan, les nouvelles données épidémiologiques obtenues au cours des dix années de travaux ont permis d’aboutir à une meilleure appréhension du risque zoonotique actuel lié aux échinocoques en France / Among parasites, Echinococcus species are of major public health importance due to their worldwide distribution and the potential severity of the diseases they cause. In Europe, the endemic species are E. multilocularis, which has a sylvatic lifestyle, and E. granulosus spp., which the hosts are mainly domestic species. When the Echinococcus spp. NRL was created in France in 2006, few data were available on the distribution of these parasitic species. The implementation of health measures made it possible to consider a marked reduction of the endemic level and geographical distribution of E. granulosus and consequently a reduced or inexistent zoonotic risk. With regard to E. multilocularis, the parasite spread already observed in Europe was also suspected in France. The development of classical parasitology and molecular techniques for diagnosis and epidemiology has helped improve understanding of the distribution of these parasitic species in France.A large-scale surveillance study in foxes, using the SSCT method validated by the NRL, led to the description of significant westward and northward expansion from E. multilocularis’s historical endemic focus, which was estimated, using a spatio-temporal scenario deduced by EmsB microsatellite analysis, to have begun several decades ago. Molecular analyses of various types of animal samples confirmed its westward expansion in aquatic rodents. Its extension southward was confirmed thanks to fecal samples of foxes.Surveillance studies of E. granulosus at the slaughterhouse confirmed its presence in southern France and in Corsica. The first molecular characterization of this parasite in France resulted in the identification of E. granulosus sensu stricto in southern France and E. canadensis G6-7 in Corsica. The presence of E. granulosus s.s. throughout continental France was then observed on the basis of a national surveillance study at the slaughterhouse. The prevalence level of infection by E. granulosus s.s. estimated per million was 15.3 cases in sheep and 8.3 cases in cattle which was much lower than that described 20 years ago. The two main endemic foci – the Alps for E. granulosus s.s. and Corsica for E. canadensis G6-7 – still exist, while the identification of E. ortleppi confirmed maintenance of this species despite its current rarity in Europe.In France, the low prevalence of E. multilocularis infection in dogs and cats was ascertained, confirming the minor contribution of these hosts to the lifecycle. The zoonotic role of the cat appears to be negligible based on observations of natural infection cases and on data obtained from experimental infection. The regular and adapted deworming of dogs, especially hunting dogs, appears to be necessary. This deworming recommendation is also relevant against E. canadensis G6-7 in Corsica where access to viscera of pigs and wild boar adds a sylvatic component at this lifecycle.An acknowledgment of the NRL’s expertise led to several international collaborations which in turn contributed to the diversity of the epidemiological situations studied. Thus, the study of the genetic diversity of E. multilocularis by EmsB microsatellite led to a better understanding of the parasite’s expansion dynamics throughout Europe. The study of foreign foci of E. granulosus led to characterization of the endemic parasitic species and of their prevalence levels in intermediate hosts, which made it possible to plan appropriate control measures. The NRL participated in the testing of control methods against E. multilocularis, including deworming of foxes and population regulation, which demonstrated the complexity of the conditions required for these methods to be effective.The epidemiological data obtained over ten years of studies has led to a better understanding of the current zoonotic risk associated with the Echinococcus species in France

L'Echinococcose Alveolaire est une zoonose mortelle transmise a l'Homme par l'ingestion des oeufs du tænia Echinococcus multilocularis. Le cycle du parasite fait intervenir un carnivore comme hote definitif (principalement le renard roux) et des campagnols prairiaux (Microtus arvalis et Arvicola terrestris) comme hotes intermediaires. Depuis une vingtaine d'annees, les observations de plus en plus frequentes de renards urbains ont suscite de nombreuses questions sur l'augmentation du risque de contamination humaine a cause de cette proximite des renards. Des etudes recentes ont montre la presence d'E. multilocularis chez le renard urbain avec des prevalences tres variables. Cependant, les conditions du developpement de ce parasite dans les milieux urbanises sont peu documentees. Les travaux presentes proposent d'ameliorer la comprehension du cycle d'E. multilocularis dans de tels milieux. Un suivi de l'infection vulpine par collecte de cadavres a mis en evidence un gradient d'infection decroissant du milieu rural au milieu urbain. Le long de ce gradient, differents milieux ont ete regulierement echantillonnes et ont montre l'importance pour le renard roux de la disponibilite en Microtus sp. dans les milieux friches. L'etude de la reponse alimentaire du renard roux aux variations de densites de rongeurs a montre que Microtus sp. etait fortement consomme meme lorsqu'il etait faiblement present sur le terrain alors que A. terrestris, en milieu peri-urbain, est consomme selon sa disponibilite. L'etude de la disponibilite en rongeurs a l'echelle de la ville montre que la consommation en hotes intermediaires est plus importante en milieu rural qu'en milieu urbain et que le regime alimentaire rural se caracterise par une predominance de Microtus sp. par rapport a A. terrestris alors que ces differences sont pas presentes en milieu urbain. La repartition des feces de renard roux est correlee aux densites de Microtus sp et d'A. terrestris, soulignant les possibilites d'existence du cycle parasitaire quel que soit le niveau d'urbanisation. Enfin, l'etude de trajectoires de renards par utilisation de colliers GPS a permis d'observer differents types de comportements individuels qui pourraient entrainer une modulation de la dynamique spatiale de la transmission urbaine du parasite basee sur la stabilite des populations vulpines.

Le fonctionnement du cycle parasitaire de l'échinocoque alvéolaire (Echinococcus multilocularis) est étudié en Franche-Comté (France) à travers (i) la distribution des prévalences chez le renard (Vulpes vulpes) au niveau régional, (ii) distribution des cas humains, au niveau régional et (iii) la distribution des rongeurs, du renard, du chat forestier (Felis silvestris et domestique (Felis catus) au niveau du biotope. Cette dernière étude, menée au niveau d'organisation du peuplement et comparée à celles menées aux autres niveaux de perception aboutit à formuler une théorie selon laquelle le cycle de l'échinococcose alvéolaire se maintiendrait en Franche-Comté grâce à un fonctionnement en mosaïque: la parasitose serait temporaire en un secteur donné (= tesselle), la permanence de l'enzootie dans la région étant due à l'alimentation de zones "indemnes' par les zones temporairement favorables et infestées (vecteur principal = renard). Le caractère temporaire de l'infestation d'une tesselle serait dû au fait que convergent un nombre de conditions: abiotiques (mésoclimatologie) et biotiques (cinétique des populations de rongeurs et utilisation par le renard dans une relation prédateur/proie conditionnée par le paysage). L'appréciation du caractère "fonctionnel" de la mosaïque tiendrait donc à l'analyse simultanée de relations et de dynamiques qui s'expriment à des niveaux de perception différents (station : conservation des œufs de Ténia selon les conditions édaphiques et la climatologie saisonnière ; biotope: distribution des peuplements de rongeurs; secteur: cinétique des peuplements de rongeurs dépendant de l'organisation de l'espace agricole; région: mésoclimatologie et arrangement spatial des secteurs).