Seit der Entdeckung, dass das ZNS ein immunprivilegiertes Organ ist, wurde dies vor allem durch das Fehlen einer afferenten zellulären immunologischen Versorgung erklärt, also dem Fehlen einer zur Auswärtsmigration fähigen APZ- Population im Parenchym und der fehlenden Versorgung des ZNS mit Lymph- gefäßen. In letzter Zeit wurde dieses Erklärungsmodell sowohl prinzipiell als auch experimentell in Frage gestellt. Durch die Verwendung von transgenen Mäusen, die unter dem Promoter von CD11c GFP (green fluorescent protein) exprimieren, konnten wir zum ersten Mal im ZNS-Parenchym von gesunden Mäusen eine CD11c-positive Zellpopulation nachweisen. Diese Zellen zeigen morphologisch starke Ähnlichkeit zu DZs und sind vor allem dort zu finden, wo sich im Rahmen der MS-Erkrankung Demyelinisierungen finden lassen. Mit ihren Fortsätzen sind sie teilweise an der Bildung der glia limitans beteiligt, stehen also in enger anatomischer Beziehung zum perivaskulären Raum. In diesem Raum findet die Selektion der Lymphozyten statt, denen ein Übertritt in das ZNS ermöglicht wird. Eine Beteiligung der CD11c-positiven Zellpopulation an diesem Prozess ist wahrscheinlich. Um diese Zellen genauer zu typisieren isolierten wir mithilfe eines einheitlichen Isolationsprotokolls mononukleäre Zellen aus Gehirn, Lunge, Leber und Milz von Wildtypmäusen und untersuchten diese nach immunologischer Färbung von CD11b, CD11c, CD45, CD80, CD86, F4/80, CD103, CCR2, CX 3 CR1 und Flt 3 mittels Durchflusszytometrie. Hiermit konnten wir zeigen, dass sich in den verschiedenen Organen stark heterogene, umgebungsspezifische CD11c-positive Zellpopulationen finden. Zusammenfassend lässt sich konstatieren, dass Mikro- glia, charakterisiert durch ihre intermediäre Expression von CD45, eine äußerst geringe Expressivität von MHC-II aufweisen. Zusätzlich kultivierten wir isolier- te mononukleäre Zellen aus Hirngewebe und aus der Milz von MHC-II-eGFP Mäusen auf organotypischen Schnittkulturen, die aus dem Hippocampus (engl.: organotypical hippocampal slice cultures - OHSC), respektive der Milz (engl.: organotypical spleen slice cultures - OSSC) von Wildtyptieren gewonnen wurden. Hier konnten wir am lebenden Gewebe über einen Zeitraum von mindestens 72 Stunden mittels konfokaler Mikroskopie eine umgebungsspezifische Adaption der eingebrachten transgenen MHC-II-eGFP-positiven Zellpopulation zeigen. Aus Milzgewebe isolierte mononukleäre Zellen, die auf OHSC kultiviert wurden, ramifizierten und verringerten ihre Expression von MHC-II; wurden diese auf OSSC kultiviert, behielten sie ihre amöboide Form und zeigten eine hohe Ex- pression von MHC-II. Mononukleäre Zellen aus Hirngewebe ramifizierten auf OHSC und zeigten eine geringe Expression von MHC-II; auf OSSC blieben diese Zellen amöboid und zeigten keine signifikante Expression von MHC-II. Diese Befunde lassen den Schluss zu, dass sowohl Umgebungsfaktoren als auch der Ur- sprung dieser mononukleären Zellen ihre immunologische Funktion beeinflussen können. Um der Frage nachzugehen, welche immunologische Funktion die CD11c-positive Zellpopulation im ZNS unter neuroinflammatorischen Bedingungen besitzt und ob sich Anzeichen für eine Auswärtsmigration dieser Zellen finden lassen, verwendeten wir myeloablativ bestrahlte CD11-GFP transgene Tiere, denen wildtyp Knochenmark transplantiert wurde und in denen EAE induziert wurde. Vorangegangene Arbeiten hatten eine mechanische Zerstörung von natürlichen Barrieren, u.a. von Blutgefäßen mit ihren Endothelien, Lymphgefäßen der Haut und der Subcutis, neuronalem Gewebe, Hirnhäuten, etc., in Kauf genommen, um Farbstoffe oder Zellen einzubringen. Durch die Chimärisierung wird eine – nicht vollumfängliche – Trennung der zentralnervösen DZ-Population und ihrem systemischen Gegenstück ohne o.g. mechanische Zerstörung von physiologischen Barrieren erreicht. So kann die Mehrheit der transgener Zellen, die sich 6 bis 8 Wochen nach Chimärisierung findet, dem ZNS zugeordnet werden. Mono- nukleäre Zellen aus homogenisiertem Hirngewebe dieser Tiere wurde mittels Durchflusszytometrie nach Färbung von CD11b, CD45, CD11c, CD80, CD86, F4/80 und MHC-II untersucht. ZNS-ständige Mikroglia, in unserem Modell charakterisiert durch GFP-Positivität und die intermediäre Expression von CD45, zeigen in der Gruppe der stark erkrankten Tiere eine signifikante Erhö- hung ihrer Expression von CD11c-GFP, MHC-II und CD80. Dieses Muster der Oberflächenmarker zeigt die Fähigkeit zur Stimulation von T-Zellen. Verschie- dene Lymphknotenstationen wurden homogenisiert und mittels quantitativer PCR auf ihren Gehalt an transgener DNA hin untersucht. Hier konnten wir eine signifikante Zunahme dieser transgenen DNA in zervikalen und axillären Lymhpknoten stark erkrankter Tiere zeigen. Zusätzlich ließen sich in der Fluo- reszenzmikroskopie ramifizierte Zellen in diesen Lymphknoten finden, welche sowohl GFP als auch P2Y 12 -positiv waren. P2Y 12 ist ein rezent beschriebener Oberflächenmarker, der spezifisch für Mikroglia ist. Zusammenfassend lassen sich diese Ergebnisse dahingehend deuten, dass die CD11c-positive Population im ZNS im Rahmen eines neuroinflammatorischen Prozesses in ZNS-assoziierte Lymphknoten migrieren und dort T-Zellen stimulieren kann. Bei an MS erkrank- ten Patienten könnten diese Lymphknoten ein lohnenswertes anatomisches Ziel darstellen, um zu versuchen mittels immunmodulierender oder -suppressiver Medikamente den neuroinflammatorischen Prozess zu lindern. Auf diese Wei- se ließe sich eventuell die Effektivität dieser Medikamente erhöhen und die systemische, unerwünschte, Wirkung reduzieren.

Alemtuzumab exerts its clinical efficacy by its specific pattern of depletion and repopulation of different immune cell subsets. Recently, single cases of multiple sclerosis patients who developed severe exacerbation after the first alemtuzumab application, accompanied by re-appearance of peripheral B cells, were reported. Here we present a case with underlying B cell-driven multiple sclerosis that impressively improves after alemtuzumab, although peripheral B cell repopulation took place. Our detailed clinical, histopathological, imaging and immunological data suggest that alemtuzumab can act as an effective rescue treatment in highly active B cell-driven and antibody/complement-mediated multiple sclerosis type II patients.

Die Multiple Sklerose (MS) ist die häufigste chronisch-entzündliche Erkrankung des zentralen Nervensystems und die häufigste Ursache erworbener Behinderung im jungen Erwachsenenalter. Histopathologisches Kennzeichen der MS sind fokale Läsionen, die durch Demyelinisierung, Entzündungsinfiltrat, gliale Narbenbildung, Astrozytose, Oligodendrozytenschädigung und unterschiedlich stark ausgeprägte Axondegeneration gekennzeichnet sind. Die Läsionen können im gesamten ZNS auftreten. Bei der Pathogenese der MS geht man von einem multifaktoriellen Geschehen aus. Nach dem derzeitigen Wissenstand ist die MS eine T-Zell-vermittelte Autoimmunerkrankung gegen bestimmte Bestandteile des zentralen Nervensystems, bei der zusätzlich genetische, epidemiologische und Umweltfaktoren eine Rolle spielen. MicroRNAs (miRNAs) haben wichtige Funktionen in der Genregulation und sind in viele physiologische Zellprozesse involviert. Man geht daher davon aus, dass miRNAs auch eine wichtige Rolle in der Pathogenese der MS spielen. Sowohl an MS-Patienten als auch im Tiermodell werden diesbezügliche Untersuchungen durchgeführt. Das wichtigste Tiermodell der MS ist die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE). In der vorliegenden Arbeit wurde die miRNA-Regulation ausgewählter miRNAs in EAE-Läsionen von C57/BL6 Mäusen (MOG35-55-induziert) und Weißbüschelaffen (MOG1-125-induziert) im Gegensatz zu Kontrollgewebe ermittelt und mit der bekannten miRNA-Regulation in aktiven humanen MS-Läsionen verglichen. Aus den EAE-Rückenmarksläsionen der Mäuse und den makrosezierten EAE-Hirnläsionen der Weißbüschelaffen wurde zunächst die RNA extrahiert. Im Anschluss erfolgte die Umschreibung in eine cDNA und dann eine miRNA-Detektion und -Quantifizierung mit Hilfe einer qPCR. Es konnte gezeigt werden, dass die miRNA-Regulation in den EAE-Läsionen von Mäusen und Weißbüschelaffen mit der miRNA-Hoch- und -Herabregulation in den aktiven humanen MS-Läsionen vergleichbar ist. Die im Menschen konservierten und regulierten miRNAs miR-155, miR-142-3p, miRNA-146a, miR-146b und miR-21 waren auch in Maus und Weißbüschelaffe in ähnlicher Weise hochreguliert.

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Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the rodent model of multiple sclerosis (MS), a chronic autoimmune neuroinflammatory disease that has a devastating impact on various neurological functions of the patients. The hallmarks of both, MS and EAE, are neuroinflammation, demyelination and neuroaxonal degeneration. Various types of lymphoid and myeloid cells were shown to infiltrate the central nervous system and to participate in disease pathology. However, the role of eosinophil granulocytes has been less explored thus far. An early study showed that eosinophils infiltrate into the spinal cord of EAE mice and suggested their role in the disease progression. Recently, it was reported that eosinophils can play a protective role against EAE when mice are treated with an extract from helminths. Furthermore, it was shown that EAE development is not altered in mice deficient for interleukin-5, an important eosinophil pro-survival factor. Taken together, the role of eosinophils in EAE is currently unclear and needs to be investigated in detail. In the present study, we use the active model of EAE, whereby we immunized the C57BL/6 mouse strain with MOG35-55 peptide emulsified in the complete Freund’s adjuvant, in order to study a possible contribution of eosinophils to the disease pathology. Using the flow cytometry and RT-qPCR analysis of the spinal cord, we show that eosinophils infiltrate into the tissue in the course of EAE. The infiltration is likely driven by eosinophil chemoattractants, such as eotaxin-1, as the concentration of the latter was increased in the spinal cord during EAE, as shown on mRNA and protein level. Moreover, detailed flow cytometry analysis of spinal cord eosinophils revealed that they show signs of activation, namely an increase in CD11b and decrease in CCR-3 surface expression. Furthermore, we observed signs of degranulation of spinal cord eosinophils in EAE which was measured as a decrease of the side scatter parameter and an upregulation of CD63 surface expression. These data suggest a potential role of eosinophils in the pathology of EAE. In order to elucidate whether eosinophils are important for the disease development, eosinophil-deficient mice were subjected to EAE and the clinical development of the disease was observed. For this purpose, we used two independent models of eosinophil deficiency - ΔdblGATA1 and interleukin-5-depleted mice. ΔdblGATA1 mice are a genetically manipulated mouse strain bearing a deletion in GATA1 promoter that causes a specific depletion of eosinophils. Interestingly, clinical development of EAE was not affected in these mice when compared to their wild-type controls. As a next step, we depleted eosinophils by injecting wild-type mice with an antibody against the eosinophil pro-survival factor interleukin-5 in order to reduce eosinophil numbers in the effector phase of EAE. In accordance with the result from the experiment with ΔdblGATA1 mice, EAE progression was not altered in the eosinophil-depleted mice when compared to mice that were injected with an isotype control antibody. Further, we analyzed the neuroinflammation and demyelination in the spinal cord of 4ΔdblGATA1 mice subjected to EAE. Specifically, the infiltration of inflammatory cell populations, including CD4 and CD8 T cells, neutrophils and macrophages, was assessed by flow cytometry. In agreement with the unchanged clinical EAE development, inflammatory cell infiltration was not affected in ΔdblGATA1 mice. Furthermore, we analyzed expression of pro-inflammatory cytokines in the spinal cord of ΔdblGATA1 mice subjected to EAE in order to better characterize the inflammatory status. No significant changes were detected further confirming that eosinophils do not contribute to neuroinflammation in EAE. Finally, we assessed the demyelination in the spinal cord of ΔdblGATA1 EAE mice using luxol fast blue staining to detect myelin. In accordance with the unaffected clinical development and inflammatory status, we did not observe any difference in the spinal cord demyelination in ΔdblGATA1 mice when compared to their wild-type littermates. Taken together, although eosinophils infiltrate into the spinal cord of EAE mice and are activated and degranulate therein, they are dispensable for EAE development.

Background: Multiple sclerosis (MS) is a chronic, incurable disease of the central nervous system (CNS) and a potentially severe cause of neurological disability throughout adult life. Typically diagnosed between the ages of 20 and 40, the disease is associated with a severely impaired health-related quality of life and a high societal economic impact. About 85% of patients are initially diagnosed with relapsing-remitting MS (RRMS), which is characterized by the unpredictable occurrence of relapses. Clinically, a relapse is defined as a worsening or appearance of new neurological symptoms followed by a period of partial or complete recovery (relapse without worsening, RWW). Up to 80% of patients transit to the secondary progressive course (SPMS) within 20 years. SPMS is marked by an accumulation of irreversible disability either resulting from relapse-associated worsening (RAW) or progression independent of relapse activity (PIRA). Even though health economic assessments are well established in MS, implications of relapses and disability worsening on societal economic costs have scarcely been studied. Regarding disability worsening it is known that annual costs increase with increasing disability from 21,174–28,200€ (EDSS 0–3) to 39,923–44,000€ (EDSS 4–6.5) (in 2015 values). However, the impact of PIRA and RAW on societal costs remains not well understood. Research to date has shown that the societal economic burden of MS increases in periods of relapses with most recent estimates at 2468€ per relapse (in 2015 values). The results of relapse cost analyses are inconsistent between studies since relapses and associated costs can vary across and within individuals depending on disease severity, disease duration, age, gender or therapy. However, a comprehensive test of this hypothesis is still needed. Research aims: I investigated the societal economic costs of disability worsening and relapses in patients with MS. First, I determined the societal economic costs of patients achieving disease activity free status (DAF, neither relapses nor disability worsening) and compared them with those having PIRA and RAW events. Second, I estimated direct and indirect relapse costs and determined differences in costs related to patient characteristics. Furthermore, I described the pharmacoeconomic impact during the relapse follow-up. Methods: Two-year clinical and pharmacoeconomic data were derived from two single arm, prospective, multicenter, non-interventional long term studies conducted in Germany applying the Multiple Sclerosis Health Resource Survey (MS-HRS). The MS-HRS estimates the MS-associated direct and indirect costs from a societal perspective using the most accurate form of bottom-up microcosting. Costs are presented per quarter in 2011 Euros. PIRA and RAW events were indicated through a roving confirmed disability worsening (CDW) measure and corresponding relapse assessments. CDW is based on a predefined increase on the Expanded Disability Status Scale (EDSS) sustained over at least 6 months. The effects of PIRA and RAW on total, direct medical, direct non-medical and indirect societal economic costs are adjusted for age, gender and EDSS. Due to the right skewness of cost data, I applied a Generalized Linear Mixed Model (GLMM) with a negative binomial distribution. Patients achieving DAF were assigned as the reference group. I calculated relapse costs as the difference in quarterly costs between propensity score (PS) matched patients with and without relapses (1:1 ratio). Statistical differences in relapse costs between patient and disease strata were derived from a Generalized Linear Model (GLM) with a negative binomial distribution. For relapse active patients, I additionally calculated the difference between quarterly costs prior- and during relapse and determined costs in the post-relapse quarter. Results: Overall, 1959 patients were analyzed with typical patient characteristics for a clinical RRMS population. Patients reported an average age of 41.62±10.04 years and were mostly female (73%). The mean disease duration was 7.30±5.95 with a mean baseline EDSS value of 2.26±1.37. Total mean quarterly societal economic costs including disease-modifying therapies (DMTs) were 6929€±2886€ per patient averaged over two years. Excluding DMTs, patients achieving DAF status had total mean quarterly costs of 1703€±2489€. PIRA caused 29% (IRR: 1.29; 95% CI 1.06–1.50, p<0.05) higher total costs compared to DAF. On the contrary, RAW increased total costs by factor 1.56 (95% CI 1.30–1.87, p<0.001). The effect of PIRA and RAW was striking for direct medical costs which increased by factor 1.48 (95% CI 1.13–1.95, p<0.01) and 2.25 (95% CI 1.72–2.94, p<0.001), respectively. In the relapse cost analyses, a total of 1882 patients were included encompassing 607 (32%) relapse-active patients. After PS-matching, 597 active and inactive patients were retained. Relapse costs ranged between 690€ (age: 50+ years) and 1729€ (disease du-ration: <5 years). In mildly disabled and recently diagnosed patients, indirect relapse costs (range: 971€-1093€) constantly outweighed direct costs (range: 535€-636€). The increase from prior- to relapse quarter was strongest for inpatient stays (+364%, 390€; p<0.001), day admissions (+241%, 53€; p<0.001) and absenteeism (+127%, 419€; p<0.001). In the post-relapse quarter direct costs and costs of absenteeism remained elevated for patients with relapse associated worsening. Conclusion: For the case of MS, disease activity should be a focus in medical research to reduce the societal economic burden of the disease. Disability worsening is associated with significantly higher societal economic costs compared to DAF status in patients with MS. Accordingly, it is highly important from a societal perspective to delay or even prevent transition into the progressive phase of MS. That is another argument for treating MS patients early with appropriate DMTs. Furthermore, relapses significantly increase the societal economic burden of MS. From a health economic societal perspective, the prevention of relapses in young patients and those with a recent diagnosis should be a particular focus.